JP2000500503A

JP2000500503A - 活性化ｔリンパ球におけるリバビリン及びリバビリン類似体によるｔｈ１型／ｔｈ２型サイトカインの発現の調節

Info

Publication number: JP2000500503A
Application number: JP9-526907A
Authority: JP
Inventors: タム，ロバート; ラマサミー，カンダサミー; アベレツト，デブロン
Original assignee: アイ・シー・エヌ・フアーマシユーテイカルズ・インコーポレイテツド
Priority date: 1997-01-14
Filing date: 1997-01-21
Publication date: 2000-01-18
Anticipated expiration: 2017-01-21

Abstract

(57)【要約】リバビリンは、活性化Ｔ細胞におけるリンホカインの発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。特に、リバビリンは、Ｔｈ２媒介性Ｔ細胞応答の抑制及びＴｈ１媒介性Ｔ細胞応答の促進に用いる。本発明の他の態様において、１種以上のリバビリン類似体は、活性化Ｔ細胞におけるリンホカインの発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。該リバビリン類似体は、Ｔｈ１又はＴｈ２媒介性Ｔ細胞応答の抑制又は促進に用い得る。

Description

【発明の詳細な説明】活性化Ｔリンパ球におけるリバビリン及びリバビリン類似体によるＴＨ１型／ＴＨ２型サイトカインの発現の調節発明の分野本発明の分野は免疫学である。発明の背景リンホカインは、サイトカインファミリーに属する一群のポリペプチド、即ち、種々の細胞機能に影響を与え得且つ異なる細胞間の情報伝達を可能にするホルモン様分子である。近年の研究により、免疫応答におけるリンホカインの役割の解明が進められた。ヘルパーＣＤ４⁺（及びＣＤ８⁺）Ｔ細胞により産生されるリンホカインは、マウス系の場合もヒト系の場合も、２種の表現型、Ｔｈ１及びＴｈ２のどちらかに属する場合が多い〔Ｒｏｍａｇｎａｎｉ，１９９１，ＩｍｍｕｎｏｌＴｏｄａｙ１２：２５６−２５７，Ｍｏｓｍａｎｎ，１９８９，ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，７：１４５−１７３〕。Ｔｈ１型細胞は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生し、主として遅延型過敏症などの細胞性免疫に関与する。Ｔｈ２型細胞は、インターロイキン類、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を産生し、主としてＩｇＥ及びＩｇＧ４抗体アイソタイプスイッチングなどの体液性免疫応答の促進に関与する（Ｍｏｓｍａｎｎ，１９８９，ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，７：１４５−１７３）。強度に分極したＴｈ１型及びＴｈ２型応答は、保護において異なる役割を果たすだけでなく、異なる免疫病理学的反応を促進し得る。Ｔｈ１型応答は、実験的自己免疫型ぶどう膜網膜炎（Ｄｕｂｅｙら，１９９１，ＥｕｒＣｙｔｏｋｉｎｅＮｅｔｗｏｒｋ２：１４７−１５２）、実験的自己免疫型脳炎（ＥＡＥ）（Ｂｅｒａｕｄら，１９９１，ＣｅｌｌＩｍｍｕｎｏｌ１３３：３７９− ３８９）及ひインスリン依存性糖尿病（Ｈａｈｎら，１９８７，ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ１８：２０３７−２０４２）などの器官特異的自己免疫状態や、接触性皮膚炎（Ｋａｐｓｅｎｂｅｒｇら，ＩｍｍｕｎｏｌＴｏｄａｙ１２：３９２−３９５）及びある種の慢性炎症性疾患に関与する。それに対し、Ｔｈ２型応答は、（一般的な環境性アレルゲンに対する）アレルギー性アトピー性疾患、例えば、アレルギー性喘息（Ｗａｌｋｅｒら，１９９２，ＡｍＲｅｖＲｅｓｐＤｉｓ１４８：１０９−１１５）及びアトピー性皮膚炎（ｖａｎｄｅｒＨｅｉｊｄｅｎら，１９９１，ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍ９７：３８９−３９４）の誘発に関与し、ぜん虫（Ｆｉｎｋｅｌｍａｎら，１９９１，ＩｍｍｕｎｏｐａｒａｓｉｔｏｌＴｏｄａｙ１２：Ａ６２−６６）やＬｅｉｓｈｍａｎｉａｍａｊｏｒ（Ｃａｃｅｒｅｓ−Ｄｉｔｔｍａｒら，１９９３，ＣｌｉｎＥｘｐＩｍｍｕｎｏｌ９１：５００−５０５）などの組織寄生原虫類感染症を悪化させると考えられ、高ＩｇＥ症候群（ＤｅｌＰｒｅｔｅら，１９８９，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ８４：１８３０−１８３５）及びＯｍｅｎｎＯｓ症候群（Ｓｃｈａｎｄｅｎｅら，１９９３，ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ２３：５６−６０）などの特定の原発性免疫不全において選択的に誘発され、高ＩｇＥ症候群（ＤｅｌＰｒｅｔｅら，１９８９，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ８４：１８３０−１８３５）及びＯｍｅｎｎＯｓ症候群（Ｓｃｈａｎｄｅｎｅら，１９９３，ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ２３：５６−６０）の低下に関連し、ＨＩＶ複製抑制能（Ｂａｒｋｅｒら，１９９５，ＰｒｏｃＳｏｃＮａｔＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９２：１１１３５−１１１３９）の低下に関連する。従って、上記疾患状態のリンホカインプロフィールを調節することが治療上有用なことは明らかである。恐らく、Ｔｈ１型応答を促進するとＴｈ２表現型が抑制され、Ｔｈ２型応答を促進するとＴｈ１表現型が抑制されるであろう。リンホカインに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、リンホカイン自体及び他の作用物質例えばチオール酸化防止剤（Ｊｅａｎｎｉｎら，１９９５，ＪＥｘｐＭｅｄ１８２１７８５−１７９２）は、疾患促進サイトカインパターン、Ｔｈ１又はＴｈ２のいずれかを阻害することにより特定の疾患の病因を逆転させることが証明されている。例えば、細胞内原虫感染症は、ＩＦＮγにより抑制され、ＩＬ−４により悪化するが、線虫感染症は、ＩＬ−４により抑制され、ＩＦＮγ により悪化する（Ｈｅｉｎｚｅｌら，１９８９，ＪＥｘｐＭｅｄ１６２：５９−７２，Ｅｌｓｅら，１９９４，ＪＥｘｐＭｅｄ１７９：３４７−３５１）。ＮＯＤマウスのインスリン依存性糖尿病や、マウス及びラットのＥＡＥは、該疾患が発症する前にＩＬ−４又は抗ＩＦＮγ ｍＡｂで治療すると改善され得る（Ｒａｐｏｐｏｒｔら，１９９３，ＪＥｘｐＭｅｄ１７８：８７−９９，Ｒａｃｋｅら，１９９４，ＪＥｘｐＭｅｄ１８０：１９６１−１９６６，Ｃａｍｐｂｅｌｌら，１９９１，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ８７：７３９−７４２）。また、全身性エリテマトーデス様症候群を特徴とする自己免疫移植片対宿主症（ＧＶＨＤ）は、Ｔｈ２型リンホカインの産生に関連し、抗ＩＬ−４抗体によって阻害される（Ｕｍｌａｎｄら，１９９２，ＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ６３：６６−７３）。