CN108342334A - 一株表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株，其保藏编号为GDMCC No.60304，所述突变菌株通过不针对菌体任何特定基因的紫外线辐射造成菌体基因组的随机突变，结合高通量的菌株筛选技术得到的，该菌株对死亡素抗菌肽的表达量显著，达到0.76g/L，是目前公开报道的最高水平，而且其生长性能和抑菌谱与出发菌株保持一致。

Description

一株表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株
技术领域
本发明涉及生物技术和微生物菌株筛选技术领域，特别涉及一株表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株。
背景技术
死亡素（Thanatin，THA），又称死亡肽，1996年由美国科学家在昆虫斑腹刺益蝽（Podisus maculiventris）中发现的，是迄今为止抗菌谱最广的抗菌肽之一，不仅对革兰氏阴性细菌如大肠杆菌、克雷伯氏菌、绿脓杆菌等有抑制作用，而且对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄菌、芽孢杆菌、浅绿气球菌等也具有明显的抑制作用。研究还发现，死亡素抗菌肽对面包霉菌、灰霉菌、木霉菌、镰孢菌等真菌也具有抑制作用，但对哺乳动物细胞却不表现出溶血性，因此，死亡素抗菌肽被认为是治疗感染性疾病的潜在药物。死亡素抗菌肽由21个氨基酸组成，分子内包含一对二硫键，因此死亡素的性质非常稳定。死亡素抗菌肽通过引起细菌凝集和抑制细胞呼吸作用起到杀菌作用，这种独特的杀菌机制使得死亡素抗菌肽不易产生耐药性，因此死亡素抗菌肽可替代抗生素使用。
死亡素抗菌肽的制备方式主要有三种：生物体提取、化学合成和微生物生物合成。但是，昆虫体内的死亡素抗菌肽含量非常低，通过生物体提取死亡素的成本非常昂贵，化学合成死亡素抗菌肽的成本也是非常高，而且还要形成二硫键，步骤繁琐，使用大量有毒的有机试剂；因此，生物体提取和化学合成的方式制备死亡素抗菌肽都是不经济的。微生物生物合成死亡素抗菌肽的核心是构建高表达量的生产菌株，目前公开报道的文献资料中，研究者主要通过大肠杆菌和裂殖酵母进行死亡素抗菌肽的融合表达或直接表达，但表达量低，且是胞内表达，不利于蛋白的分离纯化。本实验室构建了死亡素抗菌肽的毕赤酵母生产菌株，可实现死亡素的分泌表达，表达量达到0.6g/L（中国专利申请号：201711083981.0）。提高毕赤酵母蛋白分泌表达量主要考虑因素是基因剂量和蛋白分泌，通过提高基因剂量，我们得到了上述死亡素抗菌肽分泌表达菌株。毕赤酵母的蛋白分泌系统包括信号肽介导的蛋白转运、内质网中信号肽切割、蛋白折叠修饰、蛋白质跨膜转运等一系列过程，具体涉及上千个基因的调控，因此通过理性设计的方法（针对特定基因蛋白进行调控）改造毕赤酵母蛋白质分泌途径来提高死亡素抗菌肽的表达量，将会是非常盲目的、工作量也非常大。
可见，现有技术还有待改进和提高。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一株表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株，旨在解决现有技术中通过理性设计方法改造毕赤酵母蛋白质分泌途径来提高死亡素抗菌肽的表达量不仅工作量大，而且效果难以预期的技术问题。
为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：
一株表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株，已于2017年12月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60304。
所述表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株中，所述突变菌株是通过紫外诱变的方式获得的。
所述表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株中，所述突变菌株是通过紫外线照射10～20min获得的。
所述表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株中，所述突变菌株的出发菌株为中国专利申请号：201711083981.0、保藏编号为GDMCC No：60261的毕赤酵母菌株。
所述表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株中，所述突变菌株的生长性能与出发菌株的生长性能相同。
所述表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株中，所述突变菌株的抗菌谱与出发菌株相同。
所述表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株中，所述突变菌株用于发酵制备死亡素抗菌肽。
有益效果：
本发明提供了一株表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株，所述突变菌株是采用非理性设计的方法，不针对任何特定基因，通过紫外线辐射造成菌体基因组的随机突变，结合高通量菌株筛选技术，把抑菌活性显著提高的突变菌株筛选出来的，该突变菌株的死亡素抗菌肽的表达量比出发菌株提高了27%，达到0.76g/L，是目前公开报道的最高水平，而且其生长性能和抑菌普与出发菌株保持一致。
附图说明
图1为本发明提供的所述表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株与出发菌株的菌株生长曲线图。
