CN102676410A

CN102676410A - 一种高产丙位癸内酯的解脂耶氏酵母基因工程菌及制备方法和应用

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Publication number: CN102676410A
Application number: CN2012100657917A
Authority: CN
Inventors: 宋焕禄; 郭艳琼; 丁永志; 杜闪; 冯春利
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2012-03-14
Filing date: 2012-03-14
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明公开了一种解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)基因工程菌及制备方法和应用，选取野生菌株染色体中POX3基因作为靶基因，在敲除POX3基因同时将POX2及CRF1基因插入到其内部，使其完全丧失短链特异性酰基-CoA氧化能力(POX3基因编码)，同时多拷贝了编码长链特异性酰基-CoA氧化酶的POX2基因，获得的工程菌株产γ-癸内酯的能力得到极大增强。标记基因CRF1也来自出发菌株，故可确保其生物安全性。转化子Tp-12遗传稳定且由于其在发酵过程中γ-癸内酯产量降解效率不明显，故其可用于利用蓖麻油产丙位癸内酯(γ-癸内酯)的工业化连续发酵培养。

Description

一种高产丙位癸内酯的解脂耶氏酵母基因工程菌及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一株高产γ-癸内酯的Yarrowia lipolytica基因工程菌，同时涉及基因工程菌的构建方法及在工业发酵中的应用。

背景技术

γ-癸内酯(γ-decalactone，GDL)，广泛存在于水果、肉制品和日常食品中，其具有浓郁的果香香气，稀释后有桃子香气，是构成水果香味的关键成分。现已在120多种食物的香气成分中发现了γ-癸内酯。在成熟果实中，γ-癸内酯的含量可以达到15μg/kg，其中89％是(R)-异构体。在1969年，γ-癸内酯被美国食品药品管理局认为是安全的食品和药品添加剂。γ-癸内酯以其诱人的香气和低香气阈值(在水中仅为0.08mg/kg)的特性广泛用于各类花香、果香、东方香型、檀香型日化香精中，也可用于食品、烟草、饲料、食用香精中。

在γ-癸内酯的生物制备中可利用微生物尤其是酵母菌作为菌种，以蓖麻油中主要成分蓖麻油酸(12-羟基-9-十八碳烯酸)作为底物，先经过β-氧化使碳链缩短，再经内酯化即可生成γ-癸内酯。Tahara首次报道使用能够产生香味物质的酵母菌Sporobolomyces odorus生产得到γ-癸内酯。酵母菌一般选用假丝酵母(Candida sp.)、耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)、锁掷孢酵母(Sporidiobolus sp.)、毕赤酵母(Pichia sp.)等，其中以Yarrowia lipolytica降解蓖麻油产γ-癸内酯的能力最为显著。

β-氧化是指脂酰-CoA进入线粒体基质后，在脂肪酸β-氧化酶系催化下进行的氧化分解作用。酰基-辅酶A氧化酶(Acyl-CoA oxidase)、3-酮酰-辅酶A硫解酶(3-ketoacyl-CoA thiolase)及双功能酶(Bifunctional enzyme)是β-氧化反应过程中三个非常重要的酶，其中酰基-CoA氧化酶(Acyl-CoA oxidase)是β-氧化反应过程中的第一步催化酶，被普遍认为为限速酶，其活力高低与γ-癸内酯的产量有直接关系。

在Yarrowia lipolytica中酰基-CoA氧化酶有5个同工酶Aox1-Aox5，分别由POX1-POX5基因编码。研究发现，POX1基因在敲除后几乎没有看到酰基-CoA氧化酶的活性有所改变，Aox1对催化蓖麻油酸生产γ-癸内酯没有显著的促进或抑制作用；长链特异性酰基-CoA氧化酶Aox2能够特异性地催化蓖麻油酸生产γ-癸内酯，其多表达可促进γ-癸内酯产量的增加；短链特异性酰基-CoA氧化酶Aox3的存在会使γ-癸内酯进一步降解，产生更短碳链的脂类；POX4基因在敲除后没有发现对γ-癸内酯产量有大的影响，但是在同时敲除POX3、POX4基因后，γ-癸内酯产量却比单独敲除POX3基因时提高更大，故推测POX4基因可能作用是有助于POX3基因对短链γ-癸内酯的降解起到调节作用；POX5基因的破坏使得蓖麻油酸(C₁₈)第一步降解受到了影响，但影响不显著，从而推断Aox5对生成其他C₁₀产物(如3-羟基癸内酯、2-癸烯)和γ-癸内酯的降解有极其微弱的促进作用。同时Aox3的活性还可能受到其他3个同工酶Aox1、Aox4、Aox5的影响。

