KR19990081930A

KR19990081930A - 활성화된t림프구에서리바비린에의해tㅗ1/tㅗ2시토카인발현을특이적으로변조시키는방법

Info

Publication number: KR19990081930A
Application number: KR1019980705645A
Authority: KR
Inventors: 로버트 탐; 칸드사미 라마사미; 데브론 애버레트
Original assignee: 해리 에이 루스제; 아이씨엔 파마슈티컬스, 인코포레이티드
Priority date: 1996-01-23
Filing date: 1997-01-21
Publication date: 1999-11-15
Also published as: NO983372L; CZ293584B6; RU2186569C2; HUP9900681A2; CA2246162A1; WO1997026883A1; KR100298158B1; NZ330784A; PL328003A1; SK283342B6; ATE216886T1; AU1747897A; NO983372D0; CZ232998A3; HUP9900681A3; SI9720013A; HU220105B; PT879056E; UA46815C2; CA2246162C

Abstract

본 발명은 리바비린을 활성화된 T 세포에서의 림포카인 발현을 변조시키기에 유효한 용량 범위로 환자에게 투여하는 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 리바바린은 Th2 매개성 T 세포 반응을 억제하고 Th1 매개성 T 세포 반응을 촉진하기 위해 사용된다. 본 발명의 그 밖의 일면에 있어서, 1가지 이상의 리바비린 유사체는 활성화된 T 세포에서의 림포카인 발현을 변조시키기에 유효한 용량 범위로 환자에게 투여된다. 리바비린 유사체는 Th1 또는 Th2 매개성 T 세포 반응을 억제하거나 강화하기 위해 사용될 수 있다.

Description

활성화된 Ｔ 림프구에서 리바비린 및 리바비린 유사체에 의해 Ｔｈ１／Ｔｈ２ 시토카인 발현을 변조시키는 방법

림포카인은 시토카인족에 속하는 폴리펩티드 군이며, 시토카인은 다양한 세포 기능에 영향을 미칠 수 있고 서로 다른 세포끼리 통신할 수 있게 하는 호르몬류 분자이다. 최근의 기술 발달이 면역 반응에서 림포카인의 역할을 명확히 밝히는 데에 도움을 주었다. 헬퍼 CD4⁺(및 CD8⁺) T 세포에 의한 림포카인 생성은 쥐과 동물 및 사람 계통 모두에서 종종 2가지 표현형(Th1 및 Th2) 중의 하나가 된다 [참조: Romagnani, 1991, Immunol Today 12:256-257; Mosmann, 1989, Annu Rev Immunol 7:145-173]. Th1 세포는 인터루킨 2(IL-2), 종양 괴사 인자(TNFα) 및 인터페론 감마(IFNγ)를 생성하고, 이들 세포는 지연형 과민증과 같은 세포 매개성 면역을 주로 담당한다. Th2 세포는 인터루킨 IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13을 생성하고, 이들 세포는 IgE 및 IgG4 항체 아이소타이프 전환과 같은 체액성 면역 반응에 최적의 도움을 주는 데에 주로 관여한다 [참조: Mosmann, 1989, Annu Rev Immunol, 7: 145-173].

강력하게 분극된 Th1 및 Th2 반응은 예방에 있어서 서로 다른 역할을 할 뿐만 아니라 서로 다른 면역병리학적 반응을 촉진할 수 있다. Th1형 반응은 실험적 자가면역 포도막망막염[참조: Dubey 등, 1991, Eur Cytokine Network 2:147-152], 실험적 자가면역 뇌염(EAE)[참조: Beraud 등, 1991, Cell Immunol 133:379-389] 및 인슐린 의존성 당뇨병[참조: Hahn 등, 1987, Eur J Immunol 18:2307-2042]과 같은 기관 특이적 자가면역, 접촉성피부염[참조: Kapsenberg 등, Immunol Today 12:392-395], 및 일부의 만성 염증 질환에 관여한다. 대조적으로, Th2형 반응은 알레르기성 천식[참조: Walker 등, 1992, Am Rev Resp Dis 148:109-115] 및 아토피성피부염[참조: van der Heijden 등, 1991, J Invest Derm 97:389-394]과 같은 알레르기성 아토피성 질환(보편적인 환경 알레르기원에 대한)을 자극시키고, 기생충[참조: Finkelman 등, 1991, Immunoparasitol Today 12:A62-66] 및 레슈마니아 메이져[참조: Caceres-Dittmar 등, 1993, Clin Exp Immunol 91:500-505]와 같은 조직에 상주하는 원생동물에 의한 감염을 악화시키는 것으로 간주되고, E-과면역글로불린혈증[참조: Del Prete 등, 1989, J Clin Invest 84:1830-1835] 및 Omennoes 증후군[참조: Schandene 등, 1993, Eur J Immunol 23:56-60]과 같은 특정한 1차 면역결핍에서 우선적으로 유도되고, 경감된 E-과면역글로불린혈증[참조: Del Prete 등, 1989, J Clin Invest 84:1830-1835] 및 Omennoes 증후군[참조: Schandene 등, 1993, Eur J Immunol 23:56-60]과 관련되어 있고, HIV 복제[참조: Barker 등, 1995, Proc Soc Nat Acad Sci USA 92:11135-11139]를 억제하는 저하된 기능과 관련되어 있다.

따라서, 상기 언급된 질환의 림포카인 프로파일의 변조는 치료학적 잇점을 가질 것임이 명백하다. Th1 반응의 촉진은 Th2 표현형의 반전을 꼭 초래할 것이고, 그 역도 또한 같다. 림포카인에 대한 모노클론성 항체(mAb), 림포카인, 및 티올 항산화제[참조: Jeannin 등, 1995, J Exp Med 182:1785-1792]와 같은 그 밖의 인자는 질환 촉진 시토카인 유형인 Th1 또는 Th2를 억제함으로써 특정 질환의 병인론을 반전시키는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 세포내 원생동물 감염은 IFNγ에 의해 제약을 받지만 IL-4에 의해 악화되는 반면에, 선충 감염은 IL-4에 의해 조절되고 IFNγ에 의해 악화된다[참조: Heinzel 등, 1989, J Exp Med 162:59-72, Else 등, 1994, J Exp Med 179:347-351]. NOD 마우스에서의 인슐린 의존성 당뇨병 및 마우스와 래트에서의 EAE는 질환이 발달하기 전에 IL-4 또는 안티-IFNγ mAb로 처리함으로써 개선시킬 수 있다 [참조: Rapoport 등, 1993, J Exp Med 178:87-99, Racke 등, 1994, J Exp Med 180:1961-1966, Campbell 등, 1991, J Clin Invest 87:739-742]. 또한, 전신성 동상홍반성루푸스류 증후군이 특징인 자가면역 이식편대숙주질환(GVHD)은 Th2 림포카인 생성과 관련이 있고, 안티-IL-4 항체[참조: Umland 등, 1992, Clin Immunol Immunopathol 63:66-73]에 의해 억제된다. 또 다른 한편, Th1 시토카인은 급성 GVHD에서 생성되며, 이러한 급성 GVHD의 경우 공여체 CD8⁺T세포는 CTL로 발달하고 숙주 면역계를 파괴한다. 안티-IFNγ 또는 안티-TNFα mAb에 의한 처리는 질환을 개선시키고, 안티-IL-2 mAb에 의한 처리는 급성 GVHD를 자가면역 GVHD로 전환시킨다 [참조: Via 및 Finkelman, 1993, Int Immunol 5:565-572].

