CN105505802A - 解脂亚罗酵母及利用其生产γ-癸内酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种解脂亚罗酵母Yarrowia？Lipolytica？C85#，所述解脂亚罗酵母Yarrowia？Lipolytica？C85#被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC？No.11736，保藏时间为：2015年11月25日。本发明还公开了一种利用解脂亚罗酵母生产γ-癸内酯的方法。本发明对高产菌株发酵工艺进行了优化，确定了发酵的工艺参数，提高了γ-癸内酯的产量。

Description

解脂亚罗酵母及利用其生产γ-癸内酯的方法
技术领域
本发明属于工业生物技术领域，涉及一种解脂亚罗酵母，还涉及一种利用该解脂亚罗酵母发酵制取γ-癸内酯的方法。
背景技术
γ-癸内酯(γ-Decalactone，GDL)是一种内酯类香味物质，它是一个含有五元内酯环的十碳化合物，分子式为C10H18O2，分子量为170.25。GDL为无色液体，呈椰子、桃子、柑橘、椰子香气，沸点153℃/2000Pa或l14-116℃/66.7Pa，折射率(nD21.5)1.4610，微溶于水，易溶于有机溶剂。被广泛用于配制奶油、桃子、柑橘和椰子等型香精中，是香料中需求较大的产品之一。GDL天然存在于桃子、草莓、椰子、芒果、杏、啤酒、朗姆酒中，具有醋香、果香、奶油香、桃子、椰子香，也存在于乳制品的风味物质中，是调配桃子、杏、浆果、奶油、柑橘、椰子、巧克力、奶制品等食用香精的常用原料。
1969年，GDL被美国食品药品管理局认为是安全的食品添加剂和药物添加剂我国GB2760-86规定为允许使用的食用香料。它以其诱人的桃香和低香气阈值(水中为0.088mg/L)的特性而得以在香料工业中普遍应用。GDL广泛用于各类花香、果香、东方香型、檀香型日化香精，有良好定香作用；也可用于食品、烟用、饲料、酒用香精中。
很多香料公司将兴趣投向了这一潜在市场并开始进行研发，使得GDL的生产有了快速发展，天然GDL的售价也由20000美元/kg降至1000美元/kg(2014年)。但目前市场上销售的GDL仍主要是由化学合成的无旋光活性的外消旋混合物，如日本SODA公司以及国内一些香料公司均有化学合成的GDL出售。化学法合成GDL主要由辛醛与丙二酸缩合，再脱羧和环化而成。普通条件下利用有机合成的GDL是无旋光的外消旋混合物，而用微生物法生产则可以得到具有旋光活性和相对较纯的产物，且可以一次完成由化学合成需要许多步骤的生产过程，具有很高的实用价值。
目前，GDL主要利用化学合成法制备，如:新醛和丙二酸合成法该法由辛醛与丙二酸缩合，再脱梭、环化而得GDL。由于原料易得，反应路径短，产率高，是工业上常用方法。还有糠酸法，糠酵是一种常见易得原料，目前己幵发出将糠酵用格氏反应在支链上引入烷基，再开环为γ-酮酸，脱水内酯化而得GDL。Reformatsky反应合成法一羟基化合物与β-卤代酯在锌存在下缩合为β-羟基酸酯，再山酸催化脱水得GDL。由于庚醛可由蓖麻油裂解而得，因此有充足的原料来源，但有机锌试剂必须在惰性溶剂中反应，仍不是很广。醇类与不饱和酸酯游离基加成反应合成法，醇在游离基引发剂引发下形成游离基，其与不饱和羧酸酯进行加成可生成GDL。常用游离基引发剂是二叔丁基过氧化物。a-烯烃法用价廉的辛醇脱水可以制得辛醇，辛醇可以一步合成GDL，合成方法简便，是一种正在开发的工业合成方法。由此可知，利用化学合成法生产GDL都涉及有机溶剂的应用，不可避免带来有机溶剂的残留，产品安全性方面存在问题。
国内生物发酵法制备GDL研究大都停留在发酵工艺优化及菌株筛选层面，对GDL产生的工业法发酵机理研究甚少，这是制约生物发酵法生产GDL产量的关键因素。
发明内容
为此，本发明的目的之一是提供一种解脂亚罗酵母YarrowiaLipolyticaC85#。
本发明的又一目的是提供一种利用解脂亚罗酵母生产γ-癸内酯的方法。
本发明提供的技术方案为：
一种解脂亚罗酵母YarrowiaLipolyticaC85#，所述解脂亚罗酵母YarrowiaLipolyticaC85#被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCCNo.11736，保藏时间为：2015年11月25日。
一种利用所述的解脂亚罗酵母生产γ-癸内酯的方法，将所述的解脂亚罗酵母发酵培养，产生γ-癸内酯。
