CN107474127A - 一种敬钊毒素蛋白的高效表达及分离纯化方法 - Google Patents

一种敬钊毒素蛋白的高效表达及分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种敬钊缨毛蛛粗毒中活性多肽JZTX‑58的高效表达系统与分离纯化方法。本发明通过基因工程技术，采用表达质粒pVT102U/α和酿酒酵母S78菌株构成的真核表达系统，经过分离纯化、质谱分析鉴定成功表达得到敬钊毒素‑58(JZTX‑58)蛋白质，解决了直接从敬钊缨毛蛛粗毒中分离纯化而很难得到足量毒素来进行功能研究的难题，为进一步研究JZTX‑58的抗疟原虫活性奠定了重要的基础。

Description

一种敬钊毒素蛋白的高效表达及分离纯化方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及敬钊缨毛蛛粗毒中活性多肽JZTX-58的高表达系统构建与分离纯化方法。
背景技术
疟疾是原生动物寄生虫疟原虫(paslmodium)引起的传染性寄生虫疾病，这种疾病几乎流行于所有的热带和亚热带国家。现在，每年有500百万人感染此病，遍及非洲、南亚次大陆、东南亚和南美洲；每年有250万人死于此病，其中约有1百万人是5岁以下的儿童。可悲的是，目前疟原虫对治疗疟疾所用的药物普遍产生了抗药性(耐药性)。抗疟原虫活性的新型药物研究成为防治疟疾的新热点。
蜘蛛利用毒液麻痹和杀死猎物，并防御其它肉食性动物。研究发现，蜘蛛毒液中含有各种各样的生物活性分子，随着生物科学技术的发展与突破，部分多肽毒素分子己被开发成为生物学、医学、药物学等众多研究领域的先导分子。
敬钊缨毛蛛(Chilobrachys jingzhao)是一类地下穴居的原始蜘蛛,隶属狒蛛科、棒刺蛛亚科、缨毛蛛属，是近年在我国发现的又一蜘蛛新种，产于广西及海南等地。其形态与海南捕鸟蛛、虎纹捕鸟蛛十分相似，个体较海南捕鸟蛛大，体呈黄褐色，腹部背面无虎纹斑。毒性及凶猛程度更大，其毒液对小鼠具有致命性(IC50为0.4mg/kg)。敬钊缨毛蛛粗毒中含有多种生物活性成分。采用阳离子交换与反相高效液相色谱技术，己从敬钊缨毛蛛粗毒中分离纯化得到敬钊毒素-58(JZTX-58)。对JZTX-58的氨基酸序列进行BLAST分析,发现Psalmopeotoxin I和II与JZTX-58有很高的同源性，而Psalmopeotoxin I和II具有抗疟原虫活性，因此推测JZTX-58具有抗疟原虫活性，这对研究抑制疟原虫传播和有效治疗疟疾具有深远的意义。
敬钊缨毛蛛粗毒中含有的多肽毒素种类很多，而其中含量较丰富的毒素分子只有极少数几种，对于大部分含量不够丰富的毒素分子(如JZTX-58)若用直接从粗毒中分离纯化的手段则很难得到足量的毒素来进行功能研究。因此，通过基因工程技术，构建高效表达系统，来表达敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白，为进一步研究JZTX-58的抗疟原虫活性奠定了重要的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种敬钊毒素蛋白的高效表达及分离纯化方法。为实现本发明的目的，采用如下技术方案：
一种敬钊毒素蛋白的高效表达方法，包含以下步骤：
(1)表达载体构建：按照JZTX-58成熟肽cDNA序列设计引物，克隆到表达载体pVT102U/α，构建表达载体pVT102U/α-JZTX-58；
(2)酵母感受态细胞制备：采用PEG/LiAc法制备酵母感受态细胞；
(3)质粒转入酵母感受态细胞：采用热转化法将质粒pVT102U/-JZTX-58转入制备好的酵母感受态细胞，形成敬钊毒素蛋白表达系统；
(4)敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白表达：选用YPD培养液对上述酵母表达系统进行扩大培养。
优选的，所述步骤(1)的引物序列为：
上游引物：CGAATCGGGAATTCCATATGTACTATTTCTCTTA，
下游引物：CATCGGACGCGTCGACTTAGGCAGCAACTTCATA。
一种敬钊毒素蛋白的分离纯化方法，包含以下步骤：
(1)表达载体构建：按照JZTX-58成熟肽cDNA序列设计引物，克隆到表达载体pVT102U/α，构建表达载体pVT102U/α-JZTX-58；
(2)酵母感受态细胞制备：采用PEG/LiAc法制备酵母感受态细胞；
