CN102146355A - 一种利用产朊假丝酵母制备富硒酵母的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用产朊假丝酵母制备富硒酵母的方法，涉及一种新的制备富硒酵母的方法。一种制备富硒酵母的方法，包括下列步骤：a，取保藏号为CICC 1422的产朊假丝酵母复苏并制备种子；b，将步骤a得到的种子接种于发酵培养基中发酵，发酵时间为24-36小时；c，在发酵液中加入硒，硒的终浓度为5～20mg/L，继续发酵，发酵时间为24-48小时，收集菌液；d，将步骤c得到的菌液离心，收集菌体，烘干，即得富硒酵母。本发明的方法可以较好的兼顾生产成本、富硒酵母的生物量以及富硒酵母的含硒量，在消耗少量无机硒的情况下，得到生物量和含硒量均较高的富硒酵母，适于产业化生产。

Description

一种利用产朊假丝酵母制备富硒酵母的方法

技术领域

本发明涉及一种新的制备富硒酵母的方法，特别涉及利用产朊假丝酵母制备富硒酵母的的方法。

背景技术

硒元素是公认的必需微量元素，其在过氧化物的分解和自由基的清除、机体免疫力的调节、有毒元素的拮抗等方面均发挥着重要作用。目前的补硒添加剂包括无机硒和有机硒，因有机硒的食用安全性强、生物利用率更高，其是更优的补硒添加剂。通过生物富硒的方法将无机硒转化为有机硒是一种安全有效的方法，且富硒酵母的生产较为简便。因此，富硒酵母是最常用的补硒添加剂。

关于富硒酵母的研究较多，开发成本更低、含硒量更高的富硒酵母是近来研究的热点：

葛晓光等，“富硒产朊假丝酵母的制备条件研究”，粮食与饲料工业，2009年，第10期公开了环境条件对产朊假丝酵母细胞生长和富硒能力的影响。发酵菌种为产朊假丝酵母(Candida utilis SZU 07-01)，在培养基为葡萄糖30.0g/L、硫酸铵8.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、硫酸镁0.25g/L，加硒量为10mg/L的条件下发酵，得到的富硒酵母的生物量为11g/L，硒的有机转化率为90.2％，其细胞中含硒量为998μg/g，有机硒含量为90.2％。该方法使用的无机硒少，生产成本低，富硒酵母的生物量高，但是富硒酵母的含硒量低。

范秀英等，“高生物量富硒酵母的选育及培养条件初步优化”，生物工程学报，2003年，第19卷第6期公开了一种高生物量富硒酵母菌株ZFF-28及其优化培养条件。发酵菌种为筛选诱变得到的ZFF-28，在培养基为蔗糖糖蜜培养基，加硒量为60μg/ml的条件下发酵，得到的富硒酵母的生物量为8.2g/L，细胞中硒含量为2025μg/g，有机硒含量为91％。该方法得到的富硒酵母的含硒量较高，但是富硒酵母的生物量低且使用的无机硒多，导致工业生产成本较高。

现有文献还没有同时兼顾低生产成本、高生物量和高含硒量的富硒酵母制备方法的相关报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的制备富硒酵母的技术方案。

本发明提供了一种制备富硒酵母的方法，包括下列步骤：

a，取保藏号为CICC 1422的产朊假丝酵母复苏并制备种子；

b，将步骤a得到的种子接种于发酵培养基中发酵，发酵时间为24-36小时；

c，在发酵液中加入硒，硒的终浓度为10～20mg/L，继续发酵，发酵时间为24-48小时，收集菌液；

d，将步骤c得到的菌液离心，收集菌体，烘干，即得富硒酵母。

步骤b所述的发酵培养基为YPS培养基；步骤b所述的发酵时间为24小时；步骤b和步骤c的发酵pH为4～6.5，优选为5.1；步骤b和步骤c的发酵温度为28～30℃；步骤c所述的硒的终浓度为15mg/L；步骤c所述的硒为亚硒酸钠；步骤c所述的发酵时间为36小时。

