CN1884482A - 分泌溶藻物质的产气肠杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用 - Google Patents

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一株分泌溶藻物质的产气肠杆菌及其在控制蓝藻水华中的应用。该株菌是通过将自然水样浓缩10－100倍进行溶藻实验分离得到的一株分泌溶藻物质的细菌，经生化鉴定为产气肠杆菌W5。该产气肠杆菌发酵后经喷雾干燥得到白色粉末制剂，溶藻物质在2－200ppm使用浓度下都能有效杀灭水华蓝藻。而且该制剂使用方便，安全无毒，对环境无危害。该产气肠杆菌发酵条件为：灭菌参数为121℃，20－30分钟；发酵参数为：pH 5.8.0－7.0，DO 70－90,发酵温度34.0－39.0℃，搅拌速度70－130转/分钟，发酵时间16－48小时。发酵培养基配方为：发酵过程中不需要补料以及调节pH。发酵产物喷雾干燥条件为进口温度198－210℃，出口温度68－79℃。

Description

分泌溶藻物质的产气肠杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用
技术领域
本发明涉及一株分泌溶藻物质的产气肠杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用。本菌种保藏日期为2006年5月19日，保藏编号为：CCTCC NO：M206049。分类命名为：产气肠杆菌W5(Enterobacter aerogenes W5)，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国．武汉．武汉大学，邮编430072。
背景技术
当前治理水华一般采用物理、化学和工程的办法，工程与物理方法如絮凝法除藻、臭氧杀藻、机械除藻、紫外光照除藻等；化学法如硫酸铜、二氧化氯、次氯酸盐等杀藻剂等。工程与物理法往往成本很高、设备复杂、操作难度高，并不能彻底杀死藻细胞，如经常使用的絮凝法还存在二次污染的问题；化学杀藻方法对水生动物毒性大，并易造成有毒物质残留。尽管消耗了大量的财力和物力，甚至冒着破坏环境的危险，但是效果并不理想。国外很早就注意并开展生物防治水华的研究，国内也有少数几家单位开展了溶藻细菌的研究，但是大多停留在一般问题的描述上，微生物防治水华还基本上停留在实验室研究阶段，离实际应用还有一定的距离。
发明内容
为了克服物理、化学和工程办法控制水华中存在的高成本、高难度、高污染和毒物残留等问题，本发明提供一种分泌溶藻物质的微生物，和利用该微生物控制蓝藻水华的应用技术。该技术不但能有效控制蓝藻水华，而且成本低、操作简单、无污染、对环境不构成危害。
本发明的技术方案是：从不同天然水体中取水样，通过两种路线分离不同溶藻方式的溶藻细菌。实验中用到的供试藻种主要是淡水蓝藻，包括：野生微囊藻，铜绿微囊藻7820，铜绿微囊藻7806，铜绿微囊藻DS，水华鱼腥藻，聚球藻，颤藻，织线藻，席藻等淡水常见蓝藻。分离路线之一为分离直接溶藻的细菌：将水样浓缩10-100倍直接接种到培养的各种蓝藻中进行感染实验。对有感染症状(外观为培养物黄化)的培养物进行挑取单个溶藻斑平板划线法纯化。将纯化的微生物扩大培养并重复感染培养的蓝藻，验证其溶藻效果；分离路线之二为分离通过分泌物质溶藻的细菌，通过此法从自然水体得到一株细菌，证明该株细菌为分泌具有高效溶藻活性的物质。该细菌经生化鉴定为产气肠杆菌W5(Enterobacter aerogenes W5)。其生化鉴定结果见表1。
所述的一株分泌溶藻物质的产气肠杆菌的筛选方法，是通过将自然水样浓缩10-100倍进行溶藻实验分离得到。
所述的一株分泌溶藻物质的产气肠杆菌的筛选方法步骤为：
步骤1、将自然水样接种到添加柠檬酸钠的液体基础培养基中富集培养，然后用培养物按1∶1比例接种到培养的蓝藻中进行感染实验，筛选具有溶藻特性(即使被感染的藻黄化)的水样，然后将该水样倒平板挑单菌落进行平板划线纯化，对纯化的菌株利用添加柠檬酸钠的液体基础培养基扩大培养后重新感染该敏感蓝藻，验证其溶藻特性；
步骤2、利用添加柠檬酸钠的基础培养基发酵步骤1筛选出微生物，发酵条件是：
1)、灭菌参数为121℃，20-30分钟；
2)、发酵参数为：pH 5.8.0-7.0，DO 70-90，发酵温度34.0-39.0℃，搅拌速度70-130转/分钟，发酵时间16-48小时；发酵培养基使用上述添加柠檬酸钠的基础培养基，发酵过程中不需要补料以及调节pH；
3)、发酵产物经喷雾干燥获得白色干粉制剂；
所述的蓝藻是淡水蓝藻，包括：野生微囊藻，铜绿微囊藻7820，铜绿微囊藻7806，铜绿微囊藻DS，水华鱼腥藻，聚球藻，颤藻，织线藻和席藻；
