BRPI0717673B1

BRPI0717673B1 - composição de oligogalacturonanas, biomaterial e têxtil

Info

Publication number: BRPI0717673B1
Application number: BRPI0717673A
Authority: BR
Inventors: Carlos Pino Cabrera Juan; Van Cutsem Pierre
Original assignee: Faculte Notre Dame De La Praix; Facultes Univ Notre Dame De La Paix; Univ De Namur
Priority date: 2006-11-28
Filing date: 2007-11-28
Publication date: 2020-04-22
Also published as: ZA200902920B; PL2115066T3; IL198947A; AU2007327613B2; CO6231043A2; BRPI0717673B8; US8916182B2; ES2692426T3; NZ576595A; AU2007327613A1; EP2115066B1; CN101558114B; EP2115066A1; BRPI0717673A8; MY157759A; CN101558114A; WO2008065151A1; US20100087369A1; BRPI0717673A2; IL198947A0

Abstract

composição de oligogalacturonanas, biomaterial e têxtil. a presente invenção refere-se a uma composição "bioativa" que compreende uma ou mais oligogalacturonanas (((1?4)-alfa-d-oligogalacturonana) ou quaisquer outros oligossacarídeos (oligoguluronanas) que podem apresentar uma conformação em "caixa de ovos", estando esta conformação adicionalmente estabilizada por um ou mais sacarídeos policatiônicos, de um modo preferido um oligossacarídeo de quitosana ou um polissacarídeo de quitosana. a presente invenção também se refere a um processo para a preparação desta composição e com a sua utilização em aplicações médicas, farmacêuticas, agrícolas, nutracêuticas, alimentares, em rações, têxteis, cosméticas, industriais e/ou ambientais.

Description

(54) Tftulo: COMPOSIÇÃO DE OLIGOGALACTURONANAS, BIOMATERIAL E TÊXTIL (51) Int.CI.: C08L 5/06; A61L 26/00.

(30) Prioridade Unionista: 28/11/2006 EP 06124918.1.

(73) Titular(es): UNIVERSITÉ DE NAMUR.

(72) Inventor(es): JUAN CARLOS PINO CABRERA; PIERRE VAN CUTSEM.

(86) Pedido PCT: PCT EP2007062968 de 28/11/2007 (87) Publicação PCT: WO 2008/065151 de 05/06/2008 (85) Data do Início da Fase Nacional: 25/05/2009 (57) Resumo: COMPOSIÇÃO DE OLIGOGALACTURONANAS, BIOMATERIAL E TÊXTIL. A presente invenção refere-se a uma composição bioativa que compreende uma ou mais oligogalacturonanas (((l?4)-alfa-D-oligogalacturonana) ou quaisquer outros oligossacarídeos (oligoguluronanas) que podem apresentar uma conformação em caixa de ovos, estando esta conformação adicionalmente estabilizada por um ou mais sacarídeos policatiônicos, de um modo preferido um oligossacarídeo de quitosana ou um polissacarídeo de quitosana. A presente invenção também se refere a um processo para a preparação desta composição e com a sua utilização em aplicações médicas, farmacêuticas, agrícolas, nutracêuticas, alimentares, em rações, têxteis, cosméticas, industriais e/ou ambientais.

1/36 “COMPOSIÇÃO DE OLIGOGALACTURONANAS, BIOMATERIAL E TÊXTIL.

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a uma composição bioativa que compreende uma ou mais oligogalacturonanas ((1^4)-«-Dgalacturonana) ou quaisquer outros oligossacarídeos (oligoguluronanas) que podem estar presentes numa conformação em caixa de ovos(“egg box), estando esta conformação adicionalmente estabilizada por um ou mais sacarídeos policatiônicos, de um modo preferido um oligossacarídeo de quitosana ou um polissacarídeo de quitosana.

A presente invenção refere-se, também, a um processo para a preparação desta composição e à sua utilização, em aplicações médicas, farmacêuticas, agrícolas, nutracêuticas, alimentares, em rações, cosméticas, industriais e/ou ambientais.

Antecedentes da invenção

Pectina e fragmentos de pectina

Os polissacarídeos naturais, tais como amido, celulose, quitina, alginato e pectina têm grande importância tecnológica porque estão disponíveis em grandes quantidades e apresentam características específicas habitualmente não presentes em polímeros sintéticos.

A pectina constitui uma rede molecular densa que é responsável por muitas das propriedades mecânicas da parede celular das plantas.

As regiões pilosas das pectinas (Ramnogalacturonana) coexistem com domínios homopoligalacturónicos uniformes (galacturonana) que podem dimerizar de acordo com o chamado modelo caixa de ovos (Grant, FEBS Letters, volume 32, p. 195-198, 1973). Por dicroísmo circular, foi confirmada a

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2/36 existência desta conformação em caixa de ovos de quelação de cálcio intercadeias (POWELL et al., Journal of Molecular Biology vol. 155, p. 517-531, 1982).

A extensão dessas zonas de união na parede celular depende, em grande medida, da densidade de carga do poliânion, da disponibilidade de cátions divalentes e é inibida por metilesterificação e acetilesterificação (Liners et al., Plant Physiology, vol. 90, p. 1090 1104, 1992) .

A pectina também é um alvo privilegiado envolvido em processos morfológicos e em interações hospedeiro-agente patogênico. As enzimas pectolíticas libertam oligogalacturonanas que podem modular diferentes processos fisiológicos no seio da matriz da parede celular e do protoplasto.

Também é conhecido que, a diferentes concentrações, estas oligogalacturonanas podem modificar a atividade biológica das células.

Consequentemente, estas oligogalacturonanas são adequadas para o tratamento de plantas, especialmente em métodos de crescimento e proteção de plantas baseados na utilização destes produtos naturais. Mais particularmente, estas oligogalacturonanas são adequadas para a indução de defesas inatas acrescidas de plantas contra agentes patogênicos.

Van Cutsem e Messiaen (Planta, vol. 208, p. 246- 256, 1999) descrevem a adsorção de poliaminas em ácido poligalacturônico na presença de cátions mono e divalentes competitivos (Na⁺, Ca ). Entre as poliaminas, foram testadas putrescina, espermidina e espermina. A requerente mostrou que a cascata de transdução de sinais iniciada em células vegetais por 2+ (1 -4)-/.-D-oligogalacturonana ligada a Ca era bloqueada por

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3/36 espermidina e espermina, mas não por putrescina. Coloca-se a hipótese de a interrupção por espermidina e espermina da conformação supra molecular induzida por Ca²⁺ de fragmentos pécticos ter sido a causa da inibição do sinal péctico. Consequentemente, parece que as poliaminas podem atuar sobre a fisiologia das células vegetais por modulação da transdução do sinal péctico. Outros oligossacarídeos, tal como alginato, podem apresentar esta conformação em Caixa de Ovos e podem atuar na fisiologia vegetal.

Quitina e quitosana

A quitina é um polímero natural de peso molecular elevado, amplamente disseminado na natureza (é o segundo principal biopolímero a seguir à celulose) e é o componente principal da cutícula de insetos e crustáceos. A quitina também faz parte das paredes celulares de alguns fungos e outros organismos. A quitosana é produzida a nível industrial por modificações químicas da quitina e também é encontrada naturalmente nalguns organismos.

A quitosana é o copolímero estatístico de N-acetil-(D)glucosamina e (D)-glucosamina. O pedido de patente internacional WO 03/068824 descreve a estrutura química da quitosana e vários processos para a obtenção desta quitosana. Além disso, este pedido de patente também descreve um processo para isolamento de derivadas da parede celular a partir de biomassa de fungos e de leveduras e um processo para obtenção de quitosana a partir deste processo. Este pedido de patente também descreve a utilização de quitosana em aplicações médicas, farmacêuticas, agrícolas, nutracêuticas, alimentares, têxteis, cosméticas, industriais e/ou ambientais.

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Contudo, a quitosana ainda apresenta várias desvantagens, tais como as concentrações elevadas necessárias para obter um efeito fisiológico (acima de 1 g por litro) e o poder ser tóxica nessas concentrações elevadas.

