DE69712316T2 - Modulation der th1/th2 cytokinexpression durch ribavirin in aktivierten t-lymphozyten - Google Patents
Modulation der th1/th2 cytokinexpression durch ribavirin in aktivierten t-lymphozytenInfo
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Description
- Das Gebiet der Erfindung ist die Immunologie.
- Bei den Lymphokinen handelt es sich um eine Gruppe von Polypeptiden, die zur Familie der Cytokine gehören, das heißt hormonähnlichen Molekülen, die verschiedene Zellfunktionen beeinflussen können und die Kommunikation zwischen verschiedenen Zellen ermöglichen. Jüngste Entwicklungen haben geholfen, die Rolle von Lymphokinen in der Immunantwort zu klären. Die Lymphokinproduktion durch CD4&spplus;- (und auch in CD8&spplus;-)T-Helferzellen fällt sowohl in murinen als auch in humanen Systemen häufig in einen der zwei Phänotypen Th1 und Th2 (Romagnani, 1991, Immunol. Today 12: 256-257, Mosmann, 1989, Annu. Rev. Immunol. 7: 145-173). Th1-Zellen erzeugen Interleukin 2 (IL-2), den Tumornekrosefaktor (TNFct) und Interferon Gamma (IFNγ), und sie sind primär für die zellvermittelte Immunität verantwortlich wie die Spät-Typ- Hypersensitivität. Th2-Zellen erzeugen Interleukine IL-4, IL- 5, IL-6, IL-9, IL-10 und IL-13 und sind primär bei der Bereitstellung einer optimalen Hilfe für humorale Immunantworten beteiligt wie die IgE- und IgG4-Antikörper- Isotyp-Umstellung (Mosmann, 1989, Annu. Rev. Immunol. 7: 145- 173).
- Stark polarisierte Th1- und Th2-Antworten spielen nicht nur unterschiedliche Rollen beim Schutz, sie können verschiedene immunpathologische Reaktionen fördern. Antworten vom Th1-Typ sind in der organspezifische Autoimmunität beteiligt wie experimenteller Autoimmun-Uveoretinitis (Dubey et al. 1991, Eur. Cytokine Network 2: 147-152), experimenteller Autoimmunencephalitits (EAE) (Beraud et al. 1991, Cell Immunol. 133: 379-389) und insulinabhängigem Diabetes mellitus (Hahn et al., 1987, Eur. J. Immunol. 18: 2037-2042), in Kontaktdermatitis (Kapsenberg et al., Immunol. Today 12: 392-395) und in einigen chronischen entzündlichen Erkrankungen. Im Gegensatz hierzu sind Antworten vom Th2-Typ für das Auslösen von allergischen atopischen Erkrankungen (gegen übliche Umweltallergene) wie allergisches Asthma (Walker et al., 1992, Am. Rev. Resp. Dis. 148: 109-115) und atopische Dermatitis verantwortlich (von der Heijden et al., 1991, J. Invest. Derm. 97: 389-394), verschlimmern angenommermaßen die Infektion mit im Gewebe lebenden Protozon wie Helminthen (Finkelmann et al., 1991, Immunoparasitol. Today 12: A62-66) und Leishmania major (Caceres-Dittmer et al., 1993, Clin. Exp. Immunol. 91: 500- 505), werden vorzugsweise in bestimmten primären Immunschwächen wie dem Hyper-IgE-Syndrom (Del Prete et al., 1989, J. Clin. Invest. 84: 1830-1835) und Omenn-Syndrom induziert (Schandene et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23: 56-60) und sind mit verringerten Hyper-IgE-Syndrom (Del Prete et al., 1989, J. Clin. Invest. 84: 1830-1835) und Omenn-Syndrom assoziiert (Schandene et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23: 56- 60) und sind mit einer verringerten Fähigkeit, die HIV- Replikation zu unterdrücken, assoziiert (Barker et al., 1995, Proc. Soc. Nat. Acad. Sci. USA 92: 11135-11139).
