CN101558114A - 含有寡聚半乳糖醛酸和聚阳离子糖的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有一种或多种寡聚半乳糖醛酸((1→4)－α－D－聚半乳糖醛酸)或任何其他可能呈“蛋盒”构象的寡糖(oligoguluronan)的“生物活性”组合物，该构象通过一种或多种聚阳离子糖来进一步稳定，聚阳离子糖优选为壳聚糖寡糖或壳聚糖多糖。本发明还涉及制备该组合物的方法及其在医学、药物、农业、保健食品、食品、饲料、织物、化妆品、工业和/或环境应用中的用途。

Description

含有寡聚半乳糖醛酸和聚阳离子糖的组合物
发明领域
本发明涉及含有一种或多种寡聚半乳糖醛酸((1→4)-α-D-聚半乳糖醛酸或任何其他可呈“蛋盒(egg box)”构象的寡糖(oligoguluronan)的“生物活性”组合物，该构象通过一种或多种聚阳离子糖来进一步稳定，聚阳离子糖优选壳聚糖寡糖或壳聚糖多糖。
本发明还涉及制备该组合物的方法及其在医学、药物、农业、保健食品、食品、饲料、织物、化妆品、工业和/或环境应用中的用途。
发明背景
果胶和果胶片段
天然多糖，如淀粉、纤维素、几丁质、藻酸盐和果胶具有很大的技术重要性，因为它们可以大量获得并且具有通常在合成聚合物中不存在的特定特征。
果胶构成致密的分子网络，这就是植物细胞壁的许多机械特性的原因。
果胶的须状区(鼠李聚糖半乳糖醛酸)与光滑的同型聚半乳糖醛酸(聚半乳糖醛酸)结构域共存，该结构域可以按照所谓的“蛋盒模型”形成二聚物(Grant，FEBS letters，第32卷，p.195-198，1973)。通过圆二色性，已经证实了这种钙的链间螯合作用的“蛋盒”构象的存在(POWELL等，Journal of Molecu1ar Biology vol.155，p.517-531，1982)。
细胞壁中这样的连接区域的程度主要取决于聚阴离子的电荷密度，二价阳离子的可用性，并受甲酯化和乙酰酯化的抑制(Liners等，Plant Physiology，第90卷，p.1090-1104，1992)。
果胶还是参与形态学过程和宿主-病原体相互作用的特许靶。蛋白水解酶释放寡聚半乳糖醛酸，其可以调节细胞壁基质和原生质体内的不同生理过程。
还已知在不同的浓度下，这些寡聚半乳糖醛酸可以改变细胞的生物活性。
因此，这些寡聚半乳糖醛酸适用于处理植物，尤其在基于使用这些天然产物的生长和保护植物的方法中。更特别地，这些寡聚半乳糖醛酸适用于诱导提高的对抗病原体的先天植物防御。
Van Cutsem和Messiaen(Planta，第208卷，p.246-256，1999)描述了在竞争单价和二价阳离子(Na+，Ca2+)的存在下，聚胺对聚半乳糖醛酸的吸附。在聚胺中，测试了腐胺、亚精胺和精胺。作者表明植物细胞中由Ca2+结合的(1→4)-α-D-寡聚半乳糖醛酸启动的信号转导级联被亚精胺和精胺所阻断，但不被腐胺阻断。猜测亚精胺和精胺对Ca2+诱导的果胶片段的超分子构象的破坏是果胶信号抑制的原因。因此，看起来聚胺可以通过调节果胶信号的转导而作用于植物细胞生理学。其他寡糖如藻酸盐可以具有这种“蛋盒”构象并可以作用于植物生理学。
几丁质和壳聚糖
几丁质是自然界广泛分布的天然高分子量聚合物(纤维素之后的第二大主要生物聚合物)，并且是昆虫和甲壳动物外壳的主要成分。几丁质还是一些真菌和其他生物体的细胞壁的一部分。通过几丁质的化学修饰在工业水平上产生壳聚糖，并且也在少数生物体中天然存在。
壳聚糖是N-乙酰(D)-葡糖胺和(D)-葡糖胺的无规共聚物。国际专利申请WO 03/068824描述了壳聚糖的化学结构和获得这种壳聚糖的各种方法。此外，该专利申请还描述了从真菌和酵母生物质分离细胞壁衍生物的方法以及从该方法获得壳聚糖的方法。该专利申请还描述了壳聚糖在医学、药物、农业、保健食品、食品、织物、化妆品、工业和/或环境应用中的用途。
然而，壳聚糖仍然具有一些缺陷，如获得生理效应所需的高浓度(超过1g/升)，并且在这样的高浓度下可能是有毒的。
果胶和壳聚糖混合物
US5919574描述了从果胶和壳聚糖制造的生物可降解叠层薄膜。该专利阐述了壳聚糖的阳离子特性提供了利用与阴离子的部分脱甲基果胶的静电相互作用的机会。该专利的发明人称在果胶的羧酸根基团和壳聚糖的质子化氨基之间存在氢键结合和静电力的组合且相适水活度使得果胶膜和壳聚糖膜之间可以存在稳定的界面。该专利还描述了所获得的叠层薄膜在许多应用，包括医学应用(贴剂、生物可降解的药袋或包的生产、活细胞的包胶等)中的用途。
国际专利申请WO 01/82724描述了含有氨基多糖和负电荷多糖的组合物。在测试的氨基多糖中，发明人描述了与负电荷多糖，如果胶的结合壳聚糖和壳聚糖衍生物。
然而，这些文献中没有一篇描述可以改善果胶片段(寡聚半乳糖醛酸)的生物活性。也没有一篇描述壳聚糖分子对钙诱导的聚半乳糖醛酸的生物活性构象的任何作用。更特别地，这些文献中没有一篇描述对于果胶和壳聚糖片段的组合的诱导剂(elicitor)或肥料作用。
已知传统上通过使用合成的化学药品实现植物生产，而合成的化学药品通常对环境不利并且通常是昂贵的。
因此，使用这些天然产物可以减少施用于作物的作物保护或肥料化学药品的用量，使得产生合适的有机农业并最小化农业的环境影响。
在过去的数十年中，有机产品的销售显示出每年增加至少20％。有机食品和饮料零售业中增长最快的部门大约为128亿美元。有机食品也正在一些国家内获得国际认可，如日本和德国，变成重要的国际有机食品市场。