(3)质粒转入酵母感受态细胞：采用热转化法将质粒pVT102U/-JZTX-58转入制备好的酵母感受态细胞，形成敬钊毒素蛋白表达系统；
(4)敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白表达：选用YPD培养液对上述酵母表达系统进行扩大培养；
(5)敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白分离与纯化：收集酵母表达系统培养液，采用阳离子交换柱层析的分步洗脱方法进行蛋白分离，采用反相高效液相色谱进行纯化。
优选的，步骤(1)所述的引物序列为：
上游引物：CGAATCGGGAATTCCATATGTACTATTTCTCTTA，
下游引物：CATCGGACGCGTCGACTTAGGCAGCAACTTCATA。
优选的，步骤(5)所述的阳离子交换柱层析的分步洗脱方法过程为：将表达上清液注射入系统中，在上样完毕接着用0.1M NaAc、pH 4.2的平衡液冲柱子，使波长280nm处检测值达到基线，光吸收值不再跳动，之后依次用含有0.1M、0.2M和0.3M NaCl的0.1M NaAc、pH4.2的缓冲液进行洗脱，收集各洗脱峰。
优选的，步骤(5)所述的采用反相高效液相色谱进行纯化过程为：检测波长为280nm，反相柱温度为40℃，先用体积分数0.1％TFA的双蒸水脱盐10min，将所收集各洗脱峰的溶液上Waters的C18反相柱进行脱盐，按照制定的洗脱梯度进行洗脱，收集洗脱峰时标记好各峰的出峰时间。
本发明提供了一种敬钊缨毛蛛粗毒中活性多肽JZTX-58的高表达系统构建与分离纯化方法。通过基因工程技术，采用表达质粒pVT102U/α和酿酒酵母S78菌株构成真核表达系统，经过分离纯化、质谱分析鉴定成功表达得到了敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白质，解决了直接从敬钊缨毛蛛粗毒中分离纯化而很难得到足量的毒素来进行功能研究的难题，为进一步研究JZTX-58的抗疟原虫活性奠定了重要的基础。
附图说明
图1是质粒pVT120U/α结构示意图。
图2是JZTX-58蛋白反向高效液相色谱分离图谱。
图3是保留时间为22min的目的肽峰质谱分析图。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种敬钊缨毛蛛粗毒中活性多肽JZTX-58的高表达系统构建与分离纯化方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进相关技术参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1
敬钊毒素-58(JZTX-58)真核表达系统的构建
(1)表达载体构建：按照JZTX-58成熟肽cDNA序列设计引物，
上游引物：CGAATCGGGAATTCCATATGTACTATTTCTCTTA；
下游引物：CATCGGACGCGTCGACTTAGGCAGCAACTTCATA；
通过PCR扩增敬钊毒素-58(JZTX-58)基因，克隆到表达载体pVT102U/α，构建表达载体pVT102U/α-JZTX-58。
(2)酵母感受态细胞制备
本发明所用质粒pVT102U/α(图l)与酿酒酵母菌S-78(Saccharomycescerevisiaes train S-78，Leu2，Ura3，Rep4)均为湖南师范大学蛋白质组学与发育生物学省部共建国家重点实验室培育基地保存。按照JZTX-58成熟肽cDNA序列设计引物，已克隆到表达载体pVT102U/α。pVT102U/α包含一个大肠杆菌复制起点，一个酵母2μ复制起点，大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因，酵母中URA3基因，ADH1启动子以及酵母α因子前体的信号肽。
将酵母菌S-78接种到YPD平板，30℃培养2-3天；挑取直径为2-3mm的单克隆于3mLYPD培养液中，30℃，250rpm，过夜扩大培养(HZ-150C型台式恒温培养摇床，瑞华仪器公司)；取2个1.5mL的EP管(灭菌)，各加1mL上述YPD培养液，20℃，5000rpm(Eppendorf Centrifuge5415D台式高速离心机，eppendorf公司)，离心5min；吸去上清液，再各加入1mL双蒸水(灭菌)(Millipore超纯水系统，美国)清洗，20℃，4000rpm，离心5min；倒去上清液，将细胞悬于1mL的转化液1○中(10×TE,1M LiAC,双蒸水，以1:1:8的体积比混合)。
