CN106811475A - 文蛤酚氧化酶基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents

文蛤酚氧化酶基因及其编码蛋白和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106811475A
CN106811475A CN201710186942.7A CN201710186942A CN106811475A CN 106811475 A CN106811475 A CN 106811475A CN 201710186942 A CN201710186942 A CN 201710186942A CN 106811475 A CN106811475 A CN 106811475A
Authority
CN
China
Prior art keywords
clam
oxidase
oxidase gene
seq
phenol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710186942.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106811475B (zh
Inventor
岳欣
刘保忠
张淑静
王鸿霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Oceanology of CAS
Original Assignee
Institute of Oceanology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Oceanology of CAS filed Critical Institute of Oceanology of CAS
Priority to CN201710186942.7A priority Critical patent/CN106811475B/zh
Publication of CN106811475A publication Critical patent/CN106811475A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106811475B publication Critical patent/CN106811475B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及分子生物学和生物工程技术领域，具体的说是一种文蛤酚氧化酶基因及其编码蛋白和应用。本发明从文蛤中克隆了酚氧化酶cDNA全长序列并原核重组表达了该蛋白，该文蛤酚氧化酶基因cDNA全长具有序列SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列，其编码的蛋白具有SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列，获得的重组酚氧化酶具有酶活性，具有大规模生产的可能，可以弥补天然蛋白量低以致难以满足需要的局限。鉴于酚氧化酶在贝类免疫及工业、食品等领域中的重要作用，本发明所介绍的文蛤酚氧化酶基因及其编码蛋白具有在相关领域的应用前景，同时可以作为备选的水产养殖贝类新型免疫增强剂。

Description

文蛤酚氧化酶基因及其编码蛋白和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和生物工程技术领域，具体的说是一种文蛤酚氧化酶基因及其编码蛋白和应用。
背景技术
酚氧化酶是一种含铜氧化酶，在有氧条件下，能把酚类氧化为醌类。酚氧化酶具有广泛的功能，在自然界中参与黑色素生成、表皮硬化、伤口愈合以及免疫防御等生理功能。酚氧化酶被认为是无脊椎动物免疫防御系统中最重要的免疫因子之一，能通过黑化作用参与病原的体内清除。其在贝类中的免疫重要性已被广泛报道，研究证实酚氧化酶参与鲍鱼、扇贝、牡蛎、蛤等多种贝类的免疫应答。另外，由于酚氧化酶的氧化产物为水，不产生过氧离子，被认为是一种绿色环保的氧化酶，已被应用在食品、工业、包装指示剂、污水处理等众多领域。
酚氧化酶的重要作用使其具有广泛的应用价值。文蛤是一种在沿海和滩涂地区广泛分布的双壳贝类，在我国沿海，文蛤作为一种重要的经济贝类而被广泛养殖。目前，还没有从文蛤中获得酚氧化酶基因的报道。
发明内容
本发明的目的是一种文蛤酚氧化酶基因及其编码蛋白和应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种文蛤酚氧化酶基因，文蛤酚氧化酶基因具有SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列。其是通过cDNA文库结合RACE技术从文蛤中克隆得到的酚氧化酶的cDNA序列，该序列全长2238bp，其中编码框2019bp，具体为SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列。
一种文蛤酚氧化酶基因的编码蛋白，所述文蛤酚氧化酶基因的编码蛋白为具有SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列，文蛤酚氧化酶基因所编码的蛋白共包含672个氨基酸
一种文蛤酚氧化酶基因构建方法，通过PCR扩增文蛤酚氧化酶基因，而后通过酶切位点连接到表达载体上，在IPTG诱导条件下，于宿主菌株中体外重组表达该蛋白，重组产物经纯化，即体外重组表达获得含有SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列的文蛤酚氧化酶重组蛋白。
所述表达载体为pGEX-4T-1；宿主菌株为大肠杆菌BL21；纯化采用纯化柱GSTrapFF。
一种文蛤酚氧化酶基因的应用，经铜离子处理后所述含有SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列的文蛤酚氧化酶重组蛋白在制备贝类的免疫增强剂中的应用。
本发明所具有的优点：
本发明从文蛤中克隆酚氧化酶cDNA全长序列并原核重组表达该蛋白，重组蛋白具有酚氧化酶活性，能够抑制文蛤治病副溶血弧菌的生长繁殖，可以作为备选的贝类免疫增强剂，同时也具有在工业、食品等其他相关领域的应用前景。本发明重组蛋白具有大规模生产的可能，可以弥补天然蛋白量低以致难以满足需要的局限。
附图说明
图1为本发明实施例2提到的纯化的文蛤酚氧化酶重组蛋白；其中，M：蛋白marker；1：IPTG诱导前总蛋白；2：IPTG诱导后总蛋白；3：亲和柱纯化后的文蛤酚氧化酶-GST重组融合蛋白。
具体实施方式
下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。
本发明利用cDNA文库和RACE技术从文蛤中扩增到文蛤酚氧化酶的cDNA全长序列2238bp，其中编码框2019bp，编码蛋白含有672个氨基酸。根据所得序列设计表达引物，扩增全长后经酶切连接到表达载体pGEX-4T-1中，之后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，经过IPTG诱导，然后经过GSTrap FF亲和柱纯化后得到重组酚氧化酶。经检测所重组的蛋白经过铜离子处理后具有酚氧化酶活性，同时重组蛋白能够对文蛤致病副溶血弧菌有抑制作用，可以作为备选的贝类免疫增强剂。
实施例1
文蛤酚氧化酶基因，具有序列表SEQ ID NO.1所示的序列。
SEQ ID NO.1(加粗部分为编码框序列，能够编码蛋白)
(a)序列特征：
●长度：141-2160bp
●类型：核苷酸序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：文蛤
本发明中的文蛤酚氧化酶的cDNA序列克隆包括下列步骤：
1)文蛤总RNA的提取及mRNA的纯化；
2)文蛤cDNA文库构建；
3)文蛤cDNA文库EST序列的大规模测定；
4)文蛤EST序列的同源性分析及酚氧化酶基因片段的筛选；
5)RACE扩增获得文蛤酚氧化酶的全序列以及全序列的验证。
具体操作如下：
1.文蛤总RNA的提取及mRNA的纯化：利用Invitrogen公司的Trizol试剂从文蛤幼虫中提取总RNA，利用QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒纯化mRNA。
2.文蛤cDNA文库构建：利用Stratagene公司cDNA Synthesis Kit和Synthesis Kit(Stratagene)进行cDNA的合成，双链cDNA经末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切后利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose GelExtraction Kit对大于100bp的酶切片段进行回收，与Invitrogen公司Uni-ZAP XR vector载体连接，利用Stratagene公司的III Gold Cloning Kit试剂盒进行文库包装，利用Exassist Helper Phage和SOLR菌株从XR Vector上体外切割pBluescript成为质粒文库。
3.文蛤cDNA文库EST序列的大规模测定：文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物T3在MegaBACE1000测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件(*.abi，*.abd文件)数据经Phred程序处理转化为序列文件(*.seq)和质量文件(*.seq.qual)，依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13(准确率大于95％)且长度大于100bp的序列作为EST数据，具体《基因表达序列标签(EST)数据分析手册》(胡松年著，浙江大学出版社，2005年)。
4.文蛤EST序列的同源性分析及酚氧化酶基因片段的筛选：将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons，分别将所获的Contigs与Singletons在数据库中进行BLASTn和BLASTx分析，结果显示在EST序列中发现了与菲律宾蛤仔(Venerupis philippinarum)，紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)和长牡蛎(Crassostrea gigas)酚氧化酶相似性较高的序列，根据相似性分析结果确定了文蛤酚氧化酶基因的EST序列。
5.文蛤酚氧化酶基因cDNA全长序列的克隆：根据与酚氧化酶基因同源的EST序列设计特异性引物F1和R1，分别利用载体通用引物T3和T7进行3’和5’末端的RACE扩增。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒(Promega,USA)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，然后转化大肠杆菌感受态细胞Top10，挑选阳性克隆用载体引物M13-47和M13-48进行测序，所得结果经BioEdit软件拼接，得到文蛤酚氧化酶全长序列见SEQ ID NO.1。
所使用的引物序列如下：
F1：5’ATC CAA CTA CCG ACT TCC CAC 3’
R1：5’TGC GTT TTC CAT CAC TAC AAG G 3’
T3：5’ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA 3’
T7：5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3’
6.文蛤酚氧化酶基因cDNA全长的验证：在测序拼接的酚氧化酶全长序列上设计一对引物F2和R2以cDNA为模板进行全长的验证。测序以及分析同步骤5.。
所使用的引物序列如下：
F2：5’AGG CGG AGT TAA TTC GTG CTA 3’
R2：5’TGT GTG TTA GGA AAT AAG CGG C 3’
所述步骤5.中3’RACE扩增所用反应体系及反应条件：
25μl反应体系，包含：
扩增所用PCR反应程序：94℃变性4min，1个循环；94℃变性50s，56℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃保温。
所述步骤5.中5’RACE扩增所用反应体系及反应条件：
25μl反应体系，包含：
扩增所用PCR反应程序：94℃变性4min，1个循环；94℃变性50s，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃保温。
所述步骤6.中全长验证的PCR反应体系和反应条件为：
25μl反应体系，包含：
扩增所用PCR反应程序：94℃变性4min，1个循环；94℃变性50s，57℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃保温。
实施例2.文蛤酚氧化酶重组蛋白的获得
根据SEQ ID NO.1对应的编码框的cDNA序列，设计含有限制性内切酶BamH I和SalI酶切位点的特异性引物BamH I-F和Sal I-R，通过PCR技术扩增编码酚氧化酶的基因片段，然后通过酶切将其克隆到pGEX-4T-1表达载体中，转化大肠杆菌BL21，测序确认表达框正确后，接种阳性克隆到含有氨苄青霉素(100mg/ml)的LB培养基中，37℃振荡培养至O.D.600＝0.4-0.6，加入IPTG至终浓度为1mM诱导4小时后离心收集菌体。菌体在冰浴条件下用超声波200W处理30－60分钟(每次1秒，间隔1秒)。离心去掉上清，沉淀(含有重组蛋白包涵体)用Buffer A洗3次，Buffer B洗3次，然后加入10－20ml Buffer C在37℃摇床中震荡20－30min，溶解沉淀，将其转移到透析袋中，4℃条件下，在梯度尿素透析液(透析液中分别含4M，2M，0M尿素)中透析，使重组蛋白复性。利用GE公司的GSTrap FF亲和柱纯化重组产物，得到文蛤酚氧化酶的GST重组蛋白，分子量约为103.2kDa如附图1显示。
所使用的引物序列：
BamH I-F：5’CGC GGA TCC ATG AAA ATC CTC GTG GCT GC 3’
Sal I-R：5’ACG CGT CGA CCT ACC ACG GCC AAA ACG ACT 3’
所用的溶液的组成：
Buffer A：50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.1％TritonX-100
Buffer B：50mM Tris-HCl，5mM EDTA，2M尿素
Buffer C：100mM Tris-HCl，10mM DTT，8M尿素
透析液：100mM Tris-HCl，5mM EDTA，5mM半胱氨酸
获得的文蛤酚氧化酶重组蛋白是酚氧化酶与GST的融合表达蛋白，其中酚氧化酶具有SEQ ID NO.2中所示的序列。
SEQ ID NO.2
MKILVAAIFCLSSAFAKITEIALPRDVYTCFERELERSNVTNSIGEVIFSRCVHKVLWAKQTPKLTEQPLGTDAMKWISGLVDMSHILDFQTGSTDQDVRPRPRRQAFRNQSERVQGQMQLGPGQTGRRRQTLRRQPRVRKEYRMLTDRERFMFHRALNMLKADTSVSPNKFDALGRLHFMSVGRAHFGPNFLPWHRLFLVVMENALREKIPSVTIPYWDSTLDDPLLDPRSSILWTPDFLGQANGYVIDGPFANWDTPTGRLVRYSGTGGTMMNWTYIYNVFRQNHLEEITDPYAKPDNNLEDHHNQLHTWVGGHMAPPALAAFDPVFYMLHSYIDLLWEIFRGLQKRRGIDPTTDFPRNITEIPDGQRYEDPSGFGNLLNRHGLSNVFTDNIYKYERPPTCTVQNPNCGTENLRCDTSGTRPKCVSASIFDIRTLLLPSGLPMEGGSGIRELRSPTSRERRKHAKIFEMIQQVSNVQCQPSNVNEKYINNFDIDGVIDEKNWAYIPVQVIYKNQKLNRQGQNLNTIYDICKRNTSSELPSRIFVESNGLNYNGMYKDIAHFKNDLLTSSSLAYVGVKKPTTEAHSDVLVSGYDECGRICQPFCLDGTYTRNRKCHGAIRITNSVPLMHGNDVKSAVKMIWQEDRYGLPYIVENEIFITLLCETSQSFWPW-
(a)序列特征：
●长度：672
●类型：氨基酸序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：文蛤
结构特点：属于酪氨酸酶超家族，具有铜离子结合中心
实施例3.文蛤酚氧化酶重组蛋白的活性检测
利用蛋白浓度测定试剂盒2-D Quant Kit(GE Healthcare,UK)对重组的酚氧化酶-GST融合蛋白进行浓度测定。
文蛤酚氧化酶重组蛋白的活性测定以L-DOPA(sigma)为特异性底物，采用改进的Ashida等的方法在酶标板中进行。具体为：将50μl收集到的上述实施例获得重组蛋白溶液加入酶标板中，然后加入100μl的0.1M(pH 6.0)的磷酸钾缓冲液和20μl的L-DOPA水溶液(0.01M)，振荡20秒混匀后，使用TECAN M1000Pro酶标仪检测在490nm下的吸光值OD490，40分钟内每隔4分钟测定一次。每分钟增加0.001为1个酶活力单位，结合蛋白浓度测定结果，重组蛋白的酶活性以U mg-1protein表示。结果显示，获得的文蛤酚氧化酶重组蛋白的酶活性约为0.1U mg-1protein，活性较低。为了获得活性较高的重组蛋白，对上述实施例纯化后的重组蛋白进行活性激活处理，即将上述实施例纯化后重组蛋白加入终浓度50μM的CuCl2，室温孵育15min后，重新按上述方法进行酶活测定，结果显示，处理后的重组蛋白的酶活性提高到12U mg-1protein，而单独用50μM的CuCl2进行检测没有显示酶活性。
实施例4.文蛤酚氧化酶重组蛋白对文蛤致病菌的抑菌活性
酚氧化酶参与黑化作用，能够参与免疫应答，清除体内病原菌。本实施例中，选取之前分离鉴定的文蛤强致病菌副溶血弧菌，将其在海水培养基中25℃扩大活化培养20小时(h)，检测620nm下的吸光值OD620，将细菌培养液离心去上清，用灭菌的PBS缓冲液重悬至OD620为1，即菌浓度约为5×108CFU/ml，取此菌重悬液10μl分别与100μl经过CuCl2处理的上述实施例获得重组酚氧化酶溶液(CuCl2处理方式按照实施例3中的记载进行)和100μl对照溶液(不含重组酚氧化酶)混匀，25℃孵育1h，加入2ml海水培养基后继续25℃摇床孵育，5h内每隔1h测定620nm下的吸光值OD620。结果如下表所示，经过酚氧化酶重组蛋白处理能有效抑制文蛤致病副溶血弧菌的生长，因此所制备的文蛤酚氧化酶重组蛋白具有文蛤等贝类免疫增强剂的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 文蛤酚氧化酶基因及其编码蛋白和应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 2238
<212> DNA
<213> 文蛤
<220>
<221> cDNA
<222> (141)..(2160)
<223>
<400> 1
aaataagaca cgtttgaagg cggagttaat tcgtgctaat ttgaacatat tttcattgtt 60
tcaaacgggg aatgaaaatg gagtgacaaa ctggataaaa tgtttccgta gtaactttaa 120
actgcagtta caaaagaaag atgaaaatcc tcgtggctgc cattttctgc ttgtcgtctg 180
catttgcaaa aattacagaa attgctctac cgcgagatgt ttacacgtgc ttcgaacgtg 240
agctcgaacg atctaacgtc acaaactcta ttggtgaagt gatattttcg agatgcgtcc 300
ataaagtttt atgggccaaa caaacaccaa agttgacgga acagcctctt ggaaccgacg 360
caatgaagtg gatatccgga cttgttgata tgagtcatat actggatttc caaaccggaa 420
gtacagacca agacgttaga ccccgtccaa gacgacaggc ttttagaaac cagtctgaac 480
gagtacaagg ccaaatgcag ttgggcccag gccagactgg aagacgacga cagacgttga 540
ggcgtcaacc gagagtgaga aaagagtacc ggatgcttac agacagagaa aggtttatgt 600
ttcacagagc actaaatatg ctgaaagcag acacgtcagt gtcaccaaac aagttcgacg 660
ctcttggtcg ccttcatttt atgtcagtcg gtcgggctca ctttggacca aatttcctac 720
catggcacag actcttcctt gtagtgatgg aaaacgcatt aagggaaaaa attccatcgg 780
tcactatacc atactgggac tctaccctag atgaccctct gcttgacccc agatcatcca 840
ttctctggac acctgacttc cttggacagg caaatggata tgtcatcgac ggtccttttg 900
ctaactggga cactccgacc ggacggctgg ttcgatattc tggtacaggt ggcacgatga 960
tgaactggac gtacatctac aatgtgttca gacaaaatca tttggaggag ataacggacc 1020
cttatgccaa gcccgataac aatctggaag accaccataa tcagttgcat acttgggtgg 1080
gtggccacat ggctccaccg gctcttgcag catttgatcc ggtgttctat atgttacatt 1140
cttacataga cttactttgg gaaatattca ggggtctaca gaaacgtcga ggaattgatc 1200
caactaccga cttcccacgg aatatcacgg agattcccga tggtcaaaga tacgaagatc 1260
cctcaggttt cggaaatctt ttaaatagac atggactaag taatgtgttt acagataaca 1320
tatacaagta cgaacgcccg cccacgtgta cagttcaaaa tcctaattgt ggaacggaaa 1380
acttacgatg tgacacttcc ggtacgcgcc caaaatgtgt ttctgcttcg atcttcgata 1440
tcaggacatt gctgttaccc agtgggttac ctatggaagg agggtctggg attcgggagt 1500
taaggagtcc tacttcccga gagagaagaa aacatgcaaa aatatttgaa atgatacagc 1560
aggtatccaa tgttcaatgt caaccaagca acgtcaatga aaaatacatc aataactttg 1620
acatagatgg tgttatagat gaaaagaatt gggcttatat accggtgcaa gtaatttata 1680
agaaccaaaa acttaacaga caagggcaaa atttaaatac gatttatgac atttgtaaac 1740
ggaataccag ttcagagtta ccttcgagga tatttgtcga gtcaaacggc ttaaactata 1800
acggtatgta taaagatatt gcgcatttca aaaatgactt gcttacttcg tcgtcattag 1860
cctacgttgg tgttaaaaag ccaacgacgg aggcgcacag tgacgtgttg gtgagtggtt 1920
acgacgaatg cggtcgcata tgtcagccat tttgtttgga cggcacatat accagaaacc 1980
ggaaatgtca cggcgctatc cgtataacga atagtgtgcc actgatgcac ggaaatgacg 2040
tcaaatctgc tgtaaaaatg atctggcaag aagacagata cggccttcca tatattgttg 2100
aaaatgaaat atttatcact cttttgtgcg aaacgtccca gtcgttttgg ccgtggtagg 2160
ccgcttattt cctaacacac agaatattta tacaatacat gtacgttcga gacgacactg 2220
taaaaaaaaa aaaaaaaa 2238

Claims (5)

1.一种文蛤酚氧化酶基因，其特征在于：文蛤酚氧化酶基因具有SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列。
2.一种权利要求1所述的文蛤酚氧化酶基因的编码蛋白，其特征在于：所述文蛤酚氧化酶基因的编码蛋白为具有SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列。
3.一种权利要求1所述的文蛤酚氧化酶基因体外重组表达方法，其特征在于：通过PCR扩增文蛤酚氧化酶基因，而后通过酶切位点连接到表达载体上，在IPTG诱导条件下，于宿主菌株中体外重组表达该蛋白，重组产物经纯化，即体外重组表达获得含有SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列的文蛤酚氧化酶重组蛋白。
4.按权利要求3所述的文蛤酚氧化酶基因体外重组表达方法，其特征在于：所述表达载体为pGEX-4T-1；宿主菌株为大肠杆菌BL21；纯化采用纯化柱GSTrap FF。
5.一种权利要求1中所述的文蛤酚氧化酶基因的应用，其特征在于：经铜离子处理后所述含有SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列的文蛤酚氧化酶重组蛋白在制备贝类的免疫增强剂中的应用。
CN201710186942.7A 2017-03-27 2017-03-27 文蛤酚氧化酶基因及其编码蛋白和应用 Active CN106811475B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710186942.7A CN106811475B (zh) 2017-03-27 2017-03-27 文蛤酚氧化酶基因及其编码蛋白和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710186942.7A CN106811475B (zh) 2017-03-27 2017-03-27 文蛤酚氧化酶基因及其编码蛋白和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106811475A true CN106811475A (zh) 2017-06-09
CN106811475B CN106811475B (zh) 2020-06-09

Family

ID=59115562

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710186942.7A Active CN106811475B (zh) 2017-03-27 2017-03-27 文蛤酚氧化酶基因及其编码蛋白和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106811475B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921788A (zh) * 2010-06-04 2010-12-22 中国科学院海洋研究所 文蛤溶菌酶基因及其编码蛋白和应用
CN102051370A (zh) * 2009-10-30 2011-05-11 中国科学院海洋研究所 文蛤组织蛋白酶b基因及编码蛋白和应用
CN102051363A (zh) * 2009-10-30 2011-05-11 中国科学院海洋研究所 文蛤铁蛋白基因及编码蛋白和其体外重组表达产物的应用
CN103849624A (zh) * 2012-12-05 2014-06-11 中国科学院海洋研究所 文蛤DNA结合抑制因子mmID2基因及其编码蛋白和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102051370A (zh) * 2009-10-30 2011-05-11 中国科学院海洋研究所 文蛤组织蛋白酶b基因及编码蛋白和应用
