CN109400675A - 抗菌肽、抗菌药物以及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗菌肽、抗菌药物以及制备方法，涉及抗菌肽技术领域。本发明公开的抗菌肽其氨基酸序列为：RSS。该抗菌肽对铜绿假单胞菌具有抑菌效果。其可以用于制备抗菌药物，例如用于制备抑制铜绿假单胞菌的药物，其具有较广的应用前景。

Description

抗菌肽、抗菌药物以及制备方法
技术领域
本发明涉及抗菌肽技术领域，具体而言，涉及一种抗菌肽、抗菌药物以及制备方法。
背景技术
耐药性是对细菌感染有效预防和治疗的紧迫威胁，迫切需要采取替代的抗菌素战略。抗菌肽(AMPs)可能是目前抗生素的有前途的替代品或作为佐剂来提高抗生素效力。
抗菌肽是体内具有抗菌活性的碱性多肽，是大多数生物体抵御病原体入侵的天然防御机制的重要组成部分。抗菌肽具有广泛的抑制作用，在农业、医药等领域具有良好的应用前景。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗菌肽，该抗菌肽对铜绿假单胞菌、大肠杆菌和白色念珠菌具有抑菌效果。
本发明的另一目的在于提供一种抗菌药物，该抗菌药物以上述抗菌肽为活性成分，其对铜绿假单胞菌、大肠杆菌和白色念珠菌具有抑菌效果。
本发明的另一目的在于提供一种制备上述抗菌肽的方法，该方法可以制得上述抗菌肽，所制得的抗菌肽对铜绿假单胞菌、大肠杆菌和白色念珠菌具有抑菌效果。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供了一种抗菌肽，其氨基酸序列为RSS。
本发明通过实验验证，氨基酸序列为RSS的多肽对铜绿假单胞菌具有良好的抑菌效果。其对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为：63.75mg/mL。
上述抗菌肽可以用于制备抗菌药物，例如用于制备抑制铜绿假单胞菌的药物，其具有较广的应用前景。
另一方面，本发明提供了上述抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。
基于上述抗菌肽对铜绿假单胞菌的抑菌效果，上述的抗菌肽可用于制备抑制铜绿假单胞菌的药物。
另一方面，本发明提供了一种抗菌药物，其含有上述的抗菌肽，以及药学上可接受的载体。
基于抗菌肽对铜绿假单胞菌的抑菌效果，上述的抗菌药物对铜绿假单胞菌也具有相同的抑菌效果。
另一方面，本发明提供了一种制备上述抗菌肽的制备方法，其包括：往装有树脂的反应器中依次加入如下原料成氨基酸序列为RSS的多肽：Fmoc-Ser(otbu)-OH、Fmoc-Ser(otbu)-OH和Fmoc-Arg(otbu)-OH。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在每次加入原料后，进行如下操作：
步骤(a)：将反应器置于摇床中反应；
步骤(b)：往反应器中加入哌啶溶液以脱去Fmoc保护基团，再用DMF洗涤。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(a)中，摇床的温度控制为29-31℃，反应时间控制为90-150min。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(b)中，哌啶溶液含哌啶和DMF。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，哌啶和DMF的体积比为1:4。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在第1次往反应器中加入原料时，将DCM和DIEA与该次所添加的原料一起加入至反应器中；
在第2次至第4次中的任意一次往反应器中加入原料时，将HOBT和DIC与该次所添加的原料一起加入至反应器中。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在第1次往反应器中加入原料之后，进行如下操作：往反应器中加入甲醇溶液进行封闭。
本发明提供了制备方法采用多肽合成的方法制备上述抗菌肽，具有操作简单，所得的抗菌肽具有纯度高、回收率高等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例中的RSS多肽粉末的HPLC检测结果。
图2为实施例中的RSS多肽粉末的MS检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
合成多肽RSS。
1.根据目标多肽的重量计算每种原料的重量。
2.将5g树脂放入150ml反应器中，并加入50ml DCM浸泡2小时
3.用DMF洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干。
4.称取0.02molFmoc-Ser(otbu)-OH(C端第一个氨基酸)+10ml DCM+5ml DIEA加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应2小时。
5.用50ml甲醇溶液封闭(甲醇：DIEA:DCM＝1：1：2)半小时，然后用DMF洗涤四次，抽干。
6.向反应器中加入20％哌啶溶液(哌啶/DMF＝1:4)，脱去Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
7.取少量树脂用茚三酮法检测，树脂有颜色，说明脱保护成功。