YPD培养液：Yeast extract 7.5g，Peptone 15g，Glucose 15g，溶解于750mL双蒸水中，NaOH调pH值为6.6-7.0，112℃灭菌25min。
YPD固体培养基：100mL YPD培养液加琼脂粉1.5g。
转化液1○：20mL的10×TE溶液，20mL的1M LiAc，160mL的双蒸水。
(3)质粒转入酵母感受态细胞
将表达载体质粒DNA1-2μL；carrier DNA(Clontech公司)1μL；20μL上述菌悬液；转化液2○(10×TE，1M LiAC，50％PEG4000，以1:1:8的体积比混合)1mL加入1.5mL EP管(灭菌)中混合，30℃，200rpm，培养30min(EP管倾斜45°放置)；42℃热激15min(DK-98-1型电热恒温水温箱，天津泰斯特仪器有限公司)，5000rpm离心5min；倒去上清液，细胞沉淀用200μL1×TE洗涤，吸打混匀，5000rpm离心5min；倒去上清液，细胞沉淀悬浮于200μL 1×TE溶液中；细胞悬浮液涂YSD板，30℃培养2-4天。
YSD培养液:YNB 0.335g，Glucose1.0g，Leucine10.0mg，Adenine2.5mg，Inositol10.0mg，溶解于50mL双蒸水中，NaOH调pH值为6.5，112℃灭菌25min。
YSD固体培养基：100mL YSD培养液加琼脂粉1.5g。
转化液2○：20mL的10×TE溶液，20mL的1M LiAc，160mL的50％PEG4000。
实施例2
敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白表达
挑取上述YSD板上直径为2-3mm单菌落于50mLYSD溶液中，30℃，250rpm，培养20小时；转入750mL YPD溶液中，30℃，250rpm扩大培养3-4天。收集菌液，与1M NaAc(pH 4.2)溶液混合，使NaAc的终浓度为0.1M，11000rpm，4℃，离心20min(Eppendorf Centrifuge 5804R型高速冷冻离心机，eppendorf公司)，离心之前需借助电子天平(AB135-S型电子分析天平，梅特勒-托利多公司)，使对称放置的离心管平衡，每离心管称量在100g以内。留上清液以备进一步纯化。
实施例3
敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白分离与纯化
将上述表达上清液用抽滤瓶抽滤，过0.45μM滤膜，得到滤液。将所得滤液分两步进行纯化：
⑴阳离子交换柱层析。在Waters 650E液相色谱仪上进行。上样之前，先对阳离子交换色谱系统进行清洗，用高浓度盐的洗脱液冲洗交换柱，跑一次空白梯度，并平衡柱内pH。再将表达上清液注射入系统中。采用分步洗脱方法，即在上样完毕接着用0.1M NaAc(pH4.2)平衡液冲柱子，使波长280nm处检测值达到基线，光吸收值不再跳动，平衡即可。之后依次用含有0.1M,0.2M和0.3M NaCl的0.1M NaAc(pH 4.2)缓冲液进行洗脱，收集各洗脱峰。
⑵反相高效液相色谱纯化。在Waters Alliance高效液相色谱仪上进行。检测波长为280nm，反相柱温度为40℃。洗脱液由两部分组成：(A)0.1％TFA(v/v)的双蒸水；(B)0.1％TFA(v/v)的乙腈。两种溶液都用惰性气体氦气除去溶解在其中的空气。在正式梯度洗脱之前，先用0.1％TFA(v/v)的双蒸水脱盐10min。将所收集各洗脱峰的溶液上Waters的C18反相柱进行脱盐，洗脱梯度如表1所示，在收集洗脱峰时标记好各峰的出峰时间。
表1反相高效液相色谱洗脱梯度
时间(min) 流量(ml/min) A％ B％
0 4.00 95.0 5.0
5.00 4.00 85.0 15.0
55.00 4.00 55.0 45.0
55.10 4.00 0.0 100.0
66.00 4.00 100.0 0.0
76.00 4.00 100.0 0.0
77.00 0.10 100.0 0.1
检测波长:280nm柱温:40℃A:ddH2O(0.1％TFA)B:ACN(0.1％TFA)
表达的JZTX-58蛋白反向高效液相色谱分析结果(图2)显示有两个较为明显的主峰，第一个洗脱峰的保留时间大约为18min,第二个洗脱峰的保留时间大约为22min。收集这两个洗脱峰溶液进行进一步质谱鉴定。