Combinações de pectina e quitosana

O documento US 5919574 descreve películas laminadas biodegradáveis fabricadas a partir de pectina e quitosana. Esta patente afirma que a propriedade catiônica da quitosana oferece uma oportunidade de tirar partido de interações eletrostáticas com pectina desmetilada parcialmente aniônica. A requerente desta patente afirma que há uma combinação de ligações hidrogênio e forças eletrostáticas entre grupos carboxilato da pectina e grupos amina protonados da quitosana e que a atividade de água compatível possibilita uma interface estável entre uma película péctica e uma película de quitosana. Esta patente também descreve a utilização das películas laminadas obtidas em várias aplicações, incluindo aplicações médicas (produção de pensos, bolsas ou sacos biodegradáveis, encapsulação de células vivas, etc.).

O pedido de patente internacional W001/82724 descreve uma composição contendo amino-polissacarídeos e polissacarídeos carregados negativamente. Entre os aminopolissacarídeos testados, A requerente descreve quitosana e derivados de quitosana combinados com polissacarídeos carregados negativamente, tais como pectina.

Contudo, nenhum destes documentos descreve que é possível melhorar a bioatividade de fragmentos de pectina (oligogalacturonanas). Também não descrevem qualquer efeito de moléculas de quitosana sobre a conformação bioativa de galacturonana induzida por cálcio. Mais particularmente,

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5/36 nenhum destes documentos descreve um efeito eliciador de indução ou de fertilização para uma combinação de fragmentos de pectina e quitosana.

Sabe-se que a produção de plantas é classicamente realizada por utilização de produtos químicos sintéticos que não são sempre amigos do ambiente e são habitualmente dispendiosos. Consequentemente, a utilização destes produtos naturais pode reduzir a quantidade de produtos químicos para proteção de colheitas ou fertilizantes aplicados nas culturas, permitindo uma agricultura orgânica adequada e minimizando o impacto ambiental da agricultura.

Durante as últimas décadas, as vendas de produtos orgânicos apresentaram um aumento anual de, pelo menos, 20%. O sector de mais rápido crescimento da agricultura foi a venda a retalho de alimentos orgânicos e bebidas representando aproximadamente 12,8 bilhões de dólares. Os alimentos orgânicos também estão a ganhar aceitação internacional em países como o Japão e a Alemanha, que estão a tornar-se importantes mercados internacionais para os alimentos orgânicos.

Objetivos da invenção

Um primeiro objetivo da presente invenção é proporcionar uma composição compreendendo galacturonanas com propriedades melhoradas, tal como uma conformação em caixa de ovos estabilizada, de um modo preferido, detectável pelo anticorpo 2F4 (F. LINERS, J.-J. LETESSON, C. DIDEMBOURG e P. VAN CUTSEM (1989) Monoclonal antibodies against pectin: recognition of a conformation induced by calcium. Plant Physiol. 91, 14191424), especialmente propriedades de bioatividade melhoradas para o crescimento e a proteção de plantas.

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Outro objetivo da presente invenção é propor uma composição feita de produtos naturais.

Um objetivo adicional da presente invenção é proporcionar uma composição que apresenta novas propriedades para oligogalacturonanas e que pode ser utilizada em aplicações médicas, farmacêuticas, nutracêuticas, alimentares, têxteis, cosméticas, industriais e/ou ambientais.

Sumário da invenção

A presente invenção refere-se a uma composição compreendendo uma ou mais oligogalacturonanas (de um modo preferido, (1^4)α-D-oligogalacturonana), oligoguluronanas (tais como oligômeros de alginato) ou quaisquer oligômeros que possam apresentar uma conformação em caixa de ovos (com a adição de um ou mais cátions (Ca^{2 +} , Na⁺...)), podendo esta conformação ser, de um modo preferido, detectada pelo anticorpo 2F4 e é com vantagem adicionalmente estabilizada por (adição de) um ou mais sacarídeos policatiônicos. Um sacarídeo policatiônico significa um sacarídeo que tem cargas positivas múltiplas, de um modo preferido, pelo menos, 6 (seis) cargas.

Com vantagem, estes sacarídeos são produtos naturais (diferentes de um polímero ou oligômero sintético) o que significa que podem ser obtidos a partir de fontes naturais renováveis com poucas ou nenhumas modificações.

Com vantagem, o sacarídeo policatiônico é um oligo- ou um polissacarídeo, de um modo preferido, um oligossacarídeo de quitosana ou um polímero de quitosana. De um modo mais preferido, os oligo- ou polissacarídeos de quitosana utilizados têm um grau de acetilação inferior a 50% de um modo preferido, compreendido entre 0 e cerca de 50% e um grau

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7/36 de polimerização superior a 5 (cinco).

Além disso, as oligogalacturonanas presentes na composição de acordo com a invenção têm, de um modo preferido, um grau de polimerização (DP) superior a 8 (oito) , de um modo preferido compreendido entre 9 (nove) e 20 (vinte) ou entre 9 (nove) e 15 (quinze) .

A requerente inesperadamente verificou que essa composição é caracterizada por um efeito sinérgico que significa que melhora as características (especialmente as propriedades agronômicas) de oligogalacturonanas e/ou eventualmente oligoguluronanas (e. g., oligômeros de alginato) ou outros oligossacarídeos, mas também reduz possíveis efeitos secundários de sacarídeos policatiônicos, especialmente se estes sacarídeos policatiônicos forem oligossacarídeos de quitosana ou polímeros de quitosana. Em particular, essa composição, inesperadamente, reduz possíveis propriedades tóxicas de moléculas de quitosana e, portanto, controla e reduz a morte celular (induzida por estas moléculas de quitosana a concentração elevada).

Esta composição aumenta sinergicamente a bioatividade de cada oligossacarídeo e combina os seus efeitos potenciadores individuais em vários campos, incluindo médico, farmacêutico, agrícola, nutracêutico, alimentar, de alimentos para animais, têxtil, cosmético, industrial, de produção de têxteis ou de papel e/ou aplicações ambientais. Esta composição pode ser ligada à superfície de um suporte sólido através de uma ligação covalente ou não covalente.

Em particular, esta composição é uma composição eliciadora que pode ser utilizada para proteger plantas (aumentar as defesas naturais da planta contra agentes patogênicos) e para

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8/36 estimular o crescimento e a diferenciação. A eliciação pode ser explicada como um mecanismo ou mecanismos através dos quais as células e os tecidos de, essencialmente, todos os organismos respondem e se adaptam a alterações nas condições ambientais externas. Em muitos casos, estes mecanismos utilizam as vias de receptores específicos para produtos químicos. Quando esses produtos químicos entram em contato com superfícies celulares, ligam-se especificamente a receptores específicos. Esta ligação desencadeia uma cascata de eventos no seio das células, incluindo sobre- e subregulação de genes e ativação ou repressão de vias específicas no seio das células. Esses processos resultam em alterações substanciais da fisiologia celular. Assim, estes eliciadores são agentes que desencadeiam respostas fisiológicas dramáticas. Além disso, uma quantidade muito pequena da molécula eliciadora é frequentemente suficiente para provocar grandes alterações da fisiologia celular. Um exemplo de atividade com base num eliciador inclui a indução de respostas imunes ou de resistência em plantas ou animais.

A primeira resposta a eliciadores é indicada por alterações na permeabilidade da membrana e ativação de canais de íons específicos que conduzem ao influxo de Ca²⁺ e H⁺ e ao efluxo de Cl- e K⁺ (Cervone et al., (1997) Perception of fungal elicitors and signal transduction em Aducci P., ed. Signal transduction in plants Basel, Suiça: Birkhauser Verlag, 153177). Este passo também é caracterizado por alterações rápidas do potencial transmembranar. Em numerosos casos, observou-se a despolarização da membrana (Kuchitsu et al., (1993) N-acetylchitooligossaccharides, biotic elicitor for phytoalexin production, induce transient membrane

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9/36 depolarization in suspension-cultured rice cells Protoplasma 174, 79-81). Estes efeitos localizados na membrana são seguidos pela explosão oxidativa, a síntese de fitoalexinas e

a ativação	de	genes de	defe	sa (Templeton e	Lamb, (1988)
Elicitors	and	defense	gene	activation Plant, Cell	and
Environment	11,	395-401)	. No	passado, houve	problemas	com

abordagens existentes para estimular a resistência como um método prático de controlo de doenças. Estes problemas incluíram fitotoxicidade (amarelecimento, necrose, e malestar generalizado das plantas), ausência de níveis significativos de controlo de doenças, e ausência de reprodutibilidade/sustentabilidade. A composição da presente invenção com vantagem atenua estas limitações.