所述的添加柠檬酸钠的基础培养基配方为：NaNO3：150毫克，K2HPO4.3H2O：4毫克，毫克SO4.7H2O 7.5毫克，CaCl2.2H2O：3.6毫克，乙二胺四醋酸二钠盐0.1毫克，Na2CO32毫克，柠檬酸0.6毫克，柠檬酸铁铵0.6毫克，柠檬酸三钠50毫克，A5溶液0.1毫升，蒸馏水100毫升；其中A5溶液配方为：H3BO3 286毫克，MnCl2.4H2O 181毫克，ZnSO4.7H2O 22.2毫克，CuSO4.5H2O 7.4毫克，MoO3 1.5毫克，蒸馏水100毫升。
所述的发酵更佳条件为：灭菌参数为121℃，20分钟；发酵参数为pH 6.0，DO 80，发酵温度37.0℃，搅拌速度100转/分钟，发酵时间24小时。
所述的发酵产物喷雾干燥条件为进口温度198-210℃，出口温度68-79℃。发酵产物喷雾干燥更佳条件为进口温度200℃，出口温度73℃。
该白色粉末制剂含高效杀藻物质，在2-200ppm浓度下能有效控制蓝藻水华。
本分泌溶藻物质的产气肠杆菌对白色粉末制剂进行了大鼠经口和斑马鱼急性毒性试验。大鼠经口急性毒性试验参照《GB15670-1995》，采用Horn’s方法设立灌胃剂量，受试最大剂量为3000毫克/千克，经14天观察没有大鼠死亡，表明该干粉对大鼠经口的LD50大于3000毫克/千克，属低毒；斑马鱼急性毒性试验参照国家环保总局1991年9月14日颁布的《物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》完成，其LD50大于5000ppm。证明其对水生生物属低毒和无毒作用。
表1产气肠杆菌W5生化鉴定结果
  检测项目   结果   检测项目   结果
  革兰氏染色   -   硝酸盐还原   +
  细胞形状   短杆状   D-半乳糖   +
  细胞直径＞1.0μm   -   麦芽糖   +
  形成内生孢子   -   龙胆二糖   +
  产色素   -   D-蜜二糖   +
  运动   +   α-甲基-D-葡萄糖苷   +
  鞭毛   +   D-棉籽糖   +
  接触酶   +   松二糖   +
  氧化酶   -   D-乳糖   +
  吲哚   -   蔗糖   +
  V-P   +   D-海藻糖   +
  甲基红   -   D-山梨醇   +
  硫化氢   -   木糖醇   -
  葡萄糖产酸   +   乙酸   +/-
  葡萄糖产气   +   α-羟基丁酸   -
  淀粉水解   -   β-羟基丁酸   +
  明胶水解   -   丙酮酸甲基   +
  D-葡萄糖   +   琥珀酸甲基   -
  N-乙酰-D-葡萄糖胺   +   丙二酸   -
  L-阿拉伯糖   +   琥珀酸   +
  D-甘露醇   +   甘油   +
  D-甘露糖   +   尿素   -
  吐温80   +   m-肌醇   +
  D-阿拉伯醇   -   L-乌氨酸   +
  D-纤维二糖   +   L-苯丙氨酸   -
  D-果糖   +   柠檬酸   +
  D-葡萄糖酸   +
本发明的有益效果是：所筛选得到的产气肠杆菌溶藻活性高而稳定，其发酵液经121℃处理后在2-12的pH范围内的溶藻活性仍很稳定，能有效杀灭水华蓝藻，而且利用该产气肠杆菌控制蓝藻水华成本低，其小试产品成本为66.2元/500克，用户试用表明每立方水体成本约0.22元。批量生产后成本应还会大幅降低。、操作简单、无污染、对环境不构成危害，可使用于湖泊、水库等富营养化水域蓝藻水华控制，同时也可作为农业养殖水体和城市公园水体、景观水体等中的一种新型杀灭有害藻类的技术。
生物材料样品保藏
本菌种保藏日期为2006年5月19日，保藏编号为：CCTCC NO：M206049。分类命名为：产气肠杆菌W5(Enterobacter aerogenes W5)，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072。
具体实施方式
发酵培养试验：首先按1％接种量将该产气肠杆菌接种到上述的添加柠檬酸钠的液体基础培养基中，在37℃下培养，每2小时测一次OD650，绘制生长曲线，确定发酵时间。发酵设备为50L的BI06000A微生物发酵系统，由上海理工大学高机生物工程有限公司生产，灭菌参数为121℃，20-30分钟，发酵参数为pH5.8.0-7.0，DO 70-90，发酵温度34.0-39.0℃，搅拌速度70-130转/分钟，发酵时间16-48小时，发酵培养基为上述的添加柠檬酸钠的基础培养基。发酵液在进口温度200℃，出口温度73℃条件下喷雾干燥。
应用实例。2004年9月在华中师范大学水资源与水环境研究中心实验基地进行了干粉控制微囊藻水华的试验。试验在几个3×4×0.5米的水泥池中进行，使用浓度设置200ppm，20ppm，2ppm几个梯度。结果表明200ppm在2天时间就有效控制了水华，20ppm浓度组则在5天时间内有效控制了水华，而2ppm在15天时间内才有效控制住水华。
此外，2005年5-6月还在武汉市洪山区洪山乡板桥村的3口各约300平方米的池塘中进行了水华微囊藻的控制实验。每池使用干粉剂量约为500克，有效控制了水华的爆发，而相邻的未使用干粉的几口池塘则爆发了微囊藻水华。

Claims (8)

1、一株分泌溶藻物质的产气肠杆菌，其特征是该产气肠杆菌为产气肠杆菌W5，生化鉴定结果为：   检测项目   结果   检测项目   结果   革兰氏染色   -   硝酸盐还原   +   细胞形状   短杆状   D-半乳糖   +   细胞直径＞1.0μm   -   麦芽糖   +   形成内生孢子   -   龙胆二糖   +   产色素   -   D-蜜二糖   +   运动   +   α-甲基-D-葡萄糖苷   +   鞭毛   +   D-棉籽糖   +   接触酶   +   松二糖   +   氧化酶   -   D-乳糖   +   吲哚   -   蔗糖   +   V-P   +   D-海藻糖   +   甲基红   -   D-山梨醇   +   硫化氢   -   木糖醇   -   葡萄糖产酸   +   乙酸   +/-   葡萄糖产气   +   α-羟基丁酸   -   淀粉水解   -   β-羟基丁酸   +   明胶水解   -   丙酮酸甲基   +   D-葡萄糖   +   琥珀酸甲基   +   N-乙酰-D-葡萄糖胺   +   丙二酸   -   L-阿拉伯糖   +   琥珀酸   +   D-甘露醇   +   甘油   +   D-甘露糖   +   尿素   -   吐温80   +   m-肌醇   +   D-阿拉伯醇   -   L-乌氨酸   +   D-纤维二糖   +   L-苯丙氨酸   -   D-果糖   +   柠檬酸   +   D-葡萄糖酸   +
2、权利要求1所述的一株分泌溶藻物质的产气肠杆菌的筛选方法，其特征是通过将自然水样浓缩10-100倍进行溶藻实验分离得到。
3、根据权利要求2所述的一株分泌溶藻物质的产气肠杆菌的筛选方法，其特征是方法步骤为：
步骤1、将自然水样接种到添加柠檬酸钠的液体基础培养基中富集培养，然后用培养物按1∶1比例接种到蓝藻中进行感染实验，筛选使被感染的藻黄化的水样，其具有溶藻特性，然后将该水样倒平板挑单菌落进行平板划线纯化，对纯化的菌株利用添加柠檬酸钠的液体基础培养基扩大培养后重新感染该敏感蓝藻，验证其溶藻特性；
步骤2、利用上述添加柠檬酸三钠的基础培养基发酵步骤1筛选出微生物，发酵条件是：
1)、灭菌参数为121℃，20-30分钟；
2)、发酵参数为：pH 5.8.0-7.0，DO 70-90，发酵温度34.0-39.0℃，搅拌速度70-130转/分钟，发酵时间16-48小时，发酵过程中不需要补料以及调节pH；
3)、发酵产物经喷雾干燥获得干粉制剂；
所述的蓝藻是淡水蓝藻，包括：野生微囊藻，铜绿微囊藻7820，铜绿微囊藻7806，铜绿微囊藻DS，水华鱼腥藻，聚球藻，颤藻，织线藻和席藻；
所述的添加柠檬酸钠的基础培养基配方为：NaNO3150毫克，K2HPO4.3H2O4毫克，毫克SO4.7H2O7.5毫克，CaCl2.2H2O3.6毫克，乙二胺四醋酸二钠盐0.1毫克，Na2CO32毫克，柠檬酸0.6毫克，柠檬酸铁铵0.6毫克，柠檬酸三钠50毫克，A5溶液0.1毫升，蒸馏水100毫升；其中A5溶液配方为：H3BO3286毫克，MnCl2.4H2O：181毫克，ZnSO4：7H2O22.2毫克，CuSO4.5H2O：7.4毫克，MoO3：1.5毫克，蒸馏水100毫升。
4、根据权利要求3所述的一株分泌溶藻物质的产气肠杆菌的筛选方法，其特征是所述的发酵条件为：灭菌参数为121℃，20分钟；发酵参数为pH 6.0，DO 80，发酵温度37.0℃，搅拌速度100转/分钟，发酵时间24小时。
5、根据权利要求3所述的一株分泌溶藻物质的产气肠杆菌的筛选方法，其特征是所述的发酵产物喷雾干燥条件为进口温度198-210℃，出口温度68-79℃。
6、根据权利要求5所述的一株分泌溶藻物质的产气肠杆菌的筛选方法，其特征是发酵产物喷雾干燥条件为进口温度200℃，出口温度73℃。
7、权利要求1所述的一株分泌溶藻物质的产气肠杆菌在蓝藻水华控制中的应用，其特征是溶藻物质的使用剂量为2-200ppm。
8、根据权利要求7所述的一株分泌溶藻物质的产气肠杆菌在蓝藻水华控制中的应用，其特征是溶藻物质的使用剂量为20ppm。
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