CN102080109B - 双液相萃取的生物法制备天然手性γ-癸内酯的方法 - Google Patents
双液相萃取的生物法制备天然手性γ-癸内酯的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102080109B CN102080109B CN200910199593.8A CN200910199593A CN102080109B CN 102080109 B CN102080109 B CN 102080109B CN 200910199593 A CN200910199593 A CN 200910199593A CN 102080109 B CN102080109 B CN 102080109B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- decalactone
- grams per
- product
- per liters
- gama
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 title 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 6
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 claims abstract description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 5
- IFYYFLINQYPWGJ-UHFFFAOYSA-N gamma-decalactone Chemical compound CCCCCCC1CCC(=O)O1 IFYYFLINQYPWGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 142
- IFYYFLINQYPWGJ-VIFPVBQESA-N gamma-Decalactone Natural products CCCCCC[C@H]1CCC(=O)O1 IFYYFLINQYPWGJ-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 71
- AXISYYRBXTVTFY-UHFFFAOYSA-N Isopropyl tetradecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(C)C AXISYYRBXTVTFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- XUGNVMKQXJXZCD-UHFFFAOYSA-N isopropyl palmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(C)C XUGNVMKQXJXZCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 10
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 9
- ZEMPKEQAKRGZGQ-AAKVHIHISA-N 2,3-bis[[(z)-12-hydroxyoctadec-9-enoyl]oxy]propyl (z)-12-hydroxyoctadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCC(O)C\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CC(O)CCCCCC)COC(=O)CCCCCCC\C=C/CC(O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-AAKVHIHISA-N 0.000 claims description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 8
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 5
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 4
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract description 11
- 239000012071 phase Substances 0.000 abstract description 10
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 abstract 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 abstract 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 abstract 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 abstract 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 37
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 7