- Es ist somit klar, dass die Modulation der Lymphokinprofile der oben genannten Erkrankungszustände von therapeutischem Nutzen wäre. Das Fördern einer Th1-Antwort würde am wahrscheinlichsten zur Umkehr eines Th2-Phenotyps und umgekehrt führen. Monoklonale Antikörper (mAb) gegen Lymphokine, Lymphokine selbst und andere Mittel wie Thiolantioxidantien (Jeannin et al., 1995, J. Exp. Med. 182: 1785-1792) kehren, wie man zeigen konnte, die Pathogenese von bestimmten Erkrankungen um, indem sie das die Erkrankung fördernde Cytokinmuster, entweder Th1 oder Th2, inhibieren. Beispielsweise werden intrazelluläre Protozoeninfektionen durch IFNy eingeschränkt, jedoch durch IL-4 verschlechtert, während Nematodeninfektionen durch IL-4 kontrolliert und durch IFNy verschlimmert werden (Heinzel et al., 1989, J. Exp. Med. 162: 59-72, Else et al., 1994, J. Exp. Med. 179: 347- 351). Insulinabhängiger Diabetes mellitus in NOD-Mäusen und EAE bei Mäusen und Ratten kann durch Behandlung mit IL-4 oder Anti-IFNy-mAb vor der Entwicklung der Erkrankung gelindert werden (Rapoport et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 87-99, Racke et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 1961-1966, Campbell et al., 1991, J. Clin. Invest. 87: 739-742). Darüber hinaus ist die autoimmune Graft-Versus-Host-Erkrankung (GVHD), die durch ein dem systemischen Lupus-Erythematosus ähnliches Syndrom gekennzeichnet ist, mit der Th2-Lymphokinproduktion assoziiert und wird durch Anti-IL-4-Antikörper inhibiert (Umland et al., 1992, Clin. Immunol. Immunopathol. 63: 66-73). Andererseits werden beim akuten GVHD, in dem CD8&spplus;-T- Donorzellen sich zu CTL ( = cytotoxische T-Lymphozyten) entwickeln und das Wirtsimmunsystem zerstören, Th1-Cytokine produziert. Die Behandlung mit Anti-IFNy- oder Anti-TNFα-mAb lindert die Erkrankung und die Behandlung mit Anti-IL-2-mAb wandelt die akute GVHD in die autoimmune GVHD um (Via und Finkelmann, 1993, Int. Immunol. 5: 565-572).
- Klinische Untersuchungen von nativem und rekombinantem IL-2 bei der Behandlung von HIV-infizierten Patienten sind seit 1983 im Gange (Volberding et al., 1987, AIDS Res. Hum. Retroviruses 3: 115-124). Hier kommt die Beziehung aus der Tatsache, dass die Entwicklung von AIDS nach Berichten mit einer Verschiebung des Musters der erzeugten Lymphokine assoziiert ist (Clerici und Shearer, 1994, Immunol. Today 15: 575-581). Im Lauf der Zeit tritt bei einem infizierten Individuum, das auf die Erkrankung zuschreitet, eine verringerte Expression von Th1-Lymphokinen wie IL-2 auf (Maggi et al., 1987, Eur. J. Immunol. 17: 1685-1690, Gruters et al. 1990, Eur. J. Immunol. 20: 1039-1044, Clerici et al., 1993, J. Clin. Invest. 91: 759-765), gleichzeitig mit einer erhöhten Produktion von Th2-Lymphokinen wie IL-4 und IL-10 (Clerici et al., 1994, J. Clin. Invest. 93: 768-775, Hoffman et al., 1985, Virology 147: 326-335). T-Zellen aus asymptomatischen oder Langzeit-Überlebenden, die mit IL-2 behandelt wurden, erhöhten ihre Anti-HIV-Aktivität, wogegen eine Exposition gegenüber IL-4 oder IL-10 deren Fähigkeit verringerte, die HIV-Replikation zu unterdrücken und IL-2 zu erzeugen (Barker et al., 1995, Proc. Soc. Nat. Acad. Sci. USA 92: 11135-11139).
- Diese gegenwärtigen immunmodulatorischen Therapeutika (mAbs und rekombinante Cytokine) sind jedoch nicht ohne Einschränkungen. Beispielsweise entwickelt bei der chronischen Behandlung mit monoklonalen Antikörpern das Wirtstier Antikörper gegen die monoklonalen Antikörper, wodurch deren Einsetzbarkeit eingeschränkt wird. "Humanisierte" monoklonale Antikörper sind entwickelt worden, die offensichtlich das Risiko einer iniuzierten Immunantwort gegen diese mAbs verringert. Jedoch sind diese noch immer in der Entwicklung und weiterhin bleiben diese neuen mAbs große Proteine und können daher Schwierigkeiten haben, ihre Zielstellen zu erreichen. Therapeutika auf Cytokinbasis haben ebenfalls Einschränkungen. Beispielsweise führt die IL-12- Behandlung des autoimmunen GVHD zur Entwicklung des akuten GVHD in Mäusen.
- Ribavirin (1-b-D-Ribofuranosyl-1,2,4,-triazol-3- carboxamid) ist ein synthetisches Nukleosid, das die RNA- und DNA-Virusreplikation inhibieren kann (Huffman et al., 1973, Antimicrob. Agents Chemother. 3: 235, Sidwell et al., 1972, Science 177: 705). Wir haben die Beobachtung anderer bestätigt, die vermuteten, dass Ribavirin zusätzlich zu seiner antiviralen Wirkung eine Wirkung auf bestimmte Immunantworten hat (im Überblick Jolley und Suchil, 1984, Clinical Applications of Ribavirin: p93-96). Wir haben außerdem die Beobachtungen anderer bestätigt, dass Ribavirin die Proliferation von mitogen- und antigen-aktivierten T- und B-Lymphozyten beeinflusst (Tam et al., 1995 (Daten nicht gezeigt), Peavy et al., 1980, Infection and Immunity 29: 583- 589) und dann, wenn es mit Cyclosporin kombiniert wird, Ribavirin Wirksamkeit beim Langzeitüberleben von Allotransplantaten zeigte, Jolley et al. (1988, Transplantation Proc. 20: 703-706).