同源重组的发生依赖于载体与目的基因片段之间存在一定的DNA同源片段，同源片段越长则越有利于同源重组事件的发生。传统的同源重组载体的构建以DNA连接酶和限制性内切酶为基础，通过一系列的酶切连接反应将各片段连接在同一个载体上。但这种方法在连接过程中引入了不必要的酶切位点碱基序列，而且对于长片段的连接有时难以找到合适的酶切位点。为了克服传统的酶切连接方法的缺陷，出现了以聚合酶链式反应为基础的片段拼接技术，即融合PCR技术(Splice overlap extension PCR)。融合PCR技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下，采用具有互补末端的引物将不同来源的扩增片段连接起来，为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。现有的融合PCR技术一般包括两步PCR反应：(1)应用特异性的引物，对各片段进行单独的扩增，特异性引物的5′末端带有一段相邻片段的互补序列；(2)在同一反应体系中加入各片段的混合物，以一对外侧引物进行融合片段的全长扩增。融合PCR技术在应用过程中还存在缺陷，如融合产物长度一般不超过4.0kb、待融合片段的个数一般不超过3个、产物的特异性差等问题。

随着分子生物学的发展，基因敲除技术得到了快速发展，基于基因敲除技术构建重组菌株的方法也日渐成熟，且其安全性也更加可靠。这为高产γ-癸内酯Yarrowia lipolytica基因工程菌株的构建提供了可能性。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种Yarrowia lipolytica基因工程菌Tp-12。该菌种由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.5787，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。菌种保藏日期为2012年02月24日，分类命名为解脂耶氏酵母(拉丁名：Yarrowia lipolytica)。该菌株利用蓖麻油酸产γ-癸内酯的转化率高，成本低，遗传稳定，且由于没有外源基因插入，生物安全性很高，可用于γ-癸内酯的工业化生产。

本发明的目的之二是提供Yarrowia lipolytica基因工程菌制备方法的核心技术——融合PCR。该方法不用考虑限制性内切酶酶切位点对实验的影响，而只用多轮PCR即可将不同的基因融合在一起，从而可以很快捷地构建好用于同源重组的敲除组件，且重复性好。

本发明技术要点之三是利用酵母自身的铜抗性基因CRF1作为筛选标记，由于在构建过程中没有外源基因的插入所以转化子具有更高的生物安全性。Yarrowia lipolytica能够耐受较大浓度的铜离子，其铜离子抗性是S.cerevisiae的数倍，并且CRF1基因可编码铜-捕获转录因子，可捕获环境中的如铜离子等有毒金属离子，使得细胞可在含有大量金属离子的培养基中生长。不同Yarrowia lipolytica对铜离子的耐受度与其基因组内CRF1基因的拷贝数呈正比。由于CRF1基因的插入，转化子CRF1基因的拷贝数比野生型菌株更高，因而其对铜离子的抗性会明显提高。当将转化菌株和野生菌株分别接种至含不同铜离子浓度梯度的平板上时，铜离子浓度增高到一定水平，野生型菌株完全不能生长，而相比之下，能在此浓度或更高浓度铜离子培养基中正常生长的转化菌株就有可能是转化子。在本发明的一个实例中，很好的说明了这一点，从而筛选出成功敲除POX3基因的转化子。

本发明技术要点之四是利用石油醚对发酵液进行γ-癸内酯萃取而不是文献中所报道的乙醚。因为用乙醚萃取γ-癸内酯时发酵液中残留的蓖麻油也会进入到有机相乙醚中，在之后的操作中也不易将乙醚去除掉，而蓖麻油不易挥发，在进行气相检测时可能残留在气相柱中堵塞柱子并影响检测结果，所以我们选用石油醚作为萃取剂。γ-癸内酯易溶于石油醚而蓖麻油不溶于石油醚这样就可以有效的避免上述问题，同时用石油醚萃取γ-癸内酯时，在振荡过程中不易乳化，有机相与水相分层迅速。

