CN104327168B - 一种小分子多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小分子多肽，所述小分子多肽包含：(a)小分子多肽氨基酸序列：SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；(b)在(a)限定的小分子多肽中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与(a)所述多肽具有相同生物学功能的由(a)衍生的多肽；所述小分子多肽分子量为2434.99g/mol，等电点为11.6；其可应用于制备抗菌和促进成骨细胞生长的材料中。本发明是一种小分子多肽，稳定性强，结构易于调控，易于与其它化合物结合，可以简单应用于各种形式的材料，具有良好的抗菌能力，同时具备促进成骨细胞生长的能力，无毒害作用，具有很明显的应用潜力，这种小分子多肽与大分子多肽相比合成方法简便，易于大规模生产。

Description

一种小分子多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种小分子多肽及其应用。

背景技术

牙种植体，是通过外科手术的方式将其植入人体缺牙部位的上下颌骨内，待其手术伤口愈合后，在其上部安装修复假牙的装置。种植牙的核心关键在于种植体部分，种植体部分相当于真牙的牙根，对于整个牙齿的固定起到了至关重要的作用。

牙种植体按其材料不同，分为金属与合金材料类，陶瓷材料类，碳素材料类，高分子材料类，复合材料类。

随着医疗技术发展，牙种植体和骨种植体等种植材料被广泛应用在牙列缺损、骨头损失等疾病治疗。然而该类手术的感染率很高，可能会导致大量抗生素治疗、去除种植体甚至死亡等严重后果。种植体相关感染高发的主要原因有两点：菌斑在种植体表面聚集和种植体骨结合界面抵抗能力低下。为了避免种植体相关感染，移植物应具有两方面的优良性能：优异的抗菌性能和促进成骨细胞生长功能。

因此，寻找具有以上两种性能的化合物用于提高种植体性能和预防种植体相关感染是很有必要的。多肽分子结构由氨基酸组成，通常在人体内生物相容性良好，对人体不产生刺激。因此，开发具有抗菌和促进成骨细胞生长作用的多肽，对于疾病的治疗和生命的挽救具有很重要的意义。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种具有抗菌和促进成骨细胞生长的小分子多肽。本发明目的之二在于提供该小分子多肽在制备抗菌和促进成骨细胞生长的材料中的应用。

本发明提供的技术方案为：

一种小分子多肽，所述小分子多肽包含：

(a)小分子多肽氨基酸序列：SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；

(b)在(a)限定的小分子多肽中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与(a)所述多肽具有相同生物学功能的由(a)衍生的多肽。

优选的是，所述小分子多肽分子量为2434.99g/mol。

优选的是，所述小分子多肽等电点为11.6。

优选的是，其在制备抗菌和促进成骨细胞生长的材料中的应用。种植体的钛表面可用连接子预处理，并且可将含有-SH基团的氨基酸(例如半胱氨酸)引入本发明小分子多肽的N末端或C末端中，以结合所述连接子的官能团。也可用连接子对钛表面预处理后连接多肽中的-NH₂基团，将多肽连接在钛表面。举例来说，结合连接子，本发明小分子多肽在N末端含有半胱氨酸以便借助于连接子与半胱氨酸之间的相互作用容易地被引入种植体中。另外，为了将本发明小分子多肽稳定地引入种植体的钛(Ti)表面中，优选利用硅烷-连接子-肽的连接关系将这些小分子多肽引入种植体表面中。这样处理得到的钛金属可作为牙种植体和骨种植体使用，由于其优异的抗菌性能和促进成骨细胞生长功能，对于避免种植体细菌感染和挽救病人生命有重大意义。

此外，本发明的小分子多肽也可简单应用于其他日常使用的材料表面，如塑料、玻璃和其他金属表面，可有效预防日常接触引起的细菌感染。

本发明的有益效果是本发明提供的一种小分子多肽，具有良好的抗菌能力，对于多种菌种均能有效杀菌，并且杀菌效果能达到99％；同时本发明的小分子多肽具备提高成骨细胞活性的能力，促进成骨细胞分化能力的作用；通过细胞毒性分析，可知利用本发明制作的材料无毒，作用于人体不会造成健康危害；本发明提供了一种小分子多肽，稳定性强，结构易于调控，易于与其它化合物结合，可以简单应用于各种形式的材料，具有很明显的应用潜力，易于大规模生产。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“氨基酸”意指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使它的分子具有生化活性。蛋白质是生物体内重要的活性分子，包括催化新陈代谢的酶，两个或两个以上的氨基酸化学聚合成肽，一个蛋白质的原始片段，是蛋白质生成的前体，氨基酸广义上是指既含有一个碱性氨基又含有一个酸性羧基的有机化合物，正如它的名字所说的那样。但一般的氨基酸，则是指构成蛋白质的结构单位。在生物界中，构成天然蛋白质的氨基酸具有其特定的结构特点，即其氨基直接连接在α-碳原子上，这种氨基酸被称为α-氨基酸。在自然界中共有300多种氨基酸，其中α-氨基酸21种。α-氨基酸是肽和蛋白质的构件分子，也是构成生命大厦的基本砖石之一。

术语“多肽”意指α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等，通常由10～100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽，它们的分子量低于10000道尔顿，能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀，也有文献把由2～10个氨基酸组成的肽称为寡肽(小分子肽)；10～50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质。

术语“缺失”意指一个正常染色体断裂后丢失了一个片段，这片段上的基因也随之失去，在本发明中意指小分子多肽除了为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列之外，还包括小分子多肽氨基酸序列中丢失一个或几个氨基酸的不影响其功能的新的氨基酸序列的小分子多肽。

术语“插入”意指利用基因操作技术把一段DNA接入另一段DNA中或克隆载体中去，在本发明中意指小分子多肽除了为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列之外，还包括小分子多肽氨基酸序列中插入一个或几个氨基酸的不影响其功能的新的氨基酸序列的小分子多肽。

术语“置换”意指一种基因重组载体，一般利用同源重组将基因组中的某段基因替换，而达到基因敲除的目的，在本发明中意指小分子多肽除了为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列之外，还包括小分子多肽氨基酸序列中一个或几个氨基酸被其他种类的氨基酸置换后的不影响其功能的新的氨基酸序列的小分子多肽。

术语“等电点”意指在某一pH的溶液中，氨基酸或蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH成为该氨基酸或蛋白质的等电点，生物两性分子如蛋白质即含有酸性的，也含有碱性的官能团。组成蛋白质的氨基酸可能是带正电荷的、带负电荷的、中性的或者本生是两性的，它们的电荷加在一起是蛋白质的电荷，pH值小于等电点时蛋白质的总电荷是正的，大于等电点时是负的。

附图说明

图1为本发明所述小分子多肽对成骨细胞增殖活性的影响与普通培养基对成骨细胞增殖活性影响的比较结果对照图。

图2为本发明所述小分子多肽对初始细胞分化能力与普通培养基对初始细胞分化能力的比较结果对照图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1：

一种小分子多肽，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

SEQ ID No.1：GSKKPVPIIY CNRRTGKCQR M。

实施例2：

小分子多肽的制备：

选用氨基酸-王树脂作为载体(树脂)，用二氯甲烷将树脂充分溶胀，用二甲基甲酰胺清洗几遍，用适当浓度的DBLK，将Fmoc-保护基团脱出，之后用二甲基甲酰胺清洗数遍，洗去DBLK，称取适合的缩合剂苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐和活化剂甲基吗啉以及C端第二个Fmoc-保护氨基酸(Fmoc-Pro-OH)进行偶联，通过茚三酮检测法进行检测确保连接比较完全，用二甲基甲酰胺清洗几遍，洗去残留的各种残基，活化剂和缩合剂，依氨基酸序列进行偶联，将所有的氨基酸连接结束后，脱去最后的Fmoc-保护基团，用切割液裂解，去除树脂和氨基酸保护基团，得到小分子多肽的粗品，送质谱确认产品分子量2434.99g/mol符合理论值。

实施例3：

抗菌能力实验：

一、实验方法

在灭菌试管中加入1mL浓度为1×10⁶个/mL的菌液，加入1mg本发明所提供的小分子多肽，37℃培养24小时后，培养基收集起来用倍比稀释，稀释倍数为10倍和涂布培养法检测活菌数。

二、实验结果：

表1本发明所述小分子多肽的杀菌率(％)

细菌	ATCC 6538	ATCC 25922	ATCC 10231	ATCC 9372
					杀菌率	100％	99.99％	99.98％	99.98％

由表1可知，本发明所提供的小分子多肽，对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠埃希氏菌(ATCC 25922)、白假丝酵母(ATCC 10231)、枯草芽孢杆菌黑色变种(ATCC 9372)都具有很强的杀菌性，其杀菌率达99％以上。

实施例4：

成骨细胞增殖活性实验：

一、实验方法

将1mg本发明所提供的小分子多肽置于24孔板中，1mL密度为2×10⁴个/mL的小鼠成骨细胞悬液接种于24孔板，然后培养1、4和7天。到预定时间点后，每孔加入200uL浓度为5mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和800uL无血清无酚红改良杜氏伊格尔培养基(DMEM)，37℃孵育4小时后吸弃上清液，加入1ml二甲基亚砜(DMSO)溶解生成的结晶物，每孔取三份200uL溶解液转到96孔培养板，用分光光度计于490nm处测其光密度值(OD值)。

二、实验结果

如图1所示，从图1可以看到小鼠成骨细胞接种于普通培养基和添加有本发明所提供的小分子多肽的培养基中，其OD值均呈增加的趋势，随着天数增加，添加有本发明所提供的小分子多肽的小鼠成骨细胞OD值增加更加显著，OD值可以反映小鼠成骨细胞的活性，所以从图1我们可以知道本发明所提供的小分子多肽能显著提高小鼠成骨细胞增殖活性。

实施例5：

初始细胞分化能力分析：

通过比较作为成骨细胞初始分化标记物的本发明所提供的小分子多肽的碱性磷酸酶(ALP)活性，检查本发明所提供的小分子多肽对小鼠成骨细胞分化的影响。

一、实验方法

将1mL浓度为1×10⁴个/mL细胞的小鼠成骨细胞接种到24孔板中，并培育1天。随后，分别用不含本发明的培养基和含有本发明所提供的小分子多肽的分化培养基处理细胞，并在CO₂含量为5％的37℃恒温箱中培育，在培养后第7天和第14天测量ALP活性。

二、实验结果

如图2所示，实验发现，含有本发明所提供小分子多肽的分化培养基在第7天显示的ALP活性比不含本发明所提供小分子多肽的培养基高93％，这表明在发明所提供小分子多肽的作用下成骨细胞分化能力明显改善。

实施例6：

细胞毒性分析：

以乳酸脱氢酶(LDH)的活性作为细胞毒性指标来评估本发明所提供的小分子多肽的细胞毒性大小。LDH是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外。通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度，LDH活性越高表明细胞受损程度越高。

一、实验方法

将1mL浓度为1×10⁴个/mL细胞的小鼠成骨细胞接种到24孔板中，并培育1天。随后，分别用不含本发明小分子多肽的培养基和含有本发明小分子多肽的分化培养基处理细胞，并在CO₂含量为5％的37℃恒温箱中培育24小时，离心后取上清液用于LDH活性检测，LDH活性用南京建成生物工程研究所生产的LDH试剂盒检测。

二、实验结果

表2本发明小分子多肽的LDH活性(U/L)

	培养基	本发明小分子多肽
			LDH活性	308	290

如表2所示，实验发现，含有本发明所提供小分子多肽的分化培养基的LDH活性略低于不含本发明所提供的小分子多肽的培养基，表明本发明所提供小分子多肽无细胞毒性。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (1)

1.一种氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的小分子多肽在制备促进成骨细胞生长的材料中的应用。