CN102080109B - 双液相萃取的生物法制备天然手性γ-癸内酯的方法 - Google Patents
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Abstract
双液相萃取的生物转化制备天然手性γ-癸内酯的方法，采用解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica As2.1405，经过扩大培养的种子液，接种于转化培养基，以蓖麻油为底物，生物转化生产天然γ-癸内酯，在转化过程中采用添加有机溶剂的原位产物分离技术，将γ-癸内酯的生物转化合成与分离提取耦合起来，减小产物毒性、提高γ-癸内酯产量。有机溶剂相中γ-癸内酯产量比不添加溶剂的单水相转化制备提高了444％。所得产品纯度(GC)≥98.3％，旋光度
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物转化法生产天然γ-癸内酯的方法，属于生物技术领域。即采用双液相萃取的原位(in site)产物分离技术，生物转化天然原料---蓖麻油制备天然手性γ-癸内酯的方法。
技术背景
γ-癸内酯(gamma decalactone)，又名丙位癸内酯，是一种含有五元内酯环的十碳化合物。内酯可以看作是羟基酸分子内脱去一分子水的产物，由于生成酯的羟基和羧基处于同一分子内，故称为内酯，见下列反应式。
当n＝1时，称为乙位内酯，亦称β-内酯；当n＝2时，称为丙位内酯，亦称γ-内酯；当n＝3时，称为丁位内酯，亦称δ-内酯；当n＞12时，称为大环内酯，这类内酯具有麝香香气。
γ-癸内酯具有水果味、桃子味和典型的椰子香气，香气较桃醛轻飘，并以诱人的桃香和低香气阈值的特性，在香料工业得到了广泛的应用，主要用于配制奶油、桃子、柑橘和椰子等类型的香精。1969年，γ-癸内酯被美国食品药品管理局(FDA)认定是安全的食品添加剂和药物添加剂，FDA编号为172.515；我国食品添加剂国标GB2760规定为允许使用的食品香料；FEMA编号为2360。
γ-癸内酯天然存在于桃子、杏仁、草莓等水果中，具有强烈的果香香气，稀释时有桃子香气，在成熟的果实中，含量可达到15ppb，其中89％的是(R)-异构体，11％的是(S)-异构体。大量研究发现，右旋R型γ-癸内酯和左旋S-型γ-癸内酯的香气特征存在明显差异：左旋S-型γ-癸内酯的香气为柔和的、甜甜的椰奶味，有明显酯味特征；右旋R型γ-癸内酯为强烈的、脂甜的水果味，类似椰子，焦糖味。光学纯的γ-癸内酯味道偏甜，清新，有明显的水果甜味，不同对映体间的香气强度不一样，右旋体的香气较浓。由于手性内酯的香气特点，在配制高级食用香精时，选取特定构型的内酯可以得到高仿真的不同来源的香料，所以，手性γ-癸内酯的生产在香精香料行业中越来越受到重视。
γ-癸内酯的制备可以通过天然提取、化学合成、生物技术3种方法来实现。化学合成的内酯主要为无旋光的外消旋体；天然提取虽然可以得到某一光学异构体占优势的产品，但技术复杂、成本高，因而价格昂贵。生物技术方法可以使用廉价的原料生产具有光学活性(手性)的γ-癸内酯，转化条件相对温和、副产物少、环境污染小，因此越来越成为制药业、香料界关注的焦点。
利用生物技术生产γ-癸内酯普遍采用生物转化的方法，所利用的底物主要有羟基脂肪酸、脂肪酸酯和非羟基脂肪酸。生产菌种主要采用酵母菌，一般选用耶氏酵母(Yarrowia sp.)，假丝酵母(Candida sp.)，锁掷孢酵母(Sporidiobolus sp.)等菌株。比如，蓖麻油中的主要组分蓖麻油酸(12-羟基-9-十八碳烯酸，含量在80％以上)在酵母菌的作用下，经过多步β-氧化使碳链缩短，生成γ-癸内酯的直接前体4-羟基癸酸，再环化生成γ-癸内酯(见上述反应方程式，n＝2，R＝-C6H13)。
由于产物γ-癸内酯对酵母细胞有一定的毒性，当转化体系中γ-癸内酯达到一定浓度后就会抑制酵母的活性，从而限制了γ-癸内酯产生的浓度；另外，在γ-癸内酯生成后会继续β-氧化后降解，导致γ-癸内酯的得率比较低。虽然有文献报道，通过各种方法来提高γ-癸内酯的产量，但截至目前为止，还没有一个经济可行的生产工艺，这使生物技术制备天然γ-癸内酯仍未得到工业化应用。
发明内容
本发明针对生物法生产γ-癸内酯产量低等问题，提供一种采用双液相体系的原位产物分离生物法制备天然手性γ-癸内酯的方法。该方法不仅可以降低产物对菌体的影响，从而提高产量；而且在转化过程中产物全部由溶剂从水相萃取进入有机相中，实现产物的有效原位分离，方便产物的提取，简化了提取工艺。所使用的溶剂经过蒸馏后，可重复利用，从而降低生产成本。
为达到发明目的，本发明采用以下技术方案：