实施例4
敬钊毒素-58(JZTX-58)的质谱鉴定
取1μL洗脱峰溶液和1μL包埋基质CCA饱和溶液(用之前离心)混合，点样在点样板上，待样品自然干燥后用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪MALDI-TOF(美国Bruker公司生产的UltraflexTM TOF/TOF MS型)进行JZTX-58分子量鉴定，加速电压为25kV。
包埋基质CCA饱和溶液：15mg CCA(α-氰基-4-羟基-肉桂酸)，600μL乙睛，400μL双蒸水，3μL TFA。
经MALDI-TOF质谱鉴定，保留时间为18min的洗脱峰的分子量为2479.624Da,保留时间为22min的洗脱峰的分子量为3698.672Da，而它与JZTX-58的理论分子量3698Da十分接近，所以保留时间为22min的洗脱峰(图2中箭头所示)为目的肽峰。图3为保留时间为22min的目的肽峰质谱分析图。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.一种敬钊毒素蛋白的高效表达方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)表达载体构建：按照JZTX-58成熟肽cDNA序列设计引物，克隆到表达载体pVT102U/α，构建表达载体pVT102U/α-JZTX-58；
(2)酵母感受态细胞制备：采用PEG/LiAc法制备酵母感受态细胞；
(3)质粒转入酵母感受态细胞：采用热转化法将质粒pVT102U/-JZTX-58转入制备好的酵母感受态细胞，形成敬钊毒素蛋白表达系统；
(4)敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白表达：选用YPD培养液对上述酵母表达系统进行扩大培养。
2.根据权利要求1所述的一种敬钊毒素蛋白的高效表达方法，其特征在于所述步骤(1)的引物序列为：
上游引物：CGAATCGGGAATTCCATATGTACTATTTCTCTTA
下游引物：CATCGGACGCGTCGACTTAGGCAGCAACTTCATA。
3.一种敬钊毒素蛋白的分离纯化方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)表达载体构建：按照JZTX-58成熟肽cDNA序列设计引物，克隆到表达载体pVT102U/α，构建表达载体pVT102U/α-JZTX-58；
(2)酵母感受态细胞制备：采用PEG/LiAc法制备酵母感受态细胞；
(3)质粒转入酵母感受态细胞：采用热转化法将质粒pVT102U/-JZTX-58转入制备好的酵母感受态细胞，形成敬钊毒素蛋白表达系统；
(4)敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白表达：选用YPD培养液对上述酵母表达系统进行扩大培养；
(5)敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白分离与纯化：收集酵母表达系统培养液，采用阳离子交换柱层析的分步洗脱方法进行蛋白分离，采用反相高效液相色谱进行纯化。
4.根据权利要求3所述的一种敬钊毒素蛋白的分离纯化方法，其特征在于步骤(1)所述的引物序列为：
上游引物：CGAATCGGGAATTCCATATGTACTATTTCTCTTA
下游引物：CATCGGACGCGTCGACTTAGGCAGCAACTTCATA。
5.根据权利要求3所述的一种敬钊毒素蛋白的分离纯化方法，其特征在于步骤(5)所述的阳离子交换柱层析的分步洗脱方法过程为：将表达上清液注射入系统中，在上样完毕接着用0.1M NaAc、pH 4.2的平衡液冲柱子，使波长280nm处检测值达到基线，光吸收值不再跳动，之后依次用含有0.1M、0.2M和0.3M NaCl的0.1M NaAc、pH 4.2的缓冲液进行洗脱，收集各洗脱峰。
6.根据权利要求3所述的一种敬钊毒素蛋白的分离纯化方法，其特征在于步骤(5)所述的采用反相高效液相色谱进行纯化过程为：检测波长为280nm，反相柱温度为40℃，先用体积分数0.1％TFA的双蒸水脱盐10min，将所收集各洗脱峰的溶液上Waters的C18反相柱进行脱盐，按照制定的洗脱梯度进行洗脱，收集洗脱峰时标记好各峰的出峰时间。
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