- 150000002596 lactones Chemical group 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 4-Butyrolactone Chemical compound O=C1CCCO1 YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 5
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 5
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 3
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 3
- 229930188620 butyrolactone Natural products 0.000 description 3
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 3
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- -1 hydroxy fatty acid Chemical class 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- WBHHMMIMDMUBKC-QJWNTBNXSA-N ricinoleic acid Chemical compound CCCCCC[C@@H](O)C\C=C/CCCCCCCC(O)=O WBHHMMIMDMUBKC-QJWNTBNXSA-N 0.000 description 2
- FEUQNCSVHBHROZ-UHFFFAOYSA-N ricinoleic acid Natural products CCCCCCC(O[Si](C)(C)C)CC=CCCCCCCCC(=O)OC FEUQNCSVHBHROZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003656 ricinoleic acid Drugs 0.000 description 2
- MIDXCONKKJTLDX-UHFFFAOYSA-N 3,5-dimethylcyclopentane-1,2-dione Chemical compound CC1CC(C)C(=O)C1=O MIDXCONKKJTLDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QQAVZEYXLCYOKO-UHFFFAOYSA-N 4-Hydroxycapric acid Chemical compound CCCCCCC(O)CCC(O)=O QQAVZEYXLCYOKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 235000011437 Amygdalus communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000675108 Citrus tangerina Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 241000823806 Sporidiobolus sp. Species 0.000 description 1
- 241000490645 Yarrowia sp. Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 description 1
- 125000003180 beta-lactone group Chemical group 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 235000013736 caramel Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000020197 coconut milk Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 125000000422 delta-lactone group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 125000000457 gamma-lactone group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 235000019605 sweet taste sensations Nutrition 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
- PHXATPHONSXBIL-UHFFFAOYSA-N xi-gamma-Undecalactone Chemical compound CCCCCCCC1CCC(=O)O1 PHXATPHONSXBIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
双液相萃取的生物转化制备天然手性γ-癸内酯的方法，采用解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica As2.1405，经过扩大培养的种子液，接种于转化培养基，以蓖麻油为底物，生物转化生产天然γ-癸内酯，在转化过程中采用添加有机溶剂的原位产物分离技术，将γ-癸内酯的生物转化合成与分离提取耦合起来，减小产物毒性、提高γ-癸内酯产量。有机溶剂相中γ-癸内酯产量比不添加溶剂的单水相转化制备提高了444％。所得产品纯度(GC)≥98.3％，旋光度
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物转化法生产天然γ-癸内酯的方法，属于生物技术领域。即采用双液相萃取的原位(in site)产物分离技术，生物转化天然原料---蓖麻油制备天然手性γ-癸内酯的方法。
技术背景
γ-癸内酯(gamma decalactone)，又名丙位癸内酯，是一种含有五元内酯环的十碳化合物。内酯可以看作是羟基酸分子内脱去一分子水的产物，由于生成酯的羟基和羧基处于同一分子内，故称为内酯，见下列反应式。
当n＝1时，称为乙位内酯，亦称β-内酯；当n＝2时，称为丙位内酯，亦称γ-内酯；当n＝3时，称为丁位内酯，亦称δ-内酯；当n＞12时，称为大环内酯，这类内酯具有麝香香气。
γ-癸内酯具有水果味、桃子味和典型的椰子香气，香气较桃醛轻飘，并以诱人的桃香和低香气阈值的特性，在香料工业得到了广泛的应用，主要用于配制奶油、桃子、柑橘和椰子等类型的香精。1969年，γ-癸内酯被美国食品药品管理局(FDA)认定是安全的食品添加剂和药物添加剂，FDA编号为172.515；我国食品添加剂国标GB2760规定为允许使用的食品香料；FEMA编号为2360。
γ-癸内酯天然存在于桃子、杏仁、草莓等水果中，具有强烈的果香香气，稀释时有桃子香气，在成熟的果实中，含量可达到15ppb，其中89％的是(R)-异构体，11％的是(S)-异构体。大量研究发现，右旋R型γ-癸内酯和左旋S-型γ-癸内酯的香气特征存在明显差异：左旋S-型γ-癸内酯的香气为柔和的、甜甜的椰奶味，有明显酯味特征；右旋R型γ-癸内酯为强烈的、脂甜的水果味，类似椰子，焦糖味。光学纯的γ-癸内酯味道偏甜，清新，有明显的水果甜味，不同对映体间的香气强度不一样，右旋体的香气较浓。由于手性内酯的香气特点，在配制高级食用香精时，选取特定构型的内酯可以得到高仿真的不同来源的香料，所以，手性γ-癸内酯的生产在香精香料行业中越来越受到重视。
γ-癸内酯的制备可以通过天然提取、化学合成、生物技术3种方法来实现。化学合成的内酯主要为无旋光的外消旋体；天然提取虽然可以得到某一光学异构体占优势的产品，但技术复杂、成本高，因而价格昂贵。生物技术方法可以使用廉价的原料生产具有光学活性(手性)的γ-癸内酯，转化条件相对温和、副产物少、环境污染小，因此越来越成为制药业、香料界关注的焦点。
利用生物技术生产γ-癸内酯普遍采用生物转化的方法，所利用的底物主要有羟基脂肪酸、脂肪酸酯和非羟基脂肪酸。生产菌种主要采用酵母菌，一般选用耶氏酵母(Yarrowia sp.)，假丝酵母(Candida sp.)，锁掷孢酵母(Sporidiobolus sp.)等菌株。比如，蓖麻油中的主要组分蓖麻油酸(12-羟基-9-十八碳烯酸，含量在80％以上)在酵母菌的作用下，经过多步β-氧化使碳链缩短，生成γ-癸内酯的直接前体4-羟基癸酸，再环化生成γ-癸内酯(见上述反应方程式，n＝2，R＝-C6H13)。
由于产物γ-癸内酯对酵母细胞有一定的毒性，当转化体系中γ-癸内酯达到一定浓度后就会抑制酵母的活性，从而限制了γ-癸内酯产生的浓度；另外，在γ-癸内酯生成后会继续β-氧化后降解，导致γ-癸内酯的得率比较低。虽然有文献报道，通过各种方法来提高γ-癸内酯的产量，但截至目前为止，还没有一个经济可行的生产工艺，这使生物技术制备天然γ-癸内酯仍未得到工业化应用。
发明内容
本发明针对生物法生产γ-癸内酯产量低等问题，提供一种采用双液相体系的原位产物分离生物法制备天然手性γ-癸内酯的方法。该方法不仅可以降低产物对菌体的影响，从而提高产量；而且在转化过程中产物全部由溶剂从水相萃取进入有机相中，实现产物的有效原位分离，方便产物的提取，简化了提取工艺。所使用的溶剂经过蒸馏后，可重复利用，从而降低生产成本。
为达到发明目的，本发明采用以下技术方案：
使用解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica As2.1405经过扩大培养的种子液，接种于转化培养基，以蓖麻油为底物，在转速100～200转/分钟、温度20～40℃条件下，生物转化18～72小时生产天然γ-癸内酯。在转化过程中采用添加有机溶剂的原位产物分离技术，减小产物毒性、提高γ-癸内酯产量。
其中所用转化培养基为：蓖麻油10～60克/升，蛋白胨5～20克/升，酵母粉5～20克/升，钾盐1～10克/升，钠盐5～20克/升，乳化剂吐温-800～10克/升，pH 5～9。
所用的溶剂为十四酸异丙酯或十六酸异丙酯，该溶剂本身对菌体没有毒性，且不溶于水，可将水相中的产物萃取进入有机相中，以降低高浓度产物对酵母细胞的毒性，进而提高产量。按照本发明优选的技术方案，溶剂的加入时间为细胞培养开始后的0～30小时；
本发明所述的有机溶剂用量与转化培养基体积比为1∶1～5；
本发明实现了γ-癸内酯的生物转化合成与分离提取过程相耦合，在转化反应进行的同时，在转化体系中加入有机溶剂十四酸异丙酯或十六酸异丙酯，该有机溶剂的加入不影响酵母细胞生长，但可以将生成的γ-癸内酯不断的萃取到有机相中，从而降低水相培养基中的γ-癸内酯的浓度(发酵菌种存在于水相中)，减小γ-癸内酯对解脂耶氏酵母细胞的毒性，提高转化反应体系中的γ-癸内酯的浓度和转化率。