CN102051363A (zh) * 2009-10-30 2011-05-11 中国科学院海洋研究所 文蛤铁蛋白基因及编码蛋白和其体外重组表达产物的应用
CN101921788A (zh) * 2010-06-04 2010-12-22 中国科学院海洋研究所 文蛤溶菌酶基因及其编码蛋白和应用
CN103849624A (zh) * 2012-12-05 2014-06-11 中国科学院海洋研究所 文蛤DNA结合抑制因子mmID2基因及其编码蛋白和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU B. ET AL.: "EM_TSA:JI264356", 《EMBL-EBI》 *
LIU B. ET AL.: "EM_TSA:JI271832", 《EMBL-EBI》 *
PIN HUAN ET AL.: "Transcriptomic Analysis of the Clam Meretrix meretrix on Different Larval Stages", 《MARINE BIOTECHNOLOGY》 *
井岩: "文蛤SNP位点的开发和酪氨酸酶基因的克隆及表达分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
王雷等: "甲壳动物体液免疫研究进展", 《海洋科学》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106811475B (zh) 2020-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ishida et al. Polymorphic sequence in the D‐loop region of equine mitochondrial DNA
Khramtsov et al. Virus‐like, double‐stranded RNAs in the parasitic protozoan Cryptosporidium parvum
He et al. A goose-type lysozyme gene in Japanese scallop (Mizuhopecten yessoensis): cDNA cloning, mRNA expression and promoter sequence analysis
WO2006017960A1 (fr) Enzyme de détoxification ayant une activité consistant à transformer l&#39;aflatoxine et gène codant pour celle-ci
CN107937406B (zh) 一种三疣梭子蟹新型Crustin基因及其重组蛋白的应用
CN101525617B (zh) 中华绒螯蟹Crustin-1基因及体外重组表达
CN101268186B (zh) 新的内切核糖核酸酶
CN106519023A (zh) 一种嗜冷酵母金属硫蛋白的基因克隆、表达方法及应用
CN106831972B (zh) 弹涂鱼多型卵黄蛋白原Vtg基因全长序列及其克隆方法
CN110317813B (zh) 三疣梭子蟹C型凝集素PtCLec2基因及其编码蛋白和应用
CN108558994B (zh) 三疣梭子蟹C1q受体PtgC1qR基因及其编码蛋白和应用
CN106811475A (zh) 文蛤酚氧化酶基因及其编码蛋白和应用
CN101228273B (zh) 新的核糖核酸内切酶
CN101268187B (zh) 新的核糖核酸内切酶
CN101921788B (zh) 文蛤溶菌酶基因及其编码蛋白和应用
Ram et al. Stage-specific alternative splicing of the heat-shock transcription factor during the life-cycle of Schistosoma mansoni
CN101121935B (zh) 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI基因及其编码蛋白和应用
CN106755021B (zh) 文蛤多巴脱羧酶基因及其编码蛋白和应用
CN108251440B (zh) 缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法和应用
CN101565703A (zh) 中华绒螯蟹Crustin-2基因及其重组蛋白的应用
CN109628477A (zh) 一种超深渊来源溶菌酶及其制备方法
US9051559B2 (en) Peptide with the enzymatic activity of a Dicer-like protein, a method for preparing short RNA molecules, and use thereof
Hata et al. Analysis of carrot genes for proliferating cell nuclear antigen homologs with the aid of the polymerase chain reaction
Yamamoto et al. Calnexin: its molecular cloning and expression in the liver of the frog, Rana rugosa
CN107418961A (zh) 家蝇酚氧化酶原激活酶1基因及其重组蛋白与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant