JP2000500503A - 活性化tリンパ球におけるリバビリン及びリバビリン類似体によるth1型/th2型サイトカインの発現の調節 - Google Patents
活性化tリンパ球におけるリバビリン及びリバビリン類似体によるth1型/th2型サイトカインの発現の調節Info
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Abstract
(57)【要約】
リバビリンは、活性化T細胞におけるリンホカインの発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。特に、リバビリンは、Th2媒介性T細胞応答の抑制及びTh1媒介性T細胞応答の促進に用いる。本発明の他の態様において、1種以上のリバビリン類似体は、活性化T細胞におけるリンホカインの発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。該リバビリン類似体は、Th1又はTh2媒介性T細胞応答の抑制又は促進に用い得る。
Description
【発明の詳細な説明】
活性化Tリンパ球における リバビリン及びリバビリン類似体による TH1型/TH2型サイトカインの発現の調節 発明の分野
本発明の分野は免疫学である。発明の背景
リンホカインは、サイトカインファミリーに属する一群のポリペプチド、即ち
、種々の細胞機能に影響を与え得且つ異なる細胞間の情報伝達を可能にするホル
モン様分子である。近年の研究により、免疫応答におけるリンホカインの役割の
解明が進められた。ヘルパーCD4+(及びCD8+)T細胞により産生されるリ
ンホカインは、マウス系の場合もヒト系の場合も、2種の表現型、Th1及びT
h2のどちらかに属する場合が多い〔Romagnani,1991,Immu
nol Today 12:256−257,Mosmann,1989,An
nu Rev Immunol,7:145−173〕。Th1型細胞は、イン
ターロイキン−2(IL−2)、腫瘍壊死
因子(TNFα)及びインターフェロンγ(IFNγ)を産生し、主として遅延
型過敏症などの細胞性免疫に関与する。Th2型細胞は、インターロイキン類、
IL−4、IL−5、IL−6、IL−9、IL−10及びIL−13を産生し
、主としてIgE及びIgG4抗体アイソタイプスイッチングなどの体液性免疫
応答の促進に関与する(Mosmann,1989,Annu Rev Imm
unol,7:145−173)。
強度に分極したTh1型及びTh2型応答は、保護において異なる役割を果た
すだけでなく、異なる免疫病理学的反応を促進し得る。Th1型応答は、実験的
自己免疫型ぶどう膜網膜炎(Dubeyら, 1991,Eur Cytoki
ne Network 2:147−152)、実験的自己免疫型脳炎(EAE
)(Beraudら,1991,Cell Immunol 133:379−
389)及ひインスリン依存性糖尿病(Hahnら,1987,Eur J I
mmunol 18:2037−2042)などの器官特異的自己免疫状態や、
接触性皮膚炎(Kapsenbergら,Immunol Today 12:
392−395)及びある種の慢性炎症性疾患に関与する。それに対し、Th2
型応答は、(一般的な環境
性アレルゲンに対する)アレルギー性アトピー性疾患、例えば、アレルギー性喘
息(Walkerら,1992,Am RevResp Dis 148:10
9−115)及びアトピー性皮膚炎(van der Heijdenら,19
91,J Invest Derm 97:389−394)の誘発に関与し、
ぜん虫(Finkelmanら,1991,Immunoparasitol
Today 12:A62−66)やLeishmania major(Ca
ceres−Dittmarら,1993,Clin Exp Immunol
91:500−505)などの組織寄生原虫類感染症を悪化させると考えられ
、高IgE症候群(Del Preteら,1989,J Clin Inve
st 84:1830−1835)及びOmennOs症候群(Schande
neら,1993,Eur J Immunol 23:56−60)などの特
定の原発性免疫不全において選択的に誘発され、高IgE症候群(Del Pr
eteら,1989,J Clin Invest 84:1830−1835
)及びOmennOs症候群(Schandeneら,1993,Eur J
Immunol 23:56−60)の低下に関連し、HIV複製抑制
能(Barkerら,1995,Proc Soc Nat Acad Sci
USA 92:11135−11139)の低下に関連する。
従って、上記疾患状態のリンホカインプロフィールを調節することが治療上有
用なことは明らかである。恐らく、Th1型応答を促進するとTh2表現型が抑
制され、Th2型応答を促進するとTh1表現型が抑制されるであろう。リンホ
カインに対するモノクローナル抗体(mAb)、リンホカイン自体及び他の作用
物質例えばチオール酸化防止剤(Jeanninら,1995,J Exp M
ed 182 1785−1792)は、疾患促進サイトカインパターン、Th
1又はTh2のいずれかを阻害することにより特定の疾患の病因を逆転させるこ
とが証明されている。例えば、細胞内原虫感染症は、IFNγにより抑制され、
IL−4により悪化するが、線虫感染症は、IL−4により抑制され、IFNγ
により悪化する(Heinzelら,1989,J Exp Med 162:
59−72,Elseら,1994,J Exp Med 179:347−3
51)。NODマウスのインスリン依存性糖尿病や、マウス及びラットのEAE
は、該疾患が発症する前にIL−4又は抗
IFNγ mAbで治療すると改善され得る(Rapoportら,1993,
J Exp Med 178:87−99,Rackeら,1994,J Ex
p Med 180:1961−1966,Campbellら,1991,J