- Zusätzlich haben wir die vorherige Forschung signifikant gefördert, indem wir gezeigt haben, das Ribavirin das Cytokinmuster einer Immunantwort mindestens teilweise durch Fördern einer Th1-Antwort und Unterdrücken einer Th2-Antwort moduliert. Rückschauend ist diese Entdeckung mit der früheren Forschung nicht inkonsistent. Zunächst ist von Ribavirin bekannt, dass es sowohl funktionelle humorale Immunantworten inhibiert (Peavy et al., 1981, J. Immunol. 126: 861-864, Powers et al., 1982, Antimicrob. Agents Chemother. 22: 108- 114) und die IgE-vermittelte Modulation der Mastzellsekretion inhibiert (Marquardt et al., 1987, J. Pharmacol. Exp. Therapeutics 240: 145-149 (beides Th2-Lymphokin-vermittelte Ereignisse)). Zweitens wirkt Ribavirin der antiviralen Wirkung von Azidothymidin (AZT) in peripheren Blut- Lymphozyten aus HIV-Patienten entgegen (Vogt et al., 1987, Science 235: 1376-1379). Diese Entdeckung ist signifikant, da AZT den IL-2-Rezeptor (IL-2R) verringert, nicht jedoch die IL-2-Expression (Viora und Camponeschi, 1995, Cell Immunol. 163: 289-295). Es ist daher möglich, dass Ribavirin AZT entgegenwirkt, indem es die IL-2-Expression moduliert und verringerte Level an IL-2R erhöht. Drittens führte die Ribavirin-Behandlung eines immun-beeinträchtigten Patienten mit chronischem GVHD (einer Th2-vermittelten Störung) zu einer dramatischen Auflösung der Erkrankung, ein Ergebnis, das nicht mit herkömmlichen immunsuppressiven Therapien wie Cyclosporin und Glucocorticoiden auftrat (Cassano, 1991, Bone Marrow Transplantation 7: 247-248). Schließlich zeigte die Ribavirin-Behandlung (ein Jahr) von Patienten mit Hepatitis C (HCV) weniger Lymphozytenaggregate und deutlich geringere Leberschäden als Placebokontrollen (Dusheiko et al., 1994, Hepatology 20: 206A). Diese Beobachtung kann die Tatsache widerspiegeln, dass, obwohl die überwiegende Immunantwort gegen Hepatitis C über Th1-Lymphokine vermittelt wird, T- Zellen des Th0/Th2-Phenotyps durch HCV infiziert sein können (Zignego et al., 1994, nicht veröffentlichte Daten) und dass diese Infektionen die antikörper-vermittelte Zerstörung der Hepatocyten weiter vorantreiben kann.
- Fig. 1 zeigt eine grafische Darstellung der Wirkung von Ribavirin und Interferon Alpha auf die extrazelluläre Expression von IL-2, IL-4, TNFα und IFNγ in PMA/Ionomycin- aktivierten Lymphozyten. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als Prozent der gesteigerten Lymphokin-Expression nach PMA/Ionomycin-Behandlung alleine.
- Fig. 2 zeigt eine grafische Darstellung der Wirkung von 2, 10 oder 50 uM Ribavirin in Anwesenheit von 2000 U/ml Interferon Alpha (linke Tafeln) und der Wirkung von 500, 1000 oder 2000 U/ml Interferon Alpha (rechte Tafeln) in Anwesenheit von 10 uM Ribavirin auf die extrazelluläre Expression von IL-2 (A und C) und I1-4 (B und D) in PMA/Ionomycin-aktivierten T-Lymphozyten.
- Fig. 3 zeigt eine grafische Darstellung der Wirkung von Ribavirin und Interferon Alpha auf die IL-2-, IL-4- und IFNγ- mRNA-Expression in PMA/Ionomycin-aktivierten T-Lymphozyten.
- Fig. 4 zeigt eine grafische Darstellung der Wirkung von Ribavirin und Interferon Alpha auf die Expression von IL-2- und IL-4-Rezeptoren auf der Zelloberfläche in PMA/Ionomycin- aktivierten T-Lymphozyten. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als Prozentsatz der gesteigerten Lymphokin-Rezeptor- Expression nach alleiniger PMA/Ionomycin-Behandlung.
- Fig. 5 zeigt eine grafische Darstellung der Expression von intrazellulärem IL-2 in ruhenden (A und E) oder aktivierten CD4&spplus; (obere Tafel) oder CD8&spplus; (untere Tafel) T- Zellen, die nur mit PMA/Ionomycin behandelt (B und F) wurden oder in Anwesenheit von 10 uM Ribavirin (C und G) oder 5000 U/ml Interferon Alpha (D und H). Daten aus einem Experiment sind gezeigt und als Prozentsatz von Zellen dargestellt, die doppelt positive Färbungen für IL-2 und CD4 oder CD8 zeigten.
- Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das Nukleosid Ribavirin einem Patienten in einem Dosisbereich verabreicht, der wirksam ist, die Lymphokin-Expression in aktiven T-Zellen zu modulieren. Insbesondere wird Ribavirin zum Unterdrücken der Th2-vermittelten T-Zellantworten und zum Fördern der Th1-vermittelten T-Zellantwort verwendet. Anstelle der Verabreichung von Ribavirin in seiner wohl bekannten Rolle als antivirales Mittel wird somit Ribavirin vorliegend bei der Behandlung von Ungleichgewichten der Lymphokin-Expression verwendet. Solche Ungleichgewichte können begleitend zu allergischen atopischen Störungen wie allergischem Asthma und atopischer Dermatitis, Helminthen- Infektionen und Leishmaniase sowie zahlreichen primären und sekundären Immunschwächen gefunden werden, die mit viraler Infektion verbunden sein können oder auch nicht.
- Die Erfindung stellt somit die Verwendung von Ribavirin bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung einer Erkrankung bereit, die ein Ungleichgewicht der Lymphokin-Expression einschließt, dadurch gekennzeichnet, dass: (i) die Herstellung die Schritte des Erkennens umfasst, dass die behandelnde Erkrankung ein Ungleichgewicht der Lymphokin-Expression einschließt, und dass Ribavirin die Th1- und Th2-Antworten von Lymphozyten moduliert; und (ii) die pharmazeutische Zubereitung eine wirksame Menge an Ribavirin enthält, um die Th1- und Th2-Antworten von Lymphozyten invers so zu modulieren, dass die Th1-Antwort über bzw. die Th2- Antwort unter den Spiegel ansteigt bzw. abfällt, der ohne diese Behandlung vorliegt, wobei die gesteigerte Th1-Antwort und verringerte Th2-Antwort die Erleichterung der Erkrankung vermitteln.
- Die Th2-Antwort kann zuvor durch ein Antigen, einen Helminthen oder einen Antikörper erhöht worden sein.
- Die zu behandelnde Erkrankung kann eine virale Erkrankung sein. Der Virus kann Hepatitis C umfassen.
- Die Erkrankung kann eine nicht-virale Erkrankung sein.
- Die Erkrankung kann eine Allergie, eine Autoimmunerkrankung, eine helminthische Erkrankung oder Leishmaniase umfassen.
- Die Erkrankung kann eine primäre Immunschwäche oder sekundäre Immunschwäche einschließen.
- Die Erkrankung kann den humanen Immunschwächevirus involvieren.
- In einer bevorzugten Ausführungsform wird Ribavirin einem menschlichen Patienten oral in einer Dosis verabreicht, die einen Blutserumspiegel erreicht, der im Mittel etwa 2,5 uM beträgt. Bei einem typischen Individuum entspricht dieser optimale Serumspiegel etwa 4,5 mg/kg/Tag an Körpergewicht, was in Dosen von 200-1200 mg verabreicht werden kann. Vorzugsweise werden die Dosierungen in eine Anzahl kleinerer Dosen aufgeteilt, die dann über den Tag hinweg verabreicht werden.
- Da Ribavirin seit zahlreichen Jahre auf dem Markt ist, sind viele Dosierungsformen und Verabreichungswege bekannt und alle geeigneten Dosierungsformen und Verabreichungswege können eingesetzt werden. Beispielsweise kann zusätzlich zur oralen Verabreichung Ribavirin intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, topisch und dergleichen verabreicht werden, von denen alle wohl bekannt sind. Ribavirin umfassende pharmazeutische Zubereitungen können ebenfalls einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger umfassen, die Hilfsstoffe wie Stabilisatoren (zur Förderung der Langzeitlagerung), Emulgatoren, Bindemittel, Verdickungsmittel, Salze, Konservierungsmittel, Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und fungizide Mittel, isotonische und die Absorption verzögernde Mittel und dergleichen umfassen können. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch wirksame Substanzen ist im Stand der Technik wohl bekannt. Ausgenommen insoweit, dass ein herkömmliches Mittel mit Ribavirin inkompatibel ist, wird dessen Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen und Zubereitungen beabsichtigt. Ergänzende aktive Bestandteile können ebenfalls in die Zusammensetzungen und Zubereitungen aufgenommen werden.
- Es wurde außerdem entdeckt, dass zahlreiche Virazol (eingetragene Marke)-Analoga (zuvor bekannte und unbekannte), die zuvor als minimal wirksam verworfen worden waren, ebenfalls eine signifikante Cytokinwirkung aufweisen. Unsere Forschung zeigt, dass es zahlreiche Klassen von Virazol®- Analoga mit einer solchen Aktivität gibt.