Além disso, esta composição é uma composição fertilizante que pode ser utilizada para aumentar, e. g., os rendimentos de plantas, através do aumento da altura, da espessura (do caule, folhas, raízes...), da biomassa, ou do número de flores/frutos por planta. Sabe-se que uma medida de biomassa, que é basicamente a densidade ou quantidade de vida vegetal, está diretamente relacionada com o rendimento das culturas.

Contudo, a composição de acordo com a invenção pode também ser constituída por outros elementos, tais como outros oligossacarídeos, reguladores do crescimento (ou fatores de crescimento), minerais, íons, alimentos, aditivos alimentares, aromatizantes, corantes, vitaminas, minerais, fragrâncias, fito-nutrientes e outras moléculas bioativas para melhoramento da bioatividade da composição, especialmente da bioatividade de cada oligossacarídeo nestas várias aplicações.

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Consequentemente, a composição de acordo com a invenção corresponde a uma composição farmacêutica (incluindo uma vacina), um adjuvante, uma composição cosmética, uma composição de alimento ou de ração (incluindo alimento funcional ou ração funcional), um aditivo alimentar, uma bebida (especialmente vinho, cerveja ou sumo de fruta) ou um adjuvante de bebida, um produto fitossanitário (de um modo preferido, uma composição fungicida), um fertilizante, um eliciador ou um adjuvante destes produtos.

Por exemplo, a composição de acordo com a invenção pode ser utilizada para recuperação da referida bebida, de partículas orgânicas, microrganismos, colóides, proteínas, metais pesados, pesticidas residuais, micotoxinas e endotoxinas.

A composição de acordo com a invenção também pode ser utilizada como aditivos alimentares naturais para obtenção de atividades antimicrobiana e antifúngica contra uma gama ampla de fungos (incluindo leveduras) e bactérias e também pode ser utilizada como adjuvante para conservantes alimentares naturais e agentes anti-escurecimento, como componente para películas comestíveis permeáveis a gases, para armazenagem de fruta/vegetais, como agente espessante, estabilizante ou emulsionante, como agentes tixotrópicos ou como um diluente do aroma natural. Também pode ser utilizada em vários processos de alimentação uma vez que pode, por exemplo, ser aplicado como agente espumante, como espessante ou como estabilizador.

A atividade antimicrobiana e antifúngica (para a proteção de sementes ou frutos de plantas) da composição de acordo com a invenção pode ser utilizada na indústria alimentar, ou de alimentos para animais para obtenção de prazo de validade

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11/36 alargado, amadurecimento e decomposição retardados de frutos ou vegetais, para a conservação de carne, crustáceos (ostras), frutos, vegetais e produtos acabados, eventualmente em combinação com conservantes convencionais (sulfito ou benzoato de sódio) ou como alternativa a estes conservantes.

A composição de acordo com a invenção também pode ser aplicada em fibras têxteis na forma de uma película ou por impregnação dessa fibra ou tecido com uma solução compreendendo a composição de acordo com a invenção. Consequentemente, a propriedade da fibra de um têxtil pode ser modificada (propriedades antibacterianas e/ou antifúngicas melhoradas). Este têxtil também pode corresponder a um têxtil médico para o tratamento de feridas. As aplicações cosméticas da composição de acordo com a invenção são particularmente adequadas para uma formulação para cuidados da pele (creme, loção) ou para uma formulação para o cuidado capilar (como produtos para pulverização, xampus ou formulações para depois do xampu), numa composição de maquilagem em pastas de dentes e também pode ser utilizadas pelas suas propriedades anti-UV, na preparação de desodorante, em composições de higiene oral e em composições para encapsulação de pigmentos. Com vantagem, devido à sua origem não animal, é possível utilizar a composição sem induzir os riscos de alergias.

Em aplicações ambientais, a composição de acordo com a invenção pode ser utilizada como um agente quelante (quelante de metais pesados) ou para o tratamento de águas residuais, especialmente em técnicas de purificação de água para segregação de compostos orgânicos e metais pesados. Também podem ser utilizados para precipitação de certos compostos

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12/36 residuais ou outros poluentes, como DDT e policlorobenzenos ou para fixação de radicais.

Com vantagem, a composição de acordo com a invenção também pode ser utilizada no processo de fabrico de papel. Podem substituir alguns substituintes amino, tais como goma ou polissacarídeos polissintéticos e são adequadas para redução da utilização de aditivos químicos e para melhoramento da produtividade.

Também é possível que o papel obtido por utilização da composição de acordo com a invenção possa apresentar uma superfície mais uniforme e melhor resistência a umidade. Também podem ser utilizadas para a produção de papel higiênico, papel de embalagem e papelão.

Outra aplicação vantajosa da composição de acordo com a invenção é no campo de medicina e aplicação farmacêutica.

Devido às boas propriedades de bioadesão, a composição de acordo com a invenção pode ser aplicada como auxiliar cirúrgico anti-adesivo, para evitar a adesão entre tecidos durante a cirurgia e como adjuvante para vacinas, graças a uma boa muco-adesão.

A presente invenção está, portanto, relacionada também com qualquer biomaterial que compreenda a composição de acordo com a invenção para aplicações médicas, de diagnóstico ou de investigação de compostos a serem libertados nos intestinos, devido à não digestão da composição da invenção no estômago (liberação retardada).

A presente invenção pode ser formulada como um aditivo para aplicação de liberação controlada oral e parenteral e também pode melhorar a eficácia de transportadores orais por modificações químicas e de ligação de fármacos e outras

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13/36 moléculas biofuncionais e também pode ser utilizada para melhorar as propriedades formadoras de película e géis de compostos conhecidos e pode ser utilizada para fabricação de membranas transdérmicas.

As suas propriedades muco-adesivas também podem ser utilizadas para obtenção de um bom contato entre camadas da pele e para melhoramento de sistemas de administração de fármacos inovadores através de administração local e sistêmica. Também pode ser utilizada na produção de excipientes na formação de comprimidos, granulação de pós, preparação de emulsões, como agentes umectantes ou de revestimento. Também se pode utilizar as suas várias características vantajosas, tais como sua bioadesividade e a sua aptidão para formar complexos de fármacos (aniônicos, catiônicos ou anfifílicos) e polímeros em sistemas de fármacos para melhorar a solubilidade de fármacos fracamente solúveis em água, para aumentar a absorção de fármacos través de tecidos mucosos e para potenciar (melhorar ou modular) a resposta imunológica de vacinas (como adjuvantes de vacinas). As propriedades farmacêuticas conhecidas da quitosana, especialmente na cicatrização de feridas, permitem a utilização da composição para impedir ou tratar a formação de pedaços de fibrina em feridas, para impedir a formação de cicatrizes e para apoiar a regeneração celular.

A composição também pode ser utilizada para engenharia de tecidos, transplantação de células e encapsulação de células. Pode ser utilizada em películas permeáveis ao ar, para suportar a regeneração celular, ao mesmo tempo em que protege os tecidos de agressões microbianas, para formar suturas e ligaduras, para o fabrico de pele artificial, em

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14/36 sistemas para reconstrução de tecidos e órgãos e/ou a transplantação de células (eventualmente suturas e ligaduras bio (degradáveis).

Consequentemente, estas aplicações farmacêuticas podem ser combinadas, com vantagem, com compostos conhecidos, para reparação de tecidos, tais como biomateriais contendo partículas de osso ou partículas de cartilagem, íons e sais, fatores de crescimento e hormonas e derivados do plasma, tais como fibrinogênio, fatores de coagulação, plaquetas, incluindo plasma rico em plaquetas e plasma pobre em plaquetas (PRP e PPP), antibióticos, vitaminas, fatores de diferenciação, citoquinas, interferons, proteínas de tecidos moles (tais como cartilagens, elastina, fibrina, ou os seus precursores), etc.