优选的是，所述的方法中，所述发酵培养的温度为25℃-27℃，所述发酵培养的时间为280-288h。
优选的是，所述的方法中，在发酵培养中，于培养开始后的64h、76h、92h和102h分别向发酵培养基中按照质量体积分数补加3％-4％的葡萄糖和2％-7％的蓖麻甲醇酸甲酯。
优选的是，所述的方法中，在所述发酵培养中，初始搅拌速度为45-50rpm，当发酵培养基中的溶氧低于30％后，首先按照0.2vvm、0.3vvm和0.4vvm的顺序每隔一定时间调整空气流量，然后按照0.03MPa、0.04MPa和0.05MPa的顺序每隔一定时间调整压力，最后按照50rpm、60rpm和70rpm的顺序每隔一定时间调整搅拌速度。
优选的是，所述的方法中，所述一定时间为5～10min。
优选的是，所述的方法中，培养过程中，在产生γ-癸内酯之后还包括采用超临界CO2方法萃取γ-癸内酯。
优选的是，所述的方法中，所述超临界CO2方法中采取的温度为30-40℃，压力为10-15MPa，时间为1.5-3.0h。
优选的是，所述的方法中，所述发酵培养基包含：葡萄糖30-40g/L，玉米浆50-60g/L，蓖麻甲醇酸甲酯80-100g/L，吐温-808-10g/L，硫酸铵10-12g/L，硫酸镁2.4-3.2g/L，磷酸钠1.2-2.8g/L，磷酸二氢钾0.5-1.8g/L，VB25-10mg/kg和硫酸铁20-30mg/L。
本发明制备的γ-癸内酯是经紫外、NTG诱变出解脂亚罗酵母(YarrowiaLipolytica)生物发酵得到，以蓖麻甲醇酸甲酯作为前体，采用间歇补料分批发酵方式进行发酵，选择了更适宜液体培养基配方及相应的发酵控制参数，提取过程中采用超临界流体萃取法，所得γ-癸内酯浓度不低于84.3％，产量不低于14.38g/L。
本发明提供的上述生产方法，与现有技术相比，具有以下优点：
1.本发明为微生物发酵法制备γ-癸内酯，γ-癸内酯被呈有浓郁桃香和椰子香，存在于多种水果和乳制品中，是国际公认安全的食品添加剂和药品添加剂，对它的研究开发具有很好的经济价值和应用潜力。
2.本发明对高产菌株发酵工艺进行了优化，确定了发酵的工艺参数，提高了γ-癸内酯的产量，γ-癸内酯浓度不低于84.3％，产量不低于14.38g/L以上，转化率不低于48.4g/L，处于国内领先水平。
3.本发明采取超临界CO2萃取法，因此本方法可作为一种绿色、环保、无污染、安全且高效的提取方法有效提高了γ-癸内酯的得率，γ-癸内酯萃率不低于67.8％。
附图说明
图1为本发明中利用解脂亚罗酵母生产γ-癸内酯的方法的流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明提供一种解脂亚罗酵母YarrowiaLipolyticaC85#，所述解脂亚罗酵母YarrowiaLipolyticaC85#被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNo.11736，保藏时间为：2015年11月25日。
如图1所示，本发明还提供一种所述的解脂亚罗酵母生产γ-癸内酯的方法，将所述的解脂亚罗酵母发酵培养，产生γ-癸内酯。
在上述方法中，作为优选，所述发酵培养的温度为25℃-27℃，所述发酵培养的时间为280-288h。
在上述方法中，作为优选，在发酵培养中，于培养开始后的64h、76h、92h和102h分别向发酵培养基中按照质量体积分数补加3％-4％的葡萄糖和2％-7％的蓖麻甲醇酸甲酯。
在上述方法中，作为优选，在所述发酵培养中，初始搅拌速度为45-50rpm，当发酵培养基中的溶氧低于30％后，首先按照0.2vvm、0.3vvm和0.4vvm的顺序每隔一定时间调整空气流量，然后按照0.03MPa、0.04MPa和0.05MPa的顺序每隔一定时间调整压力，最后按照50rpm、60rpm和70rpm的顺序每隔一定时间调整搅拌速度。
在上述方案中，作为优选，所述一定时间为5～10min。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，培养过程中，在产生γ-癸内酯之后还包括采用超临界CO2方法萃取γ-癸内酯。
在上述方案中，作为优选，所述超临界CO2方法中采取的温度为30-40℃，压力为10-15MPa，时间为1.5-3.0h。
在上述方案中，作为优选，所述发酵培养基包含：葡萄糖30-40g/L，玉米浆50-60g/L，蓖麻甲醇酸甲酯80-100g/L，吐温-808-10g/L，硫酸铵10-12g/L，硫酸镁2.4-3.2g/L，磷酸钠1.2-2.8g/L，磷酸二氢钾0.5-1.8g/L，VB25-10mg/kg和硫酸铁20-30mg/L。