使用解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica As2.1405经过扩大培养的种子液，接种于转化培养基，以蓖麻油为底物，在转速100～200转/分钟、温度20～40℃条件下，生物转化18～72小时生产天然γ-癸内酯。在转化过程中采用添加有机溶剂的原位产物分离技术，减小产物毒性、提高γ-癸内酯产量。
其中所用转化培养基为：蓖麻油10～60克/升，蛋白胨5～20克/升，酵母粉5～20克/升，钾盐1～10克/升，钠盐5～20克/升，乳化剂吐温-800～10克/升，pH 5～9。
所用的溶剂为十四酸异丙酯或十六酸异丙酯，该溶剂本身对菌体没有毒性，且不溶于水，可将水相中的产物萃取进入有机相中，以降低高浓度产物对酵母细胞的毒性，进而提高产量。按照本发明优选的技术方案，溶剂的加入时间为细胞培养开始后的0～30小时；
本发明所述的有机溶剂用量与转化培养基体积比为1∶1～5；
本发明实现了γ-癸内酯的生物转化合成与分离提取过程相耦合，在转化反应进行的同时，在转化体系中加入有机溶剂十四酸异丙酯或十六酸异丙酯，该有机溶剂的加入不影响酵母细胞生长，但可以将生成的γ-癸内酯不断的萃取到有机相中，从而降低水相培养基中的γ-癸内酯的浓度(发酵菌种存在于水相中)，减小γ-癸内酯对解脂耶氏酵母细胞的毒性，提高转化反应体系中的γ-癸内酯的浓度和转化率。
本发明采用转化与分离耦合的双液相技术，将生成的γ-癸内酯萃取进入十四酸异丙酯或十六酸异丙酯相中，使得γ-癸内酯的产量最高可达5.44克/升，比未添加十四酸异丙酯或十六酸异丙酯的单水相发酵提高了444％，不仅降低产物对菌体的影响大大提高γ-癸内酯产量，而且方便产物的提取，实现了产物的有效分离。所用溶剂价格低廉，且通过减压蒸馏可以在得到产品的同时，回收得到该溶剂，该溶剂回收后可以重复利用。此过程简单，可实现大规模工业化应用，具有良好的工业化前景。通过此工艺生产的γ-癸内酯气味纯正，按照欧盟法规定义(88/EEC/388)，属天然产品。
本发明的方法降低了产物对菌株催化活性的影响，避免产物被继续氧化，方便产物的提取，产品具有光学活性，可大规模工业化应用，具有反应条件温和、绿色天然、成本较低、环境友好等优点。
具体实施方式
以下实施例所用菌株和细胞培养按照上述方案所述，采用双液相体系的原位产物分离生物转化制备天然γ-癸内酯，下面进一步说明本发明的实施例。
实施例一：
本实施例的培养基配方为：
转化培养基：蓖麻油40克/升，蛋白胨10克/升，酵母粉10克/升，钾盐3.5克/升，钠盐15克/升，吐温-800.7克/升，pH 6.5。
斜面培养基配方为：
葡萄糖10克/升，钠盐5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏5克/升，琼脂20克/升，pH 7.0。液体种子培养基的配方为：葡萄糖30克/升，酵母粉10克/升，钾盐1.2克/升，钠盐0.35克/升，pH 6.5。
使用解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica As2.1405经过扩大培养的种子液，从活化的菌种斜面中挑取2环菌体到装有100毫升种子培养基的1000毫升的三角瓶中，于28℃恒温摇床中，180转/分钟培养24小时，得到符合要求的种子液。按体积百分比5％的接种量，将此种子液转接到装有100毫升转化培养基的1000毫升的三角瓶中，于28℃恒温摇床中，180转/分钟培养。细胞培养13小时后，向培养液中加入75毫升的十四酸异丙酯，转化64小时时γ-癸内酯产量达到最大值，水相中γ-癸内酯产量为0.02～0.08克/升，十四酸异丙酯相中γ-癸内酯产量为6.02～7.23克/升，将两相产物合并，折合到水相培养基中的浓度达到4.6～5.44克/升，与未添加十四酸异丙酯的单水相转化(0.98～1.02克/升)相比提高了360～444％。
实施例二：
与上述实施例一的步骤相同，所不同的是：细胞培养13小时后，向培养液中加入50毫升的十四酸异丙酯。转化48小时时γ-癸内酯产量达到最大值，水相中γ-癸内酯产量为0.02～0.08克/升，十四酸异丙酯相中γ-癸内酯产量为5.84～6.84克/升，将两相产物合并，折合到水相培养基中的浓度达到3～3.44克/升，与未添加十四酸异丙酯的单水相转化(0.98～1.02克/升)相比提高了200～244％。
实施例三：
与上述实施例一的步骤相同，所不同的是：细胞培养13小时后，向培养液中加入25毫升的十四酸异丙酯。转化48小时时γ-癸内酯产量达到最大值，水相中γ-癸内酯产量为0.0～0.1克/升，十四酸异丙酯相中γ-癸内酯产量为8.92～10.6克/升，将两相产物合并，折合到水相培养基中的浓度达到2.33～2.72克/升，与未添加十四酸异丙酯的单水相转化(0.98～1.02克/升)相比提高了133～172％。