A composição de acordo com a invenção apresenta

características hidratantes	vantajosas,	propriedades	de
cicatrização	de feridas,	propriedades	regeneradoras	e
propriedades	antimicrobianas	e/ou antifúngicas.
A composição	de acordo com a	invenção pode	ser apresentada	em

várias formas, especialmente forma líquida (e. g., soluções aquosas), forma de partículas (nanopartículas, microesferas e suas suspensões ou emulsões, pastilhas) e em forma sólida porosa ou não porosa. Quando se considera as aplicações agrícolas e agroquímicas da presente composição, tipicamente vai conter componentes adicionais conhecidos por serem úteis para aplicação de materiais a culturas em crescimento, tais como um ou mais materiais transportadores, materiais tampão para controlo do pH, e outros semelhantes. A água vai ser frequentemente utilizada como um veículo, mas também podem ser utilizados outros veículos convencionais. Entender-se-á

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15/36 que a quantidade de solução necessária para tratamento da cultura vai depender da cultura específica a ser tratada. Essa quantidade é aquela que é facilmente determinada por um especialista na matéria.

A composição de acordo com a invenção também pode ser facilmente aplicada em sistemas agrícolas e agroquímicos, como um revestimento conservante e agente bioestático quando aplicada em frutos, vegetais e culturas, como um fertilizante, como um agente para aumento do número de microrganismos úteis do solo e redução dos nocivos (controlo biológico). Controlo biológico significa a redução da quantidade de inóculo ou de atividade produtora de doença de um agente patogénico conseguida por ou através de um ou mais organismos que não o homem (Harman et al., Enzymes, Biological Control and Commercial Applications, Trichoderma and Gliocladium Vol. 2, Chap. 6 (1998)) . As estirpes de controlo biológico são conhecidas na arte e são eficazes numa grande variedade de habitats e contra uma diversidade de agentes patogênicos (Harman et al., ver acima). Exemplos de organismos de controlo biológico podem ser quaisquer dos identificados como sendo úteis para controlo biológico de doenças de plantas, incluindo, sem limitação, os dos seguintes gêneros: Trichoderma, Gliocladium, Pythium, Phytophthora, Rhizoctonia, Fusarium, Botrytis e Sclerotinia (Harman et al., ver acima e Patentes U.S. N° 5474926 e 6512166). As sementes de plantas podem ser impregnadas em soluções aquosas da composição de acordo com a invenção para impedir infecções fúngicas e/ou microbianas e aumentar a produção das plantas. A composição da invenção também pode ser utilizada para obtenção de um revestimento eficiente de

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16/36 sementes .

Em concentrações adequadas, a composição da invenção pode ser utilizada para desencadear mecanismos de defesa das plantas contra infecções e agressões parasitárias (efeito eliciador) através de aplicações sistêmicas e/ou tópicas. Esse efeito eliciador pode ser medido através de certas atividades enzimáticas induzidas nas plantas tratadas com a composição da invenção, tais como as atividades de glucanase, quitinase e Fenilalanina Amônia Liase (PAL).

Além das suas propriedades eliciadoras, bioestáticas, fertilizantes e/ou conservantes, a composição de acordo com a invenção pode ser utilizada para reforças as raízes de plantas e para espessar o caule de plantas. A composição da invenção também pode ser utilizada como substituto, intensificador ou modulador de fito-hormônios.

A composição da invenção também pode ser utilizada para estimular a síntese de agentes protetores pela própria planta, para acelerar a germinação e o crescimento de plantas. Exemplos de agentes protetores sintetizados por plantas são: Óxido Nítrico (NO), Espécies de Oxigênio Reativas (Ros), ácido salicílico, ácido jasmônico, Proteínas Relacionadas com Patogêneses, e Fitoalexinas.

A composição de acordo com a invenção pode ser aplicada em sementes, folhas, flores/frutos e/ou raízes das plantas por pulverização, imersão, impregnação, imersão rápida, injeção e através de sistemas de rega fertilizante. Como um fertilizante, a composição da invenção pode ser aplicada indiferentemente através de alimentação no solo ou por alimentação foliar de forma a acelerar a germinação e o crescimento de plantas. A composição da invenção pode ser

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17/36 espalhada em forma seca ou como uma diluição de uma solução. Como um eliciador, a composição desejada da presente invenção pode ser aplicada na forma de um pulverizado, ou como um sólido, em que o eliciador está presente conjuntamente com um veículo adesivo agriculturalmente aceitável, e. g., metil celulose ou goma arábica e aplicada como um pó. A aplicação da formulação pode ser feita de acordo com técnicas bem conhecidas pelos especialistas na matéria, tais como por preparação de um produto para pulverização para aplicação na cultura em crescimento. Entender-se-á que a quantidade de solução necessária para tratamento da cultura vai depender da cultura específica a ser tratada. Essa quantidade é uma que é prontamente determinada por um especialista na matéria.

As plantas em causa são dicotiledôneas e monocotiledôneas, de um modo preferido plantas economicamente importantes selecionadas do grupo que consiste em tomates, cenouras, pepinos, ervilhas, alfaces, pimenta de Caiena, beterrabas açucareiras, batatas, trigo, milho, arroz, alfafa, cevada, centeio, algodão, girassol, amendoim, batata doce, feijão, chicória, endívia, couve, couve de Bruxelas, pastinaca, nabo, couve-flor, brócolis, rabanete, espinafre, cebola, alho, berinjela, pimenta, aipo, abóbora, abóbora-moranga, abobrinha, maçã, pêra, melão, cítricos, morango, uva, framboesa, abacaxí, soja, tabaco, sorgo e cana-de-açúcar. Exemplos de plantas ornamentais adequadas são: Saintpaulia (violeta-africana), petúnia, pelargónio, copo-de-leite, crisântemo, cravo, zínia, e gramas.

A composição da invenção também pode ser utilizada para obtenção de um revestimento de produtos fitossanitários conhecidos, tais como fungicidas, pesticidas, herbicidas,

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18/36 etc. Devido às suas características melhoradas, pode ser utilizada para obtenção de uma redução da quantidade de pesticidas utilizados habitualmente para o tratamento destas plantas.

As características adesivas vantajosas da composição de acordo com a invenção também permitem a sua utilização noutros campos (química, metalurgia, eletrônica, têxteis, etc.) para o revestimento de suportes sólidos.

Outro aspecto da presente invenção está relacionado com o processo de preparação da composição de acordo com a invenção, em que uma quantidade suficiente de um ou mais sacarídeos policatiônicos é adicionada a oligogalacturonanas (ou quaisquer outros oligossacarídeos adequados (oligoguluronanas) que possam apresentar uma conformação em caixa de ovos). Esta quantidade suficiente é, com vantagem, definida de acordo com a concentração das oligogalacturonanas (ou dos referidos outros oligossacarídeos) inicialmente presentes e o grau de polimerização destes sacarídeos.

No processo de preparação da composição de acordo com a invenção, os vários elementos são misturados desde que seja obtida uma solução aquosa uniforme, i. e., não é observada a formação de polímeros ou gel. Adicionalmente, o pH da composição é de um modo preferido mantido entre cerca de 5,0 e cerca de 6,0 (para obtenção de uma solubilidade eficiente do componente e para manutenção da segurança da planta tratada), quando aplicável. A composição da invenção pode ser preparada, e. g., por diluição de uma solução mãe em água ou qualquer outro solvente apropriado, ou por mistura de uma forma sólida da composição em água ou qualquer outro solvente apropriado. As composições assim preparadas são adequadas

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19/36 para administração através das vias de administração tópica ou sistêmica.

