CN109627310A - 一种字纹弓蟹抗菌蛋白提取方法及其食品保鲜应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种字纹弓蟹抗菌蛋白提取方法及其食品保鲜应用，提取方法包括取字纹弓蟹的鳃以及肠道等组织，采用物理匀浆法处理得到潮汕扁蟹组织匀浆液；12000rpm离心10min后取上清过滤纸除去油脂类成分得到抗菌蛋白粗提液1；采用饱和硫酸铵溶液与粗提液1等体积混合4℃条件下盐析6小时，离心后得沉淀，将沉淀复溶得到抗菌蛋白粗提液2；抗菌蛋白粗提液2进而用葡聚糖凝胶G‑150层析柱纯化，收集出峰各管可得抗菌蛋白精提液，冷冻干燥制备抗菌蛋白成品。本发明提取工艺简单、成本低，适用于间歇性和规模化生产加工高纯度、高收率的字纹弓蟹抗菌蛋白成品。本发明制得的抗菌蛋白提取液在抑菌活性方面有着非常明显的优势；可长时间贮存，可用于草莓防腐保鲜。
Description
技术领域
本发明属于天然产物深加工技术领域，具体涉及一种字纹弓蟹抗菌蛋白及其提取方法。
背景技术
我国海洋生物营养丰富，对海洋生物活性多糖、蛋白、脂类及一些其他活性小分子的研究层出不穷，其中对于海洋生物抗菌蛋白或者抗菌肽的提取和应用在食品领域具有现实的应用潜力和价值。潮汕扁蟹学名字纹弓蟹(学名：Varuna litterata)，为弓蟹科弓蟹属的动物。分布于日本、圣诞岛、新加坡、泰国、印度、马达加斯加、非洲东岸、中国台湾以及广东、海南岛、西沙群岛、福建、浙江等地，生活环境为海水，一般生活于河口半咸水地区、又可到离河口不远的淡水中，有时爬在海边漂浮的木材上。潮汕扁蟹只有手表大小，但是膏腴肉厚，味道甘香甜美，一点也不比那些名声在外的大闸蟹差。每年的7到8 月便是扁蟹上市的黄金时间。潮汕扁蟹对环境洁净度要求甚高，平时只在水田出没，其中在汕头生长的扁蟹，肉嫩膏香，可以蒸糯米饭、煮汤、煲粥，当地人最爱的做法还是腌蟹。但潮汕扁蟹市场售价不高，且受季节影响其潜在价值开发并未见报道。因此，开发此低值海产品，对其生物体内的抗菌成分进行分离提取、及其进一步的开发利用，对潮汕扁蟹的高附加值产品开发具有重要研究价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种字纹弓蟹抗菌蛋白提取方法及其食品保鲜应用，以解决现有技术存在的问题。
一种字纹弓蟹抗菌蛋白提取方法，主要包括以下步骤：
(1)制备扁蟹组织：取完整扁蟹，只取其鳃以及肠道器官等组织，四肢及壳以及其他肢体弃之不用，得到扁蟹组织；
(2)制备扁蟹组织匀浆液：将扁蟹组织与蒸馏水混合，用搅碎机搅碎匀浆得到扁蟹组织匀浆液；
(3)制备抗菌蛋白粗提液1：将扁蟹组织匀浆液离心，收集上清，过滤纸除去脂类，得到抗菌蛋白粗提液1；且由于上清液中漂浮着一定量的油脂类成分，所以用滤纸抽滤，吸附除去脂类物质；
(4)制备抗菌蛋白粗提液2：用饱和硫酸铵溶液盐析沉淀蛋白，离心后得沉淀，将沉淀复溶制得抗菌蛋白粗提液2；
(5)制备抗菌蛋白精提液：采用葡聚糖凝胶G-150进行层析纯化抗菌蛋白粗提液2，收集蛋白活性峰，制得抗菌蛋白精提液；
(6)冷冻干燥制备抗菌蛋白成品。
进一步的，步骤(4)中用饱和硫酸铵溶液盐析沉淀蛋白为取饱和硫酸铵溶液和粗提液1等体积混合在4℃条件下盐析6小时。在本发明的探索实验过程中也选用了醇沉及乙醇硫酸铵双水相体系想富集活性蛋白，但都没有效果，只有饱和硫酸铵盐析方法有效。
进一步的，步骤(5)中所述采用葡聚糖凝胶G-150进行层析纯化抗菌蛋白粗提液2时的层析条件为：柱材为葡聚糖凝胶G-150；分离分子量范围 5000-300000Da；洗脱液为蒸馏水；流速为1.5mL/min；每3分钟20秒收集一管；每管收集5mL。洗脱图谱有一个大峰且出峰各管均具有明显的抑菌活性，收集出峰各管可得抗菌蛋白精提液。
进一步的，步骤(2)中扁蟹组织与蒸馏水混合的比例为2mL蒸馏水对应 1g扁蟹组织。
进一步的，步骤(3)和步骤(4)中所述离心的转速为12000rpm，时间为 10-15min。
本发明测定蛋白质浓度采用的方法为BCA法。
上述字纹弓蟹抗菌蛋白提取方法所得抗菌蛋白粗提物1和抗菌蛋白粗提液 2。
上述字纹弓蟹抗菌蛋白提取方法所得抗菌蛋白精提液和抗菌蛋白成品。
上述抗菌蛋白精提液和抗菌蛋白成品的应用，用于食品保鲜。
上述抗菌蛋白精提液和抗菌蛋白成品的应用，用于草莓的保鲜防腐。
所述抗菌蛋白精提液和抗菌蛋白成品对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有明显的抑菌效果。抑菌能力为1mg/mL的抗菌蛋白精提液和0.2mg/mL的硫酸庆大霉素效果相当。草莓保鲜应用表明2mg/mL的抗菌蛋白精提液能有效的延缓草莓的腐烂以及保持草莓比较鲜艳的色泽和较好的质地，同时对于草莓内的总酸含量和Vc含量也有一定的延缓降低的作用。
与现有技术相比，本发明从字纹弓蟹中筛选具有抑菌活性的抗菌物质，进一步纯化提高活性及纯度，进而应用于食品保鲜防腐领域，扩宽字纹弓蟹的应用领域。本发明制得的抗菌蛋白能够很好的保持抗菌蛋白的抑菌活性，对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有明显的抑菌效果。抑菌能力为1mg/mL的抗菌蛋白成品和0.2mg/mL的硫酸庆大霉素效果相当，对比其他4种海洋生物来源的提取液和另外4种种属来源的螃蟹提取液抑菌活性相比，本发明制得的抗菌蛋白提取液在抑菌活性方面有着非常明显的优势。草莓保鲜应用表明2mg/mL的抗菌蛋白精提液能有效的延缓草莓的腐烂以及保持草莓比较鲜艳的色泽和较好的质地，同时对于草莓内的总酸含量和Vc含量也有一定的延缓降低的作用。
本发明的字纹弓蟹抗菌蛋白及其贮存和提取方法具有的优点：
(1)本发明依次采用直接提取、硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶柱纯化除盐，避免了传统亲和层析技术的成本高、上样量低等弊端，提取工艺简单、成本低，适于间歇性和规模化生产加工高纯度、高收率的字纹弓蟹抗菌蛋白成品。
(2)本发明制得的抗菌蛋白粗提物可于4℃下保存20日不变性，对于精提液和成品，在-20℃冷冻条件下，很稳定，基本不会变性，可长时间保存。可用于抗菌蛋白的贮存，使具有抑菌活性及食品保鲜应用的抗菌蛋白长时间贮存。且稳定性研究表明，抗菌蛋白粗提物能耐60℃高温和较碱的pH环境。
(3)本发明制得的抗菌蛋白成品纯度高、具有良好的抑菌效果和草莓保鲜应用，将本发明不同步骤所得的抗菌蛋白样品实施相关抑菌活性测定，发现随着对提取液一步步的纯化，抑菌活性越来明显。抑菌强弱顺序为：精提液>粗提液2>粗提液1(相同蛋白浓度条件下)。
(4)发明制得的抗菌蛋白其独特的杀菌机理导致细菌不会因突变而产生耐药性。而且应用到食品保鲜防腐领域更具备诸多优势，如应用于草莓保鲜实例中更绿色、环保、在保鲜后期能有效改善草莓缩水，颜色褐变，保持草莓较鲜艳的色泽及较好的质地。
附图说明
图1是本发明的字纹弓蟹抗菌蛋白提取工艺流程图；
图2是实施例1的不同提取步骤中抗菌蛋白的收率；
图3是实施例1的不同提取步骤中抗菌蛋白的外观图，(a)、(b)、(c)、(d)、 (e)分别是组织匀浆液、抗菌蛋白粗提液1、抗菌蛋白粗提液2、抗菌蛋白精提液、抗菌蛋白成品；其中(b)表示过滤纸前后的效果图；
图4是实施例1的不同提取步骤中抗菌蛋白溶液的抑菌活性效果图；(a)为大肠杆菌抑菌活性图；(b)为金黄色葡萄球菌抑菌活性图；其中抗菌蛋白粗提取液1的蛋白浓度：12.2575mg/mL；抗菌蛋白粗提取液2的蛋白浓度： 12.4671mg/mL；抗菌蛋白精提液的蛋白浓度：1mg/mL；抗菌蛋白成品的蛋白浓度：1mg/mL；阳性药物为0.2mg/mL的硫酸庆大霉素；
图5是4种海洋生物扇贝、牡蛎、河蚬及贻贝的粗提取液与本发明的抗菌蛋白粗提液1的抑菌活性对比图；其中阳性药物为0.2mg/mL的硫酸庆大霉素；
图6是大闸蟹、锯缘青蟹、红星梭子蟹及拥剑梭子蟹的提取液抑菌活性效果图；其中阳性药物为0.2mg/mL的硫酸庆大霉素；
图7是本发明实施例中扁蟹抗菌蛋白粗提液2的温度稳定性抑菌效果图；抗菌蛋白粗提液2蛋白质浓度为12.4671mg/mL；阳性药物为0.2mg/mL的硫酸庆大霉素；
图8是本发明实施例中扁蟹抗菌蛋白粗提液2的pH稳定性抑菌效果图；抗菌蛋白粗提液2蛋白质浓度为12.4671mg/mL；阳性药物为0.2mg/mL的硫酸庆大霉素；
图9是本发明实施例中抗菌蛋白精提液应用于草莓保鲜各参考指标图，其中，(a)为草莓感官变化趋势图；(b)为草莓腐烂率趋势图；(c)为草莓总酸含量变化趋势图；(d)为草莓VC含量变化趋势图；其中A组为0.5％的酸性壳聚糖溶液组；B组为0.5％山梨酸钾组；C组为2mg/ml的抗菌蛋白精提液；D组为空白溶液组。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
制备抗菌蛋白提取物
字纹弓蟹抗菌蛋白提取工艺流程图如图1所示，主要包括以下步骤：
(1)制备扁蟹组织：取完整扁蟹，只取其鳃以及肠道器官等组织，四肢及壳以及其他肢体弃之不用，得到扁蟹组织。
(2)制备扁蟹组织匀浆液：将扁蟹组织与蒸馏水按照比例为2mL蒸馏水对应1g扁蟹组织匀浆。用搅碎机搅碎匀浆得到扁蟹组织匀浆液。得到的组织匀浆液外观如图3(a)所示。
(3)制备抗菌蛋白粗提液1：将扁蟹组织匀浆液离心，离心的转速为 12000rpm，时间为10-15min，收集上清。但由于上清液中漂浮着一定量的油脂类成分，所以用滤纸抽滤，吸附除去脂类物质，得到抗菌蛋白粗提液1，外观如图3(b)所示。
(4)制备抗菌蛋白粗提液2：硫酸铵溶液盐析沉淀的方法为先配制饱和硫酸铵溶液，然后取饱和硫酸铵溶液和粗提液1等体积混合在4℃条件下盐析6小时，盐析出大量沉淀后离心，离心条件为12000rpm离心10-15min后得沉淀。将沉淀复溶制得抗菌蛋白粗提液2，外观如图3(c)所示。采用醇沉及乙醇硫酸铵双水相体系想富集活性蛋白，但都没有效果，只有饱和硫酸铵盐析方法有效。
(5)制备抗菌蛋白精提液：采用葡聚糖凝胶G-150进行层析纯化抗菌蛋白粗提液2时的层析条件为：柱材为葡聚糖凝胶G-150；分离分子量范围 5000-300000Da；洗脱液为蒸馏水；流速为1.5mL/min；每3分钟20秒收集一管；每管收集5mL。绘制洗脱图谱，测定出峰管抑菌活性。收集蛋白活性峰，制得抗菌蛋白精提液，外观如图3(d)所示。
(6)冷冻干燥制备抗菌蛋白成品，外观如图3(e)所示。
通过BCA法测定不同提取步骤中溶液的蛋白浓度可得到抗菌蛋白浓度及收率。同时对不同提取步骤中抗菌蛋白的收率进行统计分析，并观察不同提取步骤中抗菌蛋白的外观。不同提取步骤中抗菌蛋白的收率图如图2所示。
上述实施例的步骤中各条件可以根据说明书的内容进行适应性的变动。
实施例2
抑菌活性测定指标评定
本实施例中样品溶液为实施例1的不同提取步骤中的抗菌蛋白提取液。
菌种活化：取无菌三角瓶，加入液体LB培养基30mL；从-80℃冰箱中取出保存的菌种，吸取500μL的大肠杆菌于三角瓶中，37.0℃摇床培养6h，活化后置于4℃冰箱中备用；金黄色葡萄球菌的活化方法与上述一致，培养6h后在置于4℃冰箱中备用。
菌液浓度测定：采用平板稀释法测定菌液浓度，具体方法如下：9支EP管编号，各加入900μL无菌水；取100μL的大肠杆菌活化液置于1号管，轻轻吹打并用振荡器充分混匀，吸取100μL加入到2好管中，依次加至9号管；于7、 8、9三个管中取100μL涂布于LB培养基平皿中，每组3个平行；在37℃培养箱中培养18-24h后观察，挑选菌落数在20-100个的平板计数，计算出平均值以及原菌液浓度；金黄色葡萄球菌的计数方法于上述一致。
96微孔板培养法测定抑菌活性：具体方法如下：根据原菌液浓度取适量原菌液加入到无菌的LB液体培养基中，配制成菌悬液浓度为5x104CFU/mL的混菌培养基；取不同提取步骤的提取液过0.22μm无菌滤膜于无菌EP管中备用；取无菌96孔板，每孔加入150μL混菌培养基和50μL样品/阳性药物/无菌水，每组3个平行；其中阳性药物为0.2mg/mL的硫酸庆大霉素，同时设置一组只有混菌培养基；在37℃培养箱中培养12-18h后测定OD600值。
实验结果如图4所示，不同提取步骤中的抗菌蛋白提取液均具有抑菌活性，且随着一步步的纯化，抑菌活性越来越强。具体表现为抗菌蛋白粗提液1对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌略有抑菌活性；抗菌蛋白粗提液2对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌活性明显增强；抗菌蛋白精提液对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌活性很强，抑菌能力为1mg/mL的抗菌蛋白精提液和0.2mg/mL的硫酸庆大霉素效果相当。实验结果表明，抗菌蛋白提取液有较明显的抑菌能力，且随着一步步的纯化，抑菌活性越来越强。
实施例3
其他4种海洋生物来源提取液和另外4种螃蟹提取液活性对比
其他4种海洋生物来源提取液：从市场上分别购得扇贝、牡蛎、河蚬及贻贝，按照上述扁蟹粗提液1提取步骤分别处理这4种生物。每一种生物获得的提取液过0.22μm无菌滤膜于无菌EP管中备用；抑菌活性测定如上述实施例2 中所述。
其他种属螃蟹提取液活性对比：从市场上分别购得大闸蟹、锯缘青蟹、红星梭子蟹及拥剑梭子蟹，按照上述扁蟹粗提液提取步骤处理这4种螃蟹。对于粗提液对金黄色葡萄球菌有抑菌活性的锯缘青蟹，进一步盐析处理及过葡聚糖凝胶G-75。每一步获得的样品过0.22μm无菌滤膜于无菌EP管中备用；抑菌活性测定如上述实施例2中所述。
5种不同海洋生物来源的提取液抑菌活性如图5所示，结果表明：只有扁蟹粗提液具有抑菌活性，虽然活性较弱，但对比其他4种海洋生物来说，具有明显的抑菌优势。
其他4种螃蟹提取液的抑菌活性如图6所以，4种螃蟹粗提液只有锯缘青蟹粗提液对金黄色葡萄球菌有较明显的抑菌活性，因此进一步通过盐析纯化的锯缘青蟹盐析复溶液对大肠杆菌的抑菌活性表现出来，而进一步通过层析柱纯化后，出峰各管均无抑菌活性。所以通过对比扁蟹和其他4种螃蟹抑菌活性，发现扁蟹在抑菌活性方面比其他4种螃蟹有着非常突出的抑菌活性优势，且随着盐析及柱层析纯化，其活性并没有损失，反而随着纯度增加，其活性越来越强。
扁蟹和其他海洋生物以及螃蟹抑菌对比效果如表1所示。
表1是扁蟹和其他海洋生物以及螃蟹抑菌对比效果
注：#表示无抗菌活性，菌群浓度高于空白对照组
*表示有抗菌活性，抗菌活性不强，菌群浓度低于于空白对照组
**表示抗菌活性居中，菌群浓度明显低于于空白对照组
***表示抗菌活性强，菌群浓度接近阳性药物组的菌群浓度
实施例4抗菌蛋白稳定性测定指标评定
温度稳定性研究：具体方法如下：取制得的抗菌蛋白粗提液2，按温度梯度分别设置常温、40℃、60℃、80℃和100℃。将抗菌蛋白粗提液2分成5组，然后分别放置在不同温度梯度的水浴条件下保温10min后取出，过0.22μm无菌滤膜于无菌EP管中备用。抑菌方法为上述96微孔板培养法。
pH稳定性研究：具体方法如下：取制得的抗菌蛋白粗提液2，按pH梯度分别将溶液调成pH＝3、5、正常组、9、11后，过0.22μm无菌滤膜于无菌EP 管中备用。抑菌方法为上述96微孔板培养法。
结果如图7所示，发现抗菌蛋白粗提液2在60℃时抑菌活性仍大部分保持，而温度超过80℃后，抑菌活性几乎完全丧失。pH稳定性如图8所示，抗菌蛋白粗提液2能耐pH为5-11的环境，实验结果表明抗菌蛋白粗提液能耐较高的温度以及偏碱的pH环境，这对于抗菌蛋白提取液的长时间保存都是非常有利的。
实施例5草莓保鲜应用
将挑选好的草莓随意分成四组，每组50个。将它们分别浸入0.5％酸性壳聚糖溶液，0.5％山梨酸钾，样品溶液及空白溶液30秒钟。取出后吹干，然后放在4℃下贮存。上述三组实验均重复一次。每隔2天测定一次草莓的质量指标。这些质量指标包括总酸含量，腐烂率及Vc含量。每次测定时，均从每组试样中随意取出7-10颗草莓，用组织捣碎机捣碎后用于测定其它质量指标。
感官变化：每两日一次检查其外观，色泽，硬度等情况，对其进行评价。5 分：色泽鲜红光亮，风味浓郁，与采收时口感相当；3分：色泽较红，风味正常，稍有光泽，略失水；1分：色泽暗淡，风味淡或异常，有霉斑。
总酸含量：准确称取混合均匀磨碎的样品10g，转移至100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，8000r/min离心10min，取20mL滤液转移至100mL 三角瓶中，滴加1％酚酞指示剂2滴，用标定的0.1M Na OH滴定，0.5min内不变色。计算公式：总酸度(％)＝(V×C×N×折算系数)×100/(W×V1)注 V：样品稀释总体积；
V1：滴定时取样总体积；C：消耗NaOH标准液毫升数；N：NaOH标准液摩尔浓度；W：样品重量；折算系数：按照苹果酸计，0.067
腐烂率：腐烂率＝(烂果数/总果数)×100％
Vc含量：紫外吸收法
通过连续观察8天，实验结果如图9所示，发现扁蟹抗菌蛋白精提液对草莓保鲜有很好的应用。其他防腐剂如0.5％的酸性壳聚糖溶液和0.5％山梨酸钾组在保鲜后期草莓均出现缩水，颜色褐变等，而本发明的抗菌蛋白提取液能有效改善这些感官变化，保持草莓较鲜艳的色泽及较好的质地，改善草莓品质。
在抗菌蛋白精提液蛋白浓度为2mg/mL的条件下，抗菌蛋白精提液可以有效延缓草莓的腐烂，而且能够保持草莓比较鲜艳的色泽和较好的质地，同时对于草莓内的总酸含量和Vc含量也有一定的延缓降低的作用。实验结果表明，通过本发明的提取纯化方法制得的抗菌蛋白精提液可以应用于草莓的保鲜。
Claims (9)
1.一种字纹弓蟹抗菌蛋白提取方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)制备扁蟹组织：取完整扁蟹，只取其鳃以及肠道器官等组织，四肢及壳以及其他肢体弃之不用，得到扁蟹组织；
(2)制备扁蟹组织匀浆液：将扁蟹组织与蒸馏水混合，用搅碎机搅碎匀浆得到扁蟹组织匀浆液；
(3)制备抗菌蛋白粗提液1：将扁蟹组织匀浆液离心，收集上清，过滤纸除去脂类，得到抗菌蛋白粗提液1；
(4)制备抗菌蛋白粗提液2：用饱和硫酸铵溶液盐析沉淀蛋白，离心后得沉淀，将沉淀用去离子水复溶制得抗菌蛋白粗提液2；
(5)制备抗菌蛋白精提液：采用葡聚糖凝胶G-150进行层析纯化抗菌蛋白粗提液2，收集蛋白活性峰，制得抗菌蛋白精提液；
(6)冷冻干燥制备抗菌蛋白成品。
2.根据权利要求1所述字纹弓蟹抗菌蛋白提取方法，其特征在于，步骤(4)中用饱和硫酸铵溶液盐析沉淀蛋白为取饱和硫酸铵溶液和粗提液1等体积混合在4℃条件下盐析6小时。
3.根据权利要求1所述字纹弓蟹抗菌蛋白提取方法，其特征在于，步骤(5)中所述采用葡聚糖凝胶G-150进行层析纯化抗菌蛋白粗提液2时的层析条件为：柱材为葡聚糖凝胶G-150；分离分子量范围5000-300000Da；洗脱液为蒸馏水；流速为1.5mL/min；每3分钟20秒收集一管；每管收集5mL。
4.根据权利要求1所述字纹弓蟹抗菌蛋白提取方法，其特征在于，步骤(2)中扁蟹组织与蒸馏水混合的比例为2mL蒸馏水对应1g扁蟹组织。
5.根据权利要求1所述字纹弓蟹抗菌蛋白提取方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中所述离心的转速为12000rpm，时间为10-15min。
6.根据权利要求1所述字纹弓蟹抗菌蛋白提取方法所得抗菌蛋白粗提物1和抗菌蛋白粗提液2。
7.根据权利要求1所述字纹弓蟹抗菌蛋白提取方法所得抗菌蛋白精提液和抗菌蛋白成品。
8.根据权利要求7所述抗菌蛋白精提液和抗菌蛋白成品的应用，其特征在于，用于食品保鲜。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，用于草莓的保鲜防腐。
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