8.称取0.06mol Fmoc-Ser(otbu)-OH(C端第二个氨基酸)+20ml HOBT+10ml DIC加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应1小时。
9.取少量树脂检测，用茚三酮法检测，若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。若树脂为无色，说明反应完全；待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干。
10.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4)，放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
11.取少量树脂用茚三酮法检测，树脂有颜色，说明脱保护成功。
12.按照步骤8-11，使用Fmoc-Arg(otbu)-OH+HOBT+DIC原料，连接氨基酸。
13.用切割试剂将多肽保护基团全部切除，并从树脂上切割下来，送纯化。
14.通过高效液相色谱仪器(HPLC)将目标肽段与杂质分离，将目标肽段RSS冻干成粉末，并进行高效液相色谱检测和MS检测。结果见图1和图2。
实验例
通过测定RSS多肽的最小抑菌浓度,来反映其抗菌效果,最小抑菌浓度为检测不到细菌生长的最低样品浓度。采用二倍稀释法,具体方法如下：
1.菌种的培养
1.1细菌
(1)菌种活化：将斜面保藏的细菌接种到200mL的TSB液体培养基中，在37℃，180rmp的摇床中培养24h。
(2)获取单菌落：将经过活化的细菌接种到TSA培养基(平板)中，在37℃恒温培养箱中培养24h。
(3)培养单菌落：挑取单菌落于4mlTSB液体培养基中，在37℃，180rmp的摇床中培养14h。
(4)稀释菌数：将1ml已培养的单菌落接种入已经稀释100倍的TSB液体培养基中，在37℃，180rmp的摇床中培养6h。
2.待测样品的制备
将冷冻的RSS多肽用蒸馏水溶解为一定的浓度，用0.22微米的针孔滤膜和针孔进行一次过滤，将已经过滤的样品加入1ml于第一根、第二根离心管中，在第二根离心管中加入1ml的TSB液体培养基混匀，在第二根离心管中吸取1ml加入第三根离心管中，在第三根离心管中加入1mlTSB液体培养基混匀，依此类推。
3.药敏实验
(1)接种物的制备：细菌用TSB至1x106cfu/ml(OD600为0.1，则真菌浓度为1.5x108cfu/ml)
(2)培养皿的制备：①将配置好的固体培养基倒入平皿中，等培养基凝固后，用移液枪吸取上述用培养基稀释过的菌液0.5mL，用涂布器把菌液均匀涂布在已经凝固好的固体培养基表面。静止10分钟，待菌液被固体培养基完全吸收后，用镊子将3个牛津杯放入培养皿，静止3-5分钟，防止在移动培养皿时牛津杯滑动。用移液枪给每个牛津杯加入100微升的样品液。
②设置阴性对照：细菌培养皿上的每个牛津杯分别加入100微升TSB培养基。
③设置空白对照：固体培养基中不加入菌液，直接放置牛津杯。
(3)培养：将加入细菌液的培养皿在37℃下培养12h。
(4)测定：用游标卡尺准确测量透明抗菌圈的直径。
表1：抗菌肽RSS对各菌的最小抑菌浓度表
受试菌体 RSS MIC(mg/mL)
铜绿假单胞菌 63.75
从表1可以看出，RSS多肽对铜绿假单胞菌具有抑制效果，最小抑菌浓度(MIC)为63.75mg/mL。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗菌肽，其特征在于，其氨基酸序列为：RSS。
2.权利要求1所述的抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。
3.一种抗菌药物，其特征在于，其含有权利要求1所述的抗菌肽，以及药学上可接受的载体。
4.一种如权利要求1所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，其包括：往装有树脂的反应器中依次加入如下原料合成氨基酸序列为RSS的多肽：Fmoc-Ser(otbu)-OH、Fmoc-Ser(otbu)-OH和Fmoc-Arg(otbu)-OH。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在每次加入原料后，进行如下操作：
步骤(a)：将反应器置于摇床中反应；
步骤(b)：往反应器中加入哌啶溶液以脱去Fmoc保护基团，再用DMF洗涤。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤(a)中，摇床的温度控制为29-31℃，反应时间控制为90-150min。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，哌啶溶液含哌啶和DMF。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，哌啶和DMF的体积比为1:4。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在第1次往反应器中加入原料时，将DCM和DIEA与该次所添加的原料一起加入至反应器中；
在第2次至第4次中的任意一次往反应器中加入原料时，将HOBT和DIC与该次所添加的原料一起加入至反应器中。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，在第1次往反应器中加入原料之后，进行如下操作：往反应器中加入甲醇溶液进行封闭。
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