HIV 감염된 환자의 치료에 관한 천연 및 재조합 IL-2의 임상 시험이 1983년 이래로 진행중에 있다[참조: Volberding 등, 1987, AIDS Res Hum Retroviruses, 3:115-124]. AIDS의 발달이 생성된 림포카인의 유형의 시프트(shift)와 관련이 있는 것으로 알려진 사실로부터 일정한 관계가 성립한다 [참조: Clerici 및 Shearer, 1994, Immunol Today 15:575-581]. 시간이 지날수록, 질환으로 진행중인 감염된 개체에 있어서, IL-2와 같은 Th1 림포카인의 감소된 발현이 일어나고[참조: Maggi 등, 1987, Eur J Immunol 17:1685-1690, Gruters 등, 1990, Eur J Immunol 20:1039-1044, Clerici 등, 1993, J Clin Invest 91:759-765], 동시에 IL-4 및 IL-10과 같은 Th2 림포카인의 증가된 생성이 일어난다[참조: Clerici 등, 1994, J Clin Invest 93:768-775, Hoffman 등, 1985, Virololgy 147:326-335]. IL-2로 처리한 무증후 또는 장기 생존자로부터의 T세포는 이들의 안티-HIV 활성을 강화시킨 반면에, IL-4 또는 IL-10에 노출되는 경우 HIV 복제를 억제하고 IL-2를 생성하는 이들 세포의 기능이 저하되었다[참조: Barker 등, 1995, Proc Soc Nat Acad Sci USA 92:11135-11139].

그러나, 최근의 이러한 면역변조적 치료법(mAb 및 재조합 시토카인)은 제약을 받는다. 예를 들어, 만성 모노클론성 항체 치료법의 경우 숙주 동물은 모노클론성 항체에 대한 항체를 발달시킴으로써 이들 항체의 유용성이 제약을 받는다. 이러한 mAb에 대한 유도 면역 반응의 위험을 명백히 경감시키는 "인간화(humanized)" 모노클론성 항체가 개발되어 왔다. 그러나, 이러한 항체는 여전히 개발중이며, 또한 이러한 신규한 mAb는 거대 단백질로 존재하기 때문에 표적 부위에 도달하기가 어려울 수 있다. 예를 들어, 자가면역 GVHD의 IL-12 치료법은 마우스에서 급성 GVHD를 발달시킨다.

리바비린(1-b-D-리보푸라노실-1,2,4-트리아졸-3-카르복사미드)은 RNA 및 DNA 바이러스 복제를 억제할 수 있는 합성 누클레오시드이다 [참조: Huffman 등, 1973, Antimicrob. Agents Chemother 3:235, Sidwell 등, 1972, Science 177:705]. 본 발명자는 리바비린과 이것의 항바이러스 활성이 특정한 면역 반응에 대해 효과가 있음을 제안했던 다른 연구자의 관찰 결과를 확인하였다[Jolley 및 Suchil에 의해 재조사됨, 1984, Clinical Applications of Ribavirin: p93-96]. 본 발명자는 리바비린이 유사분열물질-활성화된 및 항원-활성화된 T 및 B 림프구의 증식에 영향을 주며[참조: Tam 등, 1995(자료는 제시되지 않음), Peavy 등, 1980, Infection and Immunity 29:583-589], 시클로스포린과 병용되는 경우 리바비린은 장기적 이인자형이식(異因子形移植) 생존에서 효능을 나타낸다는[참조: Jolley 등, 1988, Transplantation Proc 20:703-706] 다른 연구자의 관찰결과도 확인하였다.

또한, 본 발명자는 리바비딘이 Th1 반응을 촉진시키고 Th2 반응을 억제함으로써 적어도 부분적으로 면역 반응의 시토카인 유형을 변조시킴을 증명함으로써 종래의 연구를 현저하게 진보시켰다. 이러한 발견은 종래의 연구와 일치하는 것이다. 첫 번째로, 리바비딘은 기능성 체액성 면역 반응[참조: Peavy 등, 1981, J Immunol 126:861-864, Powers 등, 1982, Antimicrob Agents Chemother 22:108-114] 및 비만세포 분비의 IgE 매개성 변조[참조: Marquardt 등, 1987, J Pharmacol Exp Therapeutics 240:145-149] (두 가지 모두 Th2 림포카인 매개성 결과임)를 억제하는 것으로 공지되어 있다. 두 번째로, 리바비린은 HIV 환자로부터의 말초혈 림프구 내의 아지도티미딘(AZT)의 항바이러스 효과를 길항한다[참조: Vogt 등, 1987, Science 235:1376-1379]. 이러한 결과는 AZT가 IL-2 발현이 아닌 IL-2 수용체(IL-2R)를 감소시키기 때문에 의미가 있다 [참조: Viora 및 Camponeschi, 1995, Cell Immunol 163:289-295]. 따라서, 리바비린은 IL-2 발현을 변조시키고 IL-2R의 부진한 수준을 상승시킴으로써 AZT를 길항한다. 세 번째로, 만성 GVHD(Th2 매개성 질환)을 지닌 면역감약된(immuno-compromised) 환자의 리바비린 치료는 질환의 극적 소산을 일으키며, 이러한 성과는 시클로스포린 및 당질 코르티코이드와 같은 통상적인 면역억제 치료법에 의해서는 나타나지 않는다 [참조: Cassano, 1991, Bone Marrow Transplantation 7:247-248]. 마지막으로, C형 간염 바이러스(HCV)에 감염된 환자의 리바비린 치료 (1년)는 위약 대조구 보다 작은 정도의 림프구 응집 및 훨씬 작은 정도의 간 손상을 나타내었다 [참조: Dusheiko 등, 1994, Hepatology 20:206A]. 이러한 결과는 C형 간염에 대한 우세한 면역 반응이 Th1 림포카인에 의해 매개된다고 하더라도 Th0/Th2 표현형의 T세포는 HCV에 의해 감염될 수 있고[참조: Zignego 등, 1994, 미발표 자료), 이러한 감염으로 간세포의 항체 매개성 파괴가 더 유도될 수 있다는 사실을 반영할 수 있다.

