CN111607607A - 一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成的方法。本发明提供了一种通过敲除魏氏柠檬酸杆菌外膜蛋白ompA基因从而提高该菌株生物被膜形成能力的方法；通过使用质粒pYG4构建敲除载体，并利用基因同源重组的原理将ompA基因敲除，从而获得ΔompA。使用结晶紫染色等方法对ΔompA性状进行分析，结果表明，与野生魏氏柠檬酸杆菌相比，ΔompA的生物被膜形成能力提高了4倍以上，并且其对异噻唑啉酮类杀菌剂的抗药性也相应提高。本发明构建的ompA敲除株，可有效提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成量和抗药性水平，从而拓宽了魏氏柠檬酸杆菌用于重金属离子吸附和构建细胞蛋白合成工厂等的应用场景和范围。

Description

一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成的方法。

背景技术

魏氏柠檬酸杆菌，是一种革兰氏阴性菌，通过周生鞭毛运动，能够利用L-阿拉伯糖、麦芽糖、鼠李糖、海藻糖、D-木糖、D-甘露糖和D-山梨糖醇等为单一碳源，并且丙二酸盐和间羟基苯酸酸盐反应为阳性，该类细菌通常在水、土壤、动物和人类的肠道中发现。基于魏氏柠檬酸杆菌的上述生理特性，已经将其应用于环境治理领域，如魏氏柠檬酸杆菌本身特别是其所形成的生物被膜具有很好的积累重金属的能力而被用于重金属污染环境的生物修复，但由于其本身的生物被膜形成能力有限，就算形成了生物被膜，它的环境适应性也较差，从而限制了魏氏柠檬酸杆菌的实际应用效果，迫切需要通过一定的方法，提高该菌株的生物被膜形成能力和环境适应性。

而众所周知，细菌生物膜是一个混合的、互相聚集或者与附着物接触的细菌群体，其结构构成主要包括：水、胞外多聚物(EPS)、胞外蛋白和胞外遗传物质，如eDNA和RNA等，其生物被膜的形成将引发一系列与其浮游菌状态不同的表型和基因表达变化，如环境适应性特别是抗药性提高，已经有实验数据证明，生物被膜的形成可以导致菌体的抗药性水平提高约10-1000倍，而更为重要的是，由于生物被膜具有三维立体结构，具有很多的孔道，它的形成增加了菌体本身与外界的接触面积，从而具有更好的吸附能力。如何提高生物被膜的形成量，一直是一个科研热点。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中魏氏柠檬酸杆菌的生物被膜形成能力有限、环境适应性较差的不足，提供一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成的方法，可以提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜的形成量，提高对杀菌剂的抗药性，从而提高其在环境治理等方面的应用潜力。

外膜蛋白OmpA是革兰氏阴性菌外膜中的一个重要构成成分，在细菌的生命活动中起到非常重要的作用，主要是维持细胞外膜的完整性。并且，已经有实验数据证实，ompA可以影响细菌生物被膜的形成，如敲除大肠杆菌的ompA，其生物被膜的形成能力降低，其它菌株中也发现了类似的结果。但是，当发明人在魏氏柠檬酸杆菌中把ompA敲除以后，却发现敲除菌株的生物被膜的形成能力，提高很多，并且生物被膜对工业杀菌剂的抗药性与野生菌株相比，也提高了不少。由此可见，本发明的敲除魏氏柠檬酸杆菌外膜蛋白ompA基因的菌株具有重要的实际应用价值和潜力。

本发明的的第一个目的是提供一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成的方法。

本发明的提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成的方法，其特征在于，通过敲除魏氏柠檬酸杆菌外膜蛋白ompA基因实现，所述的外膜蛋白ompA基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

优选，所述的方法，包括以下步骤：

合成外膜蛋白ompA基因的上下游同源片段，酶切连接到质粒pYG4上构建敲除载体pYG4-ompA，然后转化大肠杆菌S17-1；将携带有敲除载体pYG4-ompA的大肠杆菌S17-1与魏氏柠檬酸杆菌共孵育，将共孵育物洗脱下来适当稀释后涂布于Kana和利福平抗性筛选LB平板，用敲除鉴定引物鉴定外膜蛋白ompA基因一次交换重组子，然后将一次交换重组子用LB液体培养基扩大培养并适当稀释后涂布到含质量分数5％蔗糖的LB平板上，挑取单克隆，使用敲除鉴定引物鉴定成功敲除魏氏柠檬酸杆菌外膜蛋白ompA基因的工程菌。

本发明还提供根据所述的方法获得的敲除魏氏柠檬酸杆菌外膜蛋白ompA基因的工程菌。

本发明还提供所述的敲除魏氏柠檬酸杆菌外膜蛋白ompA基因的工程菌在提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成中的应用。

本发明还提供所述的敲除魏氏柠檬酸杆菌外膜蛋白ompA基因的工程菌在提高对异噻唑啉酮类杀菌剂抗药性中的应用。

优选，所述的异噻唑啉酮类杀菌剂是1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)。

优选，所述的魏氏柠檬酸杆菌是魏氏柠檬酸杆菌BF-6。

本发明所得到的敲除魏氏柠檬酸杆菌外膜蛋白ompA基因的工程菌，除了提高了生物被膜的形成能力，同时，其生物被膜对异噻唑啉酮类杀菌剂的典型代表1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)的抗药性也提高；可有效提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成量和抗药性水平，从而拓宽了魏氏柠檬酸杆菌用于重金属离子吸附和构建细胞蛋白合成工厂等的应用场景和范围。

本发明所用的魏氏柠檬酸杆菌BF-6，其公开于文献：李龙杰，周刚，施庆姗，陈艺彩，陈仪本，欧阳友生，胡文锋；一株工业腐败物中魏氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及产生物膜特性分析，微生物学通报，Jan.20,2014,41(1):2-7。该菌种本申请人也持有，保证自本发明的申请日起20年内向公众提供。

附图说明

图1是魏氏柠檬酸杆菌外膜蛋白敲除菌株ΔompA的PCR鉴定图(M：DL5000 DNAMarker，购买自：北京擎科新业生物技术有限公司)。

图2是魏氏柠檬酸杆菌野生菌株(A)、外膜蛋白敲除菌株ΔompA-13(B)、ΔompA-16(C)和ΔompA-18(D)的生物被膜形成量；注：柱子上方的数字为均值。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

以下实施例中使用的魏氏柠檬酸杆菌是魏氏柠檬酸杆菌BF-6。

以下实施例中用到的引物如下：

ACGCCTGTCTCAAGCGGTTTTC(ompA-identify-F)；

AAGAAGCATCGTGAGGGGGAAT(ompA-identify-R)。

一、ompA敲除载体的构建

首先，将魏氏柠檬酸杆菌的ompA基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)的上下游序列(上游1005bp(对应为SEQ ID NO.2的第9至1013位碱基)和下游876bp(对应为SEQ IDNO.2的第1014至1889位碱基))整合在一起(无ompA基因本身序列)，然后在该整合序列前端加上BglII酶切位点(GAAGATCT)、在后端加上SpeI酶切位点(ACTAGTCC)和保护碱基，委托上海美吉生物医药科技有限公司进行全基因合成。

于此同时，用质粒提取试剂盒(全式金生物)提取pYG4质粒，并使用下面的酶切体系进行酶切：

试剂	体积(μl)
		10×QuickCut Buffer	5
质粒pYG4(225ng/ul)	5
		BglII(1000units/ml)	1
SpeI(20000units/ml)	1
		无菌水	38
总体积	50

上述酶切体系中使用的BglII和SpeI均购买在北京全式金生物技术有限公司，同时，将混匀的上述体系放入37℃培养箱孵育15min，然后，使用胶回收试剂盒(全式金)对酶切后的载体片段进行回收。

用同样的酶BglII和SpeI双酶切全基因合成的ompA上下游同源臂片段(该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，也使用同样的胶回收试剂盒(全式金)对酶切后的酶切片段进行回收。

将酶切后的pYG4质粒载体片段和ompA上下游同源臂片段，按照说明书的要求使用T4连接酶(TaKaRa)进行连接反应：

试剂	体积(μl)
		Solution I	10
酶切后的质粒pYG4	3
		酶切后的ompA上下游同源臂片段	7
总体积	20

将上述体系混合好以后，放置于16℃水浴中过夜连接，第二天，吸取10μl连接反应液，热激法转化大肠杆菌S17-1(42℃水浴热激90s)，摇床恢复培养1.5h以后，涂布Kana平板，并放置于37℃培养箱过夜培养，待长出单菌落以后，挑取单菌落并用引物ompA-identify-F和ompA-identify-R鉴定转化成功的转化子(扩增出来的片段长度是：775bp)，并提取质粒用BglII和SpeI双酶切鉴定，若切下的片段大小是1887bp，则证明敲除载体pYG4-ompA构建正确，可用于后续实验。

二、接合转移和ompA敲除子鉴定

将携带有敲除载体pYG4-ompA的大肠杆菌S17-1与魏氏柠檬酸杆菌BF-6野生菌进行接合转移。具体来说，就是先将上述两株菌分别过夜培养，然后调节OD600＝1.0左右，并按照1：1的体积比将菌液混合，然后，将混合菌液滴在放有0.22μm滤膜的LB平板上，静置2h以后，将平板转移到37℃培养箱，正置培养1d后，将菌体用PBS洗下并适当稀释以后涂布在含有50mg/L Kana和30mg/L利福平的双抗LB平板上，37℃培养1-2d。挑取生长菌落利用引物ompA-identify-F和ompA-identify-R进行PCR验证，ompA基因一次交换重组菌应该两条带，一个是1834bp大条带和775bp小条带。

将一次交换重组成功的菌株用LB液体培养基扩大培养，用扩大培养菌液适当稀释后在含质量分数5％蔗糖的LB平板上划线，培养72h后，挑取平板上的单菌落用引物ompA-identify-F和ompA-identify-R进行PCR验证(图1)，确定ompA敲除菌，敲除菌株应该是发生了双交换，所以只能扩增出小条带，即775bp条带；将PCR鉴定为阳性的菌落分别在含50mg/LKana LB平板或含50mg/L利福平LB平板上划线，具有利福平抗性、对Kana敏感菌株为最终的ompA敲除菌，用于后续实验。

三、ompA敲除子生物被膜形成能力和抗药性测定

从图1中可以看出，一共有5个ompA敲除子，分别是13、14、16、18和21号，我们选取其中三个敲除株即ΔompA-13、ΔompA-16和ΔompA-18分别测试它们的生物膜形成能力和对BIT抗药性水平，其实验步骤主要是：用无菌的LB分别配置浓度梯度为0、8、16、32、64和128mg/L的BIT药母液，同时，将上述三株敲除子的菌液浓度调节到OD600＝1.0待用；在96孔板中，分别加入75μl BIT药母液，15μl菌液(按10％的量加入)，并加入60μl新鲜无菌LB液体培养基，从而使BIT的总浓度为：0、4、8、16、32和64m/L，同时，用魏氏柠檬酸杆菌BF-6野生菌株作为对照。将上述加了样品的96孔板，放入30℃培养箱静置培养4天后，首先使用酶标仪，测定96孔板中各样品在OD600 nM时的光吸收，从而反应浮游菌的生长水平；然后，将浮游菌舍弃，并对96孔板进行清洗，然后用0.1％的结晶紫进行染色，用灭菌水洗脱掉多余的染料以后，用95％的酒精洗脱残余在96孔板孔壁上的结晶紫，并用同样的酶标仪测定样品在595nM的光吸收值，用来表示生物被膜的形成量。设置未加任何药剂的孔作为对照，所有的处理均设8个重复，并且在不同的时间重复至少3次。

魏氏柠檬酸杆菌BF-6野生菌株和三个ompA基因敲除子的浮游菌生长和生物被膜形成能力见图2，从图中可以看出，无论是敲除子ΔompA-13(OD595＝3.62)、ΔompA-16(OD595＝3.63)和ΔompA-18(OD595＝3.62)，它们的生物被膜形成能力比BF-6野生菌株(OD595＝0.86)提高了4倍以上，与此同时，生物被膜对BIT的抗药性水平也相应的增加，特别是在BIT浓度为32mg/L时，野生菌株的OD595只有0.23，但敲除子ΔompA-13、ΔompA-16和ΔompA-18的OD595的值分别为：2.26、1.66和2.27。

上述结果说明，可以通过敲除魏氏柠檬酸杆菌ompA基因实现该菌株生物被膜生物量的提高和抗药性的增加，具有实际应用潜力和前景。

序列表

<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1059

<212> DNA

<213> 魏氏柠檬酸杆菌BF-6(Citrobacter werkmanii BF-6)

<400> 1

atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtggcgcag 60

gccgctccga aagataacac ctggtacgct ggtgctaaac tgggctggtc tcagtaccat 120

gatgttggca acaaccagat caacaacgcc ggtcctaccc acgaaagcca actgggtgct 180

ggtgcgttcg gtggttatca ggttaacccg tacgtaggtt ttgaaatggg ttacgactgg 240

ttaggccgta tgccgtacaa aggctacacc gaccagactc atcaaaacgg cgctttcaaa 300

gctcagggcg ttcagctgac cgctaaactg ggttacccaa tcactgacga tctggacgtt 360

tatacccgtc tgggtggtat ggtttggcgt gcagacgcta aaaacaacga aggcttcaaa 420

gaccacgaca ctggtgtatc cccagtattc gctggtggcg tagagtatgc aattactcct 480

gaaatcgcta cccgtctgga ataccagtgg accaacaaca tcggtgatgc aaacaccgtt 540

ggcggtcgcc cggataacgg tctgttaagc gttggtgttt cttaccgttt cggccagcag 600

gaagaagcag ctccagtagt tgttgctccg gctccggctc cagaagtaca gaccaagcac 660

ttcactctga agtctgacgt tctgttcaac ttcaacaaag caactctgaa accagaaggc 720

cagcaggctc tggaccagat gtacagccag ctgagcaacc tggatccgaa agacggttcc 780

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aaaggtatca aagacgttgt aactcagcct caggcttaa 1059

<210> 2

<211> 1897

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaagatctcg catggggcaa gatgaatttt atttttcccg taactacgac taaaaattgc 60

gaacctgttt ccgaaaataa ggttgatctt tgttgatagc agggttactg tatatccata 120

cagtaactca cagggctgga ttgattatgt acacttcagg ctatgcaaat cgttcttcgt 180

cgttctcttc cgcatcaagc aacattgcgc gcgtttcatc agagaacgca accgctgggc 240

ttatcagtga agtagtctat cgcgaggacc agcccatgat gacgcaacta ctgctgcttc 300

ccctcctgca acagttaggg cagcaatcac gctggcagct gtggctgacg cctcagcaaa 360

aattaagtcg ggagtgggtg cagtcagccg gacttccatt gacaaaagta atgcagatta 420

gccaactctc cccctgtaat acgctggaat cgatgattcg agcgctgcgc acaggtaatt 480

acagcgtcgt tatcggctgg ctggcagaag aattgacgga agatgaacat gccgaactgg 540

taaaagcggc tgatgtagga aatgctatgg gatttatcat gcgtcctgtt cgcgcacagt 600

cacttgcggg gagacagcat tccgggctaa aaattcactc gaatttgtat cattgagtaa 660

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cacttgtaag ttttcaacta cgttgtagac tttacatcgc caggggtgct cggcgtaagc 900

cgcagatatc ggtagagtaa ctattgaact ggtccccggg tgaaggattt aaccgtgtta 960

tctctcttcg gagatattca tggcgaattt tggatgataa cgaggcgcaa aaagttatcg 1020

tcttataaaa aaaccccgca tcgcggggtt ttttttcatc tgtgttttaa tcaaagcaca 1080

ctactacgtc acccattaaa ccaccctgcc actactcttt tccgagtagt gcctgtaaat 1140

cctgttttaa ggtcgacatt ttattcgcgt acttctcttt atgctccgca tcttcaatca 1200

gttgcacaat ggtttcagaa agcgttttac cccgccgctg cgcaaggcca gctaagcgtt 1260

gccaaaccat aaactccaga tcgatagatt tctttcgcgt atgctgatgc tcagcattaa 1320

agtgccgctt gcgcctcgcc cgtatggtct gtttcatacg attgagtagc gcagggttca 1380

tgtgttcttc aatccaggta ttgacccgaa ccggttcatt ttcgagggtt agcaataaat 1440

caacggcttc tttggcagcg ctggcctcca cgtaacgggt tattaattcc ccctcacgat 1500

gcttcttcac cagatacttc cacttccagc cgctttcaag attttcaagt tgttgatatt 1560

tcattgcgat ctcaatgtta ccgtgtaact cttatcagaa tatcagcttt ttgagcaact 1620

gaagaaaaga atatccagcc tgtgaactgc cgcgcgtcat cacaaccgtt tcgcagtgct 1680

ttccaggtgt gtagtgatga gggttacggt ataatctcgt ttttaacaac agactaaaaa 1740

acatcaactt tgaccattac gaaacttgca tggcgtgagc tggttcctga taccgacagt 1800

tatcaggaag tatttgcaca gccgcacgtc actgacgaca ccgatacctt acttagtgat 1860

actcagccac gtttacaatt cgcgctagaa ctagtcc 1897

Claims (8)

1.一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成的方法，其特征在于，通过敲除魏氏柠檬酸杆菌外膜蛋白ompA基因实现，所述的外膜蛋白ompA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

合成外膜蛋白ompA基因的上下游同源片段，酶切连接到质粒pYG4上构建敲除载体pYG4-ompA，然后转化大肠杆菌S17-1；将携带有敲除载体pYG4-ompA的大肠杆菌S17-1与魏氏柠檬酸杆菌共孵育，将共孵育物洗脱下来适当稀释后涂布于Kana和利福平抗性筛选LB平板，用敲除鉴定引物鉴定外膜蛋白ompA基因一次交换重组子，然后将一次交换重组子用LB液体培养基扩大培养并适当稀释后涂布到含质量分数5％蔗糖的LB平板上，挑取单克隆，使用敲除鉴定引物鉴定成功敲除魏氏柠檬酸杆菌外膜蛋白ompA基因的工程菌。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的魏氏柠檬酸杆菌是魏氏柠檬酸杆菌BF-6。

4.根据权利要求1所述的方法获得的敲除魏氏柠檬酸杆菌外膜蛋白ompA基因的工程菌。

5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述的魏氏柠檬酸杆菌是魏氏柠檬酸杆菌BF-6。

6.权利要求4所述的敲除魏氏柠檬酸杆菌外膜蛋白ompA基因的工程菌在提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成中的应用。

7.权利要求4所述的敲除魏氏柠檬酸杆菌外膜蛋白ompA基因的工程菌在提高对异噻唑啉酮类杀菌剂抗药性中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的异噻唑啉酮类杀菌剂是1,2-苯并异噻唑啉-3-酮。

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