图2 为所述突变菌株THA-08与出发菌株的发酵上清液的Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳分析结果图。
其中，M：标准蛋白分子量marker；泳道1：出发菌株；泳道2：THA-08菌株。
图3 为所述突变菌株THA-08与出发菌株的发酵上清液抑菌圈比较图。
具体实施方式
本发明提供一株表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一株表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株THA-08（毕赤酵母Pichia pastoris X33）,分类名Pichia pastoris，已于2017年12月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59楼5楼，保藏编号为GDMCCNo.60304；所述菌株诱导120小时发酵上清液的总蛋白浓度为0.84g/L，死亡素蛋白含量在90%以上，该菌株的死亡素抗菌肽表达量达到0.76 g/L，比出发菌株提高了27%。
进一步地，所述突变菌株是通过紫外诱变的方式获得的；本发明的紫外诱变方式不针对任何特定的基因，通过紫外辐射造成菌体基因组的随机突变，结合高通量菌株筛选技术，把抑菌活性显著提高的突变菌株筛选出来。
进一步地，所述突变菌株是通过紫外线照射10～20min获得的；以不进行紫外照射的出发菌株为对照，计算致死率，紫外照射10～20min时致死率约为70%～80%，是比较适合的致死范围。
进一步地，所述突变菌株的出发菌株为中国专利申请号：201711083981.0、保藏编号为GDMCC No：60261的毕赤酵母菌株；该菌株已于2017年10月26日保藏于广东省微生物研究所，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
请参阅图1，进一步地，所述突变菌株的生长性能与出发菌株的生长性能相同。
进一步地，所述突变菌株的抗菌谱与出发菌株相同。
进一步地，所述突变菌株用于发酵制备死亡素抗菌肽；该突变菌株产生的死亡素抗菌肽的抑菌活性与出发菌株相同，但是死亡素抗菌肽的表达量大大地提高了。
以下列举实施例对所述突变菌株的筛选、发酵表达死亡素抗菌肽及其性能作进一步的说明，实施例中所使用的试剂和药品除特别说明的以外，均为市售商品。
所使用的培养基有：
YPD培养基：酵母浸出粉10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；固体培养基再添加琼脂15g/L。
BMGY培养基：酵母浸出粉10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，酵母氨基碳源13.4 g/L，生物素0.2m g/L，PH6.0磷酸缓冲液100mmol/L，甘油10 g/L。
BMMY培养基配方：酵母浸出粉10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，酵母氨基氮源13.4 g/L，生物素0.2 g/L，PH6.0磷酸缓冲液100mmol/L，甲醇10mL/L。
MH培养基配方：MH培养基21 g/L；固体培养基再添加琼脂15g/L。
实施例 1 死亡素表达菌株的紫外诱变
选择本实验室构建的毕赤酵母死亡素抗菌肽表达菌株作为出发菌株（中国专利申请号：201711083981.0，保藏编号为GDMCC No：60261），接种到YPD培养基中，30℃、220rpm培养24h，按1%的浓度接种至YPD液体培养基，30℃、220rpm培养至OD600≈1.0；取10mL菌液于4000rpm离心3min后弃去上清液，并用生理盐水将菌泥洗涤2次，再用生理盐水重悬至OD600≈0.1，取5mL菌液置于Ф9cm的无菌培养皿中，并将无菌培养皿放置在超净台中央，开启紫外灯（20W,距离约50cm），分别照射1min、2min、5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min，然后按一定稀释倍数涂板，30℃培养3天，每个处理重复3次；以不进行紫外照射的出发菌株为对照，计算致死率。致死率（%）=1-（紫外处理菌落数/出发菌菌落数）×100%。
通过致死率的计算，得出紫外照射10～20min时致死率约为70%～80%，是比较合适的致死范围，因此选择紫外照射时间为10～20min。
按照上述紫外诱变流程，紫外照射出发菌株10～20min，稀释菌液涂板，30℃培养至长出单菌落，挑取单菌落，接种至2mL BMGY培养基中（24深孔板），30℃、220rpm培养24h，5000rpm离心5min，弃上清液，添加2mLBMMY培养基诱导培养，30℃、220rpm诱导培养72h，每24h补加1%甲醇，然后5000rpm离心5min，收集上清液。
检测发酵上清液的抑菌圈大小，抑菌圈大的表示抑菌活性强；选取抑菌圈较大的几株菌，按上述方法，摇瓶培养重复验证，筛选得到抑菌圈最大的菌株为THA-08菌株。
抑菌圈检测：将指示菌（大肠杆菌ATCC25922）接种于MH培养基中，37℃过夜培养，用生理盐水稀释至OD625=2.3，取100μL稀释指示菌液至100mLMH固体培养基（温度50～55℃），混匀，取10.5mLMH固体培养基至标准培养皿中，冷却凝固，利用打孔器大孔，每孔添加10μL发酵上清液，盖上陶瓦盖，置于37℃培养箱中培养16小时，观察抑菌圈大小。
实施例 2 突变菌株评价
1）死亡素诱导表达
挑取实施例1中的THA-08菌株，接种于25mLBMGY培养基中，30℃、220rpm培养24小时，制备一级种子液；