发明目的
本发明的第一个目的是提供具有改良特性的聚半乳糖醛酸的组合物，改良特性如稳定的蛋盒构象，优选通过2F4抗体可检测的(F.LINERS，J.-J.LETESSON，C.DIDEMBOURG和P.VAN CUTSEM(1989)Monoclonal antibodies against pectin：recognition of aconformation induced by calcium(对抗果胶的单克隆抗体：由钙诱导的构象的识别)，Plant Physiol.91，1419-1424)，尤其是对于植物生长和保护的改善的生物活性。
本发明的另一个目的是提出由天然产物制得的组合物。
本发明的再一个目的是提供一种组合物，其对于寡聚半乳糖醛酸具有新特性，并且其可以用于医学、药物、保健食品、食品、织物、化妆品、工业和/或环境应用中。
发明概述
本发明涉及含有一种或多种寡聚半乳糖醛酸(优选(1→4)-α-D-寡聚半乳糖醛酸、oligoguluronan(如藻酸盐的寡聚物)或任何可以呈现“蛋盒”构象的寡聚物(添加一种或多种阳离子(Ca2+、Na+……)的组合物，该构象优选通过2F4来检测，并且有利地通过(添加)一种或多种聚阳离子糖来进一步稳定。聚阳离子糖意指具有多个正电荷，优选至少6(六)个电荷的糖。
有利地，这些糖是天然产物(不同于合成的聚合物或寡聚物)，这表示它们获自天然可再生来源，具有很少或没有改变。
有利地，聚阳离子糖是寡糖或多糖，优选壳聚糖寡糖或壳聚糖聚合物。更优选，所用的壳聚糖寡糖或多糖具有低于50％的乙酰化程度，优选包括0至约50％，和高于5(五)的聚合度。
此外，根据本发明的组合物中存在的寡聚半乳糖醛酸优选具有高于8(八)的聚合度(DP)，优选包括9(九)至20(二十)或9(九)至15(十五)。
本发明人出人意料地发现了这样的组合物的特征在于协同效应，这意味着其改善了寡聚半乳糖醛酸和/或可能的oligoguluronan(例如，藻酸盐寡聚物)或其他寡糖的特征(尤其是农艺学特性)，而且还减轻了聚阳离子糖可能的副作用，尤其是如果这些聚阳离子糖是壳聚糖寡糖或壳聚糖聚合物。特别地，这样的组合物出人意料地降低了壳聚糖分子可能的毒性，因此控制和减少了细胞死亡(由这些高浓度的壳聚糖分子引起的)。
该组合物协同提高了每种寡糖在各种领域中的生物活性并且结合了它们各自的在各个领域中的增强效应，这些领域包括医学、药物、农业、保健食品、食品、饲料、织物、化妆品、工业、织物或纸张生长和/或环境应用。可以通过共价或非共价连接将该组合物结合到固体支持物表面上。
特别地，该组合物是可以用于保护植物(提高对抗病原体的天然植物防御)以及用于刺激植物生长和分化的诱导剂组合物。诱导可以解释为基本上所有生物体的细胞和组织应答并适应外部环境条件的变化的机制。在许多情况下，这些机制使用特定化学药品的特异性受体的途径。当这样的化学药品接触细胞表面时，它们特异性地结合特定的受体。这种结合引发了细胞内事件的级联，包括基因的上调和下调以及细胞内特定途径的激活或抑制。这些过程导致细胞生理学的实质性改变。因此，这些诱导剂是显著的生理应答的引发剂。此外，非常少量的引发剂分子常常足以引起分子生理学的重要变化。基于诱导剂活性的实例包括植物或动物中免疫或抗性应答的诱导。
通过膜渗透性的变化以及导致Ca2+和H+流入和Cl-和K+流出的特定离子通道的激活来显示出对诱导剂最早的应答(Cervone等，(1997)，“Perception of fungal elicitors and signal transduction”(真菌诱导剂和信号转导的接收)，Aducci P编辑，Signal transductionin plants(植物中的信号转导)，Basel，Switzerland：Birkha üserVerlag，153-177)。该步骤的特征还在于跨膜势能的快速变化。在多种情况下，注意到了膜的去极化(Kuchitsu等，(1993)，“N-acetylchitooligosaccharides，biotic elicitor forphytoalexin production，induce transient membranedepolarization in suspension-cultured rice cells”(N-乙酰壳寡糖，用于植物抗毒素产生的生物诱导剂，诱导悬浮液培养的水稻细胞中瞬时的膜去极化)，Protoplasma 174，79-81)。这些位于膜的作用之后为氧化爆发，植物抗毒素的合成和防御基因的激活(Templeton和Lamb，(1988)，“Elicitors and defense geneactivation”(诱导剂和防御基因激活)，Plant，Cell and Environment11，395-401)。过去，使用现有的作为疾病防治的实用方法的刺激抗性的方法已经遇到了问题。这些问题包括植物毒性(变黄、坏死和一般的植物病)、缺乏显著水平的疾病防治和缺乏再现性/可持续性。本发明的组合物有利地缓解了这些限制。
另外，该组合物是肥料组合物，可以用来提高，例如，植物的产量，通过增加的(茎、叶、根……的)高度、厚度、生物量或每株植物的花/水果的数量。已知“生物量”的量度与作物产量直接相关，生物量基本上是植物生命的密度或量。
然而，根据本发明的组合物还可以含有其他成分，如其他寡糖、生长调节剂(或生长因子)、矿物质、离子、营养素、食品添加剂、调味剂、色素、维生素、矿物质、香料、植物营养素和用于提高该组合物生物活性的其他生物活性分子，尤其是每种寡糖在这些不同应用中的生物活性。
因此，根据本发明的组合物相当于药物组合物，(包括疫苗)、佐剂、化妆品组合物、食品或饲料组合物(包括功能食品或功能饲料)、食品添加剂、饮料(尤其是葡萄酒、啤酒或果汁)或饮料添加剂、防治植物病害的产品(优选杀真菌组合物)、肥料、诱导剂，或这些产品的助剂。
例如，根据本发明的组合物可以用于从所述饮料、有机颗粒、微生物、胶体、蛋白质、重金属、残余的杀虫剂、真菌毒素和内毒素回收。
根据本发明的组合物还可以用作天然食品添加剂，用于获得对抗各种真菌(包括酵母)和细胞的抗微生物和抗真菌活性，还可以用作佐剂，用于常规的食品防腐剂和抗褐变剂，作为适用于水果/蔬菜保藏的透气性可食膜的成分，作为增稠剂、稳定剂或乳化剂，作为触变剂或作为天然香精填充剂。还可以用于各种饲料加工中，因为例如，可以用作起泡剂、增稠剂或稳定剂。
根据本发明组合物的抗微生物和抗真菌活性(用于保护植物种子或水果)可以用于食品或饲料工业中，用于获得延长的保存期限、延迟的成熟和水果或蔬菜的腐烂，用于肉、甲壳动物(牡蛎)、水果、蔬菜和成品的保藏，可能与常规的防腐剂(亚硫酸盐或苯甲酸钠)结合或作为这些防腐剂的替代品。
根据本发明的组合物还可以用于织物纤维，以薄膜的形式或通过将该纤维或薄纱浸入含有根据本发明组合物的溶液中。因此，可以改进织物纤维的特性(提高的抗细菌和/或抗真菌特性)。该织物还对应于用于治疗伤口的医用织物。
根据本发明组合物的化妆品应用特别适用于皮肤护理剂(霜剂、化妆水)或头发护理剂(作为喷雾、香波或香波后制剂)，用于化妆组合物或牙膏中，并且还可以因为它们的抗UV特性而得到使用，用于除臭剂的制备中，用于口腔卫生的组合物中和用于色素包胶的组合物中。有利地，由于其非动物来源，可以使用该组合物，而没有诱导过敏的风险。
在环境应用中，根据本发明的组合物可以用作螯合剂(螯合重金属)或用于处理废水，尤其是用于分离有机化合物和重金属的水纯化技术中。它们还可以用于沉淀特定的废弃化合物或其他污染物，如DDT和聚氯苯，或用于固定自由基。
有利地，根据本发明的组合物还可以用于纸张的制造过程中。它们可以替代一些氨基取代物，如树胶或多聚合成的多糖，并且适用于减少化学添加剂的使用和用于提高产量。
还可能的是通过使用根据本发明的组合物获得的纸张具有更光滑的表面和更好的抗水性。它们还可以用于生产卫生纸、包装纸和纸板。
根据本发明组合物的另一种有利应用是在医学和药物应用中。
由于这些良好的生物粘附特性，根据本发明的组合物可以用作抗粘连外科助剂，以防止外科手术过程中组织之间的粘连，以及由于良好的粘液粘附，将其用作疫苗的佐剂。
因此，本发明还涉及含有根据本发明的组合物的任何生物材料，由于本发明的化合物在胃中不消化(延迟释放)，用于在肠内释放化合物的特定医学、诊断或研究应用中。
本发明可以配制成用于口服和非肠道受控释放应用的添加剂，并且还可以通过化学修饰以及药物和其他生物功能分子的结合来提高口服载体的功效，并且还可以用于提高已知化合物的薄膜和凝胶形成特性，并可以用于制造经过皮肤的膜。
其粘液粘附特性还可以用于获得与皮肤层的良好接触，和用于改善创新的通过局部和全身给药的药物传送系统。它们还可以用于制备片剂形成、粉末的颗粒化、乳浊液制备中的赋形剂，或作为润湿剂和涂层剂。还可以使用其各种有利的特征，如生物粘附性以及在药物系统中形成复合(阴离子、阳离子或两性离子)药物和聚合物的能力，用于提高水溶性差的药物的溶解度，用于增强药物穿过粘膜组织的吸收和用于加强(改善或调节)疫苗的免疫应答(作为疫苗的佐剂)。
壳聚糖已知的药物特性，尤其在伤口愈合中的特性，使得可以使用该组合物来防止或治疗伤口中纤维蛋白块的形成，防止疤痕的形成和支持细胞再生。
该组合物还可以用于组织工程化、细胞移植和细胞微囊化。可以用于透气薄膜中，以支持细胞再生，同时保护组织免受微生物侵略，以形成缝合和绷带，用于制造重建组织和器官和/或细胞移植的体系中的人造皮肤(可以生物(降解)的缝合和绷带)。
因此，这些药物应用可以有利地结合已知的化合物，用于组织修复，如生物材料，该生物材料含有骨颗粒或软骨颗粒、离子和盐、生长因子和激素和血浆衍生物，如纤维蛋白原、凝血因子、血小板，包括富含血小板的血浆和血小板少的血浆(PRP和PPP)、抗生素、维生素、分化因子、细胞因子、干扰素、软组织蛋白(如软骨、弹性蛋白、纤维蛋白或其前体)等。
根据本发明的组合物具有有利的水合特征、伤口愈合特性、再生特性和抗微生物和/或抗真菌特性。
根据本发明的组合物可以以各种形式存在，尤其是液体形式(例如，水溶液)，颗粒形式(纳米颗粒、微球体，及其悬浮液或乳液，丸剂)，以及多孔或无孔固体形式。当考虑本发明组合物的农业和农用化肥应用时，它通常将含有另外的成分，已知这些成分对于将物质施加到生长的作物中是有用的，如一种或多种载体物质、用于pH控制的缓冲物质等。通常将水用作载体，但是也可以使用其他常规载体。将认识到处理作物所需的溶液量将取决于待处理的特定作物。这样的用量是本领域技术人员容易确定的。
根据本发明的组合物还可以容易地用于农业和农用化肥系统中，用于水果、蔬菜和作物时，作为防腐的涂层剂和生物稳定剂，作为肥料，作为提高有用土壤微生物数量和减少有害微生物数量的试剂(“生物防治”)。生物防治意指通过人以外的一种或多种生物体来实现接种物量的减少或病原体产生疾病活性的降低(Harman等，“Enzymes，Biological Control and Commercial Applications，”(酶、生物防治和商业应用)，Trichoderma和Gliocladium，第2卷，第6章(1998))。生物防治菌株是本领域已知的，并且在多种生境和对抗各种病原体中是有效的(Harman等，参见上文)。生物防治生物体的实例可以是所鉴定的对植物疾病的生物防治有用的那些中的任一种，包括但不限于，来自以下属的那些：木霉属(Trichoderma)、胶霉属(Gliocladium)、腐霉属(Pythium)、疫霉属(Phytophthora)、丝核菌属(Rhizoctonia)、镰刀菌属(Fusarium)、葡萄孢属(Botrytis)和核盘菌属(Sclerotinia)(Harman等，参见上文，和美国专利No.5,474,926和6,512,166)。可以将植物种子浸泡在根据本发明组合物的水溶液中以防止真菌和/或微生物感染和增加植物生产。本发明的组合物还可以用于获得种子的有效涂覆。
在合适的浓度下，本发明的组合物可以通过系统和/或局部施用用于引发植物对抗寄生物感染和侵害的防御机制(诱导剂作用)。可以通过用本发明的组合物处理的植物中诱导的某些酶活性来测量这样的诱导剂作用，某些酶活性如葡聚糖酶、几丁质酶和苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)活性。
除了其诱导剂、生物稳定剂、肥料和/或防腐剂特性，根据本发明的组合物还可以用于使植物根增强和植物茎增厚。本发明的组合物还可以用作植物激素替代品、增强剂或调节剂。
本发明的组合物还可以用于刺激通过植物自身合成保护剂，用于促进植物的发芽和生长。通过植物合成的保护剂实例是：一氧化氮(NO)、活性氧种类(ROS)、水杨酸、茉莉酮酸、发病机理相关蛋白和植物抗毒素。
可以通过喷雾、喷淋、浸泡、浸蘸、注射和通过加肥灌溉系统将根据本发明的组合物施加于植物的种子、叶、花/水果和/或根。作为肥料，本发明的组合物可以通过土壤施肥或叶面施肥平常地施用本发明的组合物，以促进植物的发芽和生长。可以以干形式或作为溶液的稀释液来散布本发明的组合物。作为诱导剂，可以以喷雾形式，或作为固体来使用所需的本发明组合物，其中诱导剂与农业上可接受的粘附载体一起存在，并作为粉末来使用，粘附载体例如为甲基纤维素或阿拉伯树胶。可以根据本领域技术人员公知的技术来进行制剂的施用，如通过用于施用至生长中作物的喷雾。将认识到处理作物所需的溶液量将取决于待处理的特定作物。本领域技术人员可以容易地确定这样的含量。
所涉及的植物是双子叶植物和单子叶植物，优选经济上重要的植物，选自番茄、胡萝卜、黄瓜、豌豆、生菜、辣椒、甜菜、马铃薯、小麦、玉米、水稻、苜蓿、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、甘薯、豆、菊苣、苦苣、卷心菜、孢子甘蓝、防风草、芜菁、花菜、花椰菜、萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、倭瓜、南瓜、西葫芦、苹果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、高粱和甘蔗。合适的观赏植物实例是：非洲堇、矮牵牛、天竺葵、一品红、菊花、康乃馨、百日菊和草坪草。
本发明的组合物还可以用于获得已知的防治植物病害产品，如杀真菌剂、杀虫剂、除草剂等的涂层。由于其改善的特征，它可以用于获得通常用于处理这些植物的杀虫剂量的减少。
根据本发明的组合物的有利粘附特征还使其可以用于其他领域(化学、冶金、电子、纺织等)中，用于涂覆固体支持物。
本发明的另一个方面涉及根据本发明的组合物的制备方法，其中将足量的一种或多种聚阳离子糖加入寡聚半乳糖醛酸(或任何其他合适的可以具有“蛋盒”构象的寡糖(oligoguluronan)中。有利地根据最初存在的寡聚半乳糖醛酸(或所述其他寡糖)的浓度和这些糖的聚合物来限定该足够的含量。
在根据本发明的组合物的制备方法中，将各种成分混合，只要获得均匀的水溶液，即，没有观察到聚合物或凝胶的形成。此外，应用时，优选将组合物的pH维持于约5.0至约6.0(用于获得成分的有效溶解和用于维持所处理植物的安全性)。例如，可以通过将储液稀释于水中或任何其他合适的溶剂中，或通过将固体形式的组合物混入水中或任何其他合适的溶剂中来制备本发明的组合物。这样制备的组合物适用于通过局部或全身给药途径传送。
对于该制备方法，为了获得优选通过2F4抗体可检测的这种蛋盒构象，还存在适量的离子。因为不同的成分含有单价和二价离子，二价/单价摩尔比优选为约1/50至约1/300(或约1/25至约1/250毫当量)，可以将它们用于获得这些寡聚半乳糖醛酸(或其他寡糖)的生物活性“蛋盒”构象，该构象通过加入这些糖得到进一步的稳定。在非生理学条件下(如ELISA)，可以降低二价/单价阳离子的比例，或在其中例如高Na+浓度是有害的生理学条件下(如细胞培养物)，可以升高二价/单价阳离子的比例。优选将Ca2+用作二价离子。其他二价离子也是合适的(Mn2+，Zn2+、Cu2+…)。
对于具有高聚合度(高于8)的寡聚半乳糖醛酸，加入较高含量的聚阳离子糖。还根据聚阳离子糖中存在的正电荷量来限定该浓度。
该浓度的特征在于所加入的聚阳离子糖的聚合度。优选，加入的寡糖具有高于5的聚合度。
有利地，根据待获得的组合物的特征来限定两种成分的含量，优选用于获得“蛋盒”构象所需的有效稳定，该构象优选特征在于其结合由植物探针公司(英国)(www.plantprobes.co.uk)销售的特异性(鼠Ig G1)抗体PP-2F4的能力。
本发明的另一个方面涉及混合物的熟化，以提高如下举例说明的生物活性构象中聚半乳糖醛酸分子的比例。
藻酸盐糖(oligoguluronan)在合作过程中结合Ca2+离子，该过程已经根据《蛋盒模型》进行了解释。本领域技术人员可以使用壳聚糖寡糖或其他聚阳离子聚合物(聚胺或聚阳离子糖)稳定这些藻酸盐蛋盒。
本发明的另一个方面涉及该组合物在上述应用中，尤其是在医学、药物、保健食品、食品、饲料、织物、化妆品、工业、农艺和/或环境应用中，尤其是在其中观察到组合物的两种成分的协同效应的应用中，或在其中降低了一种或两种单独成分可能的缺陷的应用中的用途；例如，用于调节由单独的成分诱导的细胞死亡，用于获得由加入单独的成分诱导的氧化应激反应的降低(例如，用于获得活性氧种类如过氧化强较低的累积)和用于获得细胞系统中提高的活性(如涉及防御的苯丙氨酸氨裂解酶活性，该防御对抗由病原体诱导的生物应激)。
本发明的再一方面是提高植物抗病性的方法。该方法包括在有效提高植物抗病性的条件下将本发明的组合物施用于植物。如上所述进行所需的本发明组合物的应用，使用足量的所需的本发明组合物，本发明的组合物是根据选定的应用方式合适地制备的。
本发明的再一方面是提高植物产量的方法，通过增加的(茎、叶、根……的)高度、厚度、生物量或每株植物的花/水果的数量。该方法包括在有效获得较高产量的条件下将本发明的组合物施用于植物。如上所述进行所需的本发明组合物的应用，使用足量的所需的本发明组合物，本发明的组合物是根据选定的应用方式合适地制备的。
参照附图，在所附的实施例中将更详细地描述本发明，该实施例是本发明各种实施方案的非限制性说明。
实施例
实施例1：壳寡糖的制备
通过在pH约为5.5的约0.175M醋酸盐缓冲液中在室温过夜振荡溶解浓度为约10.0g/L的壳聚糖。将该壳聚糖溶液(约90mL)与10mLPectinex Ultra SPL(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)混合。将反应混合物在约37℃孵育约24小时。通过中性壳聚糖水解产物在90％甲醇中的选择性沉淀来分离壳寡糖。所获得的壳寡糖组的组成列于表1中。
表1：通过酶水解制备的并通过在90％甲醇中的选择性沉淀分级分离的具有6或更高聚合度(DP)的壳寡糖的MALDI-TOF-MS光谱的指定离子组成。
Figure A20078004329900161
实施例2：寡聚半乳糖醛酸的制备
通过聚半乳糖醛酸的酶水解获得果胶寡聚物。用约10mL(1∶3000)Pectinex Ultra SPL溶液在60分种过程中水解PGA溶液(约2％w/v，pH 6.0，90mL)。将溶液煮沸约10分钟后，通过其钡盐的选择性沉淀将果胶寡糖分级分离。所获得的寡聚半乳糖醛酸的组成列于图1中，其是来自果胶水解产物的寡聚半乳糖醛酸混合物的HPAEC-PAD洗脱模式。按照它们相应的聚合度来标记峰值。
实施例3：蛋盒构象稳定化
壳寡糖能够稳定由钙离子诱导的寡聚半乳糖醛酸的蛋盒构象。这种作用取决于壳寡糖聚合度、乙酰化程度(DA)和混合物中/半乳糖醛酸摩尔比。使用了单克隆抗体(称为2F4)，其识别钙诱导的果胶蛋盒构象。
使用抗鼠免疫球蛋白覆盖微孔：将50μL抗鼠免疫球蛋白(完整分子，SIGMA)(50mM pH 9.5的碳酸盐缓冲液中约0.05mg/mL)分散至NUNC高结合能力微平板(MAXI SORP)的每个孔中，并使其在4℃过夜。通过用约250μL来自牛血清的白蛋白(在含有约0.5mM CaCl2和约150mM NaCl的pH5.7的50mM醋酸盐缓冲液中制备的约30mg/mL)在约37℃将孔孵育约2小时来阻断非特异性结合。该溶液，以毫当量表示时，对应于1毫当量钙，因为钙是二价阳离子，和对应于150毫当量钠，因为钠是单价阳离子。除去过量白蛋白后，将竞争溶液加入孔中。
竞争溶液的制备和使用抗体的孵育：在上述含有Ca2+/Na+溶液的醋酸盐缓冲液中使用100μL 2F4腹水稀释177倍来制备竞争溶液，并用约100μL果胶物质和壳寡糖的混合溶液在约25℃预孵育约30分钟。在将上清液分散至覆盖抗鼠免疫球蛋白的微孔中并如上所述进行阻断之前，将这些寡糖-抗体混合物离心在约7500g约10分钟。在约37℃将含有竞争测试上清液的微平板孵育约60分钟。在37℃加入约50μL辣根过氧化物酶标记的绵羊抗鼠免疫球蛋白(在上述含有Ca2+/Na+溶液的50mM醋酸盐缓冲液中约1∶5000)约60分钟之前，用如上所述的含有Ca2+/Na+溶液并进一步含有约0.1％吐温20的缓冲液将微平板洗涤八次。第二次洗涤循环后，通过约100μL增强的K-蓝TMB底物(NeogenCorporation，Lexington，KY，USA)在室温黑暗中孵育约20分钟来显示抗体的结合。通过约50μL 1N HCl来停止显示过程。15分钟后用Titertek
Figure A20078004329900181
在405nm测量溶液的吸收值。
图2表示通过低DA和不同聚合度的壳寡糖来稳定钙诱导的寡半乳糖醛酸(DP9-DP15)二聚化作用。用寡聚半乳糖醛酸和不同浓度的具有DA～10％的低和高DP的壳寡糖来孵育2F4单克隆抗体。将所得到的混合物离心并将上清液分散至抗鼠Ig-覆盖的微孔中。将结果表示为没有壳寡糖的对照的吸收值的百分比。
实施例4：体外实验
A.果胶分子阻止拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞悬浮液中 由高浓度的完全去乙酰化的壳寡糖诱导的细胞死亡。
将细胞生活力表示为细胞蛋白含量的函数(mg蛋白质/鲜重(FW))。
图3表示用壳寡糖(完全去乙酰化的，5至9的DP)、寡聚半乳糖醛酸(DP高于8)及其混合物处理24小时后，拟南芥细胞悬浮液重的蛋白含量。数据是来自两个独立实验中一个代表性实验的重复三份样品的平均±SD。
将来自拟南芥株L-MM1生态型Landsberg erecta叶子的悬浮液培养的细胞生长于Murashige和Skoog培养基中(约4.43g/L)，该培养基含有蔗糖(约30g/L)，约0.5μg/mL NAA和约0.05μg/mL激动素，pH5.7。将培养物维持于16小时/8小时光/暗光周期下，在约25℃，在100rpm的旋转摇床上。每7天，将细胞在新鲜培养基中稀释10倍。
将待测试的壳寡糖溶解于250μL蒸馏水中，通过0.22μm膜滤器(MILLIPORE)过滤，并无菌加入约10ml培养了三天的悬浮液细胞中，并在温和搅拌下在约25℃孵育约24小时。将5ml反应混合物在约100g和约4℃离心约5分钟，以收集细胞。在约4℃将约1ml约0.1M的含有约2mM巯基乙醇的硼酸盐缓冲液(pH 8.8)中的细胞均质。将均质物在约4℃在4000r pm离心约10分钟。通过Bradford蛋白测试(BIO-RAD)测定提取物的蛋白浓度。
B.壳寡糖结合寡聚半乳糖醛酸刺激了胡萝卜细胞悬浮液中的细胞 生长。
如上所述进行该实验，但是使用胡萝卜(Daucus carota)悬浮液。通过重量测量细胞密度(细胞g/mL)。
图4表示用壳寡糖(完全去乙酰化的，5至9的DP)、寡聚半乳糖醛酸(DP高于8)及其混合物处理24小时后，胡萝卜细胞悬浮液的细胞密度。数据是来自两个独立实验中一个代表性实验的重复三份样品的平均±SD。
C.寡聚半乳糖醛酸和壳寡糖的特定组合比单独的寡糖具有更高的 植物防御反应的诱导剂活性。
如上所述进行该实验。在约1.37ml补充约60mM L-苯丙氨酸的约0.1M硼酸盐缓冲液存在下(pH8.8)，在0.125m l上清液中测定PAL(EC 4.3.1.5)活性，如Beaudoin-Eagan和Thorpe(Plant.Physiol78：438-441，1985)中所述的，并表示为每mg蛋白质每小时产生的肉硅酸的微摩尔量。
图5表示用壳寡糖(完全去乙酰化的，5至9的DP)、寡聚半乳糖醛酸(DP高于8)及其混合物处理24小时后，拟南芥细胞悬浮液中PAL活性的诱导。数据是来自两个独立实验中一个代表性实验的重复三份样品的平均±SD。
D.寡半乳糖醛酸和壳寡糖的特定组合比单独应用这些寡糖诱导植 物中更低的氧化应激。
细胞培养条件与上述的相似。
H2O2测量：将待测试的壳寡糖溶解于约50μL蒸馏水中，通过0.22μm膜滤器(MILLIPORE)过滤，并加入约5mL培养了三天的悬浮液细胞中，并在搅拌下在约25℃孵育。在30分钟的过程中每4分钟取出约100μL的等份试样，快速旋转离心并根据供应商的说明使用AmplexRed过氧化氢/过氧化物酶测试试剂盒(MOLECULAR PROBES)测量上清液中的H2O2浓度。
图6表示用壳寡糖(完全去乙酰化的，5至9的DP)、寡聚半乳糖醛酸(DP高于8)及其混合物处理24小时后，拟南芥细胞悬浮液中的过氧化氢蓄积。数据是来自两个独立实验中一个代表性实验的重复三份样品的平均±SD。
实施例5：通过番茄种子吸收寡聚半乳糖醛酸和壳寡糖的特定组 合并刺激植物生长。
将品种为“Moneymaker”的番茄(Lycopersicum esculentum)植物的种子浸入在适于诱导果胶二聚物形成的离子条件下(Ca2+/Na+阳离子，约0.5mM Ca2+/150mM Na+比例)含有寡聚半乳糖醛酸和壳寡糖混合物的溶液或除了寡糖混合物以外含有混合物所有成分的溶液(对照)中4小时。所用的壳寡糖具有25％的乙酰化程度。然后，将种子干燥，接着种植并在6-腔种子床中的土壤中25℃下以16小时白天/8小时黑暗的状况栽培30天。
图7表示从用壳寡糖、寡聚半乳糖醛酸及其混合物处理的种子获得的30天大的番茄植物的生物量(新鲜的和干的)，表示为对照植物生物量的百分比。报告了平均±SE的值(n＝3)。大写字母和小写字母指两个独立的ANOVA检验。使用相同字母的数据没有统计学差异(P＜0.05)。
实施例6：寡聚半乳糖醛酸和壳寡糖的特定组合的叶面施用协同 诱导番茄植物中的防御反应。
在受控的条件下将品种“moneymaker”的番茄植物在土壤中栽培，受控条件为各自16小时/8小时亮/暗状况，在25℃，20天，接着喷雾含有寡聚半乳糖醛酸和壳寡糖混合物的溶液，该混合物以250mg.L-1溶解于pH5.5的含有约0.01％吐温20和约0.5mM Ca2+/150mMNa+比例的溶液中。混合物中所用的壳寡聚物具有25％的乙酰化程度(DA)。作为对照，将含有约0.01％吐温20的水喷在叶面上。
24小时后，收集来自通过喷雾处理的植物的真叶，并在液氮中研磨。将粉末状的叶片在50mM含有约5mM EDTA，约14mM β-巯基乙醇和约1.0M NaCl的pH 5.2的醋酸盐缓冲液中提取，缓冲液与叶片的比例为约1g粉末状叶片/2ml缓冲液。然后将提取物在12000g 4℃离心15分钟。分析上清液的两种致病机理相关蛋白的活性：葡聚糖酶(活性表示为释放的葡萄糖mg/蛋白mg.分钟)(Boudart等，(1998)Planta206：86-94)和几丁质酶(活性表示为释放的p-硝基酚皮摩尔/蛋白mg.分钟)(几丁质酶测定试剂盒，Sigma)。
图8表示叶面施用寡聚半乳糖醛酸和壳寡糖混合物24小时后，番茄植物中葡聚糖酶和几丁质酶活性的诱导。报告了平均±SE的值(n＝3)。ANOVA检验表示用对照溶液和混合物处理的植物之间的统计学显著差异(P＜0.05)。
实施例7：寡聚半乳糖醛酸和壳寡糖的特定组合协同诱导拟南芥 植物中的防御反应。
将拟南芥植物以16小时白天/8小时黑暗的状况在25℃下生长于半固体培养基上，该培养基含有约4.4g/L Murashige和Skoog营养素、约30g/L蔗糖和约0.3g/L琼脂。从培养基中取出成熟的植物，用pH 5.7的约0.05M的MES缓冲液洗涤并转移至含有Ca2+/Na+阳离子的相同缓冲液中，离子比例为约0.5mM Ca2+/150mM Na+，该缓冲液含有单独的寡聚半乳糖醛酸(DP 9-10)、单独的壳寡聚物(DP 5-9，DA 25％)，或寡聚半乳糖醛酸和壳寡聚物的混合物。在24小时后测试苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)活性(产生的肉硅酸微摩尔/mg蛋白.小时)。
图9表示用寡聚半乳糖醛酸、壳寡聚物及其混合物处理的拟南芥植物中PAL活性的诱导。报告了平均±SE的值(n＝3)。ANOVA检验表示用壳寡聚物或混合物处理的植物之间的统计学显著差异(P＜0.05)。
实施例8：钾流出和培养基碱化
将源自拟南芥株L-MM1生态型Landsberg erecta叶子的悬浮液培养细胞生长于Murashige和Skoog培养基中(约4.43g L-1)，该培养基含有蔗糖(约30g L-1)、约0.5μg mL-1NAA、约0.05μg mL-1激动素，pH5.7。将培养物维持在16小时/8小时亮/暗光周期下，在约25℃，在100r pm的旋转摇床上。每七天将细胞在新鲜培养基中稀释10-倍。将七天大的细胞用于实验。
将壳寡糖(约30mg L-1)、寡聚半乳糖醛酸(约40mg L-1)以及约70mg L-1的两种寡糖的混合物溶解于含有10mM蔗糖、约0.5mM Ca 2+、约50mM Na+和约0.5mM MES的溶液中，用Tris-(羟甲基)-氨基甲烷将溶液pH调节至5.7。
将等份的洗涤过的细胞(100mg鲜重(FW)mL-1)置于玻璃瓶中，并将孵育培养基换成等体积的测试溶液，并在150rpm的旋转摇床上搅拌。测定等份孵育培养基中的胞外pH和K+浓度，该培养基是通过
Figure A20078004329900221
(Calbiochem)的细胞快速过滤获得的。
用pH电极监控胞外pH变化，并使用原子吸收分光光度计(PU9200X，Pye-Unicam，Cambridge，UK)在1N HCl中测定胞外K+浓度。
图10显示了钾从用壳寡聚物、寡聚半乳糖醛酸或混合物处理的拟南芥悬浮液细胞中流出。混合物将钾流出控制降低至接近寡聚半乳糖醛酸单独的值。
图11显示了用壳寡聚物、寡聚半乳糖醛酸或混合物处理的拟南芥悬浮液细胞的培养基碱化。混合物诱导了持续的培养基碱化，而单独的成分只在处理后不到一小时内有作用。
图12表示用壳寡聚物、寡聚半乳糖醛酸或混合物处理后24小时，拟南芥悬浮液细胞的培养基碱化。混合物比单独的成分诱导了明显更好的培养基碱化。
实施例9：蛋白组/基因组/转录组分析
为了这些分析，如上所述进行拟南芥的细胞培养。
A.不同表达蛋白的蛋白组分析。
用对照缓冲液、寡聚半乳糖醛酸、壳寡糖或混合物孵育4小时后，通过离心收集细胞，并提取蛋白，通过二维凝胶电泳来分析，使用Valot等2005所述的实验方案(Plant Molecular Biology 59：565-580)。
蛋白组分析显示出与其他三个相比较在至少一个处理中存在59种显著相关的蛋白。在这59种蛋白中，鉴定了44种。
超表达蛋白主要与防御机制相关，如PAL(苯丙氨酸氨裂解酶)。令人感兴趣地看到四分之一受调控的蛋白与能量代谢相关。显著地，簇分析显示出用生物活性混合物诱导的细胞诱导了不同于用彼此间更密切相关的单种成分诱导的细胞的可溶蛋白表达模式。处理间表达水平不同的蛋白实例列于表2中：
表2：
  对照   壳寡糖   组合物   寡聚半乳糖醛酸
  琥珀酸脱氢酶   1,00*   2,00*   0,93   1,53
  WD40-重复蛋白   1,00   0,75*   1,12*   0,85
  NADP依赖性苹果酸酶   1,00   1,14*   0,71*   0,82
  线粒体磷酸转运器   1,00   0,88*   1,51*   1,12
  甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)   1,00*   1,62*   1,13   1,56
用星号(*)标记彼此间表达水平显著不同的蛋白。
B.差异表达基因的转录组分析
通过cDNA微矩阵技术对用诱导剂处理4小时后取样的拟南芥细胞进行转录组分析。使用QIAGEN RNeasy Mini试剂盒(Darlington Lab)提取拟南芥处理细胞的总RNA。
在3个处理(寡聚半乳糖醛酸，壳寡糖，两者的混合物)的至少2个中，拟南芥转录组分析显示出96个显著相关的基因(P＜0.05)，具有至少3倍的比例。与蛋白组分析相反，转录组分析揭示了用壳聚糖寡聚物或用混合物处理培养细胞诱导了非常相似的应答。用果胶寡聚物处理似乎诱导了有限的应答，与对照培养物接近。用壳聚糖寡聚物、果胶寡聚物或其混合物处理各自调节了95个(57个下调，38个上调)，25个(16个下调，9个上调)和92个(56个下调。36个上调)基因的表达。
在受调控的基因中，根据处理，几个呈现出截然不同的表达模式。那些基因中的一些列于表3中，其中按照超过对照中表达水平的比例来给出基因表达的水平。用星号表示统计学显著差异。
表3
  名称   登录#   壳寡糖   组合物   寡聚半乳糖醛酸
  Clavata3/ESR-相关-1   Atlg73165   -3.60*   -1.15   3.35*
  脯氨酸-富集-伸展蛋白样家族   At5g49080   3.15   2.51*   -3.68*
  WD-40重复家族蛋白   At5g40880   3.38*   1.77   -2.24*
  防御相关蛋白   At 3g44870   5.46*   -2.06*   -1.15
  共分子伴侣grpE家族   At4g26780   -1.15   3.16*   1.03
  AMP-结合蛋白   At lg75960   1.61   3.87*   1.95
实施例10：诱导苹果秧苗对苹果黑星菌(Venturia inequalis)的抗性
用漂白剂消毒后，将品种《Golden Delicious》的苹果种子(大约1400粒)置于4℃进行春化处理90或120天。然后以40粒种子/床的密度将种子播种在表层土中。然后每床用表层土覆盖、浇水并在接近10℃的温度孵育一周，然后转移至18℃的温室。
通过喷雾对照溶液(水加0.01％吐温20)或水溶液中的诱导剂(在“3-叶期”0.25g.L-1的本发明的组合物，在接种苹果黑星菌(150,000个活的分生孢子/mL)前10和3天)来处理40棵秧苗的组。接种后14天时对诱导剂处理前产生的最后一片叶子(F1)和用诱导剂处理后产生的第一片叶子(F0)进行形成孢子的表面积百分比的评价。将结果表示为F1和F0的形成孢子的叶片表面积的百分比(每次处理200棵秧苗的平均±SD)，如图13中所示的。
实施例11：KH 2 PO 4 与寡聚半乳糖醛酸和壳寡糖混合物的组合物的 杀真菌特性。
将三个20μL含有2.104个扩展青霉(Penicilium expansum)孢子的点接种于39g.L-1马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)的培养皿上，琼脂涂布以下一种溶液：水+0.01％吐温20(对照)、寡聚半乳糖醛酸和壳寡糖(0,5g.L-1)的混合物、KH 2PO4(5g.L-1)、寡聚半乳糖醛酸和壳寡糖(0,5g.L-1)+KH 2PO4(5g.L-1)。将培养皿在25℃孵育48小时，并使用Neubaue r计数池将所得到的孢子计数。图14中显示了以3个实验的平均值表示的结果。

Claims (17)

1.含有一种或多种寡聚半乳糖醛酸的组合物，该寡聚半乳糖醛酸具有高于8的聚合度并具有通过一种或多种聚阳离子糖进一步稳定的二聚蛋盒构象。
2.权利要求1的组合物，其中通过2F4抗体检测二聚蛋盒构象。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中聚阳离子糖是壳聚糖寡糖或壳聚糖多糖。
4.根据权利要求3的组合物，其中壳聚糖寡糖或多糖具有高于5的聚合度。
5.根据权利要求3或4的组合物，其中壳聚糖寡糖或多糖具有低于50％的乙酰化程度。
6.根据在前任一项权利要求的组合物，其是水溶液。
7.根据在前任一项权利要求的组合物，其进一步含有一种或多种选自下组的成分：其他糖类、生长调节剂或生长因子、矿物质、离子、营养素、食品添加剂、调味剂、色素、维生素和植物营养素。
8.根据在前任一项权利要求的组合物，其是选自下组的产品：药物组合物、保健食品组合物、食品或饲料组合物，包括功能食品或功能饲料，控制植物病害的产品、诱导剂、肥料，或这些产品的助剂。
9.权利要求8的组合物，其中控制植物病害的产品是杀真菌剂。
10.含有根据在前任一项权利要求的组合物的生物材料。
11.含有权利要求1至9的组合物的织物。
12.根据在前任一项权利要求的组合物在食品、饲料、织物、化妆品、工业和/或环境应用中的用途。
13.根据权利要求1至10的组合物诱导植物对抗植物病原体感染的保护的用途。
14.根据权利要求1至11的组合物作为生长促进剂的用途。
15.根据权利要求1至11的组合物作为种子涂层的用途。
16.根据权利要求1至10的组合物作为抗真菌助剂的用途。
17.根据在前任一项权利要求的组合物用于制造处理伤口愈合的药物的用途。
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