实施例1
本发明的方法，包括下列步骤：
1.发酵菌株：采用亚硝基胍(NTG)诱变筛选的解脂亚罗酵母(YarrowiaLipolytica)C85#。
亚硝基胍(NTG)诱变：将培养基对数生长期的种子培养基离心(6000r/min5min)，以每次20mL磷酸缓冲液洗涤，离心2次，合并，吸取20ml菌悬浮液到一个黑袋子包住的带玻璃珠的小三角瓶中，点加入0.6mlNTG(配制方法：加入2.5mgNTG，蒸馏水定容至10ml，终浓度为0.25mg/ml)。挑选生长较好的菌落经过摇瓶发酵实验，经用NTG处理反复筛选得到C85#，经发酵后内酯产量可达到8.7g/L以上。
2.培养基：
(1)斜面培养基：麦芽汁斜面(配方：麦芽膏粉90-120g/L，酵母粉5-10g/L，琼脂15g/L，NaCl5g/L)，pH值5.5～6.5，120℃灭菌15min，25-28℃培养48-72h。
(2)种子培养基：葡萄糖15-18g/L，酵母膏2.5-7.5g/L，蛋白胨3.5-7.5g/L，硫酸镁2.4-5g/L，磷酸二氢钾0.1-0.5g/L，磷酸钠1.2-4.8g/L，蓖麻甲醇酸甲酯7.5-8.5g/L，pH5.5～6.5，121℃灭菌15min。
(3)发酵培养基：葡萄糖30-40g/L，玉米浆50-60g/L，蓖麻甲醇酸甲酯80-100g/L，吐温-808-10g/L，硫酸铵10-12g/L，硫酸镁2.4-3.2g/L，磷酸钠1.2-2.8g/L，磷酸二氢钾0.5-1.8g/L，VB25-10mg/kg，硫酸铁20-30mg/L，100-115℃灭菌15-20min。
3.摇瓶发酵培养：
将斜面培养基上保存的菌株接种到种子培养基中，制备得到一级种子，取发酵液的一级种子利用种子培养基培养得到二级培养菌株：菌种用500mL三角瓶，装液量100-200mL、接种量10％-15％、摇床22-25℃、170-175r/min培养45-48h、起始pH5.5-6.5。
发酵培养方法：50L发酵罐内发酵培养：将二级培养菌株按照2-4％的接种量转接入50L的发酵罐内(内装30L经灭菌的发酵培养基)，采用分批补料方式，分别在64h、76h、92h、102h，补加3-4％的葡萄糖和2-7％的蓖麻甲醇酸甲酯。调整发酵温度25-27℃培养，发酵时间到280-288h；
发酵罐内控制方法：初始搅拌转速为45-50rpm，以便打散空气，搅均匀发酵料液。当溶氧低于30％，每次间隔5-10min，依次调节空气流量、罐压和搅拌速度：先提高空气流量0.2vvm→0.3vvm→0.4vvm，再提高罐压0.03MPa→0.04MPa→0.05MPa，再提高搅拌速度50rpm→60rpm→70rpm，可使空气充分打散，与料液混合均匀，又不至于空气浪费，同时又最大限度降低掠拌的剪切作用。其中，vvm:airvolume/culturevolume/min(通气比)，是每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值。
前体蓖麻甲醇酸甲酯：摇瓶中以0.9％的质量体积比添加在基础配方中，50L发酵罐在发酵过程中流加，蓖麻甲醇酸甲酯残留控制在0.2％。
提取：采取超临界CO2萃取，确定GDL提取的工艺条件范围：温度为30-40℃，压力为10-15MPa，时间为1.5-3.0h，γ-癸内酯浓度为84.3±2.0％，产量为14.38±2.0g/L，萃取率为86.2％，转化率为48.4±2.0％。
转化率(％)＝1-蓖麻甲醇酸甲酯起始添加量/发酵液中蓖麻甲醇酸甲酯量
实施例2
取一级种子用500mL三角瓶，装种子培养基液量150-200mL、接种量10％-15％、摇床25℃、175r/min培养48h、起始pH6.0，获得二级种子。
接种50L发酵罐内大体积发酵培养：将二级种子按照2％的接种量转接入50L的发酵罐内(内装30L经灭菌的发酵培养基)，采用5％蓖麻甲醇酸甲酯分别在64h，76h，92h，102h分批补料，添加与发酵培养基质量体积比为3％的葡萄糖和2％的蓖麻甲醇酸甲酯。调整发酵温度27℃培养，发酵时间288h，测得γ-癸内酯浓度87.53％，产量为14.52g/L，转化率为49.34％。
其中，种子培养基包含：葡萄糖15g/L，酵母膏2.5g/L，蛋白胨3.5g/L，硫酸镁2.4g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，磷酸钠1.2g/L，蓖麻甲醇酸甲酯7.5g/L，pH5.5，121℃灭菌15min。