一方、Ｔｈ１型サイトカインは、ドナーＣＤ８⁺Ｔ細胞がＣＴＬになり、宿主の免疫系を破壊する急性ＧＶＨＤにおいて産生される。抗ＩＦＮ γ又は抗ＴＮＦα ｍＡｂで治療すると疾患が改善され、抗ＩＬ−２ｍＡｂで治療すると急性ＧＶＨＤが自己免疫型ＧＶＨＤに変化する（Ｖｉａ及びＦｉｎｋｅｌｍａｎ，１９９３，ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｌ５：５６５−５７２）。１９８３年以来、ＨＩＶ感染患者の治療において天然及び組換えＩＬ−２の臨床実験が進められている（Ｖｏｌｂｅｒｄｉｎｇら，１９８７，ＡＩＤＳＲｅｓＨｕｍＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，３：１１５−１２４）。この場合、両者の関係は、ＡＩＤＳの発症が産生されるリンホカインのパターン変化に関連すると報告されたことに由来する（Ｃｌｅｒｉｃｉ及びＳｈｅａｒｅｒ，１９９４，ＩｍｍｕｎｏｌＴｏｄａｙ１５：５７５−５８１）。発症に向かって進行している感染患者では、ＩＬ −２などのＴｈ１型リンホカインの発現が経時的に低下する（Ｍａｇｇｉら，１９８７，ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ１７：１６８５−１６９０，Ｇｒｕｔｅｒｓら，１９９０，ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ２０：１０３９−１０４４，Ｃｌｅｒｉｃｉら，１９９３，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ９１：７５９−７６５）と同時に、ＩＬ−４及びＩＬ−１０などのＴｈ２型リンホカインの産生が増大する（Ｃｌｅｒｉｃｉら，１９９４，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ９３：７６８−７７５，Ｈｏｆｆｍａｎら，１９８５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１４７：３２６−３３５）。ＩＬ−２で治療した非症候性又は長期生存患者由来のＴ細胞は、その抗ＨＩＶ活性が増強されていたが、ＩＬ−４又はＩＬ−１０に暴露すると、そのＨＩＶ複製抑制能及びＩＬ−２産生能が低下した（Ｂａｒｋｅｒら，１９９５，ＰｒｏｃＳｏｃＮａｔＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９２：１１１３５−１１１３９）。しかし、現在使用されているこれらの免疫調節治療薬（ｍＡｂ及び組換えサイトカイン）には限界がある。例えば、長期間モノクローナル抗体を用いて治療を行うと、宿主動物にモノクローナル抗体に対する抗体ができ、そのためにモノクローナル抗体の有用性が制限される。ｍＡｂに対する免疫応答の誘発というリスクを明らかに低減させる「人化」（humanized）モノクローナル抗体が開発された。しかし、該抗体はまだ開発途上であり、その上、これら新規なｍＡｂは依然、巨大タンパク質であり、従って、標的部位への到達が難しい可能性がある。サイトカインをベースとする治療薬にも限界がある。例えば、マウスでは、自己免疫型ＧＶＨＤをＩＬ−１２で治療すると急性ＧＶＨＤが発症する。リバビリン（１−ｂ−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３− カルボキサミド）は、ＲＮＡ及びＤＮＡウイルスの複製を阻害し得る合成ヌクレオシドである（Ｈｕｆｆｍａｎら，１９７３，ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ３：２３５，Ｓｉｄｗｅｌｌら，１９７２，Ｓｃｉｅｎｃｅ１７７：７０５）。本発明者は、リバビリンが、その抗ウイルス活性に加えて、特定の免疫応答に作用することを示唆した他の人々の所見を確認した（Ｊｏｌｌｅｙ及びＳｕｃｈｉｌ，１９８４，ＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＲｉｂａｖｉｒｉｎ：９３−９６ページを再検討した）。本発明者はさらに、リバビリンがマイトジェン及び抗原活性化Ｔ及びＢリンパ球の増殖に影響を与え〔Ｔａｍら、１９９５（データ示さず），Ｐｅａｖｙら，１９８０，ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ２９：５８３−５８９〕、さらに、リバビリンは、シクロスポリンと組み合わせると、長期の同種移植生存に効力を示す（Ｊｅｌｌｅｙら，１９８８，ＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎＰｒｏｃ２０：７０３−７０６）という他の人々の所見を確認した。また、本発明者は、リバビリンが、Ｔｈ１型応答を促進し且つＴｈ２型応答を抑制することにより、少なくとも部分的に免疫応答のサイトカインパターンを調節することを証明することにより従来の研究を著しく進展させた。この発見は従来の研究と矛盾しないと洞察される。先ず第１に、リバビリンが機能性体液性免疫応答（Ｐｅａｖｙら，１９８１，ＪＩｍｍｕｎｏｌ１２６：８６１−８６４，Ｐｏｗｅｒｓら，１９８２，ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ２２：１０８−１１４）及び肥満細胞分泌のＩｇＥ媒介性調節（Ｍａｒｑｕａｒｄｔら，１９８７，ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＥｘｐＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ２４０：１４５− １４９）（いずれもＴｈ２型リンホカイン媒介性事象である）のどちらをも阻害することは公知である。第２に、リバビリンは、ＨＩＶ患者由来の末梢血リンパ球においてアジドチミジン（ＡＺＴ）の抗ウイルス作用を拮抗する（Ｖｏｇｔら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５：１３７６−１３７９）。この知見は重要である。というのは、ＡＺＴはＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）の発現を低下させるがＩＬ−２の発現は低下させないからである（Ｖｉｏｒａ及びＣａｍｐｏｎｅｓｃｈｉ，１９９５，ＣｅｌｌＩｍｍｕｎｏｌ１６３：２８９−２９５）。従って、リバビリンが、ＩＬ−２の発現を調節し且つ低下したＩＬ−２Ｒレベルを上昇させることによりＡＺＴを拮抗することは可能である。第３に、慢性ＧＶＨＤ（Ｔｈ２媒介性疾患）を有する免疫減弱患者をリバビリンで治療すると該疾患が驚異的に消散するが、これは、シクロスポリンやグルココルチコイドなどの従来の免疫抑制療法では起こらなかったことである（Ｃａｓｓａｎｏ，１９９１，ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ７：２４７−２４８）。最後に、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）患者をリバビリンで（１年間）治療すると、プラシーボ対照群に比べ、リンパ球の凝集率が低下し且つ肝損傷率がはるかに低下することが判明した（Ｄｕｓｈｅｉｋｏら，１９９４，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２０：２０６Ａ）。