本发明还提供一种由前述方法制备得到的富硒酵母。

本发明提供的制备富硒酵母的方法成本低，加硒量仅为15mg/L，得到的富硒酵母的生物量高，可达到为9.7g/L，富硒酵母的含硒量高，可达到1430μg/g，有机硒含量为1300μg/g。本发明提供的方法可以在生产成本较低的情况下，得到生物量和含硒量均较高的富硒酵母，适于产业化生产。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1不同pH对产朊假丝酵母生长的影响。图上的7个点从左至右分别表示发酵pH为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7得到的酵母菌的生物量。

图2酵母菌的重量随pH变化的趋势线。该曲线是根据图1的曲线经回归分析得出的曲线。

图3不同接种量的产朊假丝酵母生长曲线。图上曲线2％表示接种量为2％时产朊假丝酵母的生长情况；图上曲线5％表示接种量为5％时产朊假丝酵母的生长情况；图上曲线10％表示接种量为10％时产朊假丝酵母的生长情况。

具体实施方式

1材料与试剂

1.1菌种

产朊假丝酵母(Candida utilis)，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC 1422；啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC 31362。

1.2仪器

HZS-HA水浴振荡器、SHEN AN手扶式高压灭菌锅、101-3A电热鼓风恒温干燥箱、雷磁PHS-3D PH计、90-1型恒温磁力搅拌器、722光栅分光光度计、新苗QYC-2102大容量双层全温摇床、SW-CJ-1FD单人单面净化工作台、BIOFUGE冷冻离心机

1.3试剂

蔗糖(分析纯)、酵母粉(生化试剂)、蛋白胨(生化试剂)、酒石酸(分析纯)、亚硒酸钠(优级纯)、琼脂(生化试剂)

1.4硒母液的配制

1)标准硒贮备液：准确称取2.190g干燥的亚硒酸钠，溶于蒸馏水，添加80ml、48％的HBr，然后用蒸馏水稀释至1L，制备成含硒1g/L的标准硒贮备液。

2)硒标准溶液：取上述贮备液1ml加蒸馏水定容为1L，即含硒量为1mg/L，高压灭菌，备用。

1.5培养基的制备

1)斜面培养基

取去皮土豆200g，切成小块，加蒸馏水1L。小火煮沸45～60min，用纱布过滤，然后补足失水至1L，并同时加入蔗糖：20g；琼脂粉：20g；酵母粉：2g；蛋白胨：2g。趁热分装于试管中，装入量为试管长度的1/3，加塞后经121℃灭菌20min。在培养基未凝固前呈15°斜面放置，凝固并经恒温37℃培养24h鉴定无菌后，置于4℃冰箱贮存备用。

2)天然培养基(PS4)，种子培养基

取去皮土豆200g，切成小块，加蒸馏水1L。小火煮沸45～60min，用纱布过滤，然后补足失水至1L，并同时加入蔗糖：40g，121C灭菌20min后，置于4℃冰箱贮存备用。

3)YPG

取酵母粉10g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，加蒸馏水至1L，121℃灭菌20min后，置于4℃冰箱贮存备用。

4)YPS

取酵母粉10g，蛋白胨10g，蔗糖50g，加蒸馏水至1L，121℃灭菌20min后，置于4℃冰箱贮存备用。

本发明试验数据采用SAS 8.0GLM程序进行统计分析，REG程序建立线性回归方程，并进行显著性检验。

实施例1菌种及培养基的确定

1、菌种复苏

分别将啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和产朊假丝酵母(Candidautilis)在无菌条件下，用接种环接种于斜面培养基上，于28～30℃下培养24h，复苏菌种，复苏两代。