发酵培养基：葡萄糖30g/L，玉米浆50-g/L，蓖麻甲醇酸甲酯80g/L，吐温-808g/L，硫酸铵10g/L，硫酸镁2.4g/L，磷酸钠1.2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，VB25mg/kg，硫酸铁20mg/L，100-115℃灭菌15-20min。
实施例3
取一级种子用500mL三角瓶，装种子培养基液量150-200mL、接种量10％-15％、摇床25℃、175r/min培养48h、起始pH6.0，获得二级种子。
接种50L发酵罐内大体积发酵培养：将二级种子按照2％的接种量转接入50L的发酵罐内(内装30L经灭菌的发酵培养基)，采用5％蓖麻甲醇酸甲酯分别在64h，76h，92h，102h分批补料，添加与发酵培养基质量体积比为4％的葡萄糖和7％的蓖麻甲醇酸甲酯。调整发酵温度27℃培养，发酵时间288h，测得γ-癸内酯浓度85.1％，产量为14.9g/L，转化率为49.2％。其中，种子培养基包含：葡萄糖18g/L，酵母膏7.5g/L，蛋白胨7.5g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸钠4.8g/L，蓖麻甲醇酸甲酯8.5g/L，pH6.5，121℃灭菌15min。
发酵培养基：葡萄糖40g/L，玉米浆60g/L，蓖麻甲醇酸甲酯100g/L，吐温-8010g/L，硫酸铵12g/L，硫酸镁3.2g/L，磷酸钠2.8g/L，磷酸二氢钾0.5-1.8g/L，VB210mg/kg，硫酸铁30mg/L，100-115℃灭菌15-20min。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.一种解脂亚罗酵母YarrowiaLipolyticaC85#，其特征在于，所述解脂亚罗酵母YarrowiaLipolyticaC85#被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNo.11736，保藏时间为：2015年11月25日。
2.一种利用如权利要求1所述的解脂亚罗酵母生产γ-癸内酯的方法，其特征在于，将权利要求1所述的解脂亚罗酵母发酵培养，产生γ-癸内酯。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为25℃-27℃，所述发酵培养的时间为280-288h。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在发酵培养中，于培养开始后的64h、76h、92h和102h分别向发酵培养基中按照质量体积分数补加3％-4％的葡萄糖和2％-7％的蓖麻甲醇酸甲酯。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述发酵培养中，初始搅拌速度为45-50rpm，当发酵培养基中的溶氧低于30％后，首先按照0.2vvm、0.3vvm和0.4vvm的顺序每隔一定时间调整空气流量，然后按照0.03MPa、0.04MPa和0.05MPa的顺序每隔一定时间调整压力，最后按照50rpm、60rpm和70rpm的顺序每隔一定时间调整搅拌速度。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述一定时间为5～10min。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，培养过程中，在产生γ-癸内酯之后还包括采用超临界CO2方法萃取γ-癸内酯。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述超临界CO2方法中采取的温度为30-40℃，压力为10-15MPa，时间为1.5-3.0h。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包含：葡萄糖30-40g/L，玉米浆50-60g/L，蓖麻甲醇酸甲酯80-100g/L，吐温-808-10g/L，硫酸铵10-12g/L，硫酸镁2.4-3.2g/L，磷酸钠1.2-2.8g/L，磷酸二氢钾0.5-1.8g/L，VB25-10mg/kg和硫酸铁20-30mg/L。
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