- Mononukleäre periphere Blutzellen (Peripheral Blood Mononuclear Cells = PBMCs) wurden nach Ficoll-Hypaque- Dichtegradienten-Zentrifugation von 60 ml Blut gesunder Spender aus der Leukozytenmanschette isoliert. Die T-Zellen wurden anschließend aus den PMBCs unter Verwendung des Lymphokwik-Lymphozyten-Isolationsreagens (LK-25T, One Lambda, Canoga Park, CA), das spezifisch für T-Zellen ist, gereinigt. Eine mittlere Ausbeute von 40-60 · 10&sup6; T-Zellen wurde anschließend über Nacht bei 37ºC in 20-30 ml RPMI-AP5 (RPMI- 1640-Medium (ICN, Costa Mesa, CA), das 20 mM HEPES-Puffer, pH 7,4, 5% autologes Plasma, 1% L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin und 0,05% 2-Mercaptoethanol) enthielt, zur Entfernung jeglicher kontaminierender anhaftender Zellen inkubiert. In allen Experimenten wurden die T-Zellen mit RPMI-AP5 gewaschen und anschließend auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in einer Zellkonzentration von 1 · 10&sup6; Zellen/ml ausplattiert.
- Die T-Zellen wurden durch Zugabe von 500 ng Ionomycin und 10 ng Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) (Calbiochem, La Jolla, CA) aktiviert und für 48-72 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die PMA/Ionomycin-aktivierten T-Zellen wurden mit 0,5-50 uM Ribavirin oder mit 250-10.000 U/ml eines antiviralen Mittels, Interferon Alpha (Accurate, Westbury, NY), als Kontrolle unmittelbar nach der Aktivierung behandelt und 24 Stunden später nochmals behandelt. T-Zellen aus jeder Platte wurden für die Immunfluoreszenzanalyse verwendet und die Überstände wurden für die extrazellulären Cytokinmessungen eingesetzt. Nach der Aktivierung wurden 900 4 Zellüberstand aus jeder Mikrotiterplatte in eine andere Mikrotiterplatte für die Analyse der von den Zellen stammenden Cytokinproduktion überführt. Die Zellen werden anschließend in Immunfluoreszenzanalysen für die intrazellulären Cytokinspiegel und die Cytokin-Rezeptor- Expression verwendet.
- Konzentrationen von den Zellen stammenden humanen Cytokinen wurden in den Zellüberständen jeder Mikrotiterplatte bestimmt. Die durch Aktivierung induzierten Veränderungen der Interleukin-2-Spiegel (IL-2-Spiegel) wurden unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen ELISA-Kits (R & D Systems Quantikine Kit, Minneapolis, MN) oder mittels eines Bioassay, der die IL-2-abhängige Zelllinie CTLL-2 (ATCC, Rockville, MD) verwendet, bestimmt. Die durch Aktivierung induzierten Veränderungen von Interleukin-4 (LI- 4), dem Tumornekrosefaktor (TNFcL), Interleukin-8 (IL-8) (R & D Systems (Quantikine Kit, Minneapolis, MN) und Interferongamma-Spiegel (IFNY) (Endogen (Cambridge, MA) wurden unter Verwendung von ELISA-Kits bestimmt. Alle ELISA- Ergebnisse wurden in pg/ml ausgedrückt und die CTLL-2- Bioassays in Counts pro Minute, was die IL-2-abhängige zelluläre Inkorporation von ³H-Thymidin (ICN, Costa Mesa, CA) durch CTLL-2-Zellen repräsentiert.
- Für die direkte Färbung mit fluoreszenz-konjugierten Antikörpern gegen Zelloberflächenantigene wurden die Zellen zweimal mit isotoner Kochsalzlösung, pH 7,4 (Becton Dickinson, Mansfield, MA) gewaschen und in 50 ml isotoner Kochsalzlösung resuspendiert und in zwei Proben aufgeteilt. Ein Probenaliquot wurde entweder mit PE-Anti-CD25/FITC-Anti- CD4- oder mit PE-Ratten-Anti-Maus-IgG + Anti-CDw124/FITC- Anti-CD4-mAb co-gefärbt und die nichtspezifische Fluoreszenz durch Färbung des zweiten Aliquots mit PE/FITC-markierten isotyp-passenden monoklonalen Antikörpern als Kontrolle ermittelt. Alle fluoreszenz-markierten monoklonalen Antikörper wurden von Becton Dickinson (San Jose, CA) erhalten, mit der Ausnahme von Anti-CDw124, der von Pharmingen, San Diego, CA, erhalten wurde. Die Inkubationen wurden bei 4ºC im Dunkeln für 45 Minuten unter Verwendung von sättigenden mAb-Konzentrationen durchgeführt. Nicht eingebaute Markierung wurde durch Waschen in PBS vor der Analyse mit einem FACScan-Flowcytometer (Becton Dickinson) entfernt.
- Die Antigendichte wurde indirekt in geöffneten, lebenden CD4&spplus;-Zellen ermittelt und als mittlerer Fluoreszenzkanal (Mean Channel of Fluorescence = MCF) ausgedrückt. Die Oberflächenexpression eines spezifischen Antigens (CDw124, CD25) wurde als die mittlere Kanalverschiebung (Mean Channel Shift = MCS) dargestellt, die erhalten wurde, indem die MCF der FITC- oder PE-markierten, mit isotyp-passenden (IgG1) mAb-gefärbten Zellen als Kontrolle von der MCF der FITC- oder PE-markierten, antigen-spezifischen mAb-gefärbten Zellen subtrahiert wurde. Alternativ wurde die Oberflächenexpression der CD4&spplus;-Untergruppe der Zellen, gefärbt mit CD28-mAb, bestimmt, indem die MCF von CD28&spplus;-CD4&spplus; von den MCF der CD28- CD4-Zellen subtrahiert wurde.
- Die Lebensfähigkeit der unbehandelten Kontrolle und der Ribavirin- und Interferon-a-behandelten Zellen wurde in jedem Ansatz aller Oligonukleotide in Mehrfach-Spendern durch Färben mit dem Lebendfarbstoff Propidiumiodid (5 mg/ml Endkonzentration) bestimmt. Die Prozentzahl lebender Zellen, die Propidiumjodid ausschlossen, wurde durch Durchfluss- Zytometrie ermittelt und betrug > 90% (Bereich 90-99%) nach Behandlung mit allen verwendeten Konzentrationen.
- Für Analysen der intrazellulären Expression von IL-2 in CD4&spplus;- und CD8&spplus;-T-Zell-Untergruppen wurden T-Zellen zunächst mit 10 mg Brefeldin A (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) für die letzten 4 Stunden der 48 bis 72-stündigen Aktivierung behandelt, um die Sekretion von neu synthetisiertem IL-2 in das extrazelluläre Milieu zu minimieren. Nach der Aktivierung wurden 900 ul Zellüberstand aus jeder Mikrotiterplatte für die Analyse der von den Zellen stammenden Cytokinproduktion in eine andere Mikrotiterplatte überführt. Vor der direkten Färbung (30 Minuten, 4ºC, im Dunkeln) mit FITC-konjugierten Antikörpern gegen die Zelloberflächenantigene CD4 und CD8 wurden die Zellen zweimal mit isotonischer Kochsalzlösung, pH 7,4, gewaschen und in 100-150 ml Färbepuffer suspendiert (Phosphat gepuffertes Kochsalz, pH 7,4, enthaltend 1% fötales Kälberserum (FCS) (Hyclone, Logan, LIT) und 0,1% Natriumazid) und in zwei Proben aufgeteilt. Gefärbte Zellen wurden in 1 ml Färbepuffer gewaschen und das Zellpellet in 100 ml Fixierpuffer (4% Paraformaldehyd in PBS) nach dem Absaugen des Überstands resuspendiert. Fixierte Zellen wurden bei 4ºC für 20 Minuten gehalten, anschließend in 1 ml Färbepuffer gewaschen und das Zellpellet unter Mischen in 50 ml Permeabilisierungspuffer (0,1% Saponin (ICN, Costa Mesa, CA) in PBS) resuspendiert. Die permeabilisierten Zellen wurden mit PE-markierten IL-2-Antikörpern für 30 Minuten bei 4ºC im Dunkeln gefärbt und anschließend vor der FACS-Analyse in 1 ml Permeabilisierungspuffer gewaschen, in 250 ml Färbepuffer resuspendiert.
- Die Gesamt-RNA wurde aus ruhenden T-Zellen sowie aus mit Ribavirin- und Interferon-a- behandelten und nicht behandelten, aktivierten T-Zellen unter Verwendung einer im Handel erhältlichen Abwandlung der Guanidinthiocyanat/Phenol- Extraktionstechnik (Trizol Reagent (GIBCO/BRL) extrahiert. Die RNA wurde mit 70% Ethanol gewaschen und schließlich in 10 ul DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert.
- Die cDNA-Synthesereaktion wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt (Promega, Madion, WI). Kurz gesagt, wurden 1 ug der Gesamt-RNA auf 65ºC für 10 Minuten erwärmt und auf Eis gekühlt, bevor diese mit 2 ul 10X Puffer für die reverse Transkription (100 mM Tris-HCl (pH 8, 8), 500 mM KCl, 1% Triton-X-100), 5 mM MgCl&sub2;, 2 ul 10 mM dNTPs (1 mM jedes dNTP), 0,5 ul RNase-Inhibitor, 1 ul Oligo-(dT)&sub1;&sub5;-Primer (0,5 ug/ug RNA) und 0,65 ul AMV-reverse Transkriptase (H. C.) vereinigt wurden. Die Reaktion wurde bei 42ºC für 1 h inkubiert, anschließend für 10 Minuten bei 95ºC und 5 Minuten auf Eis.
- Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung des GeneAmp-PCR- Kits (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, CA) durchgeführt. In einem frischen Röhrchen wurde die RT-Reaktionsmischung (3 ul) mit 5 ul 10X PCR-Puffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 15 mM MgCl&sub2; und 0,1% (w/v) Gelatine), 1 ul 10 mM dNTPs und 1 U Taq-DNA-Polymerase vereinigt. Die verwendeten Primer waren wie folgt: Interleukin-2, Interleukin-4, Interferon-g (human) Primer (Stragene, La Jolla, CA) und pHE7-Ribosomal Gene. Die Amplifikationsbedingungen waren 45 Sekunden bei 94ºC, 1 Minute bei 57ºC und 2 Minuten bei 72ºC für 35 Zyklen, gefolgt von 8 Minuten bei 72 C. Die PCR-Produkte wurden auf einem Ethidiumbromid enthaltenden 2%igen Agarose-Gel analysiert. Nach der Elektrophorese wurden die PCR-Produkte über Nacht auf eine Hybond-N&spplus;-Membran (Amersham, Arlington Heights, IL) in 20 · SSC transferiert und unter Verwendung von 0,4 M NaOH immobilisiert. Die Blots wurden mit 32P-yATP-markierten Oligonukleotidsonden in Rapid-Hyb-Puffer (Amersham) für 1 h bei 42ºC hybridisiert. Jede Cytokin-Primermischung wurde als radiomarkierte Sonde (gemäß den Instruktionen) eingesetzt. Die äquivalente Beladung wurde nach der Hybridisierung mit einer Sonde beurteilt, die aus dem pHE7-Sense-Primer erzeugt worden war. Die gewaschenen Blots wurden anschließend unter Verwendung des Phosphorlmagers analysiert.
- Die PMA/Ionomycin-Behandlung (48-72 Stunden) humaner T- Zellen erhöhte die Spiegel aller analysierten Cytokine, das heißt IL-2, IL-4, TNFα, IFNγ, substanziell (Tabelle 2). Die erste Zahl in jeder Zelle zeigt das arithmetische Mittel und die Zahlen in Klammern zeigen die relevanten Bereiche (N = 4). In einem in Fig. 1 gezeigten repräsentativen Experiment erhöhte die Zugabe von Ribavirin im Dosisbereich 0,5-50 uM die aktivierten Spiegel der Th1-Cytokine IL-2 und TNFcL maximal bei 5 pH (30%) bzw. 20 uM (36%). Im Gegensatz hierzu inhibierte Interferon-a die IL-2- und TNFα-Expression in dosisabhängiger Weise (Bereich 250 - 10.000 U/ml, maximale Inhibition bei 33 bzw. 38%), im Vergleich mit Spiegeln in nicht behandelten, aktivierten T-Zellen. Darüber hinaus vermittelte Ribavirin eine gleichzeitige Abnahme der aktivierten Spiegel des Th2-Cytokins IL-4 (Peak-Inhibition von 74% bei 2 uM), wogegen Interferon Alpha extrazelluläres IL-4 maximal um 26% (10.000 U/ml) erhöhte. Unter Verwendung von Kombinationen von Ribavirin und Interferon Alpha zeigt Fig. 2, dass eine Konstante von 2000 U/ml an Interferon Alpha die Ribavirin-dosisabhängige Förderung der aktivierten IL-2- Spiegel (A) unterdrückte und die Inhibition der aktivierten IL-4-Spiegel (C) umkehrte. Gleichermaßen kehrte eine Konstante von 10 uM Ribavirin die Interferon Alphavermittelte dosisabhängige Inhibition von aktivierten IL-2- Spiegeln (B) um und unterdrückte die Förderung der aktivierten IL-4-Spiegel (D).
- Diese gegenläufigen Effekte von Ribavirin und Interferon Alpha auf die aktivierten extrazellulären Cytokinspiegel wurden auch auf der Ebene der Transkription beobachtet. Fig. 3 zeigt, dass die PMA/Ionomycin-Behandlung humaner T-Zellen die IL-2-, IL-4- und IFNγ-mRKA-Spiegel substanziell erhöht. Behandlung mit Ribavirin (2, 5 und 10 uM) nach T- Zellaktivierung erhöht IL-2, erniedrigt IL-4 und hat keine Auswirkung auf IFNγ-mRNA. Im Gegensatz hierzu verringert Interferon a bei 1000, 2000 und 5000 U/ml IL-2, erhöht IL-4 und verringert IFNymRNA. Somit laufen die jeweiligen dosisabhängigen Wirkungen von Ribavirin und Interferon a auf IL-2-, TNFα- und IL-4-mRNA-Expression den ELISA-Analysen parallel. Diese Daten legen nahe, dass Ribavirin die Synthese der Th1-Cytokine, IL-2 und TNFα fördert und die Expression des Th2-Cytokins IL-4 in aktivierten humanen T-Zellen inhibiert.
- Unter Verwendung der FACS-Analyse haben wir die Wirkungen von Ribavirin und Interferon a auf die Expression von IL-2-(CD25)- und IL-4-(CDw124)-Rezeptoren in aktivierten T-Zellen verglichen. Die PMA/Ionomycin-Behandlung erhöht die CD25- und CDw124-Expression von Ruhespiegeln von 50,16 ± 0,45 bzw. 62,31 ± 1,46 auf aktivierte Spiegel von 162,48 ± 2,89 bzw. 87,53 ± 3,98 (n = 4). In einem repräsentativen von 3 Experiment zeigt Fig. 4, dass Ribavirin (1-50 uM) eine geringe Wirkung auf aktivierte Spiegel von IL-2- und IL-4- Rezeptoren hat, wogegen Interferon a im Dosisbereich von 250- 10.000 U/ml die IL-2-Rezeptor-Expression verringerte und die IL-4-Rezeptor-Expression in dosisabhängiger Weise erhöhte, im Vergleich zu Rezeptorspiegeln in aktivierten T-Zellen als Kontrolle. Daher zeigen diese Daten, dass die Wirkung von Ribavirin auf die Cytokinsynthese unabhängig von der Cytokin- Rezeptor-Expression wirkt. Im Gegensatz hierzu korreliert die Wirkung der Interferon-a-Behandlung auf die IL-2- und IL-4- Rezeptoren mit derjenigen, die mit seiner Wirkung auf aktivierte IL-2- und IL-4-Expression beobachtet wird.
- Wir haben untersucht, ob die Wirkung von Ribavirin auf die IL-2-Expression für CD4- oder CD8&spplus;-T-Zellen spezifisch ist. Die intrazelluläre IL-2-Expression in fixierten und permeabilisierten aktivierten T-Zellen wurde über die Zweifarben-Durchfluss-Zytometrie unter Verwendung von fluoreszenz-markierten Antikörpern gegen CD4 oder CD8 und IL- 2 ermittelt. Fig. 5 zeigt, dass nach der Behandlung mit Ribavirin bei 10 uM der Prozentsatz an CD4&spplus;-T-Zellen, die IL- 2 exprimieren, von 82 auf 91% anstiegt, und dass der Prozentsatz an IL-2-exprimierenden CD8&spplus; von 81 auf 91% anstieg. Im Gegensatz dazu betrug der Prozentsatz an IL-2- exprimierenden CD4&spplus;- und CD8&spplus;-Zellen nach der Interferon-a- Behandlung (5000 U/ml) 81 bzw. 71%. Diese Daten legen nahe, dass Ribavirin eine Wirkung auf die intrazelluläre IL-2- Expression hat, die nicht zwischen den Untergruppen CD4&spplus;- oder CD8&spplus;-T-Zellen unterscheidet. Im Gegensatz hierzu hat die Interferon-Alpha-Behandlung geringe Wirkung auf CD4&spplus;-T-Zellen und verringert sogar die IL-2-Expression in den CD8&spplus;-T-Zell- Untergruppe.
Claims (7)
1. Verwendung von Ribavirin bei der Herstellung einer
pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung einer Erkrankung,
die ein Ungleichgewicht in der Lymphokin-Expression
einschließt, dadurch gekennzeichnet, dass diese Erkrankung
eine nicht-virale Erkrankung ist und dass die pharmazeutische
Zubereitung eine wirksame Menge an Ribavirin enthält, um die
Th1- und Th2-Antworten von Lymphozyten invers so zu
modulieren, dass die Th1-Antwort über bzw. die Th2-Antwort
unter den Spiegel ansteigt bzw. abfällt, der ohne diese
Behandlung vorliegt, wobei die gesteigerte Th1-Antwort und
verringerte Th2-Antwort eine Erleichterung der Erkrankung
vermitteln.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Th2-Antwort
zuvor durch ein Antigen, durch einen Helminthen oder einen
Antikörper erhöht war.
3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Erkrankung eine
Allergie, eine Autoimmunerkrankung, eine helminthische
Erkrankung oder Leishmaniase umfasst.
4. Verwendung nach einem der vorgehenden Ansprüche,
wobei die Erkrankung eine primäre Immunschwäche oder
sekundäre Immunschwäche einschließt.
5. Verwendung von Ribavirin bei der Herstellung einer
pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung einer Erkrankung,
die ein Ungleichgewicht der Lymphokin-Expression einschließt,
dadurch gekennzeichnet, dass diese Erkrankung das humane
Immunschwächevirus (HIV) einschließt und dass die
pharmazeutische Zubereitung eine wirksame Menge an Ribavirin
enthält, um die Th1- und Th2-Antworten von Lymphozyten invers
so zu modulieren, dass die Th1-Antwort über und die Th2-
Antwort unter den Spiegel ansteigt bzw. abfällt, der ohne die
Behandlung vorliegt, wobei die gesteigerte Th1-Antwort und
verringerte Th2-Antwort die Erleichterung der Erkrankung
vermitteln.
6. Verwendung von Ribavirin bei der Herstellung einer
pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung einer Erkrankung,
die ein Ungleichgewicht der Lymphokin-Expression involviert,
dadurch gekennzeichnet, dass diese Erkrankung Hepatitis C ist
und dass die pharmazeutische Zubereitung eine wirksame Menge
an Ribavirin enthält, um die Th1- und Th2-Antworten von
Lymphozyten invers so zu modulieren, dass die Th1-Antwort
über und die Th2-Antwort unter den Spiegel ansteigt bzw.
abfällt, der ohne die Behandlung vorliegt, wobei die
gesteigerte Th1-Antwort und verringerte Th2-Antwort die
Erleichterung der Erkrankung vermittelt.
7. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche,
worin Ribavirin für die Verwendung in einer Dosis von 4,5
mg/kg Körpergewicht pro Tag dient.
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