CN107338196A - 一株解酯耶氏酵母菌株及其应用 - Google Patents

一株解酯耶氏酵母菌株及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107338196A
CN107338196A CN201710515482.8A CN201710515482A CN107338196A CN 107338196 A CN107338196 A CN 107338196A CN 201710515482 A CN201710515482 A CN 201710515482A CN 107338196 A CN107338196 A CN 107338196A
Authority
CN
China
Prior art keywords
decalactone
nyl01
shi yeast
bacterial strain
ester
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710515482.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107338196B (zh
Inventor
冯贻安
沈情佳
杨霄
周俊辰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novorate Biotech Co ltd
Original Assignee
Novorate Biotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novorate Biotech Co ltd filed Critical Novorate Biotech Co ltd
Priority to CN201710515482.8A priority Critical patent/CN107338196B/zh
Publication of CN107338196A publication Critical patent/CN107338196A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107338196B publication Critical patent/CN107338196B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术微生物领域，具体涉及一株生物转化生产γ‑癸内酯的解酯耶氏酵母Yarrowialipolytica(命名为NYL01)菌株及其应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO：M2015696，保藏日期为2015年11月24日。该菌株具有高产天然γ‑癸内酯、底物转化率高、培养条件简单等优良特性。

Description

一株解酯耶氏酵母菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物技术微生物领域，具体涉及一株生物转化生产天然手性γ-癸内酯的解酯耶氏酵母Yarrowialipolytica(命名为NYL01)菌株及其应用。
背景技术
γ-癸内酯是含有五元内酯环的十碳化合物，具有浓郁的桃子和椰子香气，存在于多种水果及乳制品中，是国际公认安全的食品添加剂和药品添加剂。因其具有诱人香味和低香气阈值的特性，在香料工业得到了广泛的应用。目前，γ-癸内酯主要从水果中提取或是化学合成。由于水果中含量极低，天然提取获得的途径存在成本高昂、受季节限制等弊端。有关食品添加剂和药品添加剂的规定又严格限制化学合成产品的使用，同时，随着消费者对天然产品需求的上升，利用生物技术生产天然香料越来越受到人们的重视。
微生物法是生产较安全的、高生物活性的香味化合物及其复合物最有前途的方法。由于微生物法生产的γ-癸内酯具有旋光活性，在香料行业有特殊用途，使其更具有研究和实用价值。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)NYL01菌株，其具有高产γ-癸内酯、底物转化率高、培养条件简单等优良特性。本发明的第二个目的是提供上述的解酯耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)NYL01菌株在制备天然γ-癸内酯的应用。
为了解决上述的第一个目的，本发明采用了以下方案：
一株解酯耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)NYL01菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2015696，保藏日期为2015年11月24日。
本发明从浙江省各地收集的土壤样本中分离纯化获得628株微生物菌株，经筛选获得1株高产γ-癸内酯菌株。根据形态特征和ITS区序列比对，鉴定为解酯耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
本发明将获得的解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)菌株进行原生质体诱变，筛选获得了一株高产γ-癸内酯的正突变菌株，编号为NYL01(以下简称“解酯耶氏酵母NYL01菌株”)该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO：M 2015696，保藏日期为2015年11月24日。
解酯耶氏酵母NYL01菌株的形态特征：在YPD固体培养基上28℃培养2d，形成较典型的酵母菌落；边缘光滑而饱满，呈乳白色，直径约2～3mm(附图1)；显微镜观察细胞呈卵圆形，个体较细菌大得多，长直径约5～10微米，无鞭毛，有明显的细胞核，能看到部分细胞处在出芽繁殖的过程中(附图2)。
解酯耶氏酵母NYL01菌株ITS区基因测序比对结果显示，310bp的保守序列与解酯耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)吻合(附图3和附图4)。
为了解决上述第二个目的，本发明采用了以下技术方案：
一种生物转化法制备γ-癸内酯的方法，该方法包括以下步骤：
a.用接种环挑取适量解酯耶氏酵母NYL01菌株菌落，转接于YPD液体培养基，扩增培养20h，制得种子液。
b.按10％接种量取种子液加入转化培养基，200r/min，28℃摇床培养60h。
作为优选，所述的YPD液体培养基由以下组分构成：葡萄糖2％、蛋白胨2％、酵母粉1％、水1L，pH5.0～5.5。
