JP2005281291A - 新規な抗菌性ペプチド、それを産生するための組換え体植物及び該抗菌性ペプチドの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】タナチンはカメムシ由来の22アミノ酸からなるポリペプチドであって、2個のシステイン残基が還元型である抗菌性ペプチドを提供する。前記システイン残基のSH基の水素原子はアルキル基に置換されていてもよいし、N末端のアミノ酸残基がアセチル基で修飾されていてもよい。
【選択図】なし
Description
すなわち、本発明は、抗菌活性を有するタナチン類縁体、それを産生するための組換え体植物及び該組換え体植物を用いた該タナチン類縁体の製造方法等を提供することを課題とする。
また本発明の抗菌性ペプチドは、N末端のアミノ酸残基がアセチル基で修飾されていてもよい。
上述の通り、本発明の抗菌性ペプチドは、カメムシ類が生産するタナチンの類縁化合物であって、配列番号1のアミノ酸配列(配列番号2は配列番号1のアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列を示す)からなり、分子内にS-S結合を有しないポリペプチドである。より具体的には、本発明の抗菌性ペプチドには、本質的に次の化学構造式:
さらに他の態様では、本発明の抗菌性ペプチドは、本質的に次の化学構造式:
上記の新規抗菌性ペプチドの発見に伴い、本発明の抗菌性ペプチドを産生することができる組換え体植物も提供される。本発明による組換え体植物は、植物内で発現した抗菌性ペプチドを抽出・精製するための供給源として利用されてもよいし、それ自体が耐病性を持つ植物として提供されてもよい。本発明による組換え体植物から量産される抗菌性ペプチドは、上述の通り、抗生物質、家畜飼料への添加剤等として利用できる。
本発明者は、上記組換え体植物から得られたタナチン調製物をHPLCで分析した結果、従来知られていたタナチンとは異なる別のピークを持つ抗菌活性物質として、本発明のタナチン類縁体を発見した(実施例3参照)。すなわち、本発明の抗菌性ペプチドは、組換え体植物においてタナチンと共にタナチン類縁体として発現する。そして、本発明の抗菌性ペプチドは、組換え体から抽出された抗菌活性画分から、本願で明らかにされた当該抗菌性ペプチドの特性データ(高速液体クロマトグラフィー(HPLC)のピーク位置等)に従って同定し、単離することが可能である。また同様にして本発明の抗菌性ペプチドを、カメムシより抽出、精製してもよい。
カメムシ由来のタナチン(Feilbaum et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93, 1221-1225 (1996))をコードする塩基配列を合成し、遺伝子導入に供した。塩基配列の設計に際し、タナチンに対応する塩基配列の前に開始コドンに対応する配列を、末端に終止コドンに対応する配列を、さらにこれらの配列の両末端にNcoIおよびBamHI制限酵素切断部位を付加した配列(図2)を設定し、これを有機合成した。これを一度、プラスミドベクターpUC19にクローニングした後、タナチン領域の塩基配列をNcoIおよびBamHIで切断し、断片を調製した。これをバイナリベクターpCAMBIA1302(http://www.cambia.org/)のNcoIとBglII部位の間に導入し、プラスミドpCAM-TANを得た(図3)。
実施例1で得られた組換え体植物の緑葉から、常法(渡辺格、杉浦昌弘 編集、クローニングとシーケンス、農村文化社1989年)によりゲノムDNAを調製した。制限酵素EcoRVで切断したゲノムDNAは、アガロース電気泳動をおこなって分離後、ナイロンメンブランに転写し、タナチン領域に対応する断片をプローブとしたサザン分析により、タナチン領域が導入されたことを確認した(図4)。ゲノムDNAはそれぞれを制限酵素EcoRVで切断し、アガロースゲル電気泳動で分離した。導入遺伝子を検出するために、タナチン遺伝子領域をプローブとして用いた。
実施例2で抗菌活性の産生が認められた形質転換個体の緑葉より抗菌活性を有する物質の抽出・精製を行った。緑葉3gに実施例2で示したタンパク質の抽出用緩衝液を10 ml添加し、よく攪拌した。これにプロテアーゼ阻害剤(シグマ社製)150μlを加え、超音破砕した。この後、4℃で遠心分離し上清を得た。この上清を0.45μmのフィルターを用いて濾過し、さらに0.22μmのフィルターで濾過して滅菌した。これに50 mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH. 7.0)を加えて10倍に希釈した後、陽イオン交換樹脂カラム(Hi-Trap CM FF, ファルマシア・バイオテク社製)にアプライした。カラムは50 mMリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄後、緩衝液にNaClをそれぞれ100 mM, 250 mM, 1 Mの濃度になるように加えた緩衝液で段階的にタンパク質を溶出した。それぞれの溶出画分を集め、減圧濃縮機を用いて濃縮後、実施例2で示した方法により、それぞれの抗菌活性を検定した。その結果、250mM NaClで溶出された画分に抗菌活性が認められた(図7)。
常法(L. E. Commish & K. Kates, In: Fmoc solid phase peptides synthesis: a practical approach, W. C. Chan & P. D. White (eds), Oxford University Press, 2000, pp. 277)に従い、固相法ペプチド合成機を用いて、次の化学構造式:
実施例3及び4で得られた抗菌性物質をESI-MS(日本電子製、The AccuTOF, JMS-T700LCK)により分子量の定量を行った。先ず、実施例3において緑葉より調製したタナチン類縁体の構造を同定するため、ESI-MSによる解析を行った(図11)。緑葉より精製した物質を減圧乾固したあと、これにメタノールを加えて溶解した。同時に標準サンプルとして実施例4で調製したアセチル・タナチン合成標品も同様にメタノール溶液とし、同様の解析を行った(図12)。その結果、緑葉より調製したタナチン類縁体(図12)とアセチル・タナチン合成標品(図12)の分析パターンは完全に一致した。検出された分子量はともに2,478であり、アセチル・タナチンのものから予測される値と一致した。このことから、緑葉で産生している抗菌性物質はタナチンのN-末端がアセチル化され、かつ分子内の2つのシステイン残基はともに還元型である有機合成したアセチル・タナチンと同じものであることが明らかになった。
上記実施例の一連の実験の中で、システイン残基がアルキル基で修飾された抗菌性ペプチドが単離された。図13は、t−ブチル化タナチンの抗菌活性を確認したとき検定結果を示す。単離されたt−ブチル化タナチンは、第11位及び第18位のシステイン残基のSH基が、次の構造式:
一般にS-S結合の切断やアセチル化は生物作用によっても起こり得るものである。これとは異なりSH基のt−ブチル化のような修飾は実験段階で人工的に起こるものである。かくしてt−ブチル化タナチンは本実験において偶然発見されたものではあるが、この発見は、本発明により提供される合成タナチンをリード化合物としてシステイン残基を修飾することによって新たな抗菌性ペプチドを創生することが可能であることを示唆する。
Claims (5)
- 配列番号1に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドであって、第11位及び第18位のシステイン残基が還元型である抗菌性ペプチド。
- 前記システイン残基のSH基の水素原子がアルキル基に置換されている、請求項1に記載の抗菌性ペプチド。
- N末端のアミノ酸残基がアセチル基で修飾されている、請求項1又は2に記載の抗菌性ペプチド。
- 配列番号1に記載のアミノ酸配列をコードする核酸が導入されることにより、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗菌性ペプチドを産生するように形質転換された組換え体植物。
- 請求項4に記載の組換え体植物から抗菌性ペプチドを抽出する工程を含む、抗菌性ペプチドの製造方法。
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CN108342334A (zh) * | 2018-01-17 | 2018-07-31 | 广东海纳川生物科技股份有限公司 | 一株表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株 |
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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JPN6010022614, Pascale Fehlbaum et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, vol.93, p.1221−1225 * |
JPN6010022616, 島田浩章, 農業技術, 2003, 58巻, p.193−198 * |
Cited By (2)
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CN108342334B (zh) * | 2018-01-17 | 2021-06-01 | 广东海纳川生物科技股份有限公司 | 一株表达重组死亡素抗菌肽的毕赤酵母突变菌株 |
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