Para este processo de preparação também está presente uma quantidade adequada de íons para obtenção desta conformação em caixa de ovo de um modo preferido detectável pelo anticorpo 2F4. Uma vez que os diferentes elementos contêm íons monovalentes e divalentes, numa proporção molar divalente/monovalente de um modo preferido entre cerca de 1/50 e cerca de 1/300 (ou cerca de 1/25 e cerca de 1/250 miliequivalentes), podem ser utilizados para obtenção da conformação em caixa de ovos bioativa destas oligogalacturonanas (ou outros oligossacarídeos) adicionalmente estabilizada pela adição destes sacarídeos policatiônicos. A proporção de cátions divalentes/monovalentes pode ser diminuída em condições não fisiológicas (tais como ELISA) ou aumentada em condições fisiológicas (tais como culturas de células) em que, e. g., uma concentração de Na+ elevada seria nociva. É preferencialmente utilizado Ca²⁺ como iôn divalente. Outros cátions divalentes são também adequados (Mn²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺...).

Para oligogalacturonanas que apresentam graus elevados de polimerização (superiores a 8) é adicionada uma quantidade superior de sacarídeos policatiônicos. Esta concentração é também definida de acordo com o número de cargas positivas presentes nos sacarídeos policatiônicos.

Esta concentração é caracterizada pelo grau de polimerização dos sacarídeos policatiônicos adicionados. De um modo preferido, os oligossacarídeos adicionados têm um grau de polimerização superior a 5.

Com vantagem, a quantidade dos dois componentes é definida de

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20/36 acordo com as características da composição a ser obtida, de um modo preferido para obtenção de uma estabilização eficiente exigida pela conformação em caixa de ovos que é de um modo preferido caracterizada pela sua capacidade para se ligar ao anticorpo PP-2F4 específico (IgG1 de camundongo) comercializado pela empresa plantprobes (UK) (www. plantprobes . co .uk) .

Outro aspecto da invenção está relacionado com o envelhecimento da mistura de forma a aumentar a proporção de moléculas de galacturonanas na conformação bioativa tal como exemplificado a seguir.

Os sacarídeos de alginatos (oligoguluronanas) ligam-se aos íons Ca²⁺ num processo cooperativo, que também foi explicado de acordo com o modelo da caixa de ovos. Pode estabilizarse estas caixas de ovos de alginatos com oligossacarídeos de quitosana ou outros polímeros policatiônicos (poliaminas ou sacarídeos policatiônicos).

Outro aspecto da presente invenção está relacionado com a utilização desta composição na aplicação acima referida, especialmente em aplicações médicas, farmacêuticas, nutracêuticas, alimentares, de rações, têxteis, cosméticas, industriais, agronômicas e/ou ambientais, especialmente em aplicações em que é observado o efeito sinérgico dos dois componentes da composição ou em aplicações em que são reduzidas as possíveis desvantagens de um ou ambos os componentes individuais; por exemplo, para modulação da morte celular induzida por um componente individual, para obtenção de uma redução da reação de stress oxidativo induzida por adição de componente individual (e. g., para obtenção de menos acumulação de espécies de oxigênio reativas, tais como

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21/36 peróxido de hidrogênio) e para obtenção de atividade acrescida em sistemas celulares (tais como atividade de fenilalanina amónia liase envolvida na defesa contra stresses bióticos induzidos por agentes patogênicos).

Ainda outro aspecto da presente invenção é um método para aumentar a resistência de plantas a doenças. Este método envolve a aplicação de uma composição da presente invenção a plantas em condições eficazes para aumentar a resistência da planta a doenças. A aplicação da composição desejada da presente invenção é realizada como descrito acima, utilizando uma quantidade suficiente da composição desejada da presente invenção apropriada preparada para o modo de aplicação selecionado.

Um aspecto adicional da presente invenção é um método de aumentar os rendimentos de plantas, através de altura, espessura (do caule, folhas, raízes...), biomassa, ou número de flores/frutos aumentados por planta. Este método envolve a aplicação de uma composição da presente invenção a plantas em condições eficazes para obtenção de rendimentos mais altos. A aplicação da composição desejada da presente invenção é realizada como descrito acima, utilizando uma quantidade suficiente da composição desejada da presente invenção apropriadamente preparada para o modo de aplicação selecionado.

A presente invenção vai ser descrita em mais pormenor nos exemplos anexos, com referência às figuras anexas que são apresentadas como ilustração não limitativa das várias formas de realização da presente invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: preparação de quitooligossacarídeos

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Quitosana com uma concentração de cerca de 10,0 g/L foi dissolvida, por agitação de um dia para o outro, à temperatura ambiente em tampão acetato cerca de 0,175 M pH, cerca de 5,5. Esta solução de quitosana (cerca de 90 mL) foi misturada com 10 mL de Pectinex Ultra SPL (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca). A mistura reacional foi incubada a cerca de 37 °C durante cerca de 24 h. Os quitooligossacarídeos são isolados por precipitação seletiva em metanol a 90% do hidrolisado de quitosana neutralizado. A composição do conjunto de quitooligossacarídeos obtidos está apresentada na Tabela 1.

TABELA 1: Composição iônica atribuída de espectros MALDI-TOFMS de quitooligossacarídeos com graus de polimerização (DP) de 6 ou mais preparados por hidrólise enzimática e fracionados por precipitação seletiva em metanol a 90%.

m/z	Composição iônica	Tipos
1007,4	(GlcN)6	[M+Na]⁺
1023,4		[M+K]⁺
1049,9	(GlcN)5-GlcNAc	[M+Na]⁺
1109,9	(GlcN)3-(GlcNAc)3	[M+H]⁺
1168,4	(GlcN)7	[M+Na]⁺
1184,4		[M+K]⁺
1210,7	(GlcN)6-GlcNAc	[M+Na]⁺
1226, 4		[M+K]⁺
1270,7	(GlcN)4-(GlcNAc)3	[M+H]⁺
1329,5	(GlcN)8	[M+Na]⁺
1345,5		[M+K]⁺
1371,8	(GlcN)₇-GlcNAc	[M+Na]⁺
1387,5		[M+K]⁺
1490,5	(GlcN)9	[M+Na]⁺
1506,5		[M+K] ⁺
1532,8	(GlcN)8-GlcNAc	[M+Na]⁺
1651,6	(GlcN)10	[M+Na]⁺
1812,7	(GlcN)11	[M+Na]⁺

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Exemplo 2: preparação de oligogalacturonanas

Obteve-se oligômeros pécticos por hidrólise enzimática de ácido poligalacturônico. A solução de PGA (cerca de 2% p/v, pH 6,0, 9O mL) foi hidrolisada com cerca de 1O mL de solução (1:3000) de Pectinex Ultra SPL durante 60 min. Depois de a solução ter sido levada à ebulição durante cerca de 10 mm, os oligossacarídeos pécticos foram fracionados por precipitação seletiva dos seus sais de bário. A composição do conjunto de oligogalacturonanas obtidas está apresentada na figura 1 que é um padrão de eluição em HPAEC-PAD da mistura de oligogalacturonanas do hidrolisado péctico. Os picos estão marcados como os seus correspondentes graus de polimerização. Exemplo 3: Estabilização da configuração em caixa de ovos

Os quitooligossacarídeos são capazes de estabilizar a conformação em caixa de ovos das oligogalacturonanas induzida por íons cálcio. Este efeito depende do grau de polimerização dos quitooligossacarídeos, grau de acetilação (DA) e da proporção molar de quitooligossacarídeo/ácido galacturônico na mistura. Utilizou-se um anticorpo monoclonal (chamado 2F4), que reconhece a conformação da pectina em caixa de ovos induzida por cálcio.

Revestimento de micro-poços com imunoglobulina anticamundongo: Cinquenta pL da imunoglobulina anti-camundongo (Whole molecule, SIGMA) (cerca de 0,05 mg/mL em tampão carbonato 50 mM pH 9,5) foram, distribuídos a cada poço de microplacas NUNC com alta capacidade de ligação (MAXISORP) e deixadas de um dia para o outro a 4 °C. A ligação não específica foi bloqueada por incubação dos poços durante cerca de 2h a cerca de 37°C com cerca de 250 pL de albumina de soro de bovino (cerca de 30 mg/mL preparados em tampão

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24/36 acetato 50 mM pH 5,7 contendo cerca de CaCl2 0,5 mM e NaCl cerca de 150 mM) . Esta solução, quando expressa em miliequivalentes, corresponde a 1 miliequivalente de cálcio, uma vez que o cálcio é um cátion divalente e 150 miliequivalentes de sódio uma vez que o sódio é um cátion monovalente. Após a remoção do excesso de albumina, soluções competitivas foram adicionadas aos poços.

Preparação de soluções competitivas e incubação com anticorpos: Foram preparadas soluções competitivas com 100 pL de ascites 2F4 diluídas 177 vezes no tampão acetato contendo a solução de Ca²⁺/Na+ descrita acima e pré-incubadas com cerca de 100 pL da solução da mistura de material péctico e quitooligossacarídeos durante cerca de 30 minutos a cerca de 25 °C. Estas misturas de oligossacarídeos-anticorpo foram então centrifugadas durante cerca de 10 minutos a cerca de 7500 g antes de se distribuir o sobrenadante em micro-poços revestidos com imunoglobulina anti-camundongo e bloqueados como descrito acima. As microplacas contendo sobrenadantes dos ensaios competitivos foram incubadas durante cerca de 60 minutos a cerca de 37 °C. As microplacas foram, então, lavadas oito vezes com o tampão contendo a solução de Ca^{2 +} /Na+ como descrito acima e contendo ainda cerca de 0, 1% de Tween 20 antes da adição de cerca de 50 pL de imunoglobulina anti-camundongo de ovelha marcada com peroxidase de rábano (cerca de 1:5000 em tampão acetato 50 mM contendo a solução de Ca²⁺/Na+ descrita acima) durante 60 minutos a 37 °C. Depois de um segundo ciclo de lavagem, a ligação dos anticorpos foi revelada por cerca de 100 pL de substrato TMB intensificado com substrato TMB Enhanced K-blue (Neogen Corporation, Lexington, KY, EUA) incubados durante

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25/36 cerca de 20 minutos ao abrigo da luz à temperatura ambiente. O processo de revelação foi parado por cerca de 50 μL de HCl 1 N. A absorvência da solução foi medida após 15 minutos com um Multiscan® Titertek a 405 nm.

A Figura 2 representa a estabilização da dimerização de oligogalacturonanas (DP9-DP15) induzida por cálcio por quitooligossacarídeos com baixo DA e diferentes graus de polimerização. Os 2F4 MoAbs foram incubados com oligogalacturonanas e diferentes concentrações de quitooligossacarídeos com DA de 10% com DP baixo e alto. As misturas resultantes foram centrifugadas e os sobrenadantes distribuídos em micro-poços revestidos com Ig anticamundongo. Os resultados estão expressos como percentagem da absorvência do controlo sem quitooligossacarídeos.

Exemplo 4: experiências in vitro

A. As moléculas pépticas dificultam a morte celular induzida por quitooligossacarídeos completamente desacetilados em suspensões de células de Arabidopsis thaliana. A viabilidade celular é expressa como função do teor de proteína das células (mg de proteína/Peso Fresco (PF)).

A Figura 3 representa o teor de proteína de suspensões de células de Arabidopsis 24 h após o tratamento com quitooligossacarídeos (completamente desacetilados, DP entre 5 e 9), oligogalacturonanas (DP superior a 8) e a sua combinação. Os dados são a média ± DP de amostras em triplicado de uma experiência representativa de duas experiências independentes.

Células cultivadas em suspensão derivadas de folhas de Arabidopsis thaliana estirpe L-MM1 ecotipo Landsberg ereta foram cultivadas em meio de Murashige e Skoog (cerca de 4,43

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g/L)	com sacarose	(cerca de 30 g/L) ,	cerca	de	0,5	pg/mL	de
NAA e	cerca de 0	, 05	pg/mL	de Kinetin,	pH	5,7.	As	culturas
foram	mantidas	sob	um	fotoperíodo	de	16	h/8 h	de

luz/escuridão, a cerca de 25 °C, num agitador rotativo a 100 rpm. As células foram diluídas 10 vezes em meio fresco a cada 7 dias.

Os quitooligossacarídeos a serem testados foram dissolvidos em 250 pL de água destilada, filtrados através de um filtro de membrana de 0,22 pm (MILLIPORE) e adicionados assepticamente a cerca de 10 mL de células de cultura de uma suspensão com 3 dias de idade e incubadas durante cerca de 24 horas a cerca de 25 °C com agitação suave. Cinco mL da mistura reacional foram centrifugados durante cerca de 5 min a cerca de 100 g e cerca de 4 °C em cerca de 1 mL de tampão borato cerca de 0,1 M (pH 8,8) contendo mercaptoetanol cerca de 2 mM. O homogeneizado foi centrifugado a 4000 rpm durante cerca de 10 minutos a cerca de 4 °C. A concentração de proteína dos extratos foi determinada pelo ensaio de proteínas de Bradford (BIO-RAD).

B. Quitooligossacarídeos___em combinação com oligogalacturonanas estimulam o crescimento celular em suspensão de células de cenoura.

Esta experiência foi realizada como descrito acima, mas utilizando uma suspensão de células de cenoura (Daucus carota). A densidade das células foi determinada em peso (g de células/mL).

A Figura 4 representa a densidade das células de suspensão de células de cenoura 24 h após tratamento com quitooligossacarídeos (completamente desacetilados, DP entre 5 e 9), oligogalacturonanas (DP superior a 8) e a sua

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27/36 combinação. Os dados são a média ± DP de amostras em triplicado de uma experiência representativa de duas experiências independentes.

C. Combinações específicas de oligogalacturonanas e quitooligossacarídeos têm maior atividade eliciadora da reação de defesa das plantas do que oligossacarídeos individuais.

Esta experiência foi realizada tal como descrito acima. A atividade de PAL (EC 4.3.1.5) foi determinada em 0,125 mL de sobrenadante na presença de cerca de 1,37 mL de tampão borato cerca de 0,1 M (pH 8,8) suplementado com L-fenilalanina cerca de 60 mM tal como descrito por Beaudom-Eagan e Thorpe (Plant. Physiol. 78: 438-441, 1985) e expressa como micromoles de ácido cinâmico produzido por mg de proteína por hora).

A Figura 5 representa a indução da atividade de PAL em suspensão de células de Arabidopsis 24 h após tratamento com quitooligossacarídeos (completamente desacetilados, DP entre 5 e 9), oligogalacturonanas (DP superior a 8) e a sua combinação. Os dados são a média ± DP de amostras em triplicado de uma experiência representativa de duas experiências independentes.

D. Combinações específicas de oligogalacturonanas e quitooligossacarídeos induzem menor stress oxidativo em plantas____do____que____a____aplicação____individual____destes oligossacarídeos.

As condições de cultura de células são semelhantes às descritas acima.

Determinação de H₂O₂: Os quitooligossacarídeos a ser testados foram dissolvidos em cerca de 50 pL de água destilada, filtrados através de um filtro de membrana de 0,22 pm

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28/36 (MILLIPORE) e adicionados a cerca de 5 mL de células cultivadas em suspensão com 3 dias de idade e incubados a 25 °C com agitação. Alíquotas de cerca de 100 pL foram retiradas de 4 em 4 minutos durante 30 minutos, centrifugadas rapidamente e a concentração de H2O2 foi determinada no sobrenadante utilizando o kit de dosagem de peróxido de hidrogênio/peroxidase Amplex Red (MOLECULAR PROBES) de acordo com as instruções do fornecedor.

A Figura 6 representa a acumulação de peróxido de hidrogênio em suspensão de células de Arabidopsis 24 h após tratamento com quitooligossacarídeos (completamente desacetilados, DP entre 5 e 9), oligogalacturonana (DP superior a 8) e a sua combinação. Os dados são a média ± DP de amostras em triplicado de uma experiência representativa de duas experiências independentes.

EXEMPLO 5: Combinações específicas de oligogalacturonideos e quitooligossacarídeos podem ser absorvidas por sementes de tomateiro e estimular o crescimento da planta.

Sementes de tomateiro (Lycopersicum esculentum) da variedade Moneymaker foram imersas numa solução contendo uma mistura de oligogalacturonideos e quitooligossacarídeos em condições iônicas adequadas para induzir formação de dímeros pécticos (cátions Ca²⁺/Na+ numa proporção de cerca de Ca²⁺ 0,5 mM/Na⁺150 mM) ou uma solução contendo todos os elementos da mistura excluindo a mistura de oligossacarídeos (Controle) durante 4 horas. Os quitooligossacarídeos utilizados tinham um grau de acetilação de 25%. Em seguida, as sementes foram secas antes de serem plantadas e cultivadas durante 30 dias, num viveiro com 6 cavidades em terra a 25 °C, num regime de 16 h de luz/8 h de escuro.