本发明技术要点之五是对野生型菌株及转化子生长活力进行测定，发现转化子Tp-12以蓖麻油为主要碳源的发酵培养基中其生长活力明显低于野生型菌株。而在以葡萄糖为主要碳源的YEPD培养基中其生长活力变化不大。由此我们可以推断出POX3基因对消化脂类物质有重要作用，而对葡萄糖的分解影响不大。菌株的生长能力对γ-癸内酯的产量有一定影响。同时，通过比较转化子Tp-12生长曲线与γ-癸内酯生成曲线，我们发现当菌株生长达到稳定期后γ-癸内酯才开始迅速积累，在生产过程中我们可以通过优化底物添加时间进一步提高γ-癸内酯的产量。

本发明技术要点之六是通过气相检测可得到结果，野生型菌株γ-癸内酯的产量在70h时达到最大值0.9g/L，但随着发酵时间的增加γ-癸内酯会被进一步的降解为更短碳链的脂类，γ-癸内酯产量呈逐渐下降趋势，到120hγ-癸内酯几乎全部降解。敲除POX3基因并多表达POX2基因的重组菌株Tp-12在100h时γ-癸内酯的产量达到最大值2.9g/L，且产量稳定，发酵后期降解很小，可用于利用蓖麻油产γ-癸内酯的工业化连续发酵培养。γ-癸内酯产量的增长是由于完全阻断了C₁₀水平下的β-氧化使γ-癸内酯不会被降解，同时加强C₁₈水平的β-氧化以提高转化蓖麻油酸为γ-癸内酯的效率。

本发明技术要点之七是采用麦麸作为发酵培养基的生长碳源。麦麸作为一种廉价的原料应用于γ-癸内酯的生物技术制备，不但能大大降低生产成本，更为重要的是，麦麸作为生长碳源的同时，能极大的提高γ-癸内酯的产率。初步研究表明，麦麸的添加量作为影响γ-癸内酯产量的显著因素之一，可能是由于麦麸中含有丰富的阿魏酸、烟酸、肌醇等成分，它们有可能是促进蓖麻油生物转化成γ-癸内酯的重要影响因素。以麦麸为生长碳源，发酵周期约为72h，较普通发酵培养基周期大大缩短。当麦麸添加量为1.5％-2.5％时，经初步经优化后，γ-癸内酯的产量接近4g/L，远远超过以葡萄糖为碳源时的γ-癸内酯产量。以麦麸为碳源，还能极大的降低发酵过程中的乳化程度，从而能有效提高γ-癸内酯的分离提取效率。

实施例1.PCPP敲除组件的构建

1.野生型Yarrowia lipolytica基因组总DNA的提取。

2.利用SOE PCR技术进行PCPP敲除组件的构建。

由NCBI的Entrez检索系统，查知Yarrowia lipolytica酵母菌的POX3基因，CRF1铜抗性基因及POX2基因的全基因序列，并根据其CDS区的位置及启动子和终止子序列，用Primer premier 5.0软件设计其上游引物和下游引物。

POX3基因上段同源序列引物：

上游引物POX3-up-1：acaacaccttcacagagccacc

下游引物POX3-up-2：gaagacgagttgagacgaagactttcgcacccagtagtcgt

CRF1基因引物：

上游引物CRF1-1：acgactactgggtgcgaaagtcttcgtctcaactcgtcttc

下游引物CRF1-2：agagccgagggagaataaacggcgaaattggcggttggtat

POX2基因引物：

上游引物POX2-1：ataccaaccgccaatttcgccgtttattctccctcggctct

下游引物POX2-2：gattcccgtgcccgtattactctacccgcttgtctattcc

POX3基因下段同源序列引物：

上游引物POX3-down-1：ggaatagacaagcgggtagagtaatacgggcacgggaatc

下游引物POX3-down-2：accgaacccatactccac

利用PCR的方法扩增Yarrowia lipolytica POX3基因(GenBank登陆号AJ001301)上游同源序列，CRF1基因(GenBank登陆号Z23265)，POX2(基因GenBank登陆号AJ001300)，POX3基因下游同源序列。接着用SOE PCR的方法进行3轮PCR，构建敲除组件。

第一轮PCR

表1.POX3基因上游同源序列的PCR扩增反应体系：

反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸30s，循环30次；72℃最后延伸10min。

表2.CRF1基因的PCR扩增反应体系

反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸1min30s，循环30次；72℃最后延伸10min。

表3.POX2基因的PCR扩增反应体系

反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸2min20s，循环30次；72℃最后延伸10min。

表4.POX3基因下游同源序列的PCR扩增反应体系

第二轮PCR

表5.POX3-up-CRF1片段的PCR扩增反应体系

反应条件为：(1)反应体系中不加入引物POX3-up-1和CRF1-2，进行无引物PCR，94℃预变性4min；94℃变性40s，45℃梯度退火40s，72℃延伸1min30s，循环10次；72℃最后延伸10min；(2)向反应体系中加入引物并进行PCR，反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸2min，循环30次；72℃最后延伸10min。

表6.POX2-POX3-down片段的PCR扩增反应体系

反应条件为：(1)反应体系中不加入引物POX2-up和POX3-down-2，进行无引物PCR，94℃预变性4min；94℃变性40s，45℃梯度退火40s，72℃延伸2min20s，循环10次；72℃最后延伸10min；(2)向反应体系中加入引物并进行PCR，反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸2min40s，循环30次；72℃最后延伸10min。

第三轮PCR

表7.POX3-up-CRF1-POX2-POX3-down(PCPP)扩增反应体系

反应条件为：(1)反应体系中不加入引物POX2-up和POX3-down-2，进行无引物PCR， 94℃预变性4min；94℃变性40s，45℃梯度退火40s，72℃延伸2min45s，循环10次；72℃最后延伸10min；(2)向反应体系中加入引物并进行PCR，反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸4min10s，循环30次；72℃最后延伸10min。

3.回收目的片段PCPP，并与pMD18-T连接。将该重组质粒pMD18-PCPP转化到大肠杆菌DH5α中进行扩增。

实施例2.PCPP转化子的筛选

1.转化子的筛选

由于有CRF1基因的插入，转化子能在含更高浓度铜离子的平板上生长，以此进行转化子的筛选。分别将野生型菌株及转化菌株在铜离子浓度分别为2mM，4mM，8mM，10mM，12mM，14mM，16mM浓度梯度的平板上进行培养。当培养基中铜离子浓度达到8mM时，野生型菌株生长能力减弱，菌落变少，但转化菌株的平板上菌落数没有变化。当铜离子浓度达到12mM以上时，野生型菌株不生长，而转化菌株的平板上仍旧有菌落生长。

2.对可能的转化子进行分子生物学鉴定

将上一步高浓度铜离子平板上生长的单菌落Tp-1----Tp-20，接种至液体YEPD培养基中，28℃培养过夜。提取这些菌株的基因组，以这些菌株的基因组为模板，利用POX3基因的引物POX3-up-1和POX3-down-2进行PCR验证，PCR扩增体系及反应条件同POX3-up-CRF1-POX2-POX3-down(PCPP)扩增反应体系条件。PCR验证产物电泳图如图2所示，产物条带约为4.3kb，与预期相符，表明连接成功。

实施例3转化子的生长能力及生物转化能力测定

1.对转化子Tp-12及野生型菌株进行生长能力检测。

分别将转化子Tp-12菌株和野生型菌株种子接种至YEPD生长培养基和蓖麻油培养基中，蓖麻油培养基的组成为：蓖麻油1％～10％，酵母粉0.1％～1％，蛋白胨0.1％～1％，MgSO₄·7H₂O0.1％～1％，Na₂HPO₄ 0.1％～1％，KH₂PO₄ 0.01％～0.05％，吐温80 0.1％～1％，pH 6.5-7.5。培养条件为：装液量50mL/250mL，摇床转速180r/min，温度28℃。每隔4h取样一次，利用可见光-分光光度计测定600nm处吸收波长，作出吸光度与培养时间的关系曲线。

转化子Tp-12和野生型菌株在YEPD、蓖麻油培养基中的生长曲线如图3(a)、(b)所示，生长曲线表明，转化子Tp-12在以蓖麻油为主要碳源的发酵培养基中生长时，其生长活力明显低于野生型菌株。而在以葡萄糖为主要碳源的YEPD培养基中其生长活力变化不大。由此我们可以推断出POX3基因对消化脂类物质有重要作用，而对葡萄糖的分解影响不大。菌株的生长能力对γ-癸内酯的产量有一定影响。同时，通过比较转化子Tp-12生长曲线与γ-癸内酯生成曲线，我们发现当菌株生长达到稳定期后γ-癸内酯才开始迅速积累，在生产过程中我们可以通过优化底物添加时间进一步提高γ-癸内酯的产量。

2.转化子生物转化能力测定

对转化子Tp-12和野生型菌株在以葡萄糖为生长碳源的普通发酵培养基中产γ-癸内酯的能力以及转化子Tp-12在普通发酵培养基和麦麸发酵培养基中产γ-癸内酯的能力进行检测。其中麦麸发酵培养基的成分为：麦麸(100目)1％～3％，蓖麻油1％～10％，酵母粉0.1％～2％，MgSO₄·7H₂O 0.1％～1％，(NH₄)₂HPO₄ 0.1％～1％，KH₂PO₄ 0.1％～1％，吐温80 0.1％～1％，pH6.5-7.5；普通发酵培养基的组成为：蓖麻油1％～10％，葡萄糖3％～6％，酵母粉0.1％～1％，蛋白胨0.1％～1％，MgSO₄·7H₂O 0.1％～1％，Na₂HPO₄ 0.1％～1％，KH₂PO₄ 0.01％～0.05％，吐温800.1％～1％，pH 6.5-7.5。培养条件为：250mL三角瓶装液量为20mL，转速200r/min，接种量为8％，蓖麻油添加时间为20h。发酵24h后，每隔12h取样一次，测定发酵液中γ-癸内酯的浓度，作出γ-癸内酯的质量浓度与发酵时间的关系曲线。发酵液中γ-癸内酯的提取检测步骤如下：

(1)取发酵液20mL，4000rpm×10min离心，将上清液移至分液漏斗；

(2)按1∶2加入石油醚(40ml)，振荡5min，静置10min，待有机相和水相完全分层；

(3)将上相(有机相)倒出，并用无水硫酸钠脱水过滤后倒入圆底烧瓶中；

(4)用旋转蒸发仪在50℃条件下浓缩至2ml。

(5)γ-癸内酯的气相检测，检测条件如下：

色谱柱：美国Agilent公司Chiraldex^TM手性气相毛细管HP-INNOWAX(30m×0.32mm×0.25μm)；

气相检测升温程序：起始温度60℃以6℃/min升到150℃，保持1min 以13℃/min升到250℃，保持10min；

进样口温度：250℃；

分流比：10∶1；

FID检测器温度：300℃

转化子Tp-12在普通发酵培养基和麦麸培养基中γ-癸内酯的生成曲线如图4(a)、(b)所示。由(a)可知，在普通发酵培养基中，Tp-12菌株在前60h，γ-癸内酯的生成速率与野生型基本相同，但60h过后生成速率迅速提高，发酵至96h，产物质量浓度接近3g/L。而野生型菌株，发酵至72h后，γ-癸内酯的降解速率开始大于生成速率，产物积累量迅速下降。对照菌体生长曲线可知，前60h主要是菌体的快速增长期，60h后才是γ-癸内酯的快速积累期。由此可见，POX3基因的敲除以及POX2基因的多表达，对于γ-癸内酯高水平积累的影响是显著，从而证明了高产γ-癸内酯Yarrowia lipolytica基因工程菌的成功构建。

Yarrowia lipolytica基因工程菌Tp-12产γ-癸内酯的能力虽然有了大幅度的提升，但是发酵周期却延长了，这对于其工业化是相当不利的。而麦麸发酵培养基很好的弥补了这个不足。由(b)可知，Tp-12菌株在麦麸发酵培养基中，发酵48h后，产物的生成速率明显高于普通发酵培养基，并在72h左右得到最高的产量3.96g/L，虽然在72h后产物有所降解，但还是处于一个比较高的浓度水平。麦麸廉价易得，对于γ-癸内酯工业化生产也具有重要的意义。

Claims

1.一种Yarrowia lipolytica基因工程菌株Tp-12(CGMCC No.5787)，其特征在于敲除其染色体上的POX3基因的同时将POX2基因导入其内部以使转化菌株在POX3基因表达被阻断的同时可以多表达POX2基因。

2.一种用于权利要求1所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于运用了融合PCR(SOE PCR)的方法进行敲除组件的构建。

3.一种用于权利要求2所述的构建敲除组件的SOE PCR方法，其特征在于融合PCR的引物设计方法。

4.一种用于权利要求书1所述的基因工程菌株的筛选，其特征在于采用了菌株本身的铜抗性基因，保证了其生物安全性。

5.一种用于权利要求书1、4所述的基因工程菌在生产γ-癸内酯中的应用。

6.一种用于权利要求书5所述的基因工程菌在生产γ-癸内酯中的应用，其特征在于以麦麸为发酵培养基的生长碳源。