2、酵母种子培养

在250ml三角瓶中(装液量为50ml)装入种子培养基，取复苏后的菌种分别接种于种子培养基中，150r/min、28～30℃下培养24h，作为种子。

3、发酵培养

在250ml三角瓶中分别装入50ml PS4、YPG和YPS液体培养基，以10％的接种量将两种酵母种子分别接入不同的培养基中，150r/min、28～30℃下培养72h。收获菌液，离心(5000r/min，10min)后弃上清液收获菌体，将菌体在65～70℃烘干，以菌体重量达到恒重为准，即得酵母，称重。

4、结果

结果见表1：

表1两种酵母在不同培养基中的生长情况(g/L)

注：a1与a2差异不显著(P＞0.01)，a1与a3差异极显著(P＜0.01)，a2与a3差异极显著(P＜0.01)；b1与b2差异不显著(P＞0.01)，b1与b3差异极显著(P＜0.01)，b2与b3差异极显著(P＜0.01)；a1与b1差异极显著(P＜0.01)，a2与b2差异极显著(P＜0.01)，a3与b3差异极显著(P＜0.01)。

从表1可以看出，产朊假丝酵母在三种培养基的生长情况均比啤酒酵母好(P＜0.01)；三种培养基中，YPS培养基相对于PS4培养基和YPG培养基，更能促进产朊假丝酵母的生长(P＜0.01)。

因此，产朊假丝酵母是较优的制备富硒酵母的菌种，YPS培养基为产朊假丝酵母(Candida utilis)优选的发酵培养基。

实施例2pH对产朊假丝酵母生长的影响

1、菌种复苏

取产朊假丝酵母(Candida utilis)在无菌条件下，用接种环接种于斜面培养基上，于28～30℃下培养24h，复苏菌种，复苏两代。

2、酵母种子培养

在250ml三角瓶中(装液量为50ml)装入种子培养基，取复苏后的菌种接种于种子培养基中，150r/min、28～30℃下培养24h，作为种子。

3、发酵培养

在250ml的三角瓶中装入50ml YPS液体培养基，以10％的接种量将产朊假丝酵母种子接入培养基中，调节pH值分别为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7，于150r/min、28～30℃下培养72h。收获菌液，离心(5000r/min，10min)后弃上清液收获菌体，将菌体在65～70℃烘干，以菌体重量达到恒重为准，即得酵母，称重。

4、结果

结果见图1，由图1可知，产朊假丝酵母的重量变化趋势符合钟形曲线，随着pH的增加酵母菌重量呈上升趋势，在pH为5.5时达到高峰，随后开始下降。当pH低于4或者高于6.5时，酵母菌量急剧下降。根据所测结果，经回归分析做出酵母菌的重量随pH变化的趋势线，见图2，并得到产朊假丝酵母生物量(Y)与pH值(X)有如下关系：Y＝-1.3904×X²+14.112×X-22.649，R²＝0.84，P＜0.01(n＝2)，由方程可得出该酵母菌生长的最适pH为5.1。

由本实施例可知，在发酵pH为4～6.5时，发酵得到的产朊假丝酵母的生物量较高，且在pH为5.1时，发酵得到的产朊假丝酵母的生物量是最高的。

实施例3生长曲线及接种量的确定

1、菌种复苏

取产朊假丝酵母(Candida utilis)在无菌条件下，用接种环接种于斜面培养基上，于28～30℃下培养24h，复苏菌种，复苏两代。

2、酵母种子培养

在250ml三角瓶中(装液量为50ml)装入种子培养基，取复苏后的菌种接种于种子培养基中，150r/min、28～30℃下培养24h，作为种子。

3、发酵培养

在250ml的三角瓶中装入50ml YPS液体培养基，分别以2％、5％、10％为接种量将产朊假丝酵母种子接入培养基中，调节pH值为5.1，于150r/min、28～30℃下培养。

分别在培养的0、1、2、3、6、12、24、36、48、60、72h取1ml菌液，经适当比例稀释后，以空白培养液作为参比，使用722分光光度计在波长660nm处测定酵母菌培养液OD值，显示酵母菌的生长特性，并做出生长曲线。