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A Figura 7 representa a biomassa (fresca e seca) de tomateiros com 30 dias, obtidos a partir das sementes tratadas com quitooligossacarídeos, oligogalacturonideos e a sua combinação, expressa como percentagem da biomassa de plantas de controlo. Estão descritos os valores da média ± EP (n=3). As letras maiúsculas e as letras minúsculas referem-se a dois ensaios ANOVA independentes. Os dados com as mesmas letras não são estatisticamente diferentes (P < 0,05).

EXEMPLO 6: Aplicação foliar de combinações específicas de oligogalacturonideos e quitooligossacarídeos sinergicamente induz reações de defesa em tomateiros.

Tomateiros da variedade moneymaker foram cultivados em terra em condições controladas com um regime de claro/escuro de 16 h/8 h respectivamente, a 25 °C, durante 20 dias antes de serem pulverizados com soluções contendo a mistura de oligogalacturonideos e quitooligossacarídeos a 250 mg.L^-1dissolvida numa solução a pH 5,5 contendo Tween 20 a cerca de 0,01% e cátions Ca²⁺/Na+ numa proporção de cerca de Ca²⁺ 0,5 mM/Na⁺ 150 mM. Os quitooligômeros utilizados na mistura tinham um grau de acetilação (DA) de 25%. Como controlo, água contendo Tween 20 a cerca de 0,01% foi pulverizada nas folhas.

Após 24 horas, as folhas verdadeiras de plantas tratadas por pulverização foram colhidas e trituradas em azoto líquido. As folhas pulverizadas foram extraídas com tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,2 contendo EDTA cerca de 5 mM, βmercaptoetanol cerca de 14 mM e NaCl cerca de 1,0 M numa proporção de cerca de 1 g de folhas pulverizadas por 2 mL de tampão. O extrato foi então centrifugado a 12000 g durante 15 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi analisado quanto à

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30/36 atividade de duas proteínas relacionadas com patogéneses: glucanase (atividade expressa como mg de glucose libertada/mg de proteína.min) (Boudart et al., (1998) Planta 206:86-94) e quitinase (atividade expressa como picomoles de p-nitrofenol libertado/mg de proteína.min) (kit de dosagem de quitinase, Sigma).

A Figura 8 representa a indução de atividade de glucanase e de quitinase em tomateiros após 24 horas de uma aplicação foliar da mistura de oligogalacturonideos e quitooligossacarídeos. Estão descritos os valores da média ± EP (n=3). Os testes ANOVA indicam diferenças estatisticamente significativas (P < 0,05) entre plantas tratadas com a solução de controlo e a mistura.

EXEMPLO 7: Combinações específicas de oligogalacturonideos e quitooligossacarídeos sinergicamente induzem reações de defesa em plantas de Arabidopsis.

Plantas de Arabidopsis thaliana foram cultivadas a 25 °C num regime de claro/escuro de 16 h/8 h, em meio semi-sólido contendo nutrientes Murashige e Skoog a cerca de 4,4 g/L, sacarose a cerca de 30 g/L e agar a cerca de 0,3 g/L. Plantas completamente desenvolvidas foram retiradas do meio, lavadas com tampão MES cerca de 0,05 M a pH 5,7 e transferidas para o mesmo tampão com cátions Ca²⁺/Na+ numa proporção de cerca Ca²⁺ 0,5 mM/Na⁺ 150 mM, que contém só oligogalacturonideos (DP 9-20) , só quitooligômeros (DP 5-9, DA 25%) ou uma mistura de oligogalacturonideos e quitooligômeros. A atividade de fenilalanina amônia liase (PAL) foi testada 24 h mais tarde (micromoles de ácido cinâmico produzido/mg de proteína.h).

A Figura 9 representa a indução de atividade de PAL em plantas de Arabidopsis tratadas com oligogalacturonideos,

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31/36 quitooligômeros ou a sua combinação. Estão descritos os valores da média ± SE (n=3) . O ensaio de ANOVA indica diferenças estatisticamente significativas (P < 0,05) para plantas tratadas com quitooligômeros ou mistura.

Exemplo 8: EFLUXO DE POTÁSSIO E ALCALINIZAÇÃO DO MEIO

Células cultivadas em suspensão derivadas de folhas de Arabidopsis thaliana estirpe L-MM1 ecotipo Landsberg erecta foram cultivadas em meio de Murashige e Skoog (cerca de 4,43 g L^-1) com sacarose (cerca de 30 g L^-1), NAA cerca de 0,5 pg mL^-1, Kinetin cerca de 0,05 pg mL^-1, pH 5,7. As culturas foram mantidas com um fotoperíodo de claro/escuro de 16 h/8 h, a cerca de 25 °C, num agitador rotativo a 100 rpm. As células foram diluídas 10 vezes em meio fresco a cada sete dias. Para as experiências foram utilizadas células com sete dias.

Quitooligossacarídeos (cerca de 30 mg L^-1), oligogalacturónidos (cerca de 40 mg L^-1) e uma mistura de ambos os oligossacarídeos a cerca de 70 mg L^-1 foram dissolvidos numa solução contendo sacarose cerca de 10 mM, Ca²⁺ cerca de 0,5 mM, Na⁺ cerca de 50 mM e MES cerca de 0,5 mM, ajustada para pH 5,7 com Tris(hidroximetil)aminometano. Colocou-se alíquotas de células lavadas (100 mg de peso fresco (PF) mL^-1) em frascos de vidro e o meio de incubação foi mudado para igual volume de soluções de teste e agitou-se num agitador rotativo a 150 rpm. O pH e as concentrações de K⁺ extracelulares foram determinados em alíquotas do meio de incubação obtidas por filtração rápida das células através de Miracloth® (Calbiochem).

As alterações do pH extracelular foram monitorizadas com um eletrodo de pH e as concentrações de K⁺ extracelular

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32/36 determinadas em HCl 1 N utilizando um espectrofotômetro de absorção atómica (PU 9200X, Pye-Unicam, Cambridge, UK).

A Figura 10 mostra o efluxo de potássio de células em suspensão de Arabidopsis tratadas com quitooligômeros, oligogalacturonídeos ou a mistura. A mistura controla o efluxo de potássio até valores semelhantes aos valores só dos oligogalacturonídeos.

A Figura 11 mostra a alcalinização do meio de células em suspensão de Arabidopsis tratadas com quitooligômeros, oligogalacturonídeos ou a mistura. A mistura induz alcalinização sustentada do meio enquanto que os componentes individuais têm um efeito durante menos que uma hora após o tratamento.

A Figura 12 representa a alcalinização do meio de células em suspensão de Arabidopsis 24 h após tratamento com quitooligômeros, oligogalacturonídeos ou a mistura. A mistura induz uma alcalinização do meio claramente maior do que os componentes individuais.

Exemplo 9: ANÁLISES PROTEÔMICA/ GENÔMICA/ TRANSCRITÔMICA

Para estas análises, foram realizadas culturas de células de Arabidopsis thaliana, como descrito acima.

A. Análise____proteômica____de____proteínas____expressas diferencialmente.

Após quatro horas de incubação com tampão de controlo, oligogalacturonanas, oligoquitosanas ou a mistura, as células foram colhidas por centrifugação e as proteínas foram extraídas e analisadas por eletroforese em gel bidimensional utilizando o protocolo descrito por Valot et al., 2005 (Plant Molecular Biology 59: 565-580).

A análise proteômica mostrou 59 proteínas reguladas

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33/36 significativamente em, pelo menos, um tratamento em comparação com os outros três. Entre estas 59 proteínas, 44 foram identificadas.

As proteínas sobre-expressas estavam principalmente associadas a mecanismos de defesa, como PAL (Fenilalanina Amônia Liase). É interessante ver que um quarto das proteínas reguladas está relacionado com o metabolismo energético. O que é notável, a análise de grupo indicou que as células eliciadas com a mistura bioativa induziram um padrão de expressão de proteínas solúveis diferente do das células eliciadas com componentes individuais que estavam mais relacionados uns com os outros. Exemplos de proteínas cujos níveis de expressão são diferentes entre tratamentos estão representados na Tabela 2:

Tabela 2:

	Controle	Quitooligossa carídeos	Composição	Oligogalacturo nanas
Succinato desidrogenase	1, 00*	2,00*	0, 93	1, 53
Proteína de repetição WD40	1, 00	0, 75*	1, 12*	0, 85
Enzima málica dependente de NADP	1, 00	1, 14*	0,71*	0, 82
Translocador de fosfato mitocôndrico	1, 00	0, 88*	1, 51*	1, 12
Gliceraldeído -3-fosfato desidrogenase (GAPDH)	1, 00*	1, 62*	1, 13	1, 56

As proteínas cujos níveis de expressão são estatisticamente diferentes uns dos outros estão assinaladas com um asterisco (*) .

B . Análise____transcritômica____de____genes_____expressos diferencialmente.

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A análise transcritómica foi realizada pela técnica de micromatrizes de ADNc em células de Arabidopsis amostradas quatro horas após tratamento com eliciadores. O ARN total de células tratadas de Arabidopsis foi extraído utilizando o RNeasy Mini Kit da QIAGEN (Darlington Lab).

A análise transcritómica de Arabidopsis mostrou 96 genes regulados significativamente (P < 0,05) com, pelo menos, uma proporção de 3 vezes em, pelo menos, 2 dos 3 tratamentos (oligogalacturonidos, quitooligossacarídeos, mistura dos dois). Em contraste com a análise proteómica, a análise transcritómica mostrou que o tratamento de células de cultura com oligômeros de quitosana ou com a mistura induziu uma resposta muito semelhante. O tratamento com oligômeros de pectina parece induzir uma resposta limitada, próxima das culturas de controlo. O tratamento com oligômeros de quitosana, oligômeros de pectina ou com a sua mistura regula a expressão de 95 (57 sub, 38 sobre), 25 (16 sub, 9 sobre) e 92 (56 sub, 36 sobre) genes, respectivamente.

Entre os genes regulados, vários apresentam padrões de expressão distintos dependendo do tratamento. Alguns desses genes estão listados na Tabela 3, em que os níveis de expressão genérica são apresentados como uma proporção em relação ao nível de expressão no controlo. As diferenças estatisticamente significativas estão assinaladas com um asterisco.

Tabela 3:

Nome	Número de ordem^#	Quitooligos sacarídeos	Composição	Oligogalacturonanas
Clavata 3/Relacionado com ESR 1	At1g73165	-3,60*	1, 15	3, 35*

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Nome	Número de ordem#	Quitooligos sacarídeos	Composição	Oligogalacturonanas
Família semelhante a extensina rica em prolina	At5g49080	3, 15	2,51*	-3,68*
Proteína da família de repetição de WD-40	At5g40880	3, 38*	1, 77	-2,24*
Proteína relacionada com defesa	At3g44870	5,46*	-2,06*	-1, 15
família de grpE co-chaperone	At4g26780	-1, 15	3, 16*	1, 03
Proteína de ligação a AMP	At1g75960	1, 61	3, 87*	1, 95

EXEMPLO 10: Indução de resistência a Venturia inequalis plântulas de macieira

Sementes de macieira (aproximadamente 1400), da variedade Golden Delicious foram postas a vernalizar durante 90 ou 120 dias a 4°C após desinfecção com lixívia. As sementes foram então semeadas na camada superior da terra a uma densidade de 40 sementes por leito. Cada leito foi depois coberto com terra, regado e incubado a uma temperatura próxima de 10°C durante uma semana antes de serem transferidos para uma estufa a 18°C.

Grupos de 40 plântulas foram tratadas ou com uma solução de controlo (água mais Tween 20 a 0,01%) ou eliciadores em soluções aquosas (composição da invenção a 0,25 g.L^-1 no estádio de 3 folhas aos 10 e 3 dias antes da inoculação com Venturia inequalis (150000 conídios viáveis por mL). A percentagem de área de superfície esporulante foi avaliada 14 dias após a inoculação na última folha desenvolvida antes do tratamento com eliciadores (F1) e a primeira folha desenvolvida após tratamento com eliciadores (F0) . Os

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36/36 resultados são expressos como a percentagem de área de superfície esporulante de folha (média ± EP de 200 plântulas por tratamento) para F1 e F0 como ilustrado na Figura 13. EXEMPLO 11: Propriedades fungicidas da combinação de KH2PO4 com uma mistura de oligogalacturonídeos e quitooligossacarídeos.

Três aplicações de 20 pL contendo 2.104 esporos cada de Penicilium expansum foram inoculadas em placas de Petri de 39 g.L^-1 de Agar com Batata e Dextrose (PDA) espalhadas com uma das seguintes soluções: água + Tween 20 a 0,01% (controlo), mistura de oligogalacturonanas e oligoquitosanas (0,5 g.L^-1), KH2PO4 (5 g.L^-1), mistura de oligogalacturonanas e oligoquitosanas (0,5 g.L^-1) + KH₂PO₄ (5 g.L^-1). As placas de Petri foram incubadas durante 48 h a 25 °C e os esporos resultantes são contados utilizando uma células de Neubauer. Os resultados, expressos como médias de 3 experiências, estão apresentados na Figura 14.

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1/3

Claims

REIVINDICAÇÕES

1/7

Formação de dímero péctico

Proporção molar (GlcN/GalAc)

Fig-2

1. Composição de oligogalacturonanas, caracterizada pelo fato de compreender uma ou mais oligogalacturonanas com um grau de polimerização compreendido entre 9 e 20 e tendo uma conformação em caixa de ovos dimérica, ou um ou mais oligoguluronas em uma conformação em caixa de ovo, adicionalmente estabilizada por um ou mais sacarídeos policatiônicos.

2/7

Teor de proteína Densidade celular (g de (mg/g de peso fresco) células/mL)

Ogal 300 ppm

Fig· 3

Quito 300 ppm

Ogal 200 ppm + Ogal 200 ppm

Fig- 4

2/3

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato o produto selecionado do grupo consistindo numa composição farmacêutica, uma composição nutracêutica, uma composição alimentar ou para rações incluindo um alimento funcional ou uma ração funcional, um produto fitossanitário, um eliciador, um fertilizante, um adjuvante destes produtos, um repositor de fitohormônio, um melhroador de fitohormônio ou um modulador de fitohormônio.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de o produto fitossanitário ser um fungicida.

9. Biomaterial, caracterizado pelo fato de compreender a

composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8. 10. Têxtil, caracterizado pelo fato de compreender a composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8. 11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de ser

utilizada em aplicações alimentares, rações, têxteis, cosméticas, industriais e/ou ambientais.

12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de ser utilizada para induzir proteção de plantas contra infecção por agentes patogénicos de plantas.

13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de ser utilizada como um promot or do crescimento. 14. Composição, de acordo com qualquer uma das

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3/3 reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de utilizada como um revestimento para sementes.

15. Composição, de acordo com qualquer uma reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de utilizada como um adjuvante antifúngico.

ser das ser

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2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a conformação em caixa de ovos dimérica de dito um ou mais oligogalacturonas ser detectada pelo anticorpo 2F4.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o sacarídeo policatiônico ser um

oligossacarídeo de quitosana ou um polissacarídeo de quitosana, preferivelmente, um oligo ou polisacarídeo de quitosana tendo um grau de polimerização superior a 5. 4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de o oligo ou polissacarídeo de quitosana ter um grau de acetilação infe rior a 50%. 5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de ser uma solução aquosa. 6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de compreender ainda um ou mais elementos selecionados do grupo

consistindo em outros sacarídeos, reguladores do crescimento ou fatores do crescimento, minerais, íons, alimentos, aditivos alimentares, aromatizantes, corantes, vitaminas, fitonutrientes, ou uma molécula bioativa.

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3/7

Ogal Ogal Ogal 100 ppm 200 ppm 300 ppm