この所見は、Ｃ型肝炎に対する主要免疫応答はＴｈ１型リンホカインにより媒介されるが、Ｔｈ０／Ｔｈ２表現型のＴ細胞はＨＣＶを介して感染し得る（Ｚｉｇｎｅｇｏら，１９９４，未公開データ）ことを表し得、この感染は肝細胞のさらなる抗体媒介性破壊を誘発し得る。図面の簡単な説明表１は、ヒトＴ細胞の刺激４８及び７２時間後の上清中で測定したリンホカイン、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦα及びＩＦＮγの休止レベルとＰＭＡ／イオノマイシン（ionomycin）活性化レベル（ｐｇ／ｍｌ）、並びにＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）及びＩＬ−４受容体（ＩＬ−４Ｒ）の細胞表面発現（平均チャンネル蛍光強度）を表す。図１は、ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦα及びＩＦＮγの細胞外発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。結果を、ＰＭＡ／イオノマイシン処理のみを行った後のリンホカイン発現に対する増大率（％）として表す。図２は、ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２（Ａ及びＣ）及びＩＬ−４（Ｂ及びＤ）の細胞外発現に及ぼす、２，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαの存在下の２、１０又は５０ｍＭのリバビリンの作用（左側パネル）と、１０ｍＭのリバビリンの存在下の５００、１，０００又は２，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαの作用（右側パネル）を表すグラフである。図３は、ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮγのｍＲＮＡの発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。図４は、ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化したＴリンパ球におけるＩＬ−２及びＩＬ−４受容体の細胞表面発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。結果を、ＰＭＡ／イオノマイシン処理のみを行った後のリンホカイン受容孫発現に対する増大率（％）として表す。図５は、休止Ｔ細胞（Ａ及びＥ）、あるいはＰＭＡ／イオノマイシンのみで処理する（Ｂ及びＦ）か又はＰＭＡ／イオノマイシン処理を１０ｍＭのリバビリンの存在下（Ｃ及びＧ）若しくは５，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαの存在下（Ｄ及びＨ）に行った活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞（上部パネル）若しくはＣＤ８⁺Ｔ細胞（下部パネル）における細胞内ＩＬ−２の発現を表すグラフである。１回の実験から得られたデータを示し、ＩＬ−２とＣＤ４又はＣＤ８の二重ポジティブ染色を示す細胞の百分率として表わす。図６は、企図されるリバビリン類似体を表すグラフである。図７は、ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−４及びＩＬ−５に対する種々の濃度のリバビリン類似体の結果を示すグラフを集めたものである。発明の要旨本発明の１つの態様によれば、リバビリン（ヌクレオシド）を、活性化Ｔ細胞におけるリンホカイン発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。特に、リバビリンは、Ｔｈ２媒介性Ｔ細胞応答の抑制及びＴｈ１媒介性Ｔ細胞応答の促進に用いる。従って、本発明では、リバビリンをその抗ウイルス剤としての十分に認識された役割で投与する代わりに、リンホカイン発現の平衡異常の治療に用いる。そのような平衡異常は、アレルギー性喘息やアトピー性皮膚炎などのアレルギー性アトピー性疾患、ぜん虫感染症及びリーシュマニア症、並びにウイルス感染に関連し得るものも関連しないと考えられるものも含めた種々の原発性及び続発性免疫不全に付随するものとして見出され得る。本発明の他の態様によれば、１種以上のリバビリン類似体を、活性化Ｔ細胞におけるリンホカイン発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。リバビリン類似体は、Ｔｈ１又はＴｈ２媒介性Ｔ細胞応答の抑制又は促進に用い得る。発明の詳細な説明好ましい実施態様において、リバビリンは、平均して０．２５〜１２．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２．５ｍｇ／ｍｌの血清レベルが得られる投薬量で患者に経口投与する。典型的な個体では、最適な血清レベルは、１日につき体重１ｋｇ当たり約４．５ｍｇであり、都合２００〜１，２００ｍｇの投薬量で投与し得る。１日当たりの投薬量を何回分かに分割して投与するのが好ましい。リバビリンは数年前から市販されているので、多くの剤形や投与経路が公知となっており、そのうちの適切なものを利用することができる。例えば、リバビリンは、経口投与以外にも、公知のように、静脈内、筋肉内、腹腔内に、局所投与したりすることができる。リバビリンを含む医薬組成物は、１種以上の医薬上許容し得る担体をさらに含み得、該担体は、（長期貯蔵用の）安定剤、乳化剤、結合剤、増粘剤、塩、保存剤、溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含み得る。医薬活性物質としてのそのような媒質及び作用物質の使用は当業界では周知である。従来の媒質又は作用物質は、リバビリンに不適合である場合を除いて、治療用組成物及び製剤に用いられる。組成物や製剤に補助有効成分を混和してもよい。リバビリンは、本発明において企図されている治療用としての用途に加えて、吸収、分配、細胞取込み及び効力に関する研究の実験用ツールとしても用い得る。さらに、今まで活性が極めて低いとして用いられていなかった（既知又は未知の）数種のヴァイラゾール類似体も有意なサイトカイン活性を有することが見出された。本発明者が調べたところ、そのような活性を有するヴァイラゾール類似体は数種存在し、以下の「リバビリン類似体」というタイトルの下にその実施例が示されている。これらの実施例は、活性組成物を得るためにヴァイラゾールを修飾し得る位置を特定することを目的とし、従ってこの開示は、示されている特定の修飾に限定されるものではない。さらに、これらの修飾は、標準的なＤ型ヴァイラゾールにも、Ｌ型ヴァイラゾールにも適用し得るように企図されている。実施例細胞系及びＴ細胞の精製健康なドナー由来の血液６０ｍｌをフィコール−ハイパック密度勾配遠心分離にかけた後、バフィーコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。次いで、Ｔ細胞に特異的なＬｙｍｐｈｏｋｗｉｋリンパ球単離試薬（ＬＫ−２５Ｔ，ＯｎｅＬａｍｂｄａ，ＣａｎｏｇａＰａｒｋ，ＣＡ）を用い、ＰＢＭＣからＴ細胞を精製した。次いで、平均収量４０〜６０×１０⁶個のＴ細胞を、２０〜３０ｍｌのＲＰＭＩ−ＡＰ５〔２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４、５％の自己由来血漿、１％のＬ−グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び０．０５％の２−メルカプトエタノールを含むＰＲＭＩ−１６４０培地（ＩＣＮ，ＣｏｓｔａＭｅｓａ，ＣＡ）〕中３７℃で一晩インキュベートして、不純混合付着細胞を除去した。全ての実験において、Ｔ細胞をＲＰＭＩ−ＡＰ５で洗浄し、次いで、９６ウエルマイクロタイタープレート上に１×１０⁶細胞／ｍｌの細胞密度で平板培養した。Ｔ細胞活性化及びリバビリン処理５００ｎｇのイオノマイシン及び１０ｎｇのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を添加してＴ細胞を活性化し、３７℃で４８〜７２時間インキュベートした。ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化されたＴ細胞を、活性化直後に０．５〜５０ｍＭのリバビリン又は２５０〜１０，０００Ｕ／ｍｌの対照抗ウイルス剤、インターフェロンα（Ａｃｃｕｒａｔｅ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）で処理し、２４時間後に再処理した。各プレートからのＴ細胞を免疫蛍光法分析に用い、上清を細胞外サイトカインの測定に用いた。活性化後、細胞由来サイトカインの産生を分析するために、各マイクロプレートから細胞上清９００ｍｌを取り出し、別のマイクロプレートに移した。次いで、細胞を、免疫蛍光法による細胞内サイトカインレベル及びサイトカイン受容体の発現の分析に用いた。細胞外サイトカインの分析各マイクロプレートからの細胞上清中で細胞由来ヒトサイトカインの濃度を定量した。市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤｓｙｓｔｅｍｓＱｕａｎｔｉｋｉｎｅｋｉｔ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いるか、又はＩＬ−２依存性細胞系、ＣＴＬＬ−２（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いたバイオアッセイにかけて、活性化により誘発されたインターロイキン−２（ＩＬ−２）のレベルの変化を定量した。ＥＬＩＳＡキットを用い、活性化により誘発された、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅｋｉｔ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）（Ｅｎｄｏｇｅｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のレベルの変化を定量した。全てのＥＬＩＳＡの結果はｐｇ／ｍｌとして表し、ＣＴＬＬ−２バイオアッセイは、ＣＴＬＬ−２細胞による³Ｈ−チミジン（ＩＣＮ，ＣｏｓｔａＭｅｓａ，ＣＡ）のＩＬ−２依存性細胞取込みを表す１分当たりのカウント数として表した。直接免疫蛍光法実験（サイトカイン受容体）蛍光標識した細胞表面抗原に対する抗体で直接染色するために、細胞を生理食塩液、ｐＨ７．４（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，ＭＡ）で２回洗浄し、５０ｍｌの生理食塩液に再懸濁し、２つの試料に分割した。一方の試料アリコートをＰＥ抗ＣＤ２５／ＦＩＴＣ−抗ＣＤ４又はＰＥ−ラット抗マウスＩｇＧ＋抗ＣＤｗ１２４／ＦＩＴＣ−抗ＣＤ４ｍＡｂで同時染色し、第２のアリコートをＰＥ／ＦＩＴＣで標識したアイソタイプマッチド対照モノクローナル抗体で染色して、非特異的蛍光を評価した。蛍光標識したモノクローナル抗体は全てＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）から入手したが、抗ＣＤｗ１２４はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡから入手した。インキュベーションは、飽和ｍＡｂ濃度を用い暗所で４５分間４℃で行った。取り込まれなかった標識をＰＢＳで洗浄して除去した後、ＦＡＣＳｃａｎフロー・サイトメトリー（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。ゲートをかけた生きているＣＤ４⁺Ｔ細胞中で抗原密度を間接定量し、平均蛍光チャンネル（ＭＣＦ）として表した。特異的抗原（ＣＤｗ１２４，ＣＤ２５）の表面発現を、ＦＩＴＣ又はＰＥ標識した抗原特異的ｍＡｂ染色細胞のＭＣＦからＦＩＴＣ又はＰＥ標識したアイソタイプマッチド（ＩｇＧ１）対照ｍＡｂ染色細胞のＭＣＦを減算して得られた平均チャンネル変化（ＭＣＳ）として表した。あるいは、ＣＤ２８ｍＡｂで染色された細胞のＣＤ４⁺サブセットの表面発現を、ＣＤ２８^-ＣＤ４^-細胞のＭＣＦからＣＤ２８⁺ＣＤ４⁺のＭＣＦを減算して測定した。未処理対照とリバビリン処理細胞及びインターフェロンα処理細胞の生存能力を、生体染料、ヨウ化プロピジウム（propidium iodide）（最終濃度：５ｍｇ／ｍｌ）で染色することにより、多重ドナーの全てのオリゴヌクレオチドを有する各バッチ中で定量した。ヨウ化プロピジウムを除去した生存細胞の百分率をフロー・サイトメトリーで測定すると、用いた全ての濃度において、処理した後、＞９０％（９０〜９９％の範囲）であった。細胞内サイトカイン発現の免疫蛍光法分析ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞サブセットにおけるＩＬ−２の細胞内発現を分析するために、先ず、４８〜７２時間の活性化の最後の４時間に、Ｔ細胞を１０ｍｇのＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で処理して、新たに合成されるＩＬ−２の細胞外への分泌を最小限にした。活性化後、細胞由来サイトカインの産生を分析するために、各マイクロプレートから細胞上清９００ｍｌを取り出し、別のマイクロプレートに移した。ＦＩＴＣ標識した細胞表面抗原、ＣＤ４及びＣＤ８に対する抗体で直接染色（３０分間、４℃、暗所）する前に、細胞を生理的食塩液、ｐＨ７．４で２回洗浄し、１００〜１５０ｍｌの染色緩衝液〔１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生食液、ｐＨ７．４〕に再懸濁し、２つの試料に分割した。染色された細胞を１ｍｌの染色緩衝液で洗浄し、上清を吸引した後、細胞ペレットを１００ｍｌの固定緩衝液（ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド）に再懸濁した。固定された細胞を２０分間４ ℃に維持し、次いで、１ｍｌの染色緩衝液で洗浄し、細胞ペレットを５０ｍｌの透過性化緩衝液〔ＰＢＳ中０．１％サポニン（ＩＣＮ，ＣｏｓｔａＭｅｓａ，ＣＡ）〕に攪拌下に再懸濁した。透過性となった細胞を、暗所で３０分間４ ℃で、ＰＥ標識したＩＬ−２抗体で染色し、次いで、１ｍｌの透過性化緩衝液中で洗浄し、ＦＡＣＳ分析にかける前に２５０ｍｌの染色緩衝液に再懸濁した。サイトカインｍＲＮＡの分析商業用のグラニジウムチオシアネート／フェノール抽出剤〔Ｔｒｉｚｏｌ剤（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）〕を用い、休止Ｔ細胞、リバビリン処理Ｔ細胞及びインターフェロンα処理Ｔ細胞、並びに非処理活性化Ｔ細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを７０％エタノールで洗浄し、最後に、ＤＥＰＣ処理した水１０μｌに再懸濁した。製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｏｎ，ＷＩ）の指示に従ってｃＤＮＡ合成反応を行った。簡略的に言えば、金ＲＮＡ（１μｇ）を６５℃で１０分間加熱し、氷上で冷却してから、１０×逆転写緩衝液〔１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５００ｍＭのＫＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５ｍＭのＭｇＣｌ〕（２μｌ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ（各ｄＮＴＰ：１ｍＭ）（２μｌ）、ＲＮアーゼ阻害剤（０．５μｌ）、オリゴ（ｄＴ）₁₅ プライマー（０．５μｇ／μｇＲＮＡ）（１μｌ）及びＡＭＶ逆転写酵素（Ｈ．Ｃ．）（０．６５μｌ）と合わせた。反応混合物を４２℃で１時間次いで９５ ℃で１０分間次いで氷上で５分間インキュベートした。ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を用い、ＰＣＲ反応を行った。新しい試験管中で、ＲＴ反応混合物（３μｌ）を、１０×ＰＣＲ緩衝液〔５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１５ｍＭのＭｇＣｌ₂及び０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン〕（５μｌ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ（１μｌ）並びにＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ）と合わせた。用いたプライマーは以下の通りであった：インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターフェロンγ（ヒト）プライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）及びｐＨＥ７リボソーム遺伝子。増幅条件は、９４℃で４５秒間、５７℃で１分間、７２ ℃で２分間のサイクルを３５回、次いで、７２℃で８分間であった。臭化エチジウムを含む２％アガロースゲル上でＰＣＲ産物を分析した。電気泳動させた後、ＰＣＲ産物を２０×ＳＳＣ中で一晩かけてＨｙｂｏｎｄＮ＋メンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）に移し、０．４ＭＮａＯＨを用いて固定化した。ブロットをＲａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中４２℃で１時間、³²Ｐ−γＡＴＰ標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。（指示に従って）各サイトカインプライマーミックスを放射線標識プローブとして用いた。ｐＨＥ７センスプライマーから作製したプローブとハイブリダイズさせた後、処理量が等しいことを確認した。次いで、洗浄したブロットをＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒで分析した。活性化Ｔ細胞における細胞外サイトカインレベルに及ぼすリバビリンの作用ヒトＴ細胞をＰＭＡ／イオノマイシンで処理（４８〜７２時間）すると、分析した全てのサイトカイン、即ち、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦα、ＩＦＮγのレベルが実質的に増大した（表２）。各セルの最初の数字は算術平均を示し、括弧内の数字は関連範囲を示す。Ｎ＝４である。図１に示されている代表的な実験において、リバビリンを０．５〜５０ｍＭの用量範囲で添加すると、Ｔｈ１サイトカイン、ＩＬ−２及びＴＮＦαの活性化レベルが、それぞれ５ｍＭ（３０％）及び２０ｍＭ（３６％）で極大増大を示した。それに対し、インターフェロンαを添加すると、非処理活性化Ｔ細胞におけるレベルに比べ、ＩＬ−２及びＴＮＦαの発現が用量依存的に阻害された（２５０〜１０，０００Ｕ／ｍｌ、極大阻害率はそれぞれ３３％及び３８％）。さらに、リバビリンはＴｈ２型サイトカイン、ＩＬ−４の活性化レベルの同時低下を媒介した（２ｍＭで７４％のピーク阻害率）が、インターフェロンαは細胞外ＩＬ−４を最大で２６％増大させた（１０，０００Ｕ／ｍｌ）。図２は、リバビリンとインターフェロンαを組み合わせて用いると、２，０００Ｕ／ｍｌの定濃度のインターフェロンαは活性化ＩＬ−２レベルのリバビリン用量依存性増大を抑制し（Ａ）、活性化ＩＬ−４レベルの阻害を逆転させた（Ｃ）ことを示している。同様に、１０ｍＭの定濃度のリバビリンは、活性化ＩＬ−２レベルのインターフェロンα媒介性用量依存性阻害を逆転させ（Ｂ）、活性化ＩＬ−４レベルの増大を抑制した（Ｄ）。活性化Ｔ細胞におけるサイトカインｍＲＮＡレベルに及ぼすリバビリンの作用活性化細胞外サイトカインレベルに及ぼすリバビリンとインターフェロンαの上記対立作用は転写レベルにおいても認められた。図３は、ヒトＴ細胞をＰＭＡ／イオノマイシンで処理すると、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮγのｍＲＮＡレベルが実質的に増大することを示している。Ｔ細胞を活性化した後でリバビリン（２、５及び１０ｍＭ）で処理すると、ＩＬ−２のｍＲＮＡレベルは増大し、ＩＬ−４のｍＲＮＡレベルは低下するが、ＩＦＮγのｍＲＮＡレベルには影響がない。それに対し、１，０００、２，０００及び５，０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンαで処理すると、ＩＬ−２のｍＲＮＡレベルは低下し、ＩＬ−４のｍＲＮＡレベルは増大し、ＩＦＮγのｍＲＮＡレベルは低下する。従って、ＩＬ−２、ＴＮＦα及びＩＬ−４のｍＲＮＡの発現に及ぼすリバビリンとインターフェロン αそれぞれの用量依存性作用はＥＬＩＳＡ分析と一致した。これらのデータは、リバビリンが、活性化ヒトＴ細胞において、Ｔｈ１型サイトカイン、ＩＬ−２及びＴＮＦαの合成を促進し、Ｔｈ２型サイトカイン、ＩＬ−４の発現を阻害することを示唆している。活性化Ｔ細胞におけるＩＬ−２及びＩＬ−４受容体レベルに及ぼすリバビリンの作用ＦＡＣＳ分析を用い、活性化Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）及びＩＬ−４受容体（ＣＤｗ１２４）の発現に及ぼすリバビリンとインターフェロン αの作用を比較した。ＰＭＡ／イオノマイシンで処理すると、ＣＤ２５とＣＤｗ１２４の発現が、それぞれ５０．１６±０．４５及び６２．３１±１．４６の休止レベルから１６２．４８±２．８９及び８７．５３±３．９８の活性化レベルに増大する（ｎ＝４）。図４は、３回の実験のうち代表的なものでは、リバヒリン（１〜５０ｍＭ）はＩＬ−２及びＩＬ−４受容体の活性化レベルには殆ど作用しないが、インターフェロンαは、２５０〜１０，０００Ｕ／ｍｌの用量範囲で、対照活性化Ｔ細胞における受容体レベルに比べ、用量依存的にＩＬ−２受容体の発現を低下させ且つＩＬ−４受容体の発現を増大させたことを示している。従って、これらのデータは、サイトカイン合成に及ぼすリバビリンの作用は、サイトカイン受容体の発現とは独立に作用することを示している。それに対し、ＩＬ −２及ひＩＬ−４受容体に及ぼすインターフェロンα処理の作用は、活性化ＩＬ −２及びＩＬ−４発現に及ぼすインターフェロンαの作用と相関関係にある。活性化Ｔ細胞のＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺サブセットにおける細胞内ＩＬ−２レベルに及ぼすリバビリンの作用ＩＬ−２発現に及ぼすリバビリンの作用がＣＤ４⁺Ｔ細胞とＣＤ８⁺Ｔ細胞のどちらかに特異的であるかを調べた。固定され且つ透過性化された活性化Ｔ細胞における細胞内ＩＬ−２の発現を、蛍光標識したＣＤ４又はＣＤ８抗体及びＩＬ− ２抗体を用い、２色フロー・サイトメトリーにより定量した。図５は、１０ｍＭのリバビリンで処理した後では、ＩＬ−２を発現しているＣＤ４⁺Ｔ細胞は８２％から９１％に増大し、ＩＬ−２を発現しているＣＤ８⁺Ｔ細胞は８１％から９１％に増大したことを示している。対照的に、インターフェロンα（５，０００Ｕ／ｍｌ）で処理した後では、ＩＬ−２を発現しているＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞は、それぞれ８１％と７１％であった。これらのデータは、リバビリンが、ＣＤ４⁺Ｔ細胞サブセットとＣＤ８⁺Ｔ細胞サブセットとを区別せずに細胞内ＩＬ− ２発現に作用を及ぼすことを示している。それに対し、インターフェロンαによる処理は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞には殆どを作用を及ぼさず、しかも、ＣＤ８⁺Ｔ細胞サブセットではＩＬ−２の発現を低下させさえする。リバビリン類似体臨床的にＴｈ１又はＴｈ２媒介性Ｔ細胞応答の調節に有効であると考えられるリバビリン類似体は数種存在する。該類似体には、図６の一般式〔式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ₂、ＣＨＯＨ又はＮ−ＣＯ−Ｒ₁₁であり；Ａ、Ｂ及びＣは独立に、Ｎ、Ｐ、ＣＨ、Ｃ−ＯＨ、Ｃ−ＣＨ₃、Ｃ−アルキル、Ｃ−アルケニル、Ｃ−ＣＨ₂、−ＣＮ、Ｃ−ハロゲン、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−ＣＯＯＣＨ₃、Ｃ−ＮＨ₂、Ｃ−ＳＮＨ₂、Ｃ−ＳＯ₂−ＮＨ₂、Ｃ−ＣＯＮＨ₂、Ｃ−ＣＳ−ＮＨ₂、Ｃ−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ₂、ＣＰＯ₂−ＮＨ₂又はＣ−複素環系であり；Ｄは、Ｓ、Ｓｅ、Ｔｅ、ＰＨ、ＮＨ又はＮＲ₁₂であり；Ｒ₁は、Ｈ、（ＣＨ₂）ｐ（ＯＨ）、ハロゲン、ＣＮ、（ＣＨ₂）ｐＯＮＨ₂、（ＣＨ₂）ｐＮＨ₂、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＳＰＨ又は（ＣＨ₂）− 複素環であり；Ｒ₂は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ₃、ＳＨ、ＳＣＨ₃、ハロゲン、ＣＮ、ＮＨ₂、ＯＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、（ＣＨ₂）ＯＨ、（ＣＨ₂）ｐＮＨ₂、ＣＨ₃又はＣＯＯＭｅであり；Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇及びＲ₈は独立に、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ₃ 、ＳＨ、ＳＣＨ₃、ハロゲン、ＣＮ、ＮＨ₂、ＯＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、（ＣＨ₂）ＯＨ、（ＣＨ₂）ｐＮＨ₂、ＣＨ₃、ＣＯＯＭｅ又はフェニルであり；Ｒ₉は、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ₂、ＣＨ₃、ＣＯＮＨ、ＣＳＮＨ₂、ＣＯＯＭｅ、ＳＮＨ₂、ＳＯ₂ＮＨ₂、ＰＯ₂ＮＨ₂、（ＣＨ₂）ｐ、（ＣＨ₂）ｐ−複素環系又は（ＣＨ₂）ｐ−グルコースであり；Ｒ₁₀は、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ₂、ＣＨ₃ 、ＣＯＮＨ、ＣＳＮＨ₂、ＣＯＯＭｅ、ＳＮＨ₂、ＳＯ₂ＮＨ₂、ＰＯ₂ＮＨ₂、（ＣＨ₂）ｐ、（ＣＨ₂）ｐ−複素環系、（ＣＨ₂）ｐ−グルコース、Ｏ−ＣＨ₃、Ｏ− ＣＨ₂ＣＨ₃又はアミノ酸であり；Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ・ＨＣｌ、ＮＯＨ、ＮＯＣＨ₃又はＮＯＣＨ₂ＰＨであり；Ｒ₁₀とＹは一緒になると、チアゾール、イミダゾールなどのような複素環系を形成し；Ｒ₁₁は、ＣＨ₃（ＣＨ₂）ｐＮＨ₂、（ＣＨ₂ ）ｐ−複素環、（ＣＨ₂）ｐ−アミノ酸又は（ＣＨ₂）ｐ−糖（グルコースなど）であり；ｐは０〜８の整数である〕を有する分子が含まれ、該分子には、ＬヌクレオシドもＤヌクレオシドも包含される。そのような分子は、以下に例示する図式の１つ以上に従って製造し得る。１．ＩＣＮ１３６９（ピラゾマイシン）の合成：該化合物の合成法は、以下の参考文献に記載されている：（ａ）Ｊ．Ｆａｒｋａｓ，Ｚ．Ｆｌｅｇｅｌｏｖａ及びＦ．Ｓｏｒｍ，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｓ．，２２，２２７９（１９７２）；（ｂ）Ｓ．ＤｅＢｅｒｎａｒｄｏ及びＭ．Ｗｅｉｇｅｌｅ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４１，２８７（１９７６）；（ｃ）Ｊ．Ｇ．Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ａ．Ｓｔｏｂｉｅ及びＲ．Ｈ．Ｗｉｇｈｔｒｎａｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，９１６（１９８０）；Ｎ．Ｋａｒａｇｉｒｉ，Ｋ．Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｔ．Ｈａｎｅｄａ及びＴ．Ｋａｔｏ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ＰｅｒｋｉｎＴｒａｎｓｄ．，５５３（１９８４）。２．ＩＣＮ３４３８（１−β−Ｄ−キシロフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）の合成：該化合物の合成は、Ｊ．Ｔ．Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｆｕｅｒｔｅｓ，Ｐ．Ｄ．Ｃｏｏｋ及びＲ．Ｋ．Ｒｏｂｉｎｓ，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ２（１）、１（１９７５）に記載の手順に従って行った。３．ＩＣＮ３８４４（１（５−Ｏ−スルファモイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）の合成：該化合物は、Ｇ．Ｄ．Ｋｉｎｉ、Ｂ．Ｍ．Ｈｅｎｒｙ、Ｒ．Ｋ．Ｒｏｂｉｎｓ、Ｓ．Ｂ．Ｌａｒｓｏｎ、Ｊ．Ｊ．Ｍａｒｒ，Ｒ．Ｌ．Ｂｅｒｅｎｓ，Ｃ．Ｊ．Ｂａｃｃｈｉ，Ｈ．Ｃ．Ｎａｔｈａｎ及びＢ．Ｓ．Ｋｅｉｔｈｌｙ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３３，４４（１９９０）に開示されている手順に従って製造した。４．ＩＣＮ４６２５（１（３−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル）−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）の合成：該化合物は、以下の合成法を用いて製造した。５．ＩＣＮ５５３１（５−アミノ−１−β−Ｄ−リボフラノシルピラゾール −４−カルボキサミド）の合成：標記化合物は、Ｂ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ｒ．Ｋ．Ｒｏｂｉｎｓ及びＧ．Ｒ．Ｒｅｖａｎｋａｒ，Ｊ．ＨｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃＣｈｅｍ．，２１，７９５（１９９０）に記載の合成法に従って製造した。６．ＩＣＮ５６７６（１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルホキサミド）の合成：該化合物の合成は、Ｊ．Ｔ．Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｆｕｅｆｌｅｓ，Ｐ．Ｄ．Ｃｏｏｋ及びＲ．Ｋ．Ｒｏｂｉｎｓ，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，２（１），１（１９７５）に記載の手順に従って行った。７．ＩＣＮ５８３９（１−β−Ｄ−エリスロフラノシル−１，２，４−３− カルボキサミド）の合成：該化合物は、以下に記載の合成順序を用いて製造した：８．ＩＣＮ６２４２（２−ブロモ−１−β−Ｄ−リボフラノシルイミダゾール−４−カルボキサミド）の合成：ＩＣＮ６２４２は、以下に示されている方法に従って製造した。９．ＩＣＮ１１８０８（１−β−Ｄ−リボフラノシル−ピラゾール−３，４ −ジカルボキサミド）の合成：該化合物の合成は、Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｂ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ｇ．Ｄ．Ｋｉｎｉ，Ｓ．Ｓ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｓ．Ｂ．Ｌａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｊ．Ｊｏｌｌｅｙ，Ｒ．Ｋ．Ｒｏｂｉｎｓ及びＧ．Ｒ．Ｒｅｖａｎｋａｒ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３３，３３６（１９９０）に記載されている方法に従って行った。１０．ＩＣＮ１２２０４（２−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール− ５−カルボキサミド）の合成：該化合物の合成は、Ｊ．Ｉｇｏｌｅｏ，Ｔ．Ｈ．Ｄｉｎｈ，Ａ．Ｋｅｉｂ及びＣ．Ｐｅｒｒｅｕｒ，ＣｈｉｍｉｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｑｕｅ，２０７（１９７２）に記載の手順に従って行った。リバビリン類似体の炭素環式４′−チオ糖及び４′−アザ糖誘導体を得るには、以下の糖を適切な複素環式化合物と縮合し、上記図式及び参考文献に記載の方法で誘導体化し得る。１．炭素環式糖は、以下の文献に記載の手順に従って製造し得る：Ｍ．Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ及びＮ．Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５０，９９６１（１９９４）；Ｌ．Ａｇｒｏｆｏｇｌｉｏ，Ｅ．Ｓｕｈａｓ，Ａ．Ｐａｒｅｓｅ，Ｒ．Ｃｏｎｄｏｍ，Ｓ．Ｒ．Ｃｈａｌｌａｎｄ，ＲＡ．Ｅａｒｌ及びＲ．Ｇｕｅｄｊ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５０，１０６１１（１９９４）。２．４−アザ糖は、Ｅ．Ｊ．Ｒｅｉｓｔ，Ｄ．Ｅ．Ｇｕｅｆｆｒｏｙ及びＬ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８７，６７７（１９６５）に記載の手順に従って製造した。３．４−チオ−Ｄ−リボフラノースは、Ｍ．Ｈｏｂｅｋ及びＲ．Ｌ．Ｗｈｉｓｔｌｅｒ，“ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ”，第１巻，２９２（１９６２）に記載の手順に従って製造した。Ｔｈ１型及びＴｈ２型サイトカインの調節にリバビリンが有効であるという証拠が図７及び以下の表に示されている。該図及び表に示されているアッセイは、テストした３５種のリバビリン類似体のうち注目すべきもののリストを含み、アッセイは全て３回実施した。一般に、テストした化合物は主要な３種：（１）ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ− ４、ＩＬ−Ｓ及びＴＮＦαを抑制したＩＣＮ１３６９及びＩＣＮ３８４４などの化合物；（２）ＩＬ−２及びＴＮＦαを促進し、ＩＬＡ及びＩＬ−５を抑制したリバビリンなどの化合物；及び（３）ＩＬ−２及びＩＦＮγを促進し、ＩＬ−４及びＩＬ−５を抑制したＩＣＮ６２４２，ＩＣＮ３８３９及びＩＣＮ３５３１などの化合物に分類されることがわかるであろう。上記にリストしたような活性は、サイトカインの調節が適切な免疫応答に強い影響を与えるであろうという見通しのために潜在的に有用であると考えられる。このように、リバビリン及びリバビリン類似体は、活性化Ｔ細胞においてリンホカインの発現の調節に有効であることが証明された。特定の実施態様及び用途を記載したが、当業者には、本発明の概念を逸脱せずにさらに多くの変更を実施し得ることが明らかであろう。従って、本発明は、以下の請求の範囲の精神においてのみ制限されるものとする。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年２月１６日（１９９８．２．１６）【補正内容】請求の範囲１．患者の活性化Ｔ細胞におけるＴｈ１型及びＴｈ２型応答を調節する方法であって、リバビリンを、Ｔｈ１型応答を促進し且つＴｈ２型応答を抑制する投薬量で、Ｔ細胞に投与することを含む前記方法。２．ウイルス疾患の治療をさらに含む、請求項１に記載の方法。３．Ｔｈ１が抑制され且つＴｈ２が促進されるサイトカインプロフィールを特徴とする非ウイルス疾患を有する患者を治療する方法であって、該患者に、Ｔｈ１型応答を促進し且つＴｈ２型応答を抑制するプロトコル下にリバビリンを投与することを含む前記方法。４．前記疾患がアレルギーを包含する、請求項３に記載の方法。５．前記疾患が自己免疫疾患を包含する、請求項３に記載の方法。６．前記疾患が寄生虫病を包含する、請求項３に記載の方法。７．ウイルス性要因と、活性化Ｔリンパ球のＴｈ１レベルが低下し且つＴｈ２レベルが上昇していることを特徴とする非ウイルス性要因とを含む疾患を有する患者を治療する方法であって、患者に、Ｔｈ１型応答の促進且つＴｈ２型応答の抑制に十分なプロトコル下にリバビリンを投与することを含む前記方法。８．前記疾患が原発性免疫不全を包含する、請求項７に記載の方法。９．前記疾患が続発性免疫不全を包含する、請求項７に記載の方法。１０．前記ウイルス性要因にはヒト免疫不全ウイルスが関与する、請求項７に記載の方法。【手続補正書】【提出日】１９９８年１２月２８日（１９９８．１２．２８）【補正内容】（１）請求の範囲を別紙の通り補正する。（２）明細書第13頁第14行から16行に「好ましい実施態様において、リバビリンは、平均して０．２５〜１２．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２．５ｍｇ／ｍｌの血清レベルが得られる投薬量で患者に経口投与する。」