取20mL一级种子液接种于200mLBMGY培养基中，30℃、220rpm培养24小时，制备二级种子液；
将二级种子液全部接种于5L发酵罐（含2L BSM培养基）中，控制温度30±0.5℃、溶氧20±5%、PH5.0±0.5；
基础甘油耗尽后，流加10%甘油，甘油耗尽后直至溶氧突然上升，饥饿半小时，流加甲醇诱导死亡素抗菌肽表达，共诱导120小时，5000rpm离心5min，每个时间节点取发酵上清液进行检测菌体湿重，结果如图1所示，THA-08菌株与出发菌株的生长性能无差异。
2）蛋白浓度测定和蛋白电泳
Bradford法测定发酵上清液总蛋白浓度，结果显示，THA-08菌株诱导120小时发酵上清液的总蛋白浓度为0.84g/L，出发菌株的上清液总蛋白浓度为0.66g/L；
Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳分析THA-08与出发菌株的发酵上清液中死亡素抗菌肽含量，蛋白电泳结果如图2所示，由图中可看出，THA-08菌株的蛋白条带明显比出发菌株大，证实死亡素抗菌肽表达量有所提高。
通过软件分析，两者死亡素蛋白含量都在90%以上，可得，THA-08菌株的死亡素抗菌肽表达量达到0.76g/L，比出发菌株提高了27%。
3）抑菌活性及死亡素基因测序
最低抑菌浓度检测（MIC检测）：接种指示菌大肠杆菌ATCC25922于3mLMH培养基中，37℃,220rpm培养4～6h；然后菌液用生理盐水稀释至OD625=0.1，再将稀释后的菌液用MH培养基稀释100倍，待用。发酵上清液用0.45μm过滤器过滤，过滤后的发酵上清液用MH培养基分别稀释400、500、600、700、800倍，再分别取1mL上述稀释发酵上清液于试管中，分别添加1mL稀释菌液混合，最终稀释倍数为800、1000、1200、1400、1600倍；试管加上活塞密封后置于37℃培养箱培养16小时，观察培养基浑浊情况，判断最低抑菌浓度（MIC值）。观察结果得出，出发菌株的MIC=1/1000，THA-08菌株的MIC=1/1400，抑菌活性提高了40%。
抑菌圈检测：将指示菌（大肠杆菌ATCC25922和沙门氏菌）接种于MH培养基，37℃过夜培养，用生理盐水稀释至OD625=2.3，取100μL稀释指示菌液至100mLMH固体培养基（温度50～55℃），混匀，取10.5mL固体培养至标准培养皿，冷却凝固，利用打孔器打孔，每孔添加10μL发酵上清液，盖上陶瓦盖，置于37℃培养箱培养16h，观察抑菌圈大小。
请参阅图3，结果显示，THA-08菌株的抑菌普与出发菌株一致，都能抑制大肠杆菌和沙门氏菌，且THA-08菌株发酵液的抑菌圈明显大于出发菌株，证明THA-08菌株死亡素抗菌肽表达量明显高于出发菌株。
死亡素基因测序：利用验证引物
THA-F：5’-TACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAA-3’；
THA-R：5’-TTTTCTTTTCCAAACCTTTAGTACG-3’；
挑取THA-08菌株单菌落进行菌落PCR，验证死亡素表达盒基因序列，回收扩增基因片段，经上海生工生物工程股份有限公司进行基因测序，结果THA-08菌株的死亡素表达盒基因序列与出发菌株相同，说明THA-08菌株的抑菌活性提高并不是由于死亡素基因突变引起的活性提高，而是死亡素表达量提高引起的抑菌活性提高。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
序列表
<110> 广东海纳川生物科技股份有限公司
<120> 一株表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaa 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ttttcttttc caaaccttta gtacg 25

Claims (7)

1.一株表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株，其特征在于，所述突变菌株已于2017年12月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60304。
2.根据权利要求1所述的表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株，其特征在于，所述突变菌株是通过紫外诱变的方式获得的。
3.根据权利要求2所述的表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株，其特征在于，所述突变菌株是通过紫外线照射10～20min获得的。
4.根据权利要求1所述的表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株，其特征在于，所述突变菌株的出发菌株为中国专利申请号：201711083981.0、保藏编号为GDMCC No：60261的毕赤酵母菌株。
5.根据权利要求4所述的表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株，其特征在于，所述突变菌株的生长性能与出发菌株的生长性能相同。
6.根据权利要求1所述的表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株，其特征在于，所述突变菌株的抗菌谱与出发菌株相同。
7.根据权利要求1所述的表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株，其特征在于，所述突变菌株用于发酵制备死亡素抗菌肽。
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