作为优选，所述的转化培养基由以下组分构成：葡萄糖2％、酵母粉1％、蓖麻油酸10％、磷酸二氢钾0.05、磷酸氢二钠0.03％、硫酸镁0.01％、吐温0.4％，水1L。pH自然。
解酯耶氏酵母NYL01菌株具有高产γ-癸内酯、底物转化率高、培养条件简单等优良特性。在上述培养方法下，28℃培养60h，γ-癸内酯的产量达到4.5g/L以上，远远超过该领域的γ-癸内酯生物合成效率，利于工业扩大化生产。经气相色谱—质谱联用技术分离检测培养液中的γ-癸内酯，结果表明分离物的结构、分子量与γ-癸内酯标准品一致(附图5)。解酯耶氏酵母NYL01菌株可为γ-癸内酯的生产提供优良菌种。
附图说明
图1解酯耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)NYL01菌株在固体YPD培养基上培养2d菌落正面。
图2解酯耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)NYL01细胞显微特征(640×和1600×)。
图3解酯耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)NYL01菌株ITS基因序列。
图4解酯耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)NYL01菌株ITS序列与NCBI数据库比对结果。
图5解酯耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)NYL01菌株转化培养液气相色谱—质谱检测图。
图6解酯耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)NYL01菌株转化培养液中细胞浓度和γ-癸内酯浓度随时间的变化曲线。
保藏声明
一株解酯耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)NYL01菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2015696，保藏日期为2015年11月24日。
具体实施方式
下面对本发明具体实施方式做一个详细的说明。
实施例1解酯耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)NYL01菌株的培养。
1培养基
1.1YPD培养基：葡萄糖2％、蛋白胨2％、酵母粉1％、水1L，pH5.0～5.5。固体培养基在此基础上添加琼脂粉2％，pH调节至6.0～6.5。
1.2转化培养基：葡萄糖2％、酵母粉1％、蓖麻油酸10％、磷酸二氢钾0.05、磷酸氢二钠0.03％、硫酸镁0.01％、吐温0.4％，水1L。pH自然。
2实验方法
2.1高产γ-癸内酯菌株的分离纯化、筛选以及诱变
步骤1：分别从不同土壤样本中称取适量土样，放入装有无菌水的摇瓶中，震荡摇匀片刻，取少量土壤浸出液，用无菌水稀释成不同浓度后，吸取50uL涂布于YPD固体培养基上。28℃培养2d。选择菌落分布均匀，数量适中的平板，挑取不同表型特征的单菌落(包括细菌和真菌)，分别划线于新鲜的YPD固体培养基上进行纯化培养。获得的单菌落再次转接至新鲜的YPD固体培养基进行纯化，获得性状均一的纯菌株。将分离纯化获得的各个菌株编号保存于20％甘油中，置于－20℃冰箱中保存备用。
步骤2：将分离纯化获得的菌株接种在YPD固体培养基上活化2d，挑取少量菌落接入YPD液体培养基中扩培，200r/min，28℃摇床培养约16～20h，按10％接种量将种子液接入转化培养基，200r/min，28℃摇床培养约60h。取适量转化液，加入一定量的内标物(桃醛)混匀，再加入等体积的乙酸乙酯抽提(震荡混匀)，离心后取上清液，采用气相色谱法检测γ-癸内酯浓度，筛选产γ-癸内酯的菌株。
步骤3：将高产γ-癸内酯的菌株细胞制成原生质体，经紫外线诱变获得突变子，从中筛选高产γ-癸内酯的正突变菌株，筛选获得的高产γ-癸内酯的突变菌株，将其中产量最高的1株送宝生物工程(大连)有限公司做菌种鉴定。
3实验结果
3.1高产γ-癸内酯菌株的分离纯化、筛选
从收集的46份土壤样本中分离纯化获得了包括细菌和真菌在内的总共628株菌(不排除部分菌株为同一株，只是分离纯化时来自不同菌落)，对这628株菌分别进行了产γ-癸内酯能力的测试，其中55株菌株能不同程度地产生γ-癸内酯，最高的浓度为2.3g/L，编号N201，分离自浙江省湖州市德清县某工业区油脂厂附近土壤。
3.2高产γ-癸内酯菌株的诱变育种
将产γ-癸内酯菌株N201的细胞悬浮于浓度为10mg/mL蜗牛酶反应溶液中，37℃，100r/min摇床振荡处理30min。3000r/min离心5min收集细胞，去除上清液，将收集到的原生质体细胞重新悬浮于蔗糖高渗溶液中，置于紫外灯下照射60s(紫外灯功率15W，垂直照射距离40cm)。将照射后的菌悬液小心地涂布于高渗YPD固体培养基上，避光培养2～3天。从生长出的突变子菌落筛选高产γ-癸内酯的正突变菌株。总共获得了176个突变子菌落，其中大部分与出发菌株N201产量相近(不排除部分菌落未发生突变)，49株突变子为负突变，产量低于2.1g/L，24株突变子为正突变，产量超过2.5g/L，最高的达到4.5g/L，将其编号为NYL01，即解酯耶氏酵母NYL01菌株。
3.3解酯耶氏酵母NYL01菌株的鉴定结果
解酯耶氏酵母NYL01菌株的形态特征：在YPD固体培养基上28℃培养2d，形成较典型的酵母菌落。边缘光滑而饱满，呈乳白色，直径约2～3mm(附图1)；显微镜观察细胞呈卵圆形，个体较细菌大得多，长直径约5～10微米，有明显的细胞核，能看到部分细胞处在出芽繁殖的过程中(附图2)。ITS区基因测序比对结果显示，310bp的保守序列与解酯耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)吻合(附图3和附图4)。
3.4解酯耶氏酵母NYL01菌株的生长曲线和γ-癸内酯产量曲线
从种子液接入转化培养基开始，每隔6h取样检测细胞浓度(OD600)和γ-癸内酯浓度(附图6)。由于培养液呈乳状液，无法直接测定细胞浓度，取1mL培养液，5000r/min离心去除上层混合液，将收集的细胞重悬于10mL蒸馏水，利用分光光度计测定OD600值。γ-癸内酯浓度测定方法：取0.2mL培养液，加入等体积内标溶液(含桃醛10g/L)混匀，再加入0.4mL的乙酸乙酯抽提(震荡混匀)，离心后取上清液，进行气相色谱分析，利用内标法计算γ-癸内酯浓度。
3.5培养液中天然γ-癸内酯的鉴定
培养液经中国科学院上海药物研究所气相色谱—质谱联用技术分析(附图5)，目标产物分子结构和分子量与标准品一致：分子式C10H18O2，分子量170.25。

