SI9720013A - Uravnavanje ekspresije citokinov TH1/TH2 z ribavirinom in z analogi ribavirina v aktiviranih T-limfocitih - Google Patents

Uravnavanje ekspresije citokinov TH1/TH2 z ribavirinom in z analogi ribavirina v aktiviranih T-limfocitih Download PDF

Info

Publication number
SI9720013A
SI9720013A SI9720013A SI9720013A SI9720013A SI 9720013 A SI9720013 A SI 9720013A SI 9720013 A SI9720013 A SI 9720013A SI 9720013 A SI9720013 A SI 9720013A SI 9720013 A SI9720013 A SI 9720013A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
ribavirin
response
activated
cells
lymphocytes
Prior art date
Application number
SI9720013A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert Tam
Kandsamy Ramasamy
Devron Averett
Original Assignee
Icn Pharmaceuticals, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26712784&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SI9720013(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/590,449 external-priority patent/US5767097A/en
Application filed by Icn Pharmaceuticals, Inc. filed Critical Icn Pharmaceuticals, Inc.
Publication of SI9720013A publication Critical patent/SI9720013A/sl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/7056—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing five-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/10—Anthelmintics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/052—Imidazole radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/056—Triazole or tetrazole radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/24—Heterocyclic radicals containing oxygen or sulfur as ring hetero atom

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

Ribavirin je predpisan pacientu v količinah, ki učinkovito uravnavajo ekspresijo limfokinov v aktiviranih T-celicah. Predvsem je Ribavirin uporabljen za zavrtje Th2 uravnavanega odziva T celic in za povečanje Th1 uravnavanega odziva T celic. Nadalje, eden ali več analogov Ribavirina je predpisanih pacientu v količini, ki je učinkovita za uravnavanje ekspresije limfokinov v aktiviranih T celicah. Analogi Ribavirina so lahko uporabljeni za zavrtje ali promocijo Th1 ali Th2 uravnavanega odziva T celic.ŕ

Description

URAVNAVANJE EKSPRESIJE CIT0KIN0VTH1/TH2 Z RIBAVIRINOM IN Z ANALOGI RIBAVIRINA V AKTIVIRANIH T-LIMFOCITIH
PODROČJE TEHNIKE
Področje izuma je imunologija.
PRIKAZ PROBLEMA
Limfokini so skupina polipeptidov, ki pripadajo družini citokinov, hormonom podobnim molekulam, ki lahko vplivajo na različne celične funkcije celic in omogočajo komunikacijo med različnimi celicami. Najnovejše raziskave so pripomogle k razjasnitvi vloge citokinov pri imunološkem odzivu. Sinteza limfokinov pri CD4+ (in tudi pri CD8+) T celicah pomagalkah pogosto pripada enemu od dveh fenotipov, Th1 in Th2, v človeškem sistemu in sistemu glodalcev (Romagnani, 1991, Immunol Today 12: 256-257; Mosmann, 1989, Annu Rev Immunol 7: 145-173). Celice sintetizirajo interleukin 2 (IL-2), tumorski nekrozni faktor (TNFa) in interferon gama (IFNv). Ti so prednostno odgovorni za imunološki odziv celice, kot je zakasnela povečana imunska občutljivosti. Fenotip Th2 celic producira interleukine IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 in IL-13 in so primarno vključene v zagotavljanje optimalne pomoči pri imunskem odzivu človeka, kot so izotipna zamenjava IgE in lgG4 protiteles (Mosmann, 1989, Annu Rev Immunol7:l 45-173).
Močno polarizirana Th1 in Th2 odziva ne samo, da predstavljata različni vlogi pri zaščiti, lahko tudi izzoveta različne imunopatološke reakcije. Odziv tipa Th1 je vpleten v specifično avtoimunost organov, kot so: eksperimentalno avtoimuno vaskularno mrežnično vnetje (Dubey in sod, 1991, EurCytokine Network2,147-152), eksperimentalni avtoimuni encefalitis (EAE) (Beraud in sod, 1991, Celi Immunol 133:379-389) in insulinsko odvisno sladkorno bolezen (Hahn in sod, 1987, Eur J Immunol 18:2037-2042), kontaktni dermatitis (Kapsenberg in sod, Immunol Today 12,392395) in nekatere kronične vnetne nepravilnosti. V nasprotju je odziv tipa Th2 odgovoren pri sprožitvi alergenih atopičnih motenj (proti pogostim alergenom okolja), kot so: astma (Walker in sod, 1992, Am Rev Resp Dis 148:109-115) in atopični dermatitis (van der Heijden in sod, 1991, J InvestDerm 97:389-394), prav tako mislijo, da poveča jakost infekcije s tkivnimi protozoji, kot so: paraziti (Finkelman in sod, 1991, Immunoparasitol Today12: A62-66) in Leishmania major (Caceres-Dittmar in sod. 1993, Ciin Exp Immunol 91: 500-505), ki so inducirane v nekaterih primarnih imunoloških nepravilnostih, kot sta: hiper IgE sindrom (Del Prete in sod, 1989, J Ciin InvestM: 1830-1835) in OmennOs sindrom (Schandene in sod, 1993, Eur J lmmuno/23: 56-60),
-2prav tako so asociirana z zmanjšano sposobnostjo zavrtja HIV replikacije (Barker in sod, Proč Soc Natl Acad Sci USA 92:11135-11139).
Razvidno je, da je uravnavanje vzorca limfokinov pri navedenih omenjenih bolezenskih stanjih koristno iz vidika terapije. Povečanje Th1 odziva bi po vsej verjetnosti pripeljal do zmanjšanja Th2 fenotipa in obratno. Monoklonalna protitelesa (mAb) na limfokine, limfokini samostojno in druge substance, kot so: tiolni antioksidanti (Jeannin in sod, 1995, J Exp Med 182:1785-1792), kot je bilo pokazano, spremenijo patogenezo določenih bolezni z inhibicijo bolezensko-promoviranega vzorca citokinov, Th1 ali Th2. Na primer, intracelularno infekcijo s protozoji se da omejiti s prisotnostjo IFNv, vendar pa zvečanje IL-4 poveča nevarnost infekcije, medtem ko je infekcija z nematodi kontrolirana z IL-4 in pospešena z IFNy (Heinzel in sod, 1989, J Exp Med 162: 59-72; Else in sod, 1994, J Exp Med 179:347-351). Stanje insulinsko odvisne sladkorne bolezni v NOD miših in EAE v miših in podganah se lahko izboljša z zdravljenjem z IL-4 ali z proti-IFNy mAb, če se zdravljenje prične pred razvojem bolezni (Rapoport in sod, 1993, J Exp Med 178: 87-99; Račke in sod, 1994, J Exp Med 180: 1961-1966; Campbell in sod, 1991, J Ciin Invest 87: 739-742). Dodatno avtoimuno cepljenje proti bolezni gostitelja (GVHD), ki je označena s podobnim sindromom, kot je sistemsko tuberkolozno ali revmatično obolenje kože, je povezana s produkcijo Th2 limfokinov in inhibirana s proti IL-4 protitelesi (Umland in sod, 1992, Ciin Immunol Immunopathol33:66-73). Na drugi strani so Th1 citokini sintetizirani v akutnem stanju GVHD, ob katerem donorske CD8+ T celice razvijejo CTL in uničijo gostiteljski imunski sistem. Zdravljenje z proti-IFNy ali proti-TNFa mAb izboljša stanje bolezni, zdravljenje z proti IL-2 mAb preobrne akutno GVHD v avtoimuno GVHD (Via in Finkelman, 1993, Int Immunol 5: 565-572).
Klinični poskusi nativnega in rekombinantnega IL-2 pri zdravljenju HIV okuženih pacientov se izvajajo od leta 1983 (Volberding in sod, 1987, AIDS Res Hum Retroviruses 3:115-124). Način zdravljenja je v povezavi z boleznijo, tako da je razvoj AIDS-a povezan s spreminjanjem vzorca sintetiziranih limfokinov (Clerici in Shearer, 1994, Immunol Today 15: 575-581). Po določenem času je v okuženem posamezniku, ki se mu bolezen stopnjuje, zaznati znižanje ekspresije Th1 limfokinov, kot je: IL-2 (Maggi in sod, 1987, Eur J Immunol 17:1685-1690; Gruters in sod, 1990, Eur J Immunol 20: 1039-1044; Clerici in sod, 1993, J Ciin Invest 91: 759-765), vzporedno s povečano produkcijo Th2 limfokinov, kot sta: IL-4 in IL-10 (Clerici in sod, 1994, J Ciin Invest93: 768-775; Hoffman in sod, 1985, Virology 147: 326-335). T celice, ki izhajajo iz asimptomatičnih ali dalj časa preživelih, ki so jih obdelovali z IL-2 imajo povečano proti-HIV aktivnost, medtem ko izpostavitvi le teh IL-4 in IL-10 zmanjša sposobnost zavrtja HIV pomnoževanja in sinteze IL-2 (Barker in sod, 1995, Proč Soc Natl Acad Sci USA 92:11135-11139).
-3Učinkovitost sedanjih terapevtikov, ki spreminjajo imunološko sliko (mAb in rekombinantni citokini), je prav tako omejena. Na primer ponavljajoče zdravljenje z monoklonalnimi protitelesi povzroči pri živalih razvoj protiteles proti uporabljenim monoklonalnim protitelesom, kar omejuje njihovo uporabnost. Razvili so človeška monoklonalna protitelesa, ki očitno znižajo nevarnost vnosa imunskega odziva na ta monoklonalna protitelesa. Vendar so le ta še vedno v razvoju. Njihova značilnost je, da so nova mAbs veliki proteini in zaradi tega imajo lahko probleme pri doseganju tarčnih mest. Terapevtiki na osnovi citokinov imajo prav tako omejitve. Na primer IL-2 zdravljenje GVHD vodi do razvoja akutne GVHD pri miših.
Ribavirin (1-p-D-ribofuranozil-1,2,4-triazol-3-karboksamid) je sintetični nukleozid sposoben inhibicije razmnoževanja RNA in DNA virusov (Huffman in sod, 1973, Antimicrob Agents Chemother3:235; Sidwell in sod, 1972, Science 177: 705). Potrdili smo, da ima Ribavirin poleg antivirusne aktivnosti, tudi vpliv na določen imunski odziv (povzetek Jolley in Suchil, 1984, Clinical Applications of Ribavirin; stran 93-96). Prav tako smo potrdili, da Ribavirin vpliva na proliferacijo mitogen in antigen aktiviranih T in B limfocitov (Tam in sod, 1995 (podatki niso prikazani); Peavy in sod, 1980, Infection and Immunity29; 583-589) in v primeru, ko je kombiniran s ciklosporini, Ribavirin kaže učinkovitost v daljši preživelosti transplantantov (Jolley in sod, 1988, Transplantation Proč 20:703-706).
Poleg omenjenega je naše raziskovanje opazno pospešilo raziskave z odkritjem, da Ribavirin vpliva na vzorec ekspresije citokinov pri imunskem odzivu delno s povečanjem Th1 odziva in z znižanjem Th2 odziva. Ta dognanja niso predpostavljena s predhodnimi raziskavami. Ribavirin je poznan, da inhibira oboje: funkcijsko humoralni imunološki odziv (Peavy in sod, 1981, J ImmunolteG; 861-864, Powers in sod, 1982, Antimicrob Agents Chemother22; 108-114) in IgEuravnavano spreminjanje celic sekrecije, ki se nahajajo v povezovalnem tkivu in izločajo heparin in histamin v času vnetne reakcije (Marquardt in sod, 1987, J Pharmacol Exp Therapeutics 240: 145-149) (obastaTh2 limfokin uravnavana dogodka). Nadalje Ribavirin poveča proti virusni vpliv azidotimidina (AZT) v limfocitih periferne krvi pri HIV pacientih (Vogt in sod, 1987, Science 235: 1376-1379). Ta odkritja so pomembna, ker AZT zniža količino IL-2 receptorjev (IL-2R) ne pa ekspresijo IL-2 (Viora in Catnponeschi, 1995, Celi Immunol163; 289-295). Zato je mogoče, da Ribavirin poveča AZT delovanje z modulacijo IL-2 ekspresije in dvigom nivoja IL-2R. Zdravljenje kroničnega GVHD imunokompromitiranih pacientov z Ribavirinom (Th2 uravnavana neurejenost) vodi do dramatičnega razpleta bolezni, izid, ki ga ni moč doseči ob uporabi konvencionalnih imunosupresivnih terapijah, kot sta: ciklosporini in glukokartikoidi (Cassano, 1991, Bone Marrow Transpalntation7; 247-248). Končno, zdravljenje pacientov s hepatitisom C (HCV) z Ribavirinom (eno leto) je pokazalo manj limfocitnih agregatov in mnogo manj poškodb na jetrih, kot pri kontroli
-4s placebo (Dusheiko in sod, 1994, Hepatology 20:206A). Ti rezultati so lahko odraz dejstva, da je predominantni imunski odziv na hepatitis C pod vplivom Th1 limfokinov, T celice Th0/Th2 fenotipa so lahko inficirane z HCV (Zignego in sod, 1994, nepublicirani podatki) in da ta infekcija lahko nadalje vodi do uničenja hepatocitov s protitelesi.
KRATEK OPIS SLIK
TABELA 1 predstavlja koncentracijo limfokinov IL-2, IL-4, TNF« in IFNy (pg/ml) izmerjenih po 48 urah in 72 urah v ekstracelularnem ekstraktu v neaktivni fazi in v s PMA/ionomicin aktiviranih celicah in ekspresijo membranskih IL-2 (IL-2R) in IL-4 (IL-4R) receptorjev (povprečna intenziteta fluerescence na kanal (MCF)) pri T celicah človeka.
SLIKA 1 je grafični prikaz vpliva Ribavirina in interferona alfa na ekspresijo ekstracelularnih IL-2, IL-4, TNFa in IFNy v PMA/ionomicin aktiviranih T limfocitih. Rezultati so izraženi kot procent povečanja ekspresije limfokinov po PMA/ionomicin obdelavi.
SLIKA 2 je grafični prikaz vpliva 2,10 in 50 μΜ Ribavirina v prisotnosti 2000 U/ml interferona alfa (slike na levi) in vpliv 500,1000 ali 2000 U/ml interferona alfa (slike na desni) v prisotnosti 10 μΜ Ribavirina na ekspresijo ekstracelularnih IL-2 (A in B) in IL-4 (C in D) v PMA/ionomicin aktiviranih T limfocitih.
SLIKA 3 je grafični prikaz vpliva Ribavirina in interferona na ekspresijo mRNA IL-2, IL-4 in IFNy v PMA/ionomicin aktiviranih T limfocitih.
SLIKA 4 je grafični prikaz vpliva Ribavirina in interferona alfa na ekspresijo membranskih receptorjev IL-2 in IL-4 v PMA/ionomicin aktiviranih T limfocitih. Rezultati so izraženi kot procent povečanja ekspresije receptorjev limfokinov po PMA/ionomicin obdelavi.
SLIKA 5 je grafični prikaz ekspresije intracelularnih IL-2 v ne obdelanih (A in E) ali v aktiviranih CD4+ (zgornja slika) ali CD8+ (spodnja slika) T celicah, ki so bile obdelane samo s PMA/ionomicinom (B in F) ali ob prisotnosti 10 μΜ Ribavirina (C in G) ali 5000 U/ml interferona alfa (D in H). Podatki iz enega eksperimenta so prikazani in predstavljeni kot procenti celic, ki kažejo dvojno pozitivno barvanje za IL-2 in CD4+ ali CD8+.
SLIKA 6 je grafični prikaz opazovanih analogov Ribavirina.
-5SLIKA 7 je zbirka grafov, ki prikazujejo rezultate različnih koncentracij analogov Ribavirina na IL-2, TNFa, IFNY, IL-4 in IL-5.
POVZETEK IZUMA
V skladu z enim od vidikov tega izuma je nukleozid Ribavirin predpisan pacientu v območju količin, ki učinkovito vplivajo na ekspresijo limfokinov pri aktiviranih T celicah. Predvsem je Ribavirin uporaben za zavrtje Th2 uravnavanega T celičnega odziva in za promocijo Th1 uravnavanega T celičnega odziva.
Tako namesto Ribavirina uporabljenega kot proti virusno zdravilo, se Ribavirin v tem primeru uporablja pri zdravljenju neuravnovešenosti v ekspresiji limfokinov. Taka neravnovesja je moč zaslediti pri spremljajočih okoliščinah alergenih atopičnih nepravilnostih, kot so: astma nastala zaradi alergije in atopični dermatitis, infekcija s paraziti in laišmhmanija in različne primarne in sekundarne imunske pomanjkljivosti, ki so lahko povezane z virusno infekcijo.
V skladu z drugimi vidiki predstavljenega izuma, je eden ali več analogov Ribavirina, predpisanih pacienu v območju količin, ki učinkovito vplivajo na ekspresijo limfokinov v aktiviranih T celicah. Analogi Ribavirina se lahko uporabljajo za zavrtje ali povečanje Th1 ali Th2 uravnavanega T celičnega odziva.
PODROBEN OPIS IZVEDBENIH PRIMEROV
Prednostno je pacientu Ribavirin predpisan peroralno v količini, ki doseže nivo krvnega seruma v povprečju od 0.25 do 12.5 μΜ, in v večini približno 2.5 μΜ. Pri povprečnem značilnem posamezniku je optimalni nivo seruma približno 4.5 mg/kg/dan telesne teže, kar pomeni, da je lahko predpisan v količini od 200 do 1200 mg. Zaželeno je, da je doza porazdeljena v več manjših doz, ki so aplicirane preko celega dne.
Ker je Ribavirin na tržišču že nekaj let, je poznanih veliko oblik doziranja in načinov aplikacije, in uporabljajo se lahko vse primerne oblike in načini doziranja. Na primer, poleg peroralnega doziranja, je lahko Ribavirin apliciran intravenozno, intramuskularno, intraperitonalno, preko kože in podobno. Farmacevtske formulacije, ki vsebujejo Ribavirin lahko vsebujejo enega ali več farmacevtsko sprejemljivih nosilcev, ki lahko vključujejo dodatke, kot so: stabilizatorji (da zagotovijo dolgoročno shranjevanje), emulgatorji, vezne substance, zgoščevalne substance, soli, perzervativi, topila, disperzijski mediji, prevleke, protibakterijske in protiglivne substance,
-6izotonične in adsorbcijske substance, ki upočasnijo delovanje in podobno. Uporaba naštetih medijev in substanc za farmacevtsko aktivno substanco je dobro poznana strokovnjakom. Razen v primeru, daje kateri od konvencionalnih medijev ali substanc nekompatibilen z Ribavirinom, se njihova omenjena uporaba v terapevtskih kompozicijah in preparatih poudari. Dodatne aktivne substance so lahko dodane v kompozicije ali preparacije.
Poleg navedenih terapevtskih uporab Ribavirina, se Ribavirin lahko uporablja kot laboratorijski pripomoček za preučevanje absorpcije, porazdeljevanja, celičnega pretoka in učinkovitosti. Odkrito je bilo, da ima nekaj analogov Virazola (predhodno poznanih in nepoznanih), ki so bili predhodno zavrnjeni, zaradi njihove minimalne aktivnosti, prav tako pomemben vpliv na citokine. V naši raziskavi smo pokazali, da je več razredov analogov Virazola, ki imajo vpliv na citokine, katerih primeri so podani pod naslovom analogi Ribavirina. Ti primeri so namenjeni označitvi mest, na katerih je Virazol lahko modificiran, da se doseže aktivno kompozicijo in to odkritje naj ne bi bilo omejeno na specifične prikazane spremembe. Nadalje je prikazano, da se te modifikacije lahko nanašajo na standardno D obliko Virazola, kot tudi na L obliko Virazola.
PRIMERI
Čiščenje celičnih linij in T celic
Enojederne celice periferne krvi (PBMCa) zdravega donorja so bile izolirane iz pufrnega plašča. 60 ml krvi je bilo nato centrifugirano v Ficoll-Hypaque gradientu. T celice so bile očiščene iz PBMCs z uporabo Lymphkwik limfocitnega izolacijskega reagenta, ki je specifičen za T celice (LK-25T, One Lambda, Canoga Park, CA). Povprečni izkoristek 40 do 60 χ 106 T celic smo nato inkubirali preko noči pri 37 °C v 20 do 30 ml RPMI-AP5 (RPMI-1640 medij (ICN, Costa Mesa, CA) vsebuje 20 mM Hepes pufer, pH 7.4, 5 % avtologne plazme, 1 % L-glutamina, 1 % penicilina/ streptamicina in 0.05 % 2-merkaptoetanola) z namenom odstranitve kontaminirajočih prilepljenih celic. V vseh eksperimentih so bile T celice sprane z RPMI-AP5 medija in prenesena na mikrotitrno ploščo (96 vzorčnih lukenj) v koncentraciji 1 χ 106 celic na ml.
Aktivacija T celic in obdelava z Ribavirinom
T celice so bile aktivirane z dodatkom 500 ng ionomicina in 10 ng forbol 12-miristata 13 acetata (PMA) (Calbiochem, La Jolla, CA), ter inkubirane pri 37 °C za 48 do 72 ur. PMA/ionomicin aktivirane T celice so bile takoj po aktivaciji obdelane z od 0.5 do 50 μΜ Ribavirina ali z od 250 do 10000 U/ml kontrolnega interferona alfa, ki je služil kot protivirusna kontrola (Accurate, Westbury, NY). Postopek obdelave je bil ponovljen po 24 urah. T celice vsake plošče so bile uporabljene za imunoflourescentno analizo in supernatant je bil uporabljen za meritve prisotnosti
-7ekstracelularnih citokinov. Po aktivaciji je bilo 900 pl celičnega supernatanta vsake mikrotitrne plošče prenesene na drugo mikrotitrno ploščo z namenom analize celične produkcije citokinov. Celice so bile nato uporabljene za imunoflourescentno analizo količine intracelularnih citokinov in ekspresije receptorjev citokinov.
Analiza ekstracelularnih citokinov
Koncentracije različnih človeških citokinov, ki jih celice producirajo, so bile določena v celičnem ekstraktu vsake mikrotitrne plošče. Sprememba koncentracije interleukina 2 (IL-2), ki je bila povzročena z aktivacijsko indukcijo, je bila določena z ELISA setom reagentov, ki je komercialno na tržišču (R & D systems Ouantikine kit, Minneapolis, MN) ali z biotestom, ki uporablja IL-2 odvisne celične linije CTLL-2 (ATCC, Rockville, MD). Aktivacijsko inducirane spremembe koncentracije interleukina 4 (IL-4), tumorskega nekroznega faktorja (TNFa), interleukina 8 (IL-8) (R & D systems, Ouantikine, Minneapolis, MN) in interferona gama (IFNy) (Endogen, Cambrige, MA) so bile določene z uporabo ELISA seta. ELISA rezultati so bili izraženi v pg/ml in CTLL-2 biotest kot število signalov na minuto, ki predstavljajo IL-2 odvisno celično vgrajevanje 3H-timidina (ICN, Costa Mesa, CA) z CTLL-2 celicami.
Direktne imunoflurescentne študije (receptorji citokinov)
Za direktno barvanje celičnih membranskih antigenov s protitelesi, ki imajo fluorescentne konjugate, so bile celice dvakrat sprane z izotonično solno raztopino, pH 7.4 (Becton Dickinson, Mansfield, MA), in ponovno suspendirane v 50 ml izotonične solne raztopine in razdeljene na dva dela. Eden od alikvotov je bil vzporedno barvan ali z PE-proti CD25/FITC-proti CD4 ali z PEpodganji proti mišji lgG+ proti-CDw124/FITC-proti CD4 mAb (monoklonalnimi protitelesi) in nespecifična fluorescenca je bila določena z barvanjem drugega alikvota z PE/FITC označenimi izotipnimi-ustreznimi monoklonalnimi protitelesi. Vsa flurescentno označena monoklonalna protitelesa so bila dobljena od Becton Dickinson (San Jose, CA), izjema so proti-CDw124, ki so bili dobljeni od Pharmingen, (San Diego, CA). Inkubacija je bila izvedena pri 4 °C v temi za 45 minut z uporabo nasičene koncentracije mAb. Nevgrajena markirana protitelesa smo odstranili s spiranjem v PBS pred analizo z FACScan pretočnim citometrom (Becton Dickinson).
Gostota antigenov je bila direktno določena v živih začasno prepustnih CD4+ T celicah in izražena s povprečno intenziteto fluerescence na kanal (MCF). Ekspresija specifičnih membranskih antigenov (CDw124, CD25) je bila predstavljena kot povprečni žarnih na kanal (MCS) dobljen z razliko med MCF FITC- ali PE- označenimi izotipno ustreznimi (lgG1) kontrolnimi mAb-barvanimi celicami od MCF FITC- ali PE- označenimi antigen-specifičnimi mAB barvanimi celicami. Ekspresija membranskega CD4+podseta celic barvanega z CD28 mAb je bila določena z razliko
-8med MCF CD28+ CD4+ in CD28' CD4' celic.
Kontrola preživelosti neobdelanih in Ribavirin in interferon obdelanih celic je bila določena v vsaki skupini vseh oligonukleotidov večih donorjev z barvanjem z barvo, propidium jodid (5 mg/ml končne koncentracije). Procent živih celic, ki niso inkorporirale propidium jodid, je bil določen s pretočno citometrijo in je bil več kot 90 % (območje med 90 in 99 %) po obdelavi z vsemi uporabljenimi koncentracijami.
Imunofluorescentne analize ekspresije intracelularnih citoklnov
Za analizo ekspresije intracelularnega IL-2 v podsetu CD4+ in CD8+ T celic, so bile T celice obdelane z 10 mg Brefeldin A (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) zadnje 4 ure v obdobju aktivacije, ki je potekala od 48 do 72 ur. Obdelane so bile, da se je zmanjšalo ekstracelularno izločanje novo sintetiziranega IL-2. Po aktivaciji je bilo preneseno 900 ml celičnega supernatanta vsake mikrotitrne plošče na drugo mikrotitrno ploščo za analizo produkcije citokinov celic. Pred direktnim barvanjem (30 min, 4 °C, v temi) z FITC-konjugatnimi protitelesi na membranska antigena CD4 in CD8, so bile celice dvakrat sprane z izotonično solno raztopino, pH7.4, ki je vsebovala 1 % telečjega seruma fetusa (FCS) (Hyclone, Logan, UT) in 0.1 % natrijevega azida, in razdeljene na dva alikvota. Barvane celice so bile sprane z 1 ml pufra za barvanje in celična oborina je bila ponovno raztopljena v 100 ml fiksacijskega pufra (4 % paraformaldehida v PBS), ki ji je sledilo prepihovanje supernatanta. Fiksirane celice so bile shranjene pri 4 °C 20 minut, sprane z 1 ml pufra za barvanje in celična oborina je bila ponovno raztopljena z mešanjem v 50 ml pufra za permeabilizacijo (0.1 % saponina (ICN, Costa Mesa, CA) v PBS). Permeabilizirane celice so bile barvane z PE-označenimi IL-2 protitelesi za 30 minut pri 4 °C na temnem in sprane z 1 ml pufra za permeabilizacijo, ponovno raztopljene v 250 ml pufra za barvanje pred FACS analizo.
Analiza mRNA citokinov
Celotna RNA je bila ekstrahirana iz T celic, ki so bile neobdelane, in iz Ribavirin in interferon obdelanih aktiviranih T celic z uporabo komercialne različice gvanidin tiocianat/fenol ekstrakcijske tehnike (Trizol reagent (GIBCO/BRL)). RNA je bila sprana s 70 % etanolom in končno raztopljena v 10 μΙ DEPC-obdelani vodi:
Sinteza cDNA je bila izvedena po navodilih proizvajalca (Promega, Madison, Wl). Celokupna RNA (1 pg) je bila segreta na 65 °C za 10 minut, ohlajena na ledu pred dodatkom 2 pl pufra za reverzno transkriptazo v 10 kratni koncentraciji (100 mM Tris HCI (pH8.8), 500 mM KCI, 1 % Triton Χ-100), 5 mM MgCI2, 2 μ110 mM dNTP’s (1mM vsakega dNTP-ja), 0.5 pl RNase inhibitorja, 1 μΙ oligo (dT)15oligonukleotidnih začetnikov (0.5 pg/pg RNA) in 0.65 pl AMV reverzne transkriptaze (H.C.).
-9Reakcijska zmes je bila inkubirana pri 42 °C 1 uro, nato ji je sledila denaturacija pri 95 °C za 10 minut in ohlajevanje na ledu za 5 minut.
Za PCR reakcijo je bil uporabljen GeneAmp PCR set (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, CA). RT reakcijski mešanici (3 pl) smo primešali 5 pl 10 x PCR pufra (500 mM KCI, 100 mM Tris HCI, pH 8.3, 15 mM MgCI2 in 0.01 % (W/v - teža/volumebn) želatine), 1 pl 10 mM dNTP-jev in 1 U Taq DNA polimeraze. Oligonukleotidni začetniki, ki so bili uporabljeni v tej reakciji, so bili: interleukin 2, interleukin 4, interferon gama (človeški) (Stratagene, La Jolla, CA) in pHE7 ribosomalni gen. Pogoji pomnoževanja so bili 45 sekund pri 94 °C, 1 minuta pri 57 °C in 2 minuti pri 72 °C 35 ciklov, ki jim je sledilo 8 minut pri 72 °C. PCR produkti so bili analizirani na 2 % agarozi, ki je vsebovala etidijev bromid. Po elektroforezi so bili PCR produkti preneseni na Haybond-N+ membrane (Amersham, Arlington Heights, IL) z 20 x SSC preko noči, za imobilizacijo smo uporabili 0.4 M NaOH. DNA vezana na trdem nosilcu je bila hibridizirana z 32Ρ-γΑΤΡ označeno oligonukleotidno lovko v Rapid-hyb pufru (Amersham) za 1 uro pri 42 °C. Vsaka mešanica oligonukleotidnih začetnikov citokinov so bile uporabljene kot radioaktivno označene lovke (po navodilih). Kontrola nanosa je bila dobljena s hibridizacijo z lovko sintetizirano z pEH7 smiselnim oligonukleotidnim začetnikom. Sprane membrane z vezano DNA so bile analizirane z uporabo sistema, ki detektira emitirajoče svetlobne signale (Phosphorlmager sistem).
Vpliv Ribavirina na koncentracijo ekstraceiuiarnih citokinov v aktiviranih T celicah Obdelava človeški T celic 48 do 72 ur z PMA/ionomicinom je povečala koncentracijo vseh citokinov, ki so bili analizirani: IL-2, IL-4, TNFa, IFNy (TABELA 1). Prva številka v vsaki celici je aritmetično povprečje in številka v oklepajih predstavlja relativno območje. N=4.
TABELA 1
48 ur v neaktivni fazi 48 ur aktivirano 72 ur v neaktivni fazi 72 ur aktivirano
IL-2 6,7 (5 - 9,3) 1652 (848-2148) 5,8 (5 - 9,3) 1462 (918- 1866)
IL-4 7.5 (7,1 - 8,2) 209 (81 - 363) 8,5 (7,2 - 9,2) 131 (121 -148)
TNFa 11,5 (5-18) 1573 (1474-1672) 8.3 (5-12) 1894(1240-2548)
IFNy 8,9 (8,3 - 9,5) 1285 (807 -1765) 9,3 (9,1-9,4) 2229 (1230 - 3228)
IL-2R 50,1 (40,6 -59,7) 163(160,9 -166,5) 60,1 (49,6 - 70,4) 163 (160,1 - 165,5)
IL-4R 52,3 (42,6 - 59,2) 77,7 (73,5-82,1)
-10V reprezentativnem eksperimentu predstavljenem na sliki 1 je dodatek Ribavirina v koncentracijah od 0.5 μΜ do 50 μΜ povečal aktivirane koncentracije Th1 citokinov IL-2, maksimalno pri 5μΜ (30 %) in TNFa maksimalno pri 20 μΜ (36 %). V nasprotju je interferon alfa inhibiral ekspresijo IL-2 in TNFa na način, ki je odvisen od uporabljene količine (območje od 250 do 10000 U/ml, maksimalna inhibicija 33 % IL-2 in 38 % TNFa) v primerjavi s koncentracijami v neobdelanih aktiviranih T celicah. Ribavirin je vplival na spremljajoče znižanje koncentracije aktiviranih Th2 citokinov IL-4 (ostra inhibicija 74 % pri 2 μΜ), interferon alfa pa je maksimalno povečal ekstracelularni IL-4 za 26 % (10000 U/ml). Uporaba kombinacije Ribavirina in interferona alfa, na sliki 2 prikazuje, da konstantna koncentracija interferona alfa (2000 U/ml) zavre koncentracijsko odvisno povečanja aktivne IL-2 koncentracije (A) z Ribavirinom in preobrne inhibicijo aktivirane IL-4 koncentracije (C). Podobno konstanta 10 μΜ količina Ribavirina premakne v nasprotno smer koncentracijsko odvisno inhibitorno delovanje interferona alfa na že aktivirano IL-2 koncentracijo (B) in zavre naraščanje že aktivirane IL-4 koncentracije (D).
Vpliv Ribavirina na količino mRNA citokinov v aktiviranih T celicah
Nasprotujoči vpliv Ribavirina in interferona alfa na koncentracije aktiviranih ekstracelularnih citokinov je bilo moč opaziti tudi na nivoju transkripcije. Slika 3 prikazuje PMA/ionomicinsko obdelavo človeških T celic in naraščanje količine mRNA IL-2, IL-4 in IFNy. Obdelava z Ribavirinom (2, 5 in 10 μΜ), ki je sledila aktivaciji T celic, je dvignila mRNA količino IL-2, znižala mRNA IL-4 in ni imela vpliva na IFNy mRNA. V nasprotju je interferon alfa v koncentraciji 1000, 2000 in 5000 U/ml znižal koncentracijo mRNA IL-2, zvišal IL-4 mRNA in znižal IFNy mRNA. Rezultate koncentracijske odvisnosti vpliva Ribavarina in interferona alfa na ekspresijo mRNA IL2, TNFa in IL-4 smo primerjali z ELISA testi. Rezultati kažejo, da Ribavirin poveča sintezo Th1 citokinov, IL-2 in TNFa, in inhibira ekspresijo Th2 citokinov, IL-4 v aktiviranih človeških T celicah.
Vpliv Ribavirina na koncentracijo IL-2 in IL-4 receptorjev v aktiviranih T celicah
Z uporabo FACS analize smo primerjali vpliv Ribavirina in interferona alfa na ekspresijo receptorjev IL-2 (CD25) in IL-4 (CDw124) v aktiviranih T celicah. PMA/ionomicin obdelava je zvišala ekspresijo CD25 in CDw124, kije bila pri neobdelanih celicah 50.16±0.45 in 62.31 ±1.46, na aktiviran nivo 162.48±2.89 in 87.53±3.98 kot sledi (n=4). V treh reprezentativnih eksperimentih, slika 4 prikazuje, da ima Ribavirin (1 -50 μΜ) zelo malo vpliva na aktiviran nivo receptorjev IL-2 in IL-4, medtem ko interferon alfa na koncentracijsko odvisni način v koncentracijskem območju od 250 do 10000 U/ml, zniža ekspresijo IL-2 receptorjev in zviša ekspresijo IL-4 receptorjev v primerjavi z količino receptorjev pri kontrolnih aktiviranih T celicah. Ti rezultati kažejo, da je vpliv Ribavirina na sintezo citokinov neodvisen od ekspresije receptorjev citokinov. V nasprotju, pa je vpliv interferona alfa na IL-2 in IL-4 receptorje primerljiv z opaženim vplivom na ekspresijo
-11aktiviranih IL-2 in lL-4.
Vpliv Ribavirina na koncentracijo intracelularnega IL-2 v CD4* in CD8+ podsetov aktiviranih T celicah
Preučili smo ali je vpliv Ribavirina na ekspresijo IL-2 specifičen na CD4+ ali CD8+ T celice. Intracelularna ekspresija IL-2 pri fiksiranih in permeabilnih aktiviranih T celicah je bila določena z dvo barvno tekočinsko citometrijo ob uporabi fluorescentno označenih protiteles na CD4 ali CD8 in na IL-2. Slika 5 prikazuje obdelavo z Ribavirinom (10 μΜ). Procent CD4+ T celic, ki ekspresirajo IL-2, je narasel od 82 % na 91 % in procent CD8+, ki ekspresirajo IL-2, je narasel od 81 % na 91 %. V nasprotju pa je procent ekspresiranega IL-2 pri CD4+ in CD8+ celicah po obdelavi z interferonom alfa (5000 U/ml) 81 % in 71 %. Rezultati kažejo, da ima Ribavirin vpliv na ekspresijo IL-2 in ne ločuje med CD4+ in GD8+ T celicami. V nasprotju pa ima obdelava z interferonom alfa zelo malo vpliva na CD4+T celice in zniža ekspresijo IL-2 pri CD8+T celicah.
Analogi Ribavirina
Predstavljenih je več razredov analogov Ribavirina, ki jih preučujejo v klinične namene glede na vpliv na Th1 in Th2 uravnavan odziv T celic. To vključuje molekule, ki pripadajo v skupino generičnih formul prikazanih na sliki 6, kjer X predstavlja O, S, CH2, CHOH ali N-CO-R^; A, B in C neodvisno predstavljajo N, P, CH, C-OH, C-CH3, C-alkil, C-alkenil, C-CH2, -CN, C-halogen, CCN, C-COOCH3, C-NH2, C-SNH2, C-SO2-NH2, C-CONH2, C-CS-NH2, C-C(NH)NH2, cpo2-nh2, ali C-heterociklični obročni sistem; D predstavlja S, Se, Te, PH, NH ali NR12; R., predstavlja H, (CH2)p(OH), halogen, CN, (CH2)pONH2, (CH2)pNH2, CH3, CH2SPH ali (CH2)-heterociklični obroč; R2 predstavlja H, OH, OCH3, SH, SCH3, halogen, CN, NH2, ONH2, NHCH3, (CH2)OH, (CH2)pNH2, CH3 ali COOMe; R3, R4, Rs, R6, R7 in Re neodvisno predstavljajo H, OH, OCH3, SH, SCH3, halogen, CN, NH2, ONH2, NHCH3, (CH2)OH, (CH2)pNH2, CH3, COOMe ali fenil; Re predstavlja
H, halogen, NH2, CH3, CONH, CSNH2, COOMe, SNH2, SO2NH2, PO2NH2, (CH2)p, (CH2)pheterociklični obročni sistem, (CH2)p-glukoza; R1o predstavlja H, halogen, NH2, CH3, CONH, CSNH2, COOMe, SNH2, SO2NH2, PO2NH2, (CH2)p, (CH2)p-heterociklični obročni sistem, (CH2)pglukoza, O-CH3, O-CH2CH3 ali amino kislina Y predstavlja O, S, NHHCI, NOH, NOCH3 ali NOCH2PH; R1o in Y v kombinaciji so heterociklični obročni sistem kot so tiazol, imidazol; Rn predstavlja CH3(CH2)pNH2, (CH2)p-heterocikli, (CH2)p-aminokisline ali (CH2)-sladkorji (glukoza in drugo); p je število med 0 in 8; in vključuje L in D nukleozide.
Te molekule so lahko sintetizirane po eni ali večih navedenih shemah, ki služijo za primer.
I. Sinteza ICN1369 (Pyrazomycin): Strategija sinteze te komponente je razložena v sledeči literaturi: (a) J. Farakas, Z. Flegelova in F. Sorm, Tetrahedron Letts. 22, 2279 (1972); (b) S. De
-12Bernardo in M. VVeghtrnan, J. Org. Chem. 41, 287 (1976); (c) J.G. Buchanan, A. Stobei in R.H. VVightrnan, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 916 (1980); (d) N. Karagiri, K. Takashirna, T. Haneda in T. Kato, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1,553 (1984).
2. Sinteza ICN3438 (1 -p-D-ksilofuranozil-1,2,4-triazol-3-karboksamid): Sinteza te komponente je bila dosežena s postopkom, ki je razložen pri J.T. Witkowski, M. Fuertes, P.D. Cook in R.K. Robons, J. Carbohydr. Nucleosides. Nucleotised2 (1), 1 (1975).
3. Sinteza ICN3844 (1 (5-O-sulfamoil-p-D-ribofuranozil)-1,2,4-triazol-3-karboksamid):
Komponenta je bila pripravljena po postopku, ki so ga opisali G.D. Kini, B.M. Henry, R.K. Robins,
S.B. Larson, J.J. Marr, R.L. Berens, C.J. Bacchi, H.C. Nathan in S. Keithly, J. Med. Chem. 33, 44 (1990).
4. Sinteza ICN4625 (1 (3-deoksi-p-D-eritropentofuranosil)-1,2,4-triazol-3-karboksamid): Komponenta je bila pripravljena z uporabo sledečih metod sinteze:
OH
OH
-135. Sinteza ICN5531 (5-amino-1-p-D-ribofuranozilpirazol-4-karboksamid): Postopek sinteze so opisali: B.K. Bhattacharya, R.K. Robins in G.R. Revankar, J. Heterocyclic Chem. 21,795 (1990) in se ga uporablja za pripravo naslovljene komponente.
6. Sinteza ICN5676 (l-p-D-arabinofuranozil-IJZ.A-triazol-S-karboksamid): Komponenta je bila pripravljena po postopku, ki so ga opisali J.T. Witkowski, M. Fuefles, P.D. Cook in R.K. Robins, J. Carbohydr. Nucleosides, Nucleosides 2 (1), 1 (1975).
7. Sinteza ICN5839 (1-p-D-eritrofuranosil-1,2,4-triazol-3-karboksamid): Komponenta je bila pripravljena z uporabo sledečih metod sinteze:
-148. Sinteza ICN6242 (2-bromo-1-p-D-ribofuranosillimidazol-4-karboksamid): Komponenta je bila pripravljena z uporabo sledečih metod sinteze:
RcfP. C. Srivastava, O. A. Ivanoviči, R. J. Rousseau and R. K. Robini,
J. Org. Chem., 40,2920 (1975)
9. Sinteza ICN11808 (1-p-D-ribofuranozil-pirazol-3,4-dikarboksamid): Komponenta je bila pripravljena po postopku, ki so ga opisali Y.S. Sanghvi, B.K. Bhattacharya, G.D. Kini, S.S. Matsumoto, S.B. Larson, W.J. Jolley, R.K. Robins in G.R. Revankar, J. Med. Chem. 33, 336 (1990).
10. Sinteza ICN12204 (2-(p-D-ribofuranozil)imidazol-5-karboksamid): Komponenta je bila pripravljena po postopku, ki so ga opisali J. Igoleo, T.H. Dinh, A. Keib in C. Perreur, Chimie Therapeutigue 207 (1972).
-15Za karbociklične 4'-tiosladkorje in 4'-azasladkorje derivate analogov Ribavirina se lahko uporabljajo naslednji sladkorji skupaj s primernimi heterocikličnimi spojinami in derivatizirajo, kot je razloženo na shemah in v literaturi.
1. Karbociklični sladkorji so lahko pripravljeni po postopku, ki so ga opisali M. Yoshikawa, Y. Inoue, S. Yamaguchi in N. Murakami, Tetrahedron 50, 9961 (1994); L. Agrofoglio, E. Suhas, A. Parese, R. Condom, S.R. Challand, R.A. Earl in R. Guedj, Tetrahedron 50,10611 (1994).
2. 4-azosladkor je pripravljen po postopku, ki so ga opisali E.J. Reist, D.E. Gueffroy in L. Goodman, J. Am. Chem. Soc. 87, 677 (1965).
3. 4-tio-D-ribofuranoza je pripravljena po postopku, ki sta ga opisala M. Hobek in R.L. VVhistler, v knjigi: Methods in Carbohydrate Chemistry, vol. 1,292 (1962).
Dokazi vpliva analogov Ribavirina pri moduliranju Th1 in Th2 citokinov so prikazani na sliki 7 in v naslednji tabeli. Testi, ki šo tukaj objavljeni, obsegajo kratek seznam 35 analogov Ribavirina, ki so bili testirani, in vsi testi so bili ponovljeni trikrat. Na splošno je moč videti, da testirane spojine lahko uvrstimo v tri glavne skupine komponent, kot so: (1) ICN 1369 in ICN3844, ki zavreta IFNY, IL-2, IL-4, IL-5 in TNFa; (2) Ribavirin, ki vspodbudi IL-2 in TNFa in zavre IL-4 in IL-5; in (3) ICN6242, ICN3839 in ICN3531, ki vspodbudijo IL-2 in IFNY in zavrejo IL-4 in IL-5. Imenovane aktivnosti so potencijalno koristile pri indikacijah, pri katerih bi modulacija citokinov primerno vplivala na imunski odziv.
-16TABELA 2
Koncentracija celic na vdolbino 2 χ 106 x 24 = 48 χ 106 v 48 ml (celotni volumen vsake vdolbine je 2 ml)
1 2 3 4 5 6
A medij PMA ICN PMA ICN PMA ICN ΙΟμΜ 1369 PMA ICN 5μΜ 1369 PMA ICN 2μΜ 1369
B PMA ICN ΙΟμΜ 3438 PMA ICN 5μΜ3438 PMA ICN 2μΜ3438 PMA ICN ΙΟμΜ 3844 PMA ICN 5μΜ 3844 PMA ICN 2μΜ 3844
C PMA ICN ΙΟμΜ 4625 PMA ICN 5μΜ4625 PMA ICN 2μΜ4625 PMA ICN ΙΟμΜ 5531 PMA ICN 5μΜ5531 PMA ICN 2μΜ5531
D PMA ICN ΙΟμΜ 5676 PMA ICN 5μΜ 5676 PMA ICN 2μΜ 5676 PMA ICN ΙΟμΜ 5839 PMA ICN 5μΜ 5839 PMA ICN 2μΜ 5839
Koncentracija celic na vdolbino 2 χ 106 x 24 = 48 χ 106 v 48 ml (celotni volumen vsake vdolbine je 2 ml)
1 2 3 4 5 6
A PMA ΡΙΜΑ PMA PMA PMA PMA
ICN ICN ICN ICN ICN ICN
ΙΟμΜ 6242 5μΜ6242 2μΜ6242 ΙΟμΜ 11808 5μΜ 11808 2μΜ 11808
A PMA PMA PMA PMA PMA PMA
ICN ICN. ICN ICN ICN ICN
ΙΟμΜ 12204 5μΜ 12204 2μΜ 12204 ΙΟμΜ RIB 5μΜΙ<ΙΒ 2μΜΚΙΒ
Ribavirin in analogi Ribavirina so se pokazali kot učinkoviti pri spreminjanju ekspresije limfokinov pri aktiviranih T celicah. Medtem ko so bili opisani podatki in uporabnost izuma, je strokovnjakom jasno, da so možna odstopanja in modifikacije ne da bi se oddaljili od inventivnega koncepta imenovanega tukaj. Izum naj zaradi tega ne bil omejen razen v duhu navedenih zahtdvkov.

Claims (15)

  1. PATENTNI ZAHTEVKI
    1. Metoda inverzne modulacije Thl in Th2 odziva v aktiviranih limfocitih T, ki so v sistemu, z dodakom Ribavirina limfocitom v koncentraciji, ki poveča Thl odziv in zniža Th2 odziv.
  2. 2. Metoda po zahtevku 1, označena s tem, da je predhodno povišan Th2 odziv zaradi antigenov, infekcije s črevesnimi glistami ali protiteles.
  3. 3. Metoda inhibicije virusov z gojenjem virusov v sistemu, ki vsebuje limfocite, ki producirajo odziv Thl in Th2 citokinov, dodatkom Ribavirina sistemu v koncentraciji, ki poveča Thl odziv in zniža Th2 odziv.
  4. 4. Metoda po zahtevku 3, označena s tem, da se med viruse prišteva hepatitis C virus.
  5. 5. Metoda po katerem koli zahtevku od 1 do 4, označena s tem, da količina dodanega Ribavirina zagotavlja koncentracijo od okoli 0.25 do 12.5 μΜ v mediju, ki podpira aktivirane limfocite T.
  6. 6. Metoda po katerem koli zahtevku od 1 do 5, označena s tem, da vključuje dodatek interferona alfa k aktiviranim limfocitom T.
  7. 7. Uporaba Ribavirina pri izdelavi farmacevtske kompozicije za zdravljenje človeškega obolenja, označenega s profilom citokinov, pri katerem je znižan Thl odziv in povišan Th2 odziv, in je Ribavirin uporabljen v količini, ki poveča Thl odziv in zmanjša Th2 odziv.
  8. 8. Uporaba po zahtevku 7, označena s tem, da je obolenje virusno.
  9. 9. Uporaba po zahtevku 7, označena s tem, da je obolenje nevirusno.
  10. 10. Uporaba po zahtevku 7, označena s tem, da obolenja vključujejo alergijo, avtoimuno bolezen, infekcijo povzročeno s črevesnimi glistami ali bolezen povzročeno s protozoji iz rodu Leishmania.
  11. 11. Uporaba Ribavirina po zahtevku 7, označena s tem, da obolenje vključuje virusno komponento in nevirusno komponento in je za nevirusno komponento značilno, da zniža Thl nivo in poviša Th2 nivo v aktiviranih T limfocitih, in je Ribavirin uporabljen v količini, ki poveča Thl odziv in zmanjša Th2 odziv.
  12. 12. Uporaba po zahtevku 11, označena s tem, da se med bolezni vključuje primarno imunološko deficienco in sekundarno imunološko deficienco.
  13. 13. Uporaba po zahtevku 11, označena s tem, da virusna komponenta vključuje človeški virus imunološke deficience.
  14. 14. Uporaba po katerem koli zahtevku od 7 do 13, označena s tem, da je Ribavirin uporabljen v količini, ki doseže pri pacientu krvni serumski nivo od 0.25 do 12.5 μΜ
    Ribavirina.
  15. 15. Uporaba Ribavirina po katerem koli zahtevku od 7 do 14, označena s tem, da je Ribavirin uporabljen v dozirnem območju 4.5 mg/kg pacientove telesne teže na dan.
SI9720013A 1996-01-23 1997-01-21 Uravnavanje ekspresije citokinov TH1/TH2 z ribavirinom in z analogi ribavirina v aktiviranih T-limfocitih SI9720013A (sl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/590,449 US5767097A (en) 1996-01-23 1996-01-23 Specific modulation of Th1/Th2 cytokine expression by ribavirin in activated T-lymphocytes
US3609497P 1997-01-17 1997-01-17
PCT/US1997/000600 WO1997026883A1 (en) 1996-01-23 1997-01-21 Modulation of th1/th2 cytokine expression by ribavirin® and ribavirin® analogs in activated t-lymphocytes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SI9720013A true SI9720013A (sl) 1999-06-30

Family

ID=26712784

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI9720013A SI9720013A (sl) 1996-01-23 1997-01-21 Uravnavanje ekspresije citokinov TH1/TH2 z ribavirinom in z analogi ribavirina v aktiviranih T-limfocitih

Country Status (21)

Country Link
EP (1) EP0879056B1 (sl)
KR (1) KR100298158B1 (sl)
CN (1) CN1190198C (sl)
AT (1) ATE216886T1 (sl)
BR (1) BR9707154A (sl)
CA (1) CA2246162C (sl)
CZ (1) CZ293584B6 (sl)
DE (1) DE69712316T2 (sl)
DK (1) DK0879056T3 (sl)
ES (1) ES2172764T3 (sl)
HU (1) HU220105B (sl)
IL (1) IL125088A0 (sl)
NO (1) NO983372L (sl)
NZ (1) NZ330784A (sl)
PL (1) PL187439B1 (sl)
PT (1) PT879056E (sl)
RU (1) RU2186569C2 (sl)
SI (1) SI9720013A (sl)
SK (1) SK283342B6 (sl)
UA (1) UA46815C2 (sl)
WO (1) WO1997026883A1 (sl)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1302474A1 (en) * 1996-10-16 2003-04-16 Ribapharm, Inc. Monocyclic L-nucleosides, analogs and uses thereof
KR100518903B1 (ko) 1996-10-25 2005-10-06 미네소타 마이닝 앤드 매뉴팩춰링 캄파니 Ｔｈ2 매개 질병 및 관련 질병의 치료용 면역 반응 조절 화합물
KR20020023939A (ko) * 1999-01-29 2002-03-29 와트 씨 데이빗, 해리 에이 루스제 리바비린에 의해 면역 반응을 조절하는 방법
US6455508B1 (en) * 2000-02-15 2002-09-24 Kanda S. Ramasamy Methods for treating diseases with tirazole and pyrrolo-pyrimidine ribofuranosyl nucleosides
US7638496B2 (en) 2000-02-15 2009-12-29 Valeant Pharmaceuticals North America Nucleoside analogs with carboxamidine modified monocyclic base
US6680059B2 (en) 2000-08-29 2004-01-20 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
RU2286172C2 (ru) 2000-08-17 2006-10-27 Трипеп Аб Вакцины, содержащие рибавирин, и способы их использования
WO2002014362A2 (en) * 2000-08-17 2002-02-21 Tripep Ab A hepatitis c virus non-structural ns3/4a fusion gene
US7022830B2 (en) 2000-08-17 2006-04-04 Tripep Ab Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
ATE447967T1 (de) 2001-09-14 2009-11-15 Cytos Biotechnology Ag Verpackung von immunstimulierendem cpg in virusähnlichen partikeln: herstellungsverfahren und verwendung
MXPA05010419A (es) * 2003-03-28 2006-05-31 Pharmasset Inc Compuestos para el tratamiento de infecciones por flaviviridae.
US20050182252A1 (en) 2004-02-13 2005-08-18 Reddy K. R. Novel 2'-C-methyl nucleoside derivatives
EP1973608A1 (en) 2005-12-14 2008-10-01 Cytos Biotechnology AG Immunostimulatory nucleic acid packaged particles for the treatment of hypersensitivity
RU2498813C2 (ru) * 2006-03-09 2013-11-20 Ом Фарма Иммуномодуляторные соединения и лечение заболеваний, связанных со сверхпродукцией воспалительных цитокинов
DK2032592T3 (da) 2006-06-12 2013-09-02 Cytos Biotechnology Ag Fremgangsmåder til pakning af oligonukleotider til virus-lignende partikler af rna-bakteriofager
EP2185195A2 (en) 2007-08-16 2010-05-19 Tripep Ab Immunogen platform
US9073960B2 (en) 2011-12-22 2015-07-07 Alios Biopharma, Inc. Substituted nucleosides, nucleotides and analogs thereof
USRE48171E1 (en) 2012-03-21 2020-08-25 Janssen Biopharma, Inc. Substituted nucleosides, nucleotides and analogs thereof
US9441007B2 (en) 2012-03-21 2016-09-13 Alios Biopharma, Inc. Substituted nucleosides, nucleotides and analogs thereof
EP2861611B1 (en) 2012-05-25 2016-07-13 Janssen Sciences Ireland UC Uracyl spirooxetane nucleosides
WO2014100505A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Alios Biopharma, Inc. Substituted nucleosides, nucleotides and analogs thereof
TW201524990A (zh) 2013-10-11 2015-07-01 Alios Biopharma Inc 經取代之核苷、核苷酸及其類似物
AU2015259053B2 (en) 2014-05-16 2020-12-24 Amgen Inc. Assay for detecting Th1 and Th2 cell populations

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06507404A (ja) * 1991-05-01 1994-08-25 ヘンリー　エム．ジャクソン　ファウンデイション　フォー　ザ　アドバンスメント　オブ　ミリタリー　メディスン 感染性の呼吸性疾患の治療方法

Also Published As

Publication number Publication date
NO983372L (no) 1998-09-21
CZ293584B6 (cs) 2004-06-16
RU2186569C2 (ru) 2002-08-10
HUP9900681A2 (hu) 1999-07-28
CA2246162A1 (en) 1997-07-31
WO1997026883A1 (en) 1997-07-31
KR19990081930A (ko) 1999-11-15
KR100298158B1 (ko) 2001-09-06
NZ330784A (en) 1999-02-25
PL328003A1 (en) 1999-01-04
SK283342B6 (sk) 2003-06-03
ATE216886T1 (de) 2002-05-15
AU1747897A (en) 1997-08-20
NO983372D0 (no) 1998-07-22
CZ232998A3 (cs) 1999-04-14
HUP9900681A3 (en) 1999-12-28
HU220105B (hu) 2001-10-28
PT879056E (pt) 2002-10-31
UA46815C2 (uk) 2002-06-17
CA2246162C (en) 2000-04-04
PL187439B1 (pl) 2004-07-30
DK0879056T3 (da) 2002-08-19
CN1209747A (zh) 1999-03-03
BR9707154A (pt) 1999-05-25
AU700642B2 (en) 1999-01-14
DE69712316T2 (de) 2003-01-02
EP0879056A1 (en) 1998-11-25
CN1190198C (zh) 2005-02-23
EP0879056A4 (en) 1999-01-13
SK100498A3 (en) 2001-03-12
DE69712316D1 (en) 2002-06-06
IL125088A0 (en) 1999-01-26
ES2172764T3 (es) 2002-10-01
EP0879056B1 (en) 2002-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SI9720013A (sl) Uravnavanje ekspresije citokinov TH1/TH2 z ribavirinom in z analogi ribavirina v aktiviranih T-limfocitih
Seko et al. Expression of cytokine mRNAs in murine hearts with acute myocarditis caused by coxsackievirus b3
Comarmond et al. Direct-acting antiviral therapy restores immune tolerance to patients with hepatitis C virus–induced cryoglobulinemia vasculitis
US5767097A (en) Specific modulation of Th1/Th2 cytokine expression by ribavirin in activated T-lymphocytes
Farrar et al. Cancer dormancy. VII. A regulatory role for CD8+ T cells and IFN-γ in establishing and maintaining the tumor-dormant state
US6150337A (en) Specific modulation of Th1/Th2 cytokine expression by Ribavirin in activated T-lymphocytes
Casey et al. IL-21 promotes differentiation of naive CD8 T cells to a unique effector phenotype
Faunce et al. Acute ethanol exposure prior to thermal injury results in decreased T-cell responses mediated in part by increased production of IL-6
Hermann et al. IFN-α priming of human monocytes differentially regulates gram-positive and gram-negative bacteria-induced IL-10 release and selectively enhances IL-12p70, CD80, and MHC class I expression
Lapenta et al. Type I interferon is a powerful inhibitor of in vivo HIV-1 infection and preserves human CD4+ T cells from virus-induced depletion in SCID mice transplanted with human cells
Hosmalin et al. Type I interferon production in HIV-infected patients
Lehner et al. The emerging role of innate immunity in protection against HIV-1 infection
JP2008133293A (ja) 活性化ｔリンパ球におけるリバビリン及びリバビリン類似体によるｔｈ１型／ｔｈ２型サイトカインの発現の調節
JP2000500503A (ja) 活性化ｔリンパ球におけるリバビリン及びリバビリン類似体によるｔｈ１型／ｔｈ２型サイトカインの発現の調節
US20030212015A1 (en) Specific modulation of Th1/Th2 cytokine expression by ribavirin in activated T-lymphocytes
Turano et al. The role of human autoantibodies against γ-interferon
Shannon et al. Thalidomide can costimulate or suppress CD4+ cells' ability to incorporate [H3]-thymidine—dependence on the primary stimulant
AU700642C (en) Modulation of TH1/TH2 cytokine expression by ribavirin and ribavirin analogs in activated T-lymphocytes
WO1993002692A1 (en) Method of combatting hiv infections
EP1174141A2 (en) Modulation of TH1/TH2 cytokine expression by ribavirin and ribavirin analogs in activated t-lymphocytes
Saharan Paradigm shift in discovery & secretion of Biosimilars via path breaking innovation
COOK The Mechanism of Induction of Interferon Gamma Synthesis by Human Thymocytes
Vyakarnam Immunological Actions
TW201803567A (zh) 新穎免疫賦活化劑
Herman A study of natural killer cells

Legal Events

Date Code Title Description
IF Valid on the event date
KO00 Lapse of patent

Effective date: 20080725