본 발명의 분야는 면역학이다.

표 1은 세포외 상층액에서 측정한 림포카인(IL-2, IL-4, TNFα 및 IFNγ(pg/ml)의 48시간 및 72시간째의 휴면 농도 및 PMA/이온마이신(ionomycin)-활성화된 농도, 및 사람 T 세포로부터의 IL-2(IL-2R) 및 IL-4(IL-4R) 수용체의 세포 표면 발현을 나타낸다.

도 1은 PMA/이온마이신 활성화된 T 림프구에서의 IL-2, IL-4, TNFα 및 IFNγ의 세포외 발현에 대한 리바비린 및 인터페론 α의 효과를 그래프식으로 나타낸다. 결과는 PMA/이온마이신 단독 처리후 증가된 림포카인 발현의 백분율로서 표현된다.

도 2는 PMA/이온마이신 활성화된 T 림프구에서의 IL-2(A 및 C) 및 IL-4(B 및 D)의 세포외 발현에 대한, 2000 U/ml의 인터페론 α의 존재하의 2, 10 또는 50 mM의 리바비린의 효과(왼쪽 패널) 및 10mM의 리바비린 존재하의 500, 1000 또는 2000 U/ml의 인터페론 α의 효과(오른쪽 패널)를 그래프식으로 나타낸다.

도 3은 PMA/이온마이신 활성화된 T 림프구에서의 IL-2, IL-4 및 IFNγ mRNA 발현에 대한 리바비린 및 인터페론 α의 효과를 그래프식으로 나타낸다.

도 4는 PMA/이온마이신 활성화된 T 림프구에서의 IL-2 및 IL-4 수용체의 세포 표면 발현에 대한 리바비린 및 인터페론 α의 효과를 그래프식으로 나타낸다. 결과는 PMA/이온마이신 단독 처리후 증기된 림포카인 수용체 발현의 백분율로서 표현된다.

도 5는 휴면상태의 CD4⁺(상부 패널) 또는 CD8⁺(하부 패널) T 세포(A 및 E), 또는 PMA/이온마이신으로 단독 처리된(B 및 F) 또는 10mM의 리바비린(C 및 G) 또는 5000 U/ml의 인터페론 α(D 및 H)의 존재하에서, 활성화된 CD4⁺(상부 패널) 또는 CD8⁺(하부 패널) T 세포에서의 세포내 IL-2 발현을 그래프식으로 나타낸다. 1가지 실험으로부터의 자료가 도시되어 있고, IL-2 및 CD4 또는 CD8에 대한 이중 포지티브 염색을 나타내는 세포의 백분율로서 표현된다.

도 6은 예상되는 리바비린 유사체를 도시한다.

도 7은 IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4 및 IL-5에 대한 리바비린 유사체의 다양한 농도의 결과를 보여주는 그래프의 집합을 나타낸다.

본 발명의 일면에 따르면, 누클레오시드인 리바비린은 활성화된 T 세포에서의 림포카인 발현을 변조시키기에 유효한 용량 범위로 환자에게 투여된다. 상세하게는, 리바비린은 Th2 매개성 T세포 반응을 억제하고, Th1 매개성 T세포 반응을 촉진하기 위해 사용된다.

따라서, 본원에서는 리바비린을 널리 공지된 기능인 항바이러스제로서 투여하는 대신에 림포카인 발현의 불균형을 치료하는 데에 사용한다. 이러한 불균형은 알레르기성 천식 및 아토피성피부염과 같은 알레르기성 아토피성 질환, 기생충 감염, 레슈마니아증, 및 바이러스 감염과 관련이 있을 수도 있는 1차 및 2차 면역결핍증의 부수적 현상인 것으로 밝혀질 수 있다.

본 발명의 그 밖의 일면에 따르면, 한 가지 이상의 리바비린 유사체는 활성화된 T세포에서의 림포카인 발현을 변조시키기에 유효한 용량 범위로 환자에게 투여된다. 리바비린 유사체는 Th1 또는 Th2 매개성 T세포 반응을 억제하거나 강화하기 위해 사용될 수 있다.

바람직한 구체예에 있어서, 리바비린은 평균 0.25 내지 12.5 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 2.5 mg/ml의 혈청 농도를 이루는 용량으로 사람 환자에게 경구 투여된다. 보통 사람의 경우, 이러한 최적 혈청 농도는 200 내지 1200mg의 용량으로 투여될 수 있는 체중의 약 4.5mg/kg/day로 산정된다. 바람직하게는, 용량은 다수의 보다 적은 용량으로 분할되어, 하루에 걸쳐 투여된다.

리바비린이 수 년 동안 시판되어 왔기 때문에, 많은 제형 및 투여 경로가 공지되어 있고, 모든 제형 및 투여 경로가 이용가능하다. 예를 들어, 경구 투여 뿐만 아니라, 리바비린은 정맥내로, 근내로, 복막내로, 경피적으로 투여될 수 있으며, 이들 투여 경로는 모두 공지되어 있다. 리바리린을 포함하는 약제 제형은 한 가지 이상의 제약학적으로 허용되는 담체를 또한 포함할 수 있고, 안정제(장기간 보존 촉진용), 유화제, 결합제, 증점제, 염, 방부제, 용매, 분산매, 피복물, 항세균제와 항매제, 및 등장제와 흡수지연제 등과 같은 부형제를 포함할 수 있다. 약제 활성 물질로 이러한 매질 및 제제를 사용하는 것은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제는 리바비린과 금기시 되지 않는 한, 치료용 조성물 및 조제에 이들을 사용하려고 생각한다. 보충적 활성 성분도 조성물 및 조제에 혼입될 수 있다.

본원에 의도된 리바비린의 치료적 사용 이외에도, 리바비린은 흡수, 분포, 세포 소비, 및 효능의 연구를 위한 실험실용 수단으로서 또한 사용될 수 있다.

최소 활성을 가졌기에 초기에 거부되었던 수 가지의 비라졸(Virazole) 유사체는 현저한 시토카인 활성을 또한 지님이 또한 발견되었다. 본 발명자의 연구는 이러한 활성을 지닌 수 가지 종류의 비라졸 유사체가 존재함을 보여주며, 그 실시예는 "리바비린 유사체"란 표제 하에 아래에 첨부되어 있다. 이러한 실시예는 비라졸이 활성 조성물을 이루기 위해 개질될 수 있는 포지션을 특성화시키고자 하며, 따라서 이러한 발표는 나타난 특수한 개질에 한정되서는 안된다. 이러한 개질은 비라졸의 표준 D형 뿐만 아니라 비라졸의 L형에도 적용할 수 있는 것으로 또한 예상된다.

세포계 및 T 세포 정제

말초혈 단핵 세포(PBMC)는 건강한 공여자로부터 채혈한 혈액 60ml를 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 밀도 구배 원심분리한 후 연막으로부터 단리한다. 그후에, T 세포는 T 세포에 특이적인 림포퀴크(Lymphokwik) 림프구 단리 시약[LK-25T, One Lambda, Canoga Park CA]을 사용하여 PBMC로부터 정제한다. 그후에, 40 내지 60x10⁶T 세포의 평균 수득량을 20 내지 30ml RPMI-AP5(20mM HEPES 완충액(pH 7.4), 5% 자가유래 혈장, 1% L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 0.05% 2-메르캅토에탄올을 함유하는 RPMI-1640 배지[ICN, Costa Mesa, CA]) 중에서 37℃로 하룻밤 동안 인큐베이션시킨다. 모든 실험의 경우, T 세포는 RPMI-AP5로 세정한 후, 96-웰 미량역가 플레이트 상에 1x10⁶세포/ml의 세포 농도로 플레이팅시킨다.

T 세포 활성화 및 리바비린 처리

T 세포는 500ng의 이온마이신 및 10ng의 포르볼(phorbol) 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)[Calbiochem, La Jolla, CA]를 첨가하여 활성화시키고, 37℃로 48 내지 72시간 동안 인큐베이션시킨다. PMA/이온마이신 활성화된 T 세포는 24시간 후에 활성화 및 재처리시킨 직후 0.5 내지 50mM의 리바비린 또는 250 내지 10000 U/ml의 항바이러스 인터페론 α 대조구[Accurate, Westbury, NY]로 처리한다. 각각의 플레이트로부터의 T 세포는 면역형광 분석법에 사용되고, 상층액은 세포외 시토카인 측정에 사용된다. 활성화 후, 각각의 마이크로플레이트로부터의 900ml의 세포 상층액을 세포 유래된 시토카인 생성의 분석을 위해 또 다른 마이크로플레이트로 옮긴다. 그후에, 세포는 세포내 시토카인 농도 및 시토카인 수용체 발현에 관한 면역형광 분석법에 사용된다.

세포외 시토카인 분석법

세포 유래된 사람 시토카인 농도를 각각의 마이크로플레이트로부터의 세포 상층액에서 측정한다. 인터루킨-2(IL-2) 농도의 활성화 유도된 변화는 시판중인 ELISA 키트[R&D systems Quantikine kit, Minneapolis, MN]를 사용하여 측정하거나 IL-2 의존성 세포계인 CTLL-2(ATCC, Rockville, MD)를 사용하는 생물학적 검정법에 의해 측정한다. 인터루킨-4(IL-4), 종양 괴사 인자(TNFα), 인터루킨-8(IL-8)[R&D systems(Quantikine kit, Minneapolis, MN)] 및 인터페론 감마(IFNγ)[Endogen(Cambridge, MA)] 농도의 활성화 유도된 변화는 ELISA 키트를 사용하여 측정한다. 모든 ELISA 결과는 pg/ml로 표현되며, CTLL-2 생물학적 검정법은 CTLL-2 세포에 의한³H-티미딘의 IL-2 의존성 세포 혼입을 나타내는 분 당 계수로 표현된다.

직접적 면역형광 연구(시토카인 수용체)

세포 표면 항원을 형광 컨쥬게이트된 항체로 직접 염색시키기 위해, 세포를 pH 7.4인 염류 등장액[Becton Dickinson, Mansfield, MA]으로 2회 세정하고, 50ml의 염류 등장액 중에 재현탁시키고, 2개의 샘플로 분할한다. 1가지 샘플 분획을 PE-안티 CD25/FITC-안티 CD4 또는 PE-래트 안티 마우스 IgG+안티-CDw124/FITC-안티 CD4 mAb로 동시염색시키고, 특이적이지 않은 형광성은 제 2 분획을 PE/FITC 표지화된 아이소타이프-부합성 대조구 모노클론성 항체로 염색시켜 측정한다. 모든 형광 표지된 모노클론성 항체는 파밍젠[Pharmingen, San Diego, CA]에서 구입한 안티-CDw124를 제외하고는 벡튼 딕킨슨[Becton Dickson, San Jose, CA]에서 구입한다. 인큐베이션은 포화 mAb 농도를 이용하여 45분 동안 어두운 데에서 4℃로 수행한다. 혼입되지 않은 표지는 FACScan 유량 세포계산기[Becton Dickinson]으로 분석하기 전에 PBS 중에서 세정함으로써 분리시킨다.

항원 밀도는 게이팅된(gated) 생존 CD4⁺T 세포에서 간접적으로 측정하고, 형광의 평균 통로(MCF)로서 표현된다. 특이적 항원(CDw124, CD25)의 표면 발현은, FITC-표지화되거나 PE-표지화된 항원 특이적 mAb로 염색된 세포의 MCF에서 FITC-표지화되거나 PE-표지화된 이소타이프-부합성(IgG1) 대조구 mAb 염색된 세포의 MCF를 빼냄으로써 수득되는 평균 통로 시프트(MCS, mean channel shift)로서 표현된다. 대안적으로, CD28 mAb로 염색된 세포의 CD4⁺-서브셋(subset)의 표면 발현은 CD28^_CD4^_세포의 MCF에서 CD28⁺CD4⁺의 MCF를 빼냄으로써 측정한다.

처리하지 않은 대조구 및 리바비린과 인터페론 α로 처리된 세포의 생존 능력은 생체 염료인 요오드화 프로피듐(5mg/ml 최종 농도)으로 염색하여 다수의 공여자에서의 모든 올리고누클레오티드의 각각의 배치(batch)에서 측정한다. 요오드화 프로피듐을 제외한 생존 세포의 백분율은 유량 세포계산에 의해 측정하며, 백분율은 모든 사용 농도로 처리한 후 90%를 초과한다(범위 90 내지 99%).

세포내 시토카인 발현의 면역형광 분석

CD4⁺및 CD8⁺T 세포 서브셋에서의 IL-2의 세포내 발현을 분석하기 위해, 우선 T 세포를 48 내지 72시간의 활성화의 최종 4시간 동안 10mg의 브레펠딘 A[Brefeldin A, Gibco BRL, Gaithersburg, MD]으로 처리하여 신규하게 합성된 IL-2가 세포외 환경으로 분비되는 것을 최소화시킨다. 활성화 후에, 각각의 마이크로플레이트로부터의 900ml의 세포 상층액을 세포 유래된 시토카인 생성의 분석을 위해 또 다른 마이크로플레이트로 옮긴다. 세포 표면 항원(CD4 및 CD8)을 FITC-컨쥬게이트된 항체로 직접 염색(30분, 4C, 어두운 데에서)하기 전에, 세포를 pH 7.4인 염류 등장액으로 2회 세정하고, 100 내지 150ml의 염색용 버퍼(Staining Buffer)(1% 우태아혈청(FCS)[Hyclone, Logen, UT] 및 0.1% 아지화 나트륨을 함유하는 포스페이트 완충 식염(pH 7.4)) 중에서 재현탁시키고, 2개의 샘플로 분할한다. 염색된 세포를 1ml의 염색용 버퍼 중에서 세정하고, 상층액의 흡인후 세포 펠레트를 100ml의 고정용 버퍼(fixation buffer)(PBS 중의 4% 파라포름알데히드) 중에서 재현탁시킨다. 고정된 세포를 4C에서 20분 동안 유지시킨후, 1ml의 염색용 버퍼 중에서 세정시키고, 세포 펠레트를 50ml의 투과용 버퍼(permearbilization buffer)(PBS 중의 0.1% 사포닌[ICN, Costa Mesa, CA]) 중에서 혼합하면서 재현탁시킨다. 투과된 세포를 어두운 데에서 4C로 30분 동안 PE-표지화된 IL-2 항체로 염색시키고, 1ml의 투과용 버퍼 중에서 세정시키고, FACS 분석 전에 250ml 염색용 버퍼 중에서 재현탁시킨다.

시토카인 mRNA의 분석

전체 RNA는 휴면 T 세포 및 리바비린과 인터페론 α로 처리된/처리되지 않은 활성화된 T 세포로부터 구아니듐 티오시아네이트/페놀 추출법(Trizol reagent(GIBCO/BRL))의 상업적 변형법을 이용하여 추출한다. RNA는 70% 에탄올로 세정하고, 최종적으로 10㎕ DEPC-처리된 물 중에서 재현탁시킨다.

cDNA 합성 반응은 제조업자 지시(Promega, Madion, WI)에 따라 수행한다. 간단히 말해, 1㎍의 전체 RNA를 10분 동안 65℃로 가열하고, 얼음 상에서 냉각시킨후, 2㎕의 10X 역전사 버퍼(100mM Tris HCl(pH 8.8), 500mM KCl, 1% Triton X-100), 5mM의 MgCl, 2㎕의 10mM dNTP(각각의 dNTP 당 1mM), 0.5㎕의 RNase 억제물질, 1㎕ 올리고(dT)₁₅ 프라이머(0.5㎍/㎍RNA) 및 0.65㎕ AMV 역전사효소(H.C.)와 조합시킨다. 반응을 1시간 동안 42℃로 인큐베이션시킨후, 10분 동안 95℃로 인큐베이션시키고, 얼음 상에서 5분 동안 냉각시킨다.

PCR 반응은 진앰프(GeneAmp) PCR 키트(Perkin-Elmer Cetus, Foster City, CA)를 사용하여 수행한다. 새로운 튜브에서, RT 반응 혼합물(3㎕)을 5㎕ 10X PCR 버퍼(500mM KCl, 100mM Tris-HCl(pH 8.3), 15mM MgCl₂및 0.01%(w/v) 젤라틴), 1㎕ 10mM dNTP 및 1U의 Taq DNA 중합효소와 조합시킨다. 사용된 프라이머는 다음과 같다: 인터루킨-2, 인터루킨-4, 인터페론-g(사람) 프라이머[Stratagene, La Jolla, CA] 및 pHE7 리보솜 유전자. 증폭 조건은 35 사이클 동안 94℃로 45초, 57℃로 1분 및 72℃로 2분 이고, 그후 72℃로 8분 이다. PCR 생성물은 브롬화 에티듐을 함유하는 2% 아가로오스 겔 상에서 분석된다. 전기영동 후에, PCR 생성물은 하룻밤 동안 20 X SSC 중에서 하이본드(Hybond) N+ 막(Amersham, Arlington Heights, IL) 으로 옮기고, 0.4M의 NaOH를 사용하여 고정시킨다. 블롯(blot)은 1시간 동안 42℃로 라피드(Rapid)-hyb 버퍼(Amersham) 중에서³²P-γATP 표지화된 올리고누클레오티드 프로브와 하이브리드를 형성시킨다. 각각의 시토카인 프라이머 혼합물은 방사성표지된 프로브로서 사용된다(지시에 따라). 균등한 부하는 pHE7 센스 프라이머로부터 생성된 프로브와 하이브리드를 형성한 후 측정한다. 그후에, 세정된 블롯을 포스포이매져(PhosphorImager)를 사용하여 분석한다.

활성화된 T 세포에서의 세포외 시토카인 농도에 대한 리바비린의 효과

사람 T 세포의 PMA/이온마이신 처리(48 내지 72시간)는 분석된 모든 시토카인(즉, IL-2, IL-4, TNFα, IFNγ(표 2))의 농도를 실질적으로 증가시킨다. 각각의 세포의 첫 번째 숫자는 산술 평균을 나타내고, 괄호 안의 숫자는 관련 범위를 나타낸다. N = 4. 도 1에 도시된 대표적인 실험에 있어서, 0.5 내지 50mM의 용량 범위로 리바비린을 첨가한 경우 Th1 시토카인인 IL-2 및 TNFα의 활성화 농도를 각각 최대 5mM(30%) 및 20mM(36%)로 증대시킨다. 대조적으로, 인터페론 α는, 처리되지 않은 활성화된 T 세포에서의 농도와 비교해볼 때, 용량 의존성 방식으로 IL-2 및 TNFα 발현을 억제한다(범위 250 내지 10000 U/ml, 최대 억제율은 각각 33% 및 38%). 또한, 리바비린은 Th2 시토카인인 IL-4의 활성화 농도의 부수적 감소(2mM에서 최고 억제율 74%)를 매개하는 반면에, 인터페론 α는 세포외 IL-4를 최대한 26%(10000 U/ml) 증가시킨다. 리바비린 및 인터페론 α의 조합물을 사용하는 경우, 도 2는 2000 U/ml의 일정한 인터페론 α는 활성화된 IL-2 농도의 리바비린 용량 의존성 증대를 억제하고(A), 활성화된 IL-4 농도의 억제를 반전시킴(C)을 도시한다. 유사하게, 10 mM의 일정한 리바비린은 활성화된 IL-2 농도의 인터페론 α 매개성 용량-의존성 억제를 반전시키고(B), 활성화된 IL-4 농도의 증대를 억제한다.

활성화된 T 세포에서의 시토카인 mRNA 농도에 대한 리바비린의 효과

활성화된 세포외 시토카인 농도에 대한 리바비린 및 인터페론 α의 이러한 반대적 효과는 전사 수준에서 또한 관찰된다. 도 3은 사람 T 세포의 PMA/이온마이신 처리가 IL-2, IL-4 및 IFNγ mRNA 농도를 실질적으로 증대시킴을 도시한다. T 세포 활성화후 리바비린(2, 5 및 10mM)에 의한 처리는 IL-2를 증가시키고, IL-4를 감소시키지만, IFNγ mRNA에 대한 효과는 없다. 대조적으로, 인터페론 α는 1000, 2000 및 5000 U/ml에서 IL-2를 감소시키고, IL-4를 증가시키고, IFNγ mRNA를 감소시킨다. 따라서, IL-2, TNFα 및 IL-4 mRNA 발현에 대한 리바비린 및 인터페론의 각각의 용량 의존성 효과는 ELISA 분석과 유사하다. 이들 자료는 리바비린이 Th1 시토카인인 IL-2 및 TNFα의 합성을 촉진시키고, 활성화된 사람 T 세포에서의 Th2 시토카인인 IL-4의 발현을 억제함을 암시한다.

활성화된 T 세포에서의 IL-2 및 IL-4 수용체 농도에 대한 리바비린의 효과

FACS 분석법을 이용하여, 본 발명자는 활성화된 T 세포에서의 IL-2(CD25) 및 IL-4(CDw124) 수용체 발현에 대한 리바비린 및 인터페론 α의 효과를 비교하였다. PMA/이온마이신 처리는 CD25 및 CDw124 발현을 각각 50.16±0.45 및 62.31±1.46의 휴면 농도 내지 162.48±2.89 및 87.53±3.98의 활성화 농도로 증가시킨다(n = 4). 3가지 실험 중의 대표적인 실험에 있어서, 도 4는, 활성화된 T 세포 대조구와 비교해볼 때, 리바비린(1 내지 50mM)이 IL-2 및 IL-4 수용체의 활성화 농도에 대해 거의 효과가 없는 반면에 인터페론 α는 250 내지 10000 U/ml의 용량 범위에서 IL-2 수용체를 감소시키고 IL-4 수용체를 용량 의존성 방식으로 증가시킴을 도시한다. 따라서, 이들 자료는 시토카인 합성에 대한 리바비린의 효과는 시토카인 수용체 발현과 독립적으로 작용함을 나타낸다. 대조적으로, IL-2 및 IL-4 수용체에 대한 인터페론 α 처리의 효과는 활성화된 IL-2 및 IL-4 발현에 대한 인터페론 α의 효과에 의해 관측된 것과 서로 관련이 있다.

활성화된 T 세포의 CD4 및 CD8+ 서브셋에서의 세포내 IL-2 농도에 대한 리바비린의 효과

본 발명자는 IL-2 발현에 대한 리바비린의 효과가 CD4⁺또는 CD8⁺T 세포에 특이적인 지를 조사하였다. 고정되고 투과된 활성화 T 세포에서의 세포내 IL-2 발현을 CD4 또는 CD8 및 IL-2에 대해 형광 표지된 항체를 사용하는 2색 유량 세포계산기에 의해 측정하였다. 도 5는 10mM로 리바비린에 의해 처리한후, IL-2를 발현하는 CD4^_T 세포의 백분율은 82 내지 91%로 증가하고, IL-2를 발현하는 CD8⁺의 백분율은 81 내지 91%로 증가함을 도시한다. 대조적으로, 인터페론 α 처리(5000 U/ml)후 IL-2를 발현하는 CD4⁺및 CD8⁺의 백분율은 각각 81% 및 71% 였다. 이들 자료는 리바비린이 CD4⁺또는 CD8⁺T 세포 서브셋을 분간하지 못하는 세포내 IL-2 발현에 대해 효과가 있음을 암시한다. 대조적으로, 인터페론 α 처리는 CD4⁺T 세포에 대해 거의 효과가 없으며, 심지어 CD8⁺T 세포 서브셋에서의 IL-2 발현을 감소시킨다.

리바비린 유사체

Th1 또는 Th2 매개성 T 세포 반응을 변조시키기에 임상적으로 유효한 것으로 생각되는 여러가지 종류의 리바비린이 존재한다. 이것은 L형 및 D형 누클레오시드를 모두 포함하는 도 6의 일반식에 속하는 분자를 포함하며, 여기서 X는 O, S, CH₂, CHOH 또는 N-CO-R₁₁이고; A, B 및 C는 독립적으로 N, P, CH, C-OH, C-CH₃, C-알킬, C-알케닐, C-CH₂, -CN, C-할로겐, C-CN, C-COOCH₃, C-NH₂, C-SNH₂, C-SO₂-NH₂, C-CONH₂, C-CS-NH₂, C-C(NH)NH₂, CPO₂-NH₂, 또는 C-헤테로 고리계이고; D는 S, Se, Te, PH, NH 또는 NR₁₂이고; R₁은 H, (CH₂)p(OH), 할로겐, CN, (CH₂)pONH₂, (CH₂)pNH₂, CH₃, CH₂SPH 또는 (CH₂)-헤테로 고리이고; R₂는 H, OH, OCH₃, SH, SCH₃, 할로겐, CN, NH₂, ONH₂, NHCH₃, (CH₂)OH, (CH₂)pNH₂, CH₃, 또는 COOMe이고; R₃, R₄, R₅, R₆, R₇및 R₈은 각각 H, OH, OCH₃, SH, SCH₃, 할로겐, CN, NH₂, ONH₂, NHCH₃, (CH₂)OH, (CH₂)pNH₂, CH₃, COOMe 또는 페닐이고; R₉는 H, 할로겐, NH₂, CH₃, CONH, CSNH₂, COOMe, SNH₂, SO₂NH₂, PO₂NH₂, (CH₂)p, (CH₂)p-헤테로 고리계 또는 (CH₂)p-글루코오스이고; R₁₀은 H, 할로겐, NH₂, CH₃, CONH, CSNH₂, COOMe, SNH₂, SO₂NH₂, PO₂NH₂, (CH₂)p, (CH₂)p-헤테로 고리계, (CH₂)p-글루코오스, O-CH₃, O-CH₂CH₃또는 아미노산이고; Y는 O, S, NH·HCl, NOH, NOCH₃또는 NOCH₂PH이고; R₁₀& Y는 조합되어 티아졸, 이미다졸 등과 같은 헤테로 고리계이고, R₁₁은 CH₃(CH₂)pNH₂, (CH₂)p-헤테로고리, (CH₂)p-아미노산 또는 (CH₂)p-당(글루코오스 등)이고; p는 0 내지 8의 정수이다.

이러한 분자는 하기의 전형적인 도해 중의 1가지 이상에 따라 제조될 수 있다.

1. 1CN1369(Pyrazomycin)의 합성: 본 화합물에 대한 합성 방법은 다음의 참고 문헌에 기재되어 있다: (a) J. Farkas, Z.Flegelova 및 F.Sorm, Tetrahedron Letts., 22,2279(1972); (b) S.De Bernardo 및 M.Weigele, J. Org. Chem., 41, 287(1976); (c) J.G.Buchanan,A.Stobie 및 R.H.Wightrnan, J.Chem.Soc.Chem.Commun., 916(1980); N.Karagiri,K.Takashirna, T.Haneda 및 T.Kato, J.Chem.Soc.Perkin Trans.l, 553(1984).

2. 1CN3438(1-β-D-자이로푸라노실-1.2.4-트리아졸-3-카르복사미드)의 합성: 본 화합물의 합성은 제이.티.위트코우스키 등의 문헌[J.T.Witkowski, M.Fuertes, P.D.Cook 및 R.K.Robins, J.Carbohydr. Nucleosides, Nucleotides 2(1), 1(1975)]에 기재된 방법을 수행함으로써 이루어진다.

3. 1CN3844 (1(5-O-술파모일-β-D-리보푸라노실)-1,2,4-트리아졸-3-카르복사미드)의 합성: 본 화합물은 지.디.키니 등의 문헌[G.D.Kini, B.M.Henry, R.K.Robins, S.B.Larson, J.J.Marr, R.l.Berens, C.J.Bacchi, H.C.Nathan 및 3.S.Keithly, J.Med.Chem., 33,44(1990)]에 기재된 방법을 수행함으로써 제조된다.

4. 1CN4625(1(3-데옥시-β-에리트로펜토푸라실)-1,2,4-트리아졸-3-카르복사미드)의 합성: 본 화합물은 아래의 합성법을 이용하여 제조된다.

5. 1CN5531(5-아미노-1-β-D-리보푸라노실피라졸-4-카르복사미드)의 합성: 본 화합물은 비.케이.바타카르야 등의 문헌[B.K.Bhattacharya, R.K.Robins 및 G.R.Revankar.J.Heterocyclic Chem., 21,795(1990)]에 기재된 합성 방법을 수행함으로써 제조된다.

6. 1CN5676(1-β-D-아라비노푸라노실-1,2,4-트리아졸-3-카르복사미드)의 합성: 본 화합물은 제이.티.위트코우스키 등의 문헌[J.T.Witkowski, M Fuefles, P.D.Cook 및 R.K.Robins, J.Carbohydr. Nucleosides, Nucleotides, 2(1), 1(1975)]에 기재된 방법을 수행함으로써 제조된다.

7. ICN5839(1-β-D-에리트로푸라노실-1,2,4,3-카르복사미드)의 합성: 본 화합물은 하기에 기재된 합성 순서를 이용하여 제조된다:

8. ICN6242(2-브로모-1-β-D-리보푸라노실 이미다졸-4-카르복사미드)의 합성: ICN6242는 아래에 도시된 방법을 수행함으로써 제조된다.

9. ICN11808(1-β-D-리보푸라노실-피라졸-3,4-디카르복사미드)의 합성: 본 화합물의 합성법은 와이.에스.상비 등의 문헌[Y.S.Sanghvi, B.K.Bhattacharya, G.D. Kini, S.S.Matsumoto, S.B.Larson, W.J.Jolley, R.K.Robins 및 G.R.Revankar, J.Med. Chem., 33, 336(1990)]에 기재되어 있으며, 이에 따라서 제조된다.

10. ICN12204(2-(β-D-리보푸라노실)이미다졸-5-카르복사미드)의 합성: 본 화합물의 합성은 제이.이고레오 등의 문헌[J.Igoleo, T.H.Dinh, A.Keib 및 C.Perreur, Chimie Therapeutique, 207(1972)]에 기재된 방법을 수행함으로써 이루어진다.

리바비린 유사체의 탄소고리 4´-티오슈가(thiosugar) 및 4´-아자슈가(azasugar) 유도체에 대하여, 하기의 당이 적절한 헤테로고리 화합물과 축합될 수 있고, 상기 도해 및 참고문헌에 기재된 바와 같이 유도될 수 있다.

1. 탄소고리 당은 다음의 문헌에 기재된 방법을 수행함으로써 제조할 수 있다: 문헌[M.Yoshikawa, Y.Yoshikawa, Y.inoue, S.Yamaguchi 및 N.Murakami, Tetrahedon, 50, 9961(1994); L.Agrofoglio, E. Suhas, A.Parese, R.Condom, S.R.Challand, R.A.Earl 및 R.Guedj, Tetrahedron, 50, 10611(1994)]

2. 4-아자슈가는 다음의 문헌에 기재된 방법에 의해 제조한다: 문헌[E.J.Reist, D.E.Gueffroy 및 L.Goodman, J.Am.Chem.Soc., 87,677(1965)]

3. 4-티오-D-리보푸라노오스는 다음의 문헌에 기재된 방법을 수행함으로써 제조한다: 문헌[M.Hobek 및 R.L.Whistler in "Methods in Carbohydrate Chemistry," Vol 1,292 (1962)].