Claims (5)

1.一株解酯耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)NYL01菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：M 2015696，保藏日期为2015年11月24日。
2.根据权利要求1所述的解酯耶氏酵母NYL01菌株用于生产γ-癸内酯。
3.一种γ-癸内酯的生物转化制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
a.用接种环挑取适量如权利要求1所述的解酯耶氏酵母NYL01菌株菌落，转接于YPD液体培养基，扩增培养16～20h，制得种子液；
b.按10％接种量取种子液加入转化培养基，200r/min，28℃摇床培养60h。
4.根据权利要求3所述的γ-癸内酯的生物转化制备方法，其特征在于：YPD培养基由以下组分构成：葡萄糖2％、蛋白胨2％、酵母粉1％、水1L，pH5.0～5.5。
5.根据权利要求3所述的γ-癸内酯的生物转化制备方法，其特征在于：转化培养基基由以下组分构成：葡萄糖2％、酵母粉1％、蓖麻油酸10％、磷酸二氢钾0.05、磷酸氢二钠0.03％、硫酸镁0.01％、吐温0.4％。
CN201710515482.8A 2017-06-29 2017-06-29 一株解酯耶氏酵母菌株及其应用 Active CN107338196B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710515482.8A CN107338196B (zh) 2017-06-29 2017-06-29 一株解酯耶氏酵母菌株及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710515482.8A CN107338196B (zh) 2017-06-29 2017-06-29 一株解酯耶氏酵母菌株及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107338196A true CN107338196A (zh) 2017-11-10
CN107338196B CN107338196B (zh) 2020-08-28

Family

ID=60218103

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710515482.8A Active CN107338196B (zh) 2017-06-29 2017-06-29 一株解酯耶氏酵母菌株及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107338196B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110438179A (zh) * 2019-06-06 2019-11-12 浙江工业大学 一种利用餐厨废油脂制备γ-癸内酯的方法
CN110499259A (zh) * 2019-07-22 2019-11-26 浙江工业大学 一种解酯耶氏酵母yw100-1及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2734843A1 (fr) * 1995-06-02 1996-12-06 Centre Nat Rech Scient Nouveau procede de bioconversion microbienne.
CN102080053A (zh) * 2009-11-27 2011-06-01 爱普香料集团股份有限公司 一株新解脂耶氏酵母及其用于生物转化蓖麻油制备γ-癸内酯的方法
CN102080109A (zh) * 2009-11-27 2011-06-01 爱普香料集团股份有限公司 双液相萃取的生物法制备天然手性γ-癸内酯的方法
CN102676410A (zh) * 2012-03-14 2012-09-19 北京工商大学 一种高产丙位癸内酯的解脂耶氏酵母基因工程菌及制备方法和应用
CN105505802A (zh) * 2015-12-29 2016-04-20 西藏天虹科技股份有限责任公司 解脂亚罗酵母及利用其生产γ-癸内酯的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2734843A1 (fr) * 1995-06-02 1996-12-06 Centre Nat Rech Scient Nouveau procede de bioconversion microbienne.
CN102080053A (zh) * 2009-11-27 2011-06-01 爱普香料集团股份有限公司 一株新解脂耶氏酵母及其用于生物转化蓖麻油制备γ-癸内酯的方法
CN102080109A (zh) * 2009-11-27 2011-06-01 爱普香料集团股份有限公司 双液相萃取的生物法制备天然手性γ-癸内酯的方法
CN102676410A (zh) * 2012-03-14 2012-09-19 北京工商大学 一种高产丙位癸内酯的解脂耶氏酵母基因工程菌及制备方法和应用
CN105505802A (zh) * 2015-12-29 2016-04-20 西藏天虹科技股份有限责任公司 解脂亚罗酵母及利用其生产γ-癸内酯的方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110438179A (zh) * 2019-06-06 2019-11-12 浙江工业大学 一种利用餐厨废油脂制备γ-癸内酯的方法
CN110438179B (zh) * 2019-06-06 2021-04-06 浙江工业大学 一种利用餐厨废油脂制备γ-癸内酯的方法
CN110499259A (zh) * 2019-07-22 2019-11-26 浙江工业大学 一种解酯耶氏酵母yw100-1及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107338196B (zh) 2020-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101928679B (zh) 一株高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸乳酸菌的选育
CN102864111B (zh) 一株产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌菌株
CN102864087B (zh) 一株高产天然虾青素的红法夫酵母菌株及其选育方法和应用
CN107287127A (zh) 一株耐乳酸的产酯毕赤酵母
CN104087631B (zh) 一种深层液态发酵生产樟芝胞外多糖的方法
CN103202175A (zh) 荷叶离褶伞新菌株
CN103602591B (zh) 一种裂殖壶菌及用于生产二十二碳六烯酸油脂的方法
CN101988036A (zh) 出芽短梗霉菌株和其制备方法及用于生产无色素茁霉多糖
CN106754862A (zh) 一种高生长能力隐甲藻突变藻株的选育方法
CN105779299B (zh) 一株产腺苷及甘露醇类物质的蝙蝠蛾拟青霉菌株及应用
CN103849581B (zh) 一种花椒内生短杆菌及其筛选纯化方法和用途
CN101113410B (zh) 一种高山被孢霉及其应用
CN107338196A (zh) 一株解酯耶氏酵母菌株及其应用
CN103305442A (zh) 一种巴氏醋杆菌及其应用
CN104893978B (zh) 一株雨生红球藻enn71及其培养方法与应用
CN102766663B (zh) 桑黄活性多糖的制备方法
CN109055237A (zh) 一株尾孢菌素生产菌及其应用
CN102876592A (zh) 异常毕赤酵母
CN105462862B (zh) 一种高产三萜的灵芝菌丝体的培养方法
CN102080053A (zh) 一株新解脂耶氏酵母及其用于生物转化蓖麻油制备γ-癸内酯的方法
CN106636252A (zh) 干巴菌胞外多糖及其制备方法和应用
CN100543128C (zh) 一种生产β-胡萝卜素的粘性红圆酵母、β-胡萝卜素及其生产方法
CN105802874A (zh) 一种高效降解阿特拉津的混合菌及发酵培养方法
CN102161973A (zh) 一种制备高三尖杉酯碱的方法及专用菌株
CN101845396B (zh) 一种耐辐射真菌及其制备的红色素粗制剂

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant