CN110823823A - 一种响应面法优化眼子菜总黄酮的提取工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种响应面法优化眼子菜总黄酮的提取工艺，包括以下步骤：（1）对照品溶液的制备；（2）样品溶液的制备；（3）检测波长；（4）标准曲线的制作；（5）回归模型的建立与分析；（6）实验结果分析与优化。本发明提取工艺简单，提取效率高，易于推广应用，应用响应面法优化确定最优因素，保证提取科学性、稳定性，为质量标准研究提供依据。

Description

一种响应面法优化眼子菜总黄酮的提取工艺
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种响应面法优化眼子菜总黄酮的提取工艺。
背景技术
眼子菜（Potamogeton distinctus A. Bennett J. Bot.）是眼子菜科眼子菜属多年生水生草本植物的全草。俗称水上漂，又称水案板，在全国各稻作区均有分布，为稻田内多年生恶性杂草，主要依靠鸡爪芽（鳞茎）无性繁殖，常年造成危害。在全国第四次中药资源普查中发现眼子菜在贵州分布较广，安顺地区（屯堡人）民族民间用于治疗痔疮和肝炎效果较好。明代兰茂《滇南本草》中记载“牙齿草，又名牙拾草。生田中，味苦、涩，性寒。止赤白痢疾，大肠下血、妇人红崩漏下，恶血”。在《中药大辞典》中记载眼子菜具有清热利水、止血消肿、驱蛔的功效，眼子菜具有利尿、止血、杀虫等药理作用，用于治疗痔疮、蛔虫、水肿等病。前期研究表明眼子菜中含有黄酮类、挥发油类、氨基酸、糖类、鞣质及酚类等成分，其中黄酮类是主要活性物质。目前，国内外没有看到眼子菜提取工艺研究报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种响应面法优化眼子菜总黄酮的提取工艺，利用响应面法中的等高线和响应曲面进行参数分析，通过多元二次回归方程来拟合响应面值与因素之间函数关系的一种优化统计方法。此方法的优点是可以连续对试验因素的各个水平进行分析。
一种响应面法优化眼子菜总黄酮的提取工艺，包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：称取 120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品50.9mg，置于烧杯中，加入乙醇溶液，于水浴锅上45℃-55℃溶解，定容至 50 mL 容量瓶中，摇匀，得到1.018mg/mL的芦丁对照溶液；
（2）样品溶液的制备：将眼子菜粉碎，过20-40目筛，称取粗粉 1 g，置于具有瓶塞的锥形瓶中，加入乙醇溶液超声提取，冷却至室温，过滤，加乙醇溶液补足失去的重量，即得眼子菜总黄酮提取液；
（3）检测波长：吸取眼子菜总黄酮提取液5.0 mL 置于50 mL 容量瓶中，加入 5% NaNO2溶液2.0 mL，摇匀，放置5 min，加入10% Al(NO３)３溶液2.0 mL，摇匀，放置5 min，加入4%NaOH溶液10.0 mL，再用乙醇溶液稀释至刻度，静置15 min，在200-800 nm波长处每隔2 nm测定一次吸光度，样品溶液在508 nm处有最大吸收，即为测定波长；
分别吸取芦丁对照品溶液 0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL 于 25 mL量瓶中，依次加入 5% NaNO2溶液 2.0mL，摇匀，静置 5min，然后加入 10% Al(NO３)３溶液2.0mL，摇匀，静置5min，再加入4%NaOH 溶液 10.0 mL，蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置15 min，以依次加入上述显色剂的乙醇溶液作为空白对照，于200-800nm进行全波长光谱扫描，在508nm处有最大吸收，故选择测定波长为508 nm；
（4）标准曲线的制作：以吸光度 A 为纵坐标y，浓度 c 为横坐标x，绘制标准曲线，进行线性拟合，得吸光度 A 与浓度 c 的线性回归方程y=0.0052x+0.0046，以及相关系数R2为0.9985；
样品溶液的测定：吸取样品溶液5.0 mL，置于 50 mL 容量瓶中，标准曲线法制备待测溶液，根据芦丁标准曲线求算出总黄酮浓度，根据以下公式计算总黄酮得率。
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE002
其中，Y：总黄酮得率（%）；c：根据标准曲线所得总黄酮浓度（mg/mL）；V1：样品总溶液体积（mL）；V2：样品溶液测定体积（mL）；M：眼子菜质量（g）。
（5）回归模型的建立与分析：采用 Design Expert 8.0.5.0软件对实验结果进行多项式拟合回归，以提取温度A、乙醇浓度B、提取时间C和料液比D，以眼子菜总黄酮得率为响应值Y，建立回归方程：
Y=1.12+0.035A+0.041B+0.028C+0.060D-0.025AB-0.025AC-0.002AD-0.012BC-0.021BD+0.051CD-0.081A2-0.035B2-0.032C2-0.036D2；
（6）实验结果分析与优化：利用Design Expert 8.0.5.0软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图。
进一步的，所述步骤（1）、（2）、（3）和（4）中所用的乙醇溶液的浓度为50%。
进一步的，眼子菜药材总黄酮的最佳提取工艺为：提取温度70℃-80℃、乙醇浓度45%-50%、提取时间60-70min和料液比1：40-50 g/mL。
进一步的，眼子菜药材总黄酮的最佳提取工艺为：提取温度75.77 ℃、乙醇浓度48.71%、提取时间65.07min和料液比1：45.77 g/mL。
为便于操作，眼子菜药材总黄酮的最佳提取工艺为：提取温度76 ℃、乙醇浓度49%、提取时间65min和料液比1：46 g/mL。
本发明响应面法优化眼子菜总黄酮的提取工艺，与现有技术相比，其有益效果在于：本发明提取工艺简单，提取效率高，易于推广应用，应用响应面法优化确定最优因素，保证提取科学性、稳定性，为质量标准研究提供依据。
附图说明
图1是本发明乙醇浓度对眼子菜总黄酮得率影响图；
图2是本发明料液比对眼子菜总黄酮得率影响图；
图3是本发明提取温度对眼子菜总黄酮得率影响图；
图4是本发明提取时间对眼子菜总黄酮得率影响图；
图5是本发明乙醇浓度和提取温度交互作用下眼子菜总黄酮得率的等高线图；
图6是本发明乙醇浓度和提取温度交互作用下眼子菜总黄酮得率的响应曲面图；
图7是本发明提取时间和提取温度交互作用下眼子菜总黄酮得率的等高线图；
图8是本发明提取时间和提取温度交互作用下眼子菜总黄酮得率的响应曲面图；
图9是本发明料液比和提取温度交互作用下眼子菜总黄酮得率的等高线图；
图10是本发明料液比和提取温度交互作用下眼子菜总黄酮得率的响应曲面图；
图11是本发明提取时间和乙醇浓度交互作用下眼子菜总黄酮得率的等高线图；
图12是本发明提取时间和乙醇浓度交互作用下眼子菜总黄酮得率的响应曲面图；
图13是本发明料液比和乙醇浓度交互作用下眼子菜总黄酮得率的等高线图；
图14是本发明料液比和乙醇浓度交互作用下眼子菜总黄酮得率的响应曲面图；
图15是本发明料液比和提取时间交互作用下眼子菜总黄酮得率的等高线图；
图16是本发明料液比和提取时间交互作用下眼子菜总黄酮得率的响应曲面图；
图17为本发明芦丁标准曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
一种响应面法优化眼子菜总黄酮的提取工艺，包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：称取 120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品50.9mg，置于烧杯中，加入乙醇溶液，于水浴锅上45℃-55℃溶解，定容至 50 mL 容量瓶中，摇匀，得到1.018mg/mL的芦丁对照溶液；
（2）样品溶液的制备：将眼子菜粉碎，过20-40目筛，称取粗粉 1 g，置于具有瓶塞的锥形瓶中，加入乙醇溶液超声提取，冷却至室温，过滤，加乙醇溶液补足失去的重量，即得眼子菜总黄酮提取液；
（3）检测波长：吸取眼子菜总黄酮提取液5.0 mL 置于50 mL 容量瓶中，加入 5% NaNO2溶液2.0 mL，摇匀，放置5 min，加入10% Al(NO３)３溶液2.0 mL，摇匀，放置5 min，加入4%NaOH溶液10.0 mL，再用乙醇溶液稀释至刻度，静置15 min，在200-800 nm波长处每隔2 nm测定一次吸光度，样品溶液在508 nm处有最大吸收，即为测定波长；
分别吸取芦丁对照品溶液 0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL 于 25 mL量瓶中，依次加入 5% NaNO2溶液 2.0mL，摇匀，静置 5min，然后加入 10% Al(NO３)３溶液2.0mL，摇匀，静置5min，再加入4%NaOH 溶液 10.0 mL，蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置15 min，以依次加入上述显色剂的乙醇溶液作为空白对照，于200-800nm进行全波长光谱扫描，在508nm处有最大吸收，故选择测定波长为508 nm；
（4）标准曲线的制作：以吸光度 A 为纵坐标y，浓度 c 为横坐标x，绘制标准曲线（如图17所示），进行线性拟合，得吸光度 A 与浓度 c 的线性回归方程y=0.0052x+0.0046，以及相关系数R2为0.9985；
样品溶液的测定：吸取样品溶液5.0 mL，置于 50 mL 容量瓶中，标准曲线法制备待测溶液，根据芦丁标准曲线求算出总黄酮浓度，根据以下公式计算总黄酮得率。
其中，Y：总黄酮得率（%）；c：根据标准曲线所得总黄酮浓度（mg/mL）；V1：样品总溶液体积（mL）；V2：样品溶液测定体积（mL）；M：眼子菜质量（g）。
乙醇浓度对眼子菜总黄酮得率的影响：分别取眼子菜粉末6份，每份1g,精密称定，分别加入40mL浓度为30%、40%、 50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，于60 ℃超声提取60 min，分别精密吸取步骤2所述眼子菜样品6份各5.0mL，置于50mL容量瓶中，分别按照步骤4的方法测定并计算眼子菜总黄酮得率。结果表明体积为50%乙醇浓度提取眼子菜总黄酮得率最高，如图1所示。
料液比对眼子菜总黄酮得率的影响：分别取眼子菜粉末6份，每份1g,精密称定，分别按照料液比（g/mL）为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60加入50%乙醇浓度。于60 ℃超声提取60 min，分别精密吸取步骤2所述眼子菜样品6份各5.0mL，置于50mL容量瓶中，分别按照步骤4的方法测定并计算眼子菜总黄酮得率。结果表明料液比为1:40 g/mL的50%乙醇浓度提取眼子菜总黄酮得率最高，如图2所示。
提取温度对眼子菜总黄酮得率的影响：分别取眼子菜粉末6份，每份1g,精密称定，加入40mL浓度为50%的乙醇溶液，分别于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃超声提取60min，分别精密吸取步骤2所述眼子菜样品6份各5.0mL，置于50mL容量瓶中，分别按照步骤4的方法测定并计算眼子菜总黄酮得率。结果表明提取温度为70 ℃提取眼子菜总黄酮得率最高，如图3所示。
提取时间对眼子菜总黄酮得率的影响：分别取眼子菜粉末6份，每份1g,精密称定，加入40mL浓度为50%的乙醇溶液，于60 ℃分别超声提取30 min、40min、50min、60min、70min、80min，分别精密吸取步骤2所述眼子菜样品6份各5.0mL，置于50mL容量瓶中，分别按照步骤4的方法测定并计算眼子菜总黄酮得率。结果表明超声时间为60min提取眼子菜总黄酮得率最高，如图4所示。
Design Expert 8.0.5.0软件响应面优化：
因素水平选取及星点设计响应面设计：
在单因素试验的基础上，根据星点设计原理设计响应面试验，以眼子菜中总黄酮得率（%）作为响应值，以提取温度（A）、乙醇浓度（B）、提取时间（C）、料液比（D）作为自变量，选取5 个水平（0，±1，±1.718），采用 Design Expert 8.0.5.0建立模型对超声辅助提取眼子菜总黄酮工艺进行优化，试验设计因素与水平见表 1，星点设计组合及总黄酮提取率见表2。
表1 星点设计因素水平（r=3）
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE004
表 2 星点设计试验设计与结果(n=3)
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE006
（5）回归模型的建立与分析
采用 Design Expert 8.0.5.0软件对实验结果进行多项式拟合回归，得到回归方程：
Y=1.12+0.035A+0.041B+0.028C+0.060D-0.025AB-0.025AC-0.002AD-0.012BC-0.021BD+0.051CD-0.081A2-0.035B2-0.032C2-0.036D2。方差分析结果见表3。
表3模型方差分析
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE008
注：P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著差异。
由表3可知，实验模型“Pr>F”值小于0.0001非常显著，即该模型用于评价本实验可信度非常高，结果显示B、D、CD、A2对考察指标眼子菜总黄酮影响极其显著，而A、C、AB、AC、BD、B2、C2、D2对考察指标眼子菜总黄酮影响显著。失拟项（P=0.1138>0.05）不显著，表明方差拟合度较好，误差较小。R2=0.9184，表明最佳条件下实测值与预测值的偏差较小。
根据回归方程绘制响应面图，属于响应值与各因素间相互作用的三维空间曲面，主要用于较直观分析两交作用的影响，分析当乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比四个因素中有一个因素固定时，另外三个因素及其交互作用对所提取总黄酮含量的影响。根据方程得出模型的响应面及等高线见图5-16。
由图5-图6的等高线和响应面图可以看出，随着乙醇浓度的增加，眼子菜总黄酮含量增加，当达到一定浓度时，眼子菜总黄酮含量会下降，表明乙醇浓度对眼子菜总黄酮含量影响极显著。同理由图可以看出，料液比对眼子菜总黄酮含量也极显著，提取温度和提取时间有显著影响。
通过Design Expert 8.0.5.0软件求解方程得到，眼子菜药材总黄酮的最佳提取工艺为：乙醇浓度48.71% ，料液比1：45.77g/mL，提取时间65.07min，提取温度75.77 ℃。此条件下总黄酮的预测值为1.121%，为客观考虑可行性，将乙醇浓度定为49%，料液比1：46 g/mL，提取时间65min，提取温度76℃。再根据改进的情况最佳工艺进行实验验证（5组），实测值眼子菜中总黄酮含量平均值为1.118%，与理论预测值非常接近。因此，Design Expert 软件进行响应面优化眼子菜总黄酮提取工艺条件是可靠的，具有实用价值。
本发明提取工艺简单，提取效率高，易于推广应用，应用响应面法优化确定最优因素，保证提取科学性、稳定性，为质量标准研究提供依据。
本发明的保护范围不限于具体实施方式所公开的技术方案，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同替换、改进等，均落入本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种响应面法优化眼子菜总黄酮的提取工艺，其特征在于：包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：称取 120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品50.9mg，置于烧杯中，加入乙醇溶液，于水浴锅上45℃-55℃溶解，定容至 50 mL 容量瓶中，摇匀，得到1.018 mg/mL的芦丁对照溶液；
（2）样品溶液的制备：将眼子菜粉碎，过20-40目筛，称取粗粉 1 g，置于具有瓶塞的锥形瓶中，加入乙醇溶液超声提取，冷却至室温，过滤，加乙醇溶液补足失去的重量，即得眼子菜总黄酮提取液；
（3）检测波长：吸取眼子菜总黄酮提取液5.0 mL 置于 50 mL 容量瓶中，加入 5% NaNO2溶液2.0 mL，摇匀，放置 5 min，加入 10% Al(NO３)３溶液2.0 mL，摇匀，放置 5 min，加入 4%NaOH溶液 10.0 mL，再用乙醇溶液稀释至刻度，静置15 min，在 200-800 nm 波长处每隔 2nm 测定一次吸光度；
分别吸取芦丁对照品溶液 0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL 于 25 mL量瓶中，依次加入 5% NaNO2溶液 2.0mL，摇匀，静置 5min，然后加入 10% Al(NO３)３溶液2.0mL，摇匀，静置5min，再加入4%NaOH 溶液 10.0 mL，蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置15 min，以依次加入上述显色剂的乙醇溶液作为空白对照，于 200-800nm 进行全波长光谱扫描；
（4）标准曲线的制作：以吸光度 A 为纵坐标y，浓度 c 为横坐标x，绘制标准曲线，进行线性拟合，得吸光度 A 与浓度 c 的线性回归方程y=0.0052x+0.0046，以及相关系数R2为0.9985；
（5）回归模型的建立与分析：采用 Design Expert 8.0.5.0软件对实验结果进行多项式拟合回归，以提取温度A、乙醇浓度B、提取时间C和料液比D，以眼子菜总黄酮得率为响应值Y，建立回归方程：
Y=1.12+0.035A+0.041B+0.028C+0.060D-0.025AB-0.025AC-0.002AD-0.012BC-0.021BD+0.051CD-0.081A2-0.035B2-0.032C2-0.036D2；
（6）实验结果分析与优化：利用Design Expert 8.0.5.0软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图。
2.如权利要求1所述的响应面法优化眼子菜总黄酮的提取工艺，其特征在于：所述步骤（1）、（2）、（3）和（4）中所用的乙醇溶液的浓度为50%。
3.如权利要求1所述的响应面法优化眼子菜总黄酮的提取工艺，其特征在于：眼子菜药材总黄酮的最佳提取工艺为：提取温度70℃-80℃、乙醇浓度45%-50%、提取时间60-70min和料液比1：40-50g/mL。
4. 如权利要求1或3所述的响应面法优化眼子菜总黄酮的提取工艺，其特征在于：眼子菜药材总黄酮的最佳提取工艺为：提取温度75.77 ℃、乙醇浓度48.71%、提取时间65.07min和料液比1：45.77 g/mL。
5. 如权利要求1或3所述的响应面法优化眼子菜总黄酮的提取工艺，其特征在于：眼子菜药材总黄酮的最佳提取工艺为：提取温度76 ℃、乙醇浓度49%、提取时间65min和料液比1：46 g/mL。
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