本发明采用转化与分离耦合的双液相技术，将生成的γ-癸内酯萃取进入十四酸异丙酯或十六酸异丙酯相中，使得γ-癸内酯的产量最高可达5.44克/升，比未添加十四酸异丙酯或十六酸异丙酯的单水相发酵提高了444％，不仅降低产物对菌体的影响大大提高γ-癸内酯产量，而且方便产物的提取，实现了产物的有效分离。所用溶剂价格低廉，且通过减压蒸馏可以在得到产品的同时，回收得到该溶剂，该溶剂回收后可以重复利用。此过程简单，可实现大规模工业化应用，具有良好的工业化前景。通过此工艺生产的γ-癸内酯气味纯正，按照欧盟法规定义(88/EEC/388)，属天然产品。
本发明的方法降低了产物对菌株催化活性的影响，避免产物被继续氧化，方便产物的提取，产品具有光学活性，可大规模工业化应用，具有反应条件温和、绿色天然、成本较低、环境友好等优点。
具体实施方式
以下实施例所用菌株和细胞培养按照上述方案所述，采用双液相体系的原位产物分离生物转化制备天然γ-癸内酯，下面进一步说明本发明的实施例。
实施例一：
本实施例的培养基配方为：
转化培养基：蓖麻油40克/升，蛋白胨10克/升，酵母粉10克/升，钾盐3.5克/升，钠盐15克/升，吐温-800.7克/升，pH 6.5。
斜面培养基配方为：
葡萄糖10克/升，钠盐5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏5克/升，琼脂20克/升，pH 7.0。液体种子培养基的配方为：葡萄糖30克/升，酵母粉10克/升，钾盐1.2克/升，钠盐0.35克/升，pH 6.5。
使用解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica As2.1405经过扩大培养的种子液，从活化的菌种斜面中挑取2环菌体到装有100毫升种子培养基的1000毫升的三角瓶中，于28℃恒温摇床中，180转/分钟培养24小时，得到符合要求的种子液。按体积百分比5％的接种量，将此种子液转接到装有100毫升转化培养基的1000毫升的三角瓶中，于28℃恒温摇床中，180转/分钟培养。细胞培养13小时后，向培养液中加入75毫升的十四酸异丙酯，转化64小时时γ-癸内酯产量达到最大值，水相中γ-癸内酯产量为0.02～0.08克/升，十四酸异丙酯相中γ-癸内酯产量为6.02～7.23克/升，将两相产物合并，折合到水相培养基中的浓度达到4.6～5.44克/升，与未添加十四酸异丙酯的单水相转化(0.98～1.02克/升)相比提高了360～444％。
实施例二：
与上述实施例一的步骤相同，所不同的是：细胞培养13小时后，向培养液中加入50毫升的十四酸异丙酯。转化48小时时γ-癸内酯产量达到最大值，水相中γ-癸内酯产量为0.02～0.08克/升，十四酸异丙酯相中γ-癸内酯产量为5.84～6.84克/升，将两相产物合并，折合到水相培养基中的浓度达到3～3.44克/升，与未添加十四酸异丙酯的单水相转化(0.98～1.02克/升)相比提高了200～244％。
实施例三：
与上述实施例一的步骤相同，所不同的是：细胞培养13小时后，向培养液中加入25毫升的十四酸异丙酯。转化48小时时γ-癸内酯产量达到最大值，水相中γ-癸内酯产量为0.0～0.1克/升，十四酸异丙酯相中γ-癸内酯产量为8.92～10.6克/升，将两相产物合并，折合到水相培养基中的浓度达到2.33～2.72克/升，与未添加十四酸异丙酯的单水相转化(0.98～1.02克/升)相比提高了133～172％。
实施例四：
与上述实施例一的步骤相同，所不同的是：转接入种子液后，向培养液中加入50毫升的十四酸异丙酯，于28℃恒温摇床中，180转/分钟培养。转化64小时时γ-癸内酯产量达到最大值，水相中γ-癸内酯产量为0.02～0.08克/升，十四酸异丙酯相中γ-癸内酯产量为6.3～7.48克/升，将两相产物合并，折合到水相培养基中的浓度达到3.23～3.76克/升，与未添加十四酸异丙酯的单水相转化(0.98～1.02克/升)相比提高了223～276％。
实施例五：
与上述实施例一的步骤相同，所不同的是：细胞培养18小时后，向培养液中加入50毫升的十四酸异丙酯。转化48小时时γ-癸内酯产量达到最大值，水相中γ-癸内酯产量为0.02～0.08克/升，十四酸异丙酯相中γ-癸内酯产量为5.78～6.62克/升，将两相产物合并，折合到水相培养基中的浓度达到2.97～3.33克/升，与未添加十四酸异丙酯的单水相转化(0.98～1.02克/升)相比提高了197～233％。
实施例六：
与上述实施例一的步骤相同，所不同的是：细胞培养13小时后，向培养液中加入50毫升的十六酸异丙酯，转化64小时时γ-癸内酯产量达到最大值，水相中γ-癸内酯产量为0.02～0.08克/升，十六酸异丙酯相中γ-癸内酯产量为5.54～6.84克/升，将两相产物合并，折合到水相培养基中的浓度达到2.85～3.44克/升，与未添加十六酸异丙酯的单水相转化(0.98～1.02克/升)相比提高了185～244％。
实施例七：
由上述实施例一至实施例六可知在转化过程中，产物基本萃取进入十四酸异丙酯或十六酸异丙酯相，水相中产物含量基本为零；通过此方法制备癸内酯，有机溶剂的加入不会影响酵母细胞生长，而且减小γ-癸内酯对酵母细胞的毒性，提高的γ-癸内酯的浓度和底物转化率。按此种工艺转化制备γ-癸内酯，转化结束得到含有γ-癸内酯的十四酸异丙酯或十六酸异丙酯相，通过减压蒸馏，不仅得到的天然γ-癸内酯产品，还可以回收得到溶剂十四酸异丙酯或十六酸异丙酯，该溶剂可以重复利用。对由本发明的方法得到的天然γ-癸内酯进行物化数据检测，纯度(GC)≥98.3％，旋光度
+38.12～+45.5度(理论值为+48.5度)，对映体过量率(e.e.％)：93.42％。
将上述实施例一至实施例六的主要数据总结于下表
根据上表数据可以得出下列结论：