Th1 및 Th2 시토카인을 변조함에 있어서 리바리린 유사체의 유효성의 증거는 도 7 및 하기의 표에 설명되어 있다. 본원에 발표한 검정법은 시험된 35개의 리바비린 유사체의 간결한 목록을 포함하며, 모든 검정법은 3회씩 수행하였다. 일반적으로, 시험된 화합물은 3가지의 주요 범주에 속하는 것으로 볼 수 있다: (1) IFNγ, IL-2, IL-4, IL-S 및 TNFα를 억제하는 ICN1369 및 ICN3844와 같은 화합물; (2) IL-2 및 TNFα를 강화시키고 ILA 및 IL-5를 억제하는 리바비린과 같은 화합물; 및 (3) IL-2 및 IFNγ를 강화시키고 IL-4 및 IL-5를 억제하는 ICN6242, ICN3839 및 ICN3531과 같은 화합물. 상기에 기재된 이러한 활성은 시토카인의 변조가 적절한 면역 반응에 영향을 줄 것이라는 전조에 있어서 잠재적으로 이로울 것이다.

웰 당 세포 농도 = 2 x 10⁶x 24 = 48ml중 48 x 10⁶(각각의 웰의 전체 부피 = 2000㎕)

	1	2	3	4	5	6
A	배지	PMAICN	PMAICN	PMAICN10μM 1369	PMAICN5μM 1369	PMAICN2μM 1369
B	PMAICN10μ 3438	PMAICN5μM 3438	PMAICN2μM 3438	PMAICN10μM 3844	PMAICN5μM 3844	PMAICN2μ 3844
C	PMAICN10μ 4625	PMAICN5μM 4625	PMAICN2μM 4625	PMAICN10μM 5531	PMAICN5μM 5531	PMAICN2μM 5531
D	PMAICN10μM 5676	PMAICN5μM 5676	PMAICN2μM 5676	PMAICN10μM 5839	PMAICN5μM 5839	PMAICN2μM 5839

	1	2	3	4	5	6
A	PMAICN10μM 6242	PMAICN5μM 6242	PMAICN2μM 6242	PMAICN10μM 11808	PMAICN5μM 11808	PMAICN2μM 11808
B	PMAICN10μM 12204	PMAICN5μM 12204	PMAICN2μM 12204	PMAICN10μM RIB	PMAICN5μM RIB	PMAICN2μM RIB

따라서, 리바비린 및 리바비린 유사체는 활성화된 T 세포에서의 림포카인 발현을 변조시키는데 효과적이라는 것이 밝혀진다. 특정한 구체예 및 분야가 다루어졌지만, 당업자라면 본 발명의 개념을 벗어나지 않고 수 많은 변화가 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위의 사상에만 한정되지 않는다.

Claims

사람 환자의 활성화된 T 세포에서의 림포카인 발현을 변조시키기 위해 리바비린을 사용하는 방법.
제 1항에 있어서, 리바비린이 Th1의 농도를 증가시키고, Th2의 농도를 감소시키기에 유효한 용량으로 투여됨을 특징으로 하는 방법.
Th1이 정상 미만으로 감소하고 Th2가 정상을 초과하여 증가하는 시토카인 프로파일을 특징으로 하는 비바이러스성 질환을 치료하기 위해 리바비린을 사용하는 방법.
제 3항에 있어서, 질환이 알레르기를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 질환이 자가면역 질환을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 질환이 기생충 질환을 포함함을 특징으로 하는 방법.
바이러스성 요소, 및 활성화된 T 림프구에서 Th1 농도를 감소시키고 Th2 농도를 증가시킴을 특징으로 하는 비바이러스성 요소를 갖는 질환의 비바이러스성 요소를 치료하기 위해 리바비린을 사용하는 방법.
제 7항에 있어서, 질환이 1차 면역결핍증을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 질환이 2차 면역결핍증을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 바이러스성 요소가 인체 면역결핍 바이러스를 포함함을 특징을 하는 방법.
Th1 또는 Th2 발현을 변조시키는 데에 L형 및 D형 누클레오시드 둘 모두를 포함하는 하기 화학식의 화합물 중의 어느 하나를 사용하는 방법:

상기 식에서,

X는 O, S, CH₂, CHOH 또는 N-CO-R₁₁이고;

A, B 및 C는 독립적으로 N, P, CH, C-OH, C-CH₃, C-알킬, C-알케닐, C-CH₂, -CN, C-할로겐, C-CN, C-COOCH₃, C-NH₂, C-SNH₂, C-SO₂-NH₂, C-CONH₂, C-CS-NH₂, C-C(NH)NH₂, CPO₂-NH₂, 또는 C-헤테로 고리계이고;

D는 S, Se, Te, PH, NH 또는 NR₁₂이고;

R₁은 H, (CH₂)p(OH), 할로겐, CN, (CH₂)pONH₂, (CH₂)pNH₂, CH₃, CH₂SPH 또는 (CH₂)-헤테로 고리이고;

R₂는 H, OH, OCH₃, SH, SCH₃, 할로겐, CN, NH₂, ONH₂, NHCH₃, (CH₂)OH, (CH₂)pNH₂, CH₃, 또는 COOMe이고;

R₃, R₄, R₅, R₆, R₇및 R₈은 각각 H, OH, OCH₃, SH, SCH₃, 할로겐, CN, NH₂, ONH₂, NHCH₃, (CH₂)OH, (CH₂)pNH₂, CH₃, COOMe 또는 페닐이고;

R₉는 H, 할로겐, NH₂, CH₃, CONH, CSNH₂, COOMe, SNH₂, SO₂NH₂, PO₂NH₂, (CH₂)p, (CH₂)p-헤테로 고리계 또는 (CH₂)p-글루코오스이고;

R₁₀은 H, 할로겐, NH₂, CH₃, CONH, CSNH₂, COOMe, SNH₂, SO₂NH₂, PO₂NH₂, (CH₂)p, (CH₂)p-헤테로 고리계, (CH₂)p-글루코오스, O-CH₃, O-CH₂CH₃또는 아미노산이고;

Y는 O, S, NH·HCl, NOH, NOCH₃또는 NOCH₂PH이고;

R₁₀& Y는 결합되어 티아졸 또는 이미다졸과 같은 헤테로 고리계를 형성하고;

R₁₁은 CH₃(CH₂)pNH₂, (CH₂)p-헤테로고리, (CH₂)p-아미노산 또는 (CH₂)p-당(글루코오스 등)이고;

p는 0 내지 8의 정수이다.