とあるのを「好ましい実施態様において、リバビリンは、平均して０．２５〜１２．５μＭ、最も好ましくは約２．５μＭの血清レベルが得られる投薬量で患者に経口投与する。」と補正する。請求の範囲１．有効量のリバビリンを含有するサイトカイン発現の平衡異常の治療用薬剤であって、有効量が哺乳動物の活性化Ｔ細胞におけるTh1反応を促進し、且つTh2反応を抑制する量である薬剤。２．前記サイトカイン発現の平衡異常が、Th1が抑制され、Th2が亢進されているサイトカインプロフィールを特徴とする非ウイルス性疾患から成る請求項１に記載の薬剤。３．前記サイトカイン発現の平衡異常が、アレルギーから成る請求項１に記載の薬剤。４．前記サイトカイン発現の平衡異常が、自己免疫性疾患から成る請求項１に記載の薬剤。５．前記サイトカイン発現の平衡異常が、蠕虫病から成る請求項１に記載の薬剤。６．ウイルス性要因と非ウイルス性要因を含む疾患に罹患している哺乳動物の治療用薬剤であって、非ウイルス性要因が活性化Ｔ細胞におけるTh1レベルの低下とTh2レベルの上昇を特徴とし、該薬剤が有効量のリバビリンを含有し、該有効量が活性化Ｔ細胞におけるTh1反応を亢進し、Th2反応を抑制する量であることを特徴とする治療用薬剤。７．前記疾患が原発性免疫不全を伴う請求項６に記載の薬剤。８．前記疾患が続発性免疫不全を伴う請求項６に記載の薬剤。９．前記ウイルス性要因がヒト免疫不全ウイルスを含む請求項６に記載の薬剤。１０．進行の少なくとも一部がＴ細胞の関与を受ける疾患の治療用薬剤であって、該薬剤が有効量のリバビリンを含有し、該有効量がTh1反応を亢進しTh2反応を抑制する用量であることを特徴とする治療用薬剤。１１．前記疾患がC型肝炎から成る請求項１０に記載の薬剤。１２．有効量が一日あたり、哺乳動物の体重1kgに対して約4.5mgであることを特徴とする請求項10に記載の薬剤。１３．有効量が哺乳動物のリバビリン血中濃度を約0.25〜12.5μＭに達しさせる量であることを特徴とする請求項１０に記載の薬剤。１４．前記疾患がＣ型肝炎であり、有効量が患者のリバビリン血中濃度を約0.25 〜12.5μＭに達しさせる量であることを特徴とする請求項１０に記載の薬剤。１５．前記疾患がアレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、蠕虫感染およびリーシュマニア症から成る群から選択される請求項１０に記載の薬剤。１６．前記疾患が原発性あるいは続発性免疫不全症である請求項１０に記載の薬剤。１７．Ｔｈ１反応の亢進が、インターロイキン２（IL-2）、腫瘍壊死因子（TNF α）およびインターフェロンガンマ（IFNγ）の産生増加を特徴とする請求項１０に記載の薬剤。１８．更にインターフェロンαを含む請求項１０から１６に記載の薬剤。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/08 Ａ６１Ｋ 31/00 ６３７Ｅ // Ｃ０７Ｈ 19/056 Ｃ０７Ｈ 19/056 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ラマサミー，カンダサミーアメリカ合衆国、カリフオルニア・92653、ラグナ・ヒルズ、ロツキー・クリーク・レイン・５ (72)発明者アベレツト，デブロンアメリカ合衆国、カリフオルニア・92612、アービン、トリニテイ・26

Claims

【特許請求の範囲】１．患者の活性化Ｔ細胞におけるリンホカインの発現を調節するためのリバビリンの使用。２．Ｔｈ１のレベルを上昇させ、Ｔｈ２のレベルを低下させるのに有効な投薬量でリバビリンを投与する、請求項１に記載の使用。３．Ｔｈ１を標準以下に低下させ且つＴｈ２を標準以上に増大させるサイトカインプロフィールを特徴とする非ウイルス疾患を治療するためのリバビリンの使用。４．前記疾患がアレルギーを包含する、請求項３に記載の使用。５．前記疾患が自己免疫疾患を包含する、請求項３に記載の使用。６．前記疾患が寄生虫病を包含する、請求項３に記載の使用。７．ウイルス性要因と非ウイルス性要因とを有する疾患の非ウイルス性要因を治療するためのリバビリンの使用であって、該非ウイルス性要因は、活性化Ｔリンパ球のＴｈ１レベルが低く且つＴｈ２レベルが高いことを特徴とする前記使用。８．前記疾患が原発性免疫不全を包含する、請求項７に記載の使用。９．前記疾患が続発性免疫不全を包含する、請求項７に記載の使用。１０．前記ウイルス性要因にはヒト免疫不全ウイルスが関与する、請求項７に記載の使用。１１．Ｔｈ１又はＴｈ２の発現の調節における以下の化合物：〔ここで、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ₂、ＣＨＯＨ又はＮ−ＣＯ−Ｒ₁₁であり；Ａ、Ｂ及びＣは独立に、Ｎ、Ｐ、ＣＨ、Ｃ−ＯＨ、Ｃ−ＣＨ₃、Ｃ−アルキル、Ｃ−アルケニル、Ｃ−ＣＨ₂、−ＣＮ、Ｃ−ハロゲン、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−ＣＯＯＣＨ₃、Ｃ−ＮＨ₂、Ｃ−ＳＮＨ₂、Ｃ−ＳＯ₂−ＮＨ₂、Ｃ−ＣＯＮＨ₂、Ｃ−ＣＳ −ＮＨ₂、Ｃ−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ₂、ＣＰＯ₂−ＮＨ₂又はＣ−複素環系であり；Ｄは、Ｓ、Ｓｅ、Ｔｅ、ＰＨ、ＮＨ又はＮＨ₁₂であり；Ｒ₁は、Ｈ、（ＣＨ₂）ｐ（ＯＨ）、ハロゲン、ＣＮ、（ＣＨ₂）ｐＯＮＨ₂、（ＣＨ₂）ｐＮＨ₂、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＳＰＨ又は（ＣＨ₂）−複素環であり；Ｒ₂は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ₃、ＳＨ、ＳＣＨ₃、ハロゲン、ＣＮ、ＮＨ₂、ＯＮＨ₂ 、ＮＨＣＨ₃、（ＣＨ₂）ＯＨ、（ＣＨ₂）ｐＮＨ₂、ＣＨ₃又はＣＯＯＭｅであり；Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇及びＲ₈は独立に、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ₃、ＳＨ、ＳＣＨ₃、ハロゲン、ＣＮ、ＮＨ₂、ＯＮＨ₂、ＮＨＣＨ₃、（ＣＨ₂）ＯＨ、（ＣＨ₂）ｐＮＨ₂、ＣＨ₃、ＣＯＯＭｅ又はフェニルであり；Ｒ₉は、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ₂、ＣＨ₃、ＣＯＮＨ、ＣＳＮＨ₂、ＣＯＯＭｅ、ＳＮＨ₂、ＳＯ₂ＮＨ₂、ＰＯ₂ＮＨ₂、（ＣＨ₂）ｐ、（ＣＨ₂）ｐ−複素環系又は（ＣＨ₂）ｐ−グルコースであり；Ｒ₁₀は、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ₂、ＣＨ₃、ＣＯＮＨ、ＣＳＮＨ₂、ＣＯＯＭｅ、ＳＮＨ₂、ＳＯ₂ＮＨ₂、ＰＯ₂ＮＨ₂、（ＣＨ₂）ｐ、（ＣＨ₂）ｐ−複素環系、（ＣＨ₂）ｐ−グルコース、Ｏ−ＣＨ₃、Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₃又はアミノ酸であり；Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ・ＨＣｌ、ＮＯＨ、ＮＯＣＨ₃又はＮＯＣＨ₂ＰＨであり；Ｒ₁₀とＹは組み合わされると、チアゾール、イミダゾールなどの複素環系を形成し；Ｒ₁₁は、ＣＨ₃（ＣＨ₂）ｐＮＨ₂、（ＣＨ₂）ｐ−複素環、（ＣＨ₂）ｐ−アミノ酸又は（ＣＨ₂）ｐ−糖（グルコースなど）であり；ｐは０〜８の整数であり；上記には、ＬヌクレオシドもＤヌクレオシドも包含される〕のいずれかの使用。