实施例四：
与上述实施例一的步骤相同，所不同的是：转接入种子液后，向培养液中加入50毫升的十四酸异丙酯，于28℃恒温摇床中，180转/分钟培养。转化64小时时γ-癸内酯产量达到最大值，水相中γ-癸内酯产量为0.02～0.08克/升，十四酸异丙酯相中γ-癸内酯产量为6.3～7.48克/升，将两相产物合并，折合到水相培养基中的浓度达到3.23～3.76克/升，与未添加十四酸异丙酯的单水相转化(0.98～1.02克/升)相比提高了223～276％。
实施例五：
与上述实施例一的步骤相同，所不同的是：细胞培养18小时后，向培养液中加入50毫升的十四酸异丙酯。转化48小时时γ-癸内酯产量达到最大值，水相中γ-癸内酯产量为0.02～0.08克/升，十四酸异丙酯相中γ-癸内酯产量为5.78～6.62克/升，将两相产物合并，折合到水相培养基中的浓度达到2.97～3.33克/升，与未添加十四酸异丙酯的单水相转化(0.98～1.02克/升)相比提高了197～233％。
实施例六：
与上述实施例一的步骤相同，所不同的是：细胞培养13小时后，向培养液中加入50毫升的十六酸异丙酯，转化64小时时γ-癸内酯产量达到最大值，水相中γ-癸内酯产量为0.02～0.08克/升，十六酸异丙酯相中γ-癸内酯产量为5.54～6.84克/升，将两相产物合并，折合到水相培养基中的浓度达到2.85～3.44克/升，与未添加十六酸异丙酯的单水相转化(0.98～1.02克/升)相比提高了185～244％。
实施例七：
由上述实施例一至实施例六可知在转化过程中，产物基本萃取进入十四酸异丙酯或十六酸异丙酯相，水相中产物含量基本为零；通过此方法制备癸内酯，有机溶剂的加入不会影响酵母细胞生长，而且减小γ-癸内酯对酵母细胞的毒性，提高的γ-癸内酯的浓度和底物转化率。按此种工艺转化制备γ-癸内酯，转化结束得到含有γ-癸内酯的十四酸异丙酯或十六酸异丙酯相，通过减压蒸馏，不仅得到的天然γ-癸内酯产品，还可以回收得到溶剂十四酸异丙酯或十六酸异丙酯，该溶剂可以重复利用。对由本发明的方法得到的天然γ-癸内酯进行物化数据检测，纯度(GC)≥98.3％，旋光度
+38.12～+45.5度(理论值为+48.5度)，对映体过量率(e.e.％)：93.42％。
将上述实施例一至实施例六的主要数据总结于下表
根据上表数据可以得出下列结论：
1、本发明优选的菌种可以有效地转化底物(蓖麻油)生成产物γ-癸内酯；
2、双液相体系原位萃取技术在本发明中应用取得明显效果；
3、采用十四酸异丙酯或十六酸异丙酯作为原位萃取剂的双液相萃取技术应用在天然γ-癸内酯制备工艺中，产物γ-癸内酯的产量最高可提高四倍以上。
4、产物γ-癸内酯带有旋光性，这是生物转化法制备的独有特性，以此特性，可以有效地区分化学合成产物和生物转化生产的天然产物，即合成产物的旋光值为0，而生物法制备的产物具有旋光值。
Claims (1)
1.一种制备天然手性γ-癸内酯的方法，其特征在于使用解脂耶氏酵母Yarrowialipolytica As2.1405经过扩大培养的种子液，接种于转化培养基，以蓖麻油为底物进行生物转化制备天然γ-癸内酯，在转化过程中采用添加有机溶剂的双液相萃取原位产物分离技术，使生物转化合成与产物分离提取过程相耦合，提高了γ-癸内酯产量；所述种子液按如下步骤制备得到：将菌种接种于斜面培养基，经活化培养得到新鲜菌种，该菌种再接种于液体种子培养基，经过培养得到成熟的酵母种子液，所述斜面培养基配方为：葡萄糖10克/升，钠盐5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏5克/升，琼脂20克/升，pH7.0；液体种子培养基的配方为：葡萄糖30克/升，酵母粉10克/升，钾盐1.2克/升，钠盐0.35克/升，pH6.5；该生物转化过程以蓖麻油为底物，在有机溶剂存在的条件下进行摇床振荡培养，转速为100～200转/分钟，温度为20～40℃，转化时间为18～72小时，获得高浓度γ-癸内酯的转化液；所用的转化培养基配方为：蓖麻油10～60克/升，蛋白胨5～20克/升，酵母粉5～20克/升，钾盐1～10克/升，钠盐5～20克/升，乳化剂吐温-80 0～10克/升，pH5～9；转化过程中添加的有机溶剂为十四酸异丙酯或十六酸异丙酯，有机溶剂的添加时间为细胞培养开始后0～30小时，有机溶剂的体积用量与转化培养基体积比为1∶1～5。
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