1、本发明优选的菌种可以有效地转化底物(蓖麻油)生成产物γ-癸内酯；
2、双液相体系原位萃取技术在本发明中应用取得明显效果；
3、采用十四酸异丙酯或十六酸异丙酯作为原位萃取剂的双液相萃取技术应用在天然γ-癸内酯制备工艺中，产物γ-癸内酯的产量最高可提高四倍以上。
4、产物γ-癸内酯带有旋光性，这是生物转化法制备的独有特性，以此特性，可以有效地区分化学合成产物和生物转化生产的天然产物，即合成产物的旋光值为0，而生物法制备的产物具有旋光值。
Claims (1)
1.一种制备天然手性γ-癸内酯的方法，其特征在于使用解脂耶氏酵母Yarrowialipolytica As2.1405经过扩大培养的种子液，接种于转化培养基，以蓖麻油为底物进行生物转化制备天然γ-癸内酯，在转化过程中采用添加有机溶剂的双液相萃取原位产物分离技术，使生物转化合成与产物分离提取过程相耦合，提高了γ-癸内酯产量；所述种子液按如下步骤制备得到：将菌种接种于斜面培养基，经活化培养得到新鲜菌种，该菌种再接种于液体种子培养基，经过培养得到成熟的酵母种子液，所述斜面培养基配方为：葡萄糖10克/升，钠盐5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏5克/升，琼脂20克/升，pH7.0；液体种子培养基的配方为：葡萄糖30克/升，酵母粉10克/升，钾盐1.2克/升，钠盐0.35克/升，pH6.5；该生物转化过程以蓖麻油为底物，在有机溶剂存在的条件下进行摇床振荡培养，转速为100～200转/分钟，温度为20～40℃，转化时间为18～72小时，获得高浓度γ-癸内酯的转化液；所用的转化培养基配方为：蓖麻油10～60克/升，蛋白胨5～20克/升，酵母粉5～20克/升，钾盐1～10克/升，钠盐5～20克/升，乳化剂吐温-80 0～10克/升，pH5～9；转化过程中添加的有机溶剂为十四酸异丙酯或十六酸异丙酯，有机溶剂的添加时间为细胞培养开始后0～30小时，有机溶剂的体积用量与转化培养基体积比为1∶1～5。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910199593.8A CN102080109B (zh) | 2009-11-27 | 2009-11-27 | 双液相萃取的生物法制备天然手性γ-癸内酯的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910199593.8A CN102080109B (zh) | 2009-11-27 | 2009-11-27 | 双液相萃取的生物法制备天然手性γ-癸内酯的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102080109A CN102080109A (zh) | 2011-06-01 |
| CN102080109B true CN102080109B (zh) | 2014-03-12 |
Family
ID=44086299
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200910199593.8A Active CN102080109B (zh) | 2009-11-27 | 2009-11-27 | 双液相萃取的生物法制备天然手性γ-癸内酯的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102080109B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107338196B (zh) * | 2017-06-29 | 2020-08-28 | 浙江诺睿特生物科技有限公司 | 一株解酯耶氏酵母菌株及其应用 |
| CN110499259B (zh) * | 2019-07-22 | 2021-07-27 | 浙江工业大学 | 一种解酯耶氏酵母yw100-1及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1324409A (zh) * | 1998-10-24 | 2001-11-28 | 哈尔曼及赖默股份有限公司 | 用于生产γ－癸内酯的方法 |
| CN101096692A (zh) * | 2007-07-12 | 2008-01-02 | 江南大学 | 一种制备γ-癸内酯及生物转化与分离耦合提高产量的方法 |
-
2009
- 2009-11-27 CN CN200910199593.8A patent/CN102080109B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1324409A (zh) * | 1998-10-24 | 2001-11-28 | 哈尔曼及赖默股份有限公司 | 用于生产γ－癸内酯的方法 |
| CN101096692A (zh) * | 2007-07-12 | 2008-01-02 | 江南大学 | 一种制备γ-癸内酯及生物转化与分离耦合提高产量的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 宋焕禄 等.耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)发酵蓖麻油制备γ-癸内酯的研究.《中 国 食 品 学 报》.2007,第7卷(第5期),102-107. |
| 微生物法生产γ-癸内酯的初步研究;闫淑芳 等;《生物加工过程》;20050831;第3卷(第3期);74-77 * |
| 耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)发酵蓖麻油制备γ-癸内酯的研究;宋焕禄 等;《中 国 食 品 学 报》;20071015;第7卷(第5期);102-107 * |
| 闫淑芳 等.微生物法生产γ-癸内酯的初步研究.《生物加工过程》.2005,第3卷(第3期),74-77. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102080109A (zh) | 2011-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101165168B (zh) | 一株链霉菌及利用其生物转化阿魏酸生产香兰素的方法 | |
| CN102220248B (zh) | 一种产生聚苹果酸的菌株及利用其发酵生产聚苹果酸的方法 | |
| CN103290071B (zh) | 一种2-酮基-l-古龙酸的制备方法 | |
| CN103243134A (zh) | 一种基于埃博霉素b代谢途径的发酵生产方法 | |
| CN102747008A (zh) | 一种食甲醇芽孢杆菌及其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法 | |
| CN102827895A (zh) | 一种偶联原位萃取樟芝活性产物Antrondin C的双液相发酵方法 | |
| CN102080109B (zh) | 双液相萃取的生物法制备天然手性γ-癸内酯的方法 | |
| CN109517740A (zh) | 一株紫色红曲霉诱变株和一种水溶性功能红曲及其制备方法和应用 | |
| US20180142270A1 (en) | Streptomyces psammoticus and methods of using the same for vanillin production | |
| CN106497824B (zh) | 一株高产苯乳酸的葡糖醋杆菌及其苯乳酸的制备方法 | |
| CN102080053A (zh) | 一株新解脂耶氏酵母及其用于生物转化蓖麻油制备γ-癸内酯的方法 | |
| CN101457214A (zh) | 一种假单胞菌的筛选方法及其转化生产表面活性剂的方法 | |
| CN103215197A (zh) | 桑肠杆菌及利用其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法 | |
| CN102115769B (zh) | 微生物同步发酵生产十八碳二元酸的方法 | |
| CN101857844B (zh) | 一株生物转化l-苯丙氨酸生成2-苯乙醇的酿酒酵母 | |
| CN103789358A (zh) | 一种采用樟芝深层发酵技术制备2-苯乙醇的方法 | |
| CN103695496A (zh) | 发酵生产他克莫司的方法 | |
| CN105586289B (zh) | 一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(-)γ-内酰胺的假单胞菌及其筛选和应用 | |
| CN101864456B (zh) | 生物转化l-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法 | |
| CN103014092A (zh) | 一种提高丝裂霉素c产率的制备方法 | |
| EP3901269A1 (en) | Method for preparing natural delta-decalactone and delta-dodecalactone by bioreduction of massoia oil | |
| CN102250978B (zh) | 一种发酵法生产2(5)-乙基-4-羟基-5(2)-甲基-3(2h)-呋喃酮的方法 | |
| CN101570766B (zh) | 高大毛霉催化转化肉桂酸生成天然苯乙酮和α-苯乙醇的方法 | |
| CN102115768A (zh) | 微生物同步发酵正十六烷生产十六碳二元酸的方法 | |
| CN107177508A (zh) | 一种生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SHANGHAI APPLE PLANT TECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20120120 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20120120 Address after: 201809 No. 33 Cao Xin Road, Shanghai, Jiading District Applicant after: Apple Flavor & Fragrance Group Co., Ltd. Co-applicant after: Shanghai Apple Plant Technology Co., Ltd. Address before: 201809 No. 33 Cao Xin Road, Shanghai, Jiading District Applicant before: Apple Flavor & Fragrance Group Co., Ltd. |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |