CN107188942A - 一种用于水产养殖饲料添加剂的花蛤抗菌肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于水产养殖饲料添加剂的花蛤抗菌肽及其制备方法，本发明花蛤抗菌肽具有抗菌谱广、抑菌效率高、无残留、不易产生耐药性等优点，可以解决现有水产养殖饲料滥用抗生素带来药残和细菌耐药性等诸多严重问题。本发明根据花蛤抗菌肽的杀菌特点，设计了一种新型抗菌肽氨基酸序列。所述花蛤抗菌肽氨基酸序列为：GFGCPNDYSCSNHCRDSIGCRGGYCKYQLICTCYGCKKRRSIQE。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，合成新型抗菌肽基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后制成粉剂、液体等抗菌肽制剂。抗菌肽制剂可作为水产养殖饲料添加剂。

Description

一种用于水产养殖饲料添加剂的花蛤抗菌肽及其制备方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及一种用于水产养殖饲料添加剂的花蛤抗菌肽及其制备方法。
背景技术
抗菌肽(antibacterial peptides，ABPs)，又称抗微生物肽，是机体抵抗外来微生物入侵而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，是机体先天免疫的重要组成部分。在自然界中，ABPs广泛存在于细菌、植物、病毒、动物体包括人体内。自20世纪80年代开始进入人们的视线，而今抗菌肽已成为研究的热点。抗生素曾被公认为是20世纪最卓越的医学发明，但近年来由于传统抗生素的滥用，药物残留和细菌耐药性以及超级细菌的出现等问题日渐严重，其副作用也越发突出，严重威胁了人类健康及世界范围内养殖业的发展，新型抗菌药物的研发显得尤为迫切。因此，在当前研究中，开发新型、高效、安全的抗菌肽类药物，对缓解抗生素过度使用带来的种种困境具有非常重大的意义。天然抗菌肽具有抗菌谱广、抑菌效率高、无残留、不易产生耐药性等优点，被称为传统抗生素的“最佳替代品”，由于其独特的优势，使得天然抗菌肽在水产养殖业中具有很大发展空间和广阔的市场应用前景。目前还没有将花蛤抗菌肽应用于水产养殖饲料添加剂的报道。
发明内容
本发明提供了一种用于水产养殖饲料添加剂的花蛤抗菌肽及其制备方法，可以解决现有水产养殖饲料滥用抗生素带来药残和耐药性等诸多严重问题。
本发明根据花蛤抗菌肽的杀菌特点，设计了一种新型抗菌肽氨基酸序列。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型抗菌肽基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后制成粉剂、液体等抗菌肽制剂。抗菌肽制剂可作为水产养殖饲料添加剂。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：花蛤抗菌肽，所述抗菌肽具有如下氨基酸序列：GFGCPNDYSCSNHCRDSIGCRGGYCKYQLICTCYGCKKRRSIQE。
进一步地，上述花蛤抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）抗菌肽基因的合成
根据花蛤抗菌肽氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，并在其N端引入Kex2酶切位点，两端引入Xho I和Xba I酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中，另设计合成一对引物P1和P2，用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，上游引物位于抗菌肽基因区，下游引物位于毕赤酵母3’AOX基因区；引物序列为：P1：5'—TCGTCGTCTATGAACAAGAA—3'，P2：5'—GCATCTTACAT'TCTTTCATAT—3'；
（2）抗菌肽表达载体的构建与鉴定
将含抗菌肽基因的载体和表达载体均用Xho I和Xba I双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR测序鉴定；
（3）重组阳性质粒转化酵母菌株与筛选
阳性质粒经Sac I单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中，电转化后均匀涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30 ℃培养3~5天，待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200 μg/mL，500 μg/mL，1000 μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株；
提取可能的高拷贝重组酵母基因组DNA，以P1、P2为引物进行PCR反应，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察，扩增的条带重组子进行阳性转化子鉴定；
（4）阳性克隆的诱导表达
将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100 μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28 ℃振摇培养15~20个小时，取此菌液按2~5%体积比转接于10 ml BMGY培养基中，28 ℃摇振培养12~20 h左右，OD600值为5~6，培养物直接转接于20~40 ml BMMY培养基中，28 ℃继续摇振培养，为了维持诱导表达，每隔12~15 h补加100%甲醇使终浓度达1~1.5%，48 h后，在4 ℃条件下，4000~6000 r/min离心10~15 min，收集上清，进行抑菌活性测定。
进一步地，经上述制备方法得到的高产抗菌肽的阳性重组子（重组毕赤酵母菌株），其高密度、高效表达的发酵罐生产工艺。
所述的花蛤抗菌肽制剂具体制备工艺如下：将筛选得到的阳性重组子活化后按3~6%接种量接种于三角瓶，28~30 ℃，150~200 r/min摇床培养18~24 h后以5~10%接种量接入发酵罐，在28~30 ℃，150~180 r/min，pH值5.0~6.0，通气量0.5~1.0 VVM（1 L发酵液1 min通入的氧气量），溶氧>20%情况下进行发酵，在培养18~24 h后，流加50%甘油，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48~72h；
发酵结束后原罐蒸汽100 ℃灭菌10~15 min，放料，5000~6000 r/min离心10~15 min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品；
上述抗菌肽半成品喷雾干燥或冻干生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂，即为抗菌肽产品。
更进一步地，上述抗菌肽产品作为水产养殖饲料的添加剂。
本发明设计的新型抗菌肽与国内外同类产品相比，生产工艺简单，生产成本低，抑菌能力强，且抗菌谱广，极具市场前景。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明做进一步的描述。在本发明中，若非特指，所有百分比均为重量单位，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
实施例1
一种用于试剂盒防腐剂的花蛤抗菌肽，所述抗菌肽具有如下氨基酸序列：GFGCPNDYSCSNHCRDSIGCRGGYCKYQLICTCYGCKKRRSIQE。
花蛤抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）抗菌肽基因的合成
根据花蛤抗菌肽氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，并在其N端引入Kex2酶切位点，两端引入Xho I和Xba I酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中，另设计合成一对引物P1和P2，用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，上游引物位于抗菌肽基因区，下游引物位于毕赤酵母3’AOX基因区。引物序列如下：
P1：5'—TCGTCGTCTATGAACAAGAA—3'；
P2：5'—GCATCTTACAT'TCTTTCATAT—3'。
（2）抗菌肽表达载体的构建与鉴定
将含抗菌肽基因的载体和表达载体均用Xho I和Xba I双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR测序鉴定；
（3）重组阳性质粒转化酵母菌株与筛选
阳性质粒经Sac I单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中，电转化后均匀涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30 ℃培养4天，待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200 μg/mL，500 μg/mL，1000 μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株；
提取可能的高拷贝重组酵母基因组DNA，以P1、P2为引物进行PCR反应，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察，扩增的条带重组子进行阳性转化子鉴定；
（4）阳性克隆的诱导表达
将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100 μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28 ℃振摇培养16个小时，取此菌液按3%体积比转接于10 ml BMGY培养基中，28 ℃摇振培养18 h左右，OD600值为6，培养物直接转接于30 ml BMMY培养基中，28 ℃继续摇振培养，为了维持诱导表达，每隔12 h补加100%甲醇使终浓度达1.2%，48 h后，在4 ℃条件下，5000 r/min离心12 min，收集上清，进行抑菌活性测定。
花蛤抗菌肽具体制备工艺如下：将筛选得到的阳性重组子活化后按4%接种量接种于三角瓶，28 ℃，180 r/min摇床培养18 h后以6%接种量接入发酵罐，在28 ℃，160 r/min，pH值6.0，通气量0.8 VVM（1 L发酵液1 min通入的氧气量），溶氧>20%情况下进行发酵，在培养18 h后，流加50%甘油，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续60h；
发酵结束后原罐蒸汽100 ℃灭菌15 min，放料，6000 r/min离心12 min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品；
上述抗菌肽半成品喷雾干燥或冻干生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂，即为抗菌肽产品，可作为水产养殖饲料的添加剂。
实施例2
一种用于试剂盒防腐剂的花蛤抗菌肽，所述抗菌肽具有如下氨基酸序列：GFGCPNDYSCSNHCRDSIGCRGGYCKYQLICTCYGCKKRRSIQE。
花蛤抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）抗菌肽基因的合成
根据花蛤抗菌肽氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，并在其N端引入Kex2酶切位点，两端引入Xho I和Xba I酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中，另设计合成一对引物P1和P2，用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，上游引物位于抗菌肽基因区，下游引物位于毕赤酵母3’AOX基因区。引物序列如下：
P1：5'—TCGTCGTCTATGAACAAGAA—3'；
P2：5'—GCATCTTACAT'TCTTTCATAT—3'。
（2）抗菌肽表达载体的构建与鉴定
将含抗菌肽基因的载体和表达载体均用Xho I和Xba I双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR测序鉴定；
（3）重组阳性质粒转化酵母菌株与筛选
阳性质粒经Sac I单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中，电转化后均匀涂布于含100 μg/mL Zeocin 的YPDS选择平板上，30 ℃培养3天，待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200 μg/mL，500 μg/mL，1000 μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株；
提取可能的高拷贝重组酵母基因组DNA，以P1、P2为引物进行PCR反应，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察，扩增的条带重组子进行阳性转化子鉴定；
（4）阳性克隆的诱导表达
将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100 μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28 ℃振摇培养18个小时，取此菌液按4%体积比转接于10 ml BMGY培养基中，28 ℃摇振培养15 h左右，OD600值为6，培养物直接转接于35 ml BMMY培养基中，28 ℃继续摇振培养，为了维持诱导表达，每隔15 h补加100%甲醇使终浓度达1.5%，48 h后，在4 ℃条件下，4500 r/min离心15 min，收集上清，进行抑菌活性测定。
花蛤抗菌肽具体制备工艺如下：将筛选得到的阳性重组子活化后按5%接种量接种于三角瓶 30 ℃，160 r/min摇床培养20 h后以7.5%接种量接入发酵罐，在30 ℃，150 r/min，pH值5.5，通气量0.6VVM（1 L发酵液1 min通入的氧气量），溶氧>20%情况下进行发酵，在培养20 h后，流加50%甘油，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48 h；
发酵结束后原罐蒸汽100 ℃灭菌12 min，放料，5000 r/min离心12 min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品；
上述抗菌肽半成品喷雾干燥或冻干生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂，即为抗菌肽产品，可作为水产养殖饲料的添加剂。
抗菌肽在试剂盒中的防腐性能试验
实验方案：分离鉴定试剂盒中常见菌，并分别进行复壮；在试剂盒中加入一定的菌量，添加实施例的抗菌肽制品，测定试剂盒的性能。同时添加化学防腐剂和不添加防腐剂作对比，测定本发明抗菌肽抗菌防腐性能。本发明抗菌肽作为防腐剂在试剂盒中的添加量为千分之一，化学防腐剂的在试剂盒中添加量为千分之五。
表1 各实施例与对比例的试验统计结果
从表1可以明显看出，各实施例中抗污染天数明显多于化学防腐剂组和无防腐剂组，说明本发明的花蛤抗菌肽具有显著抗菌防腐性能，能显著延长试剂盒保质期限。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (4)

1.一种花蛤抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽具有如下氨基酸序列：GFGCPNDYSCSNHCRDSIGCRGGYCKYQLICTCYGCKKRRSIQE。
2. 一种权利要求1所述的花蛤抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）抗菌肽基因的合成
根据花蛤抗菌肽氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，并在其N端引入Kex2酶切位点，两端引入Xho I和Xba I酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中，另设计合成一对引物P1和P2，用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，上游引物位于抗菌肽基因区，下游引物位于毕赤酵母3’AOX基因区；引物序列为：P1：5'—TCGTCGTCTATGAACAAGAA—3'，P2：5'—GCATCTTACAT'TCTTTCATAT—3'；
（2）抗菌肽表达载体的构建与鉴定
将含抗菌肽基因的载体和表达载体均用Xho I和Xba I双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR测序鉴定；
（3）重组阳性质粒转化酵母菌株与筛选
阳性质粒经Sac I单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中，电转化后均匀涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30 ℃培养3~5天，待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200 μg/mL，500 μg/mL，1000 μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株；
提取可能的高拷贝重组酵母基因组DNA，以P1、P2为引物进行PCR反应，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察，扩增的条带重组子进行阳性转化子鉴定；
（4）阳性克隆的诱导表达
将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100 μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28 ℃振摇培养15~20个小时，取此菌液按2~5%体积比转接于10 ml BMGY培养基中，28 ℃摇振培养12~20 h左右，OD600值为5~6，培养物直接转接于20~40 ml BMMY培养基中，28 ℃继续摇振培养，为了维持诱导表达，每隔12~15 h补加100%甲醇使终浓度达1~1.5%，48 h后，在4 ℃条件下，4000~6000 r/min离心10~15 min，收集上清，进行抑菌活性测定。
3.权利要求1和2所述的高产抗菌肽制剂具体制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将筛选得到的阳性重组子活化后按3~6%接种量接种于三角瓶，28~30 ℃，150~200r/min摇床培养18~24 h后以5~10%接种量接入发酵罐，在28~30 ℃，150~180 r/min，pH值5.0~6.0，通气量0.5~1.0 VVM（1 L发酵液1 min通入的氧气量），溶氧>20%情况下进行发酵，在培养18~24 h后，流加50%甘油，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48~72h；
（2）发酵结束后原罐蒸汽100 ℃灭菌10~15 min，放料，5000~6000 r/min离心10~15min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品；
（3）上述抗菌肽半成品喷雾干燥或冻干生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂，即为抗菌肽产品。
4.上述任一权利要求所述的抗菌肽产品作为水产养殖饲料的添加剂。
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