4、结果

结果见图3，产朊假丝酵母在0～3h内处于延滞期；3～36h处于对数生长期，细胞生长速度快，酵母数量急剧增加；在36h后进入稳定期，酵母生长放缓；60h后，酵母数量基本恒定。不同的接种量得到的酵母的生长趋势一致，相互间无显著差异(P＞0.05)。

因此，产朊假丝酵母(Candida utilis)发酵的接种量优选为2％，培养时间优选为60h。

实施例4加硒时间的确定

1、菌种复苏

取产朊假丝酵母(Candida utilis)在无菌条件下，用接种环接种于斜面培养基上，于28～30℃下培养24h，复苏菌种，复苏两代。

2、酵母种子培养

在250ml三角瓶中(装液量为50ml)装入种子培养基，取复苏后的菌种接种于种子培养基中，150r/min、28～30℃下培养24h后，作为种子。

3、发酵培养

在250ml的三角瓶中装入50ml YPS液体培养基，以2％的接种量将产朊假丝酵母种子接入培养基中，调节pH值为5.1，于150r/min、28～30℃下发酵60h；分别在酵母培养的诱导期、对数生长前期和对数生长中后期往发酵液中添加亚硒酸钠，硒的终浓度为20mg/L，具体是在发酵培养开始后第0h、第12h和第24h添加。收获菌液，离心(5000r/min，10min)后弃上清液收获菌体，将菌体在65～70℃烘干，以菌体重量达到恒重为准，即得富硒酵母，称重。

4、含硒量的测定

富硒酵母的含硒量的测定方法使用“分光光度法测定富硒酵母中有机硒的含量”，贺立东等，食品工业科技，2000年，第21卷第5期，第67页～68页公开的富硒酵母的含硒量的测定方法。

5、结果

结果见表2：

表2不同加硒时间对产朊假丝酵母生长的影响(g/L)

注：a1与a2差异极显著(P＜0.01)，a1与a3差异极显著(P＜0.01)，a2与a3差异极显著(P＜0.01)。

由表2可知，与诱导期加硒相比，对数生长期加硒极显著提高产朊假丝酵母的生物量(P＜0.01)；而对数生长中后期加硒与对数生长前期加硒相比，产朊假丝酵母生生物量提高了40.9％(P＜0.01)。

本实施例证明了在产朊假丝酵母(Candida utilis)对数生长中后期加硒的发酵方法可以保证制备得到高生物量的富硒酵母，且优选在发酵培养第24h将硒加入发酵液中。

实施例5加硒量的确定

1、菌种复苏

取产朊假丝酵母(Candida utilis)在无菌条件下，用接种环接种于斜面培养基上，于28～30℃下培养24h，复苏菌种，复苏两代。

2、酵母种子培养

在250ml三角瓶中(装液量为50ml)装入种子培养基，取复苏后的菌种接种于种子培养基中，150r/min、28～30℃下培养24h，作为种子。

3、发酵培养

在250ml的三角瓶中装入50ml YPS液体培养基，以2％的接种量将产朊假丝酵母种子接入培养基中，调节pH值为5.1，于150r/min、28～30℃下发酵60h；在对数生长中后期，具体是在发酵培养开始后第24h分别往发酵液中添加终浓度为5、10、15、20mg/L的亚硒酸钠。收获菌液，离心(5000r/min，10min)后弃上清液收获菌体，将菌体在65～70℃烘干，以菌体重量达到恒重为准，即得富硒酵母，称重。

4、含硒量、有机硒含量的测定

富硒酵母的含硒量和有机硒含量的测定方法使用“分光光度法测定富硒酵母中有机硒的含量”，贺立东等，食品工业科技，2000年，第21卷第5期，第67页～68页公开的富硒酵母的含硒量和有机硒含量的测定方法。

5、结果

结果见表3：

表3不同加硒量对产朊假丝酵母生物量及含硒量的影响

注：a1与a2差异极显著(P＜0.01)，a1与a3差异极显著(P＜0.01)，a1与a4差异极显著(P＜0.01)，a2与a3差异不显著(P＞0.01)，a2与a4差异极显著(P＜0.01)，a3与a4差异极显著(P＜0.01)；b1与b2差异极显著(P＜0.01)，b1与b3差异极显著(P＜0.01)，b1与b4差异极显著(P＜0.01)，b2与b3差异极显著(P＜0.01)，b2与b4差异极显著(P＜0.01)，b3与b4差异不显著(P＞0.01)；c1与c2差异极显著(P＜0.01)，c1与c3差异极显著(P＜0.01)，c1与c4差异极显著(P＜0.01)，c2与c3差异极显著(P＜0.01)，c2与c4差异极显著(P＜0.01)，c3与c4差异不显著(P＞0.01)。

由表3可知，随着硒添加量的增加，产朊假丝酵母生物量显著下降(P＜0.05)；酵母菌体总硒及有机硒含量极显著增加(P＜0.01)。当硒添加量为15mg/L和20mg/L时，产朊假丝酵母生物量及有机硒含量无显著差异(P＞0.05)，有机硒比例分别为90.9％和82.0％，因此试验的加硒量优选为15mg/L。

本实施例证明了加硒量为10mg/L～20mg/L时，制备得到的富硒酵母的生物量和有机硒含量均较高，特别在加硒量为15mg/L时，制备的富硒酵母的生物量和有机硒的含量达到最佳平衡。

实施例5富硒酵母的制备

1、菌种复苏

取产朊假丝酵母(Candida utilis)在无菌条件下，用接种环接种于斜面培养基上，于28～30℃下培养24h，复苏菌种，复苏两代。

2、酵母种子培养

在250ml三角瓶中(装液量为50ml)装入种子培养基，取复苏后的菌种接种于种子培养基中，150r/min、28～30℃下培养24h，作为种子。

3、发酵培养

在250ml的三角瓶中装入50ml YPS液体培养基，以2％的接种量将产朊假丝酵母种子接入培养基中，调节pH值为5.1，于150r/min、28～30℃下发酵60h；在对数生长中后期，具体是在发酵培养开始后第24h以15mg/L硒浓度加入亚硒酸钠。收获菌液，离心(5000r/min，10min)后弃上清液收获菌体，将菌体在65～70℃烘干，以菌体重量达到恒重为准，即得富硒酵母，称重。

4、含硒量、有机硒含量的测定

富硒酵母的含硒量和有机硒含量的测定方法使用“分光光度法测定富硒酵母中有机硒的含量”，贺立东等，食品工业科技，2000年，第21卷第5期，第67页～68页公开的富硒酵母的含硒量和有机硒含量的测定方法。

5、结果

经上述发酵方法得到的富硒酵母的生物量为9.7g/L，单位含硒量为1430μg/g，有机硒含量为1300mg/kg，有机硒含量百分比为90.9％。

综上所述，本发明提供的制备富硒酵母的方法可以较好的兼顾生产成本、富硒酵母的生物量以及富硒酵母的含硒量，在消耗少量无机硒的情况下，得到生物量和含硒量均较高的富硒酵母，具有很好的产业化应用前景。

Claims (10)

1.一种制备富硒酵母的方法，其特征在于：包括下列步骤：

a，取保藏号为CICC 1422的产朊假丝酵母复苏并制备种子；

b，将步骤a得到的种子接种于发酵培养基中发酵，发酵时间为24～36小时；

c，在发酵液中加入硒，硒的终浓度为10～20mg/L，继续发酵，发酵时间为24-48小时，收集菌液；

d，将步骤c得到的菌液离心，收集菌体，烘干，即得富硒酵母。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b所述的发酵培养基为YPS培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b所述的发酵时间为24小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b和步骤c的发酵温度为28～30℃。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的发酵pH为4～6.5。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的发酵pH为5.1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c所述的硒的终浓度为15mg/L。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c所述的硒为亚硒酸钠。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c所述的发酵时间为36小时。

10.权利要求1～9任意一项所述的方法制备得到的富硒酵母。

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