Clin Invest 87:739−742)。また、全身性エリテマト
ーデス様症候群を特徴とする自己免疫移植片対宿主症(GVHD)は、Th2型
リンホカインの産生に関連し、抗IL−4抗体によって阻害される(Umlan
dら,1992,Clin Immunol Immunopathol 63
:66−73)。一方、Th1型サイトカインは、ドナーCD8+T細胞がCT
Lになり、宿主の免疫系を破壊する急性GVHDにおいて産生される。抗IFN
γ又は抗TNFα mAbで治療すると疾患が改善され、抗IL−2mAbで治
療すると急性GVHDが自己免疫型GVHDに変化する(Via及びFinke
lman,1993,Int Immunol 5:565−572)。
1983年以来、HIV感染患者の治療において天然及び組換えIL−2の臨
床実験が進められている(Volberdingら,1987,AIDS Re
s Hum Retrovi
ruses,3:115−124)。この場合、両者の関係は、AIDSの発症
が産生されるリンホカインのパターン変化に関連すると報告されたことに由来す
る(Clerici及びShearer,1994,Immunol Toda
y 15:575−581)。発症に向かって進行している感染患者では、IL
−2などのTh1型リンホカインの発現が経時的に低下する(Maggiら,1
987,Eur J Immunol 17:1685−1690,Grute
rsら,1990,Eur J Immunol 20:1039−1044,
Clericiら,1993,J Clin Invest 91:759−7
65)と同時に、IL−4及びIL−10などのTh2型リンホカインの産生が
増大する(Clericiら,1994,J Clin Invest 93:
768−775,Hoffmanら,1985,Virology 147:3
26−335)。IL−2で治療した非症候性又は長期生存患者由来のT細胞は
、その抗HIV活性が増強されていたが、IL−4又はIL−10に暴露すると
、そのHIV複製抑制能及びIL−2産生能が低下した(Barkerら,19
95,Proc Soc Nat Acad Sci USA 92:1113
5−11139)。
しかし、現在使用されているこれらの免疫調節治療薬(mAb及び組換えサイ
トカイン)には限界がある。例えば、長期間モノクローナル抗体を用いて治療を
行うと、宿主動物にモノクローナル抗体に対する抗体ができ、そのためにモノク
ローナル抗体の有用性が制限される。mAbに対する免疫応答の誘発というリス
クを明らかに低減させる「人化」(humanized)モノクローナル抗体が開発され
た。しかし、該抗体はまだ開発途上であり、その上、これら新規なmAbは依然
、巨大タンパク質であり、従って、標的部位への到達が難しい可能性がある。サ
イトカインをベースとする治療薬にも限界がある。例えば、マウスでは、自己免
疫型GVHDをIL−12で治療すると急性GVHDが発症する。
リバビリン(1−b−D−リボフラノシル−1,2,4−トリアゾール−3−
カルボキサミド)は、RNA及びDNAウイルスの複製を阻害し得る合成ヌクレ
オシドである(Huffmanら,1973,Antimicrob Agen
ts Chemother 3:235,Sidwellら,1972,Sci
ence 177:705)。本発明者は、リバビリン
が、その抗ウイルス活性に加えて、特定の免疫応答に作用することを示唆した他
の人々の所見を確認した(Jolley及びSuchil,1984,Clin
ical Applications of Ribavirin:93−96
ページを再検討した)。本発明者はさらに、リバビリンがマイトジェン及び抗原
活性化T及びBリンパ球の増殖に影響を与え〔Tamら、1995(データ示さ
ず),Peavyら,1980,Infection and Immunit
y 29:583−589〕、さらに、リバビリンは、シクロスポリンと組み合
わせると、長期の同種移植生存に効力を示す(Jelleyら,1988,Tr
ansplantation Proc 20:703−706)という他の人
々の所見を確認した。
また、本発明者は、リバビリンが、Th1型応答を促進し且つTh2型応答を
抑制することにより、少なくとも部分的に免疫応答のサイトカインパターンを調
節することを証明することにより従来の研究を著しく進展させた。この発見は従
来の研究と矛盾しないと洞察される。先ず第1に、リバビリンが機能性体液性免
疫応答(Peavyら,1981,J Immunol 126:861−86
4,Powersら,1982,A
ntimicrob Agents Chemother 22:108−11
4)及び肥満細胞分泌のIgE媒介性調節(Marquardtら,1987,
J PharmacolExp Therapeutics 240:145−
149)(いずれもTh2型リンホカイン媒介性事象である)のどちらをも阻害
することは公知である。第2に、リバビリンは、HIV患者由来の末梢血リンパ
球においてアジドチミジン(AZT)の抗ウイルス作用を拮抗する(Vogtら
,1987,Science 235:1376−1379)。この知見は重要
である。というのは、AZTはIL−2受容体(IL−2R)の発現を低下させ
るがIL−2の発現は低下させないからである(Viora及びCampone
schi,1995,Cell Immunol 163:289−295)。
従って、リバビリンが、IL−2の発現を調節し且つ低下したIL−2Rレベル
を上昇させることによりAZTを拮抗することは可能である。第3に、慢性GV
HD(Th2媒介性疾患)を有する免疫減弱患者をリバビリンで治療すると該疾
患が驚異的に消散するが、これは、シクロスポリンやグルココルチコイドなどの
従来の免疫抑制療法では起こらなかったことである(Ca
ssano,1991,Bone Marrow Transplantati
on 7:247−248)。最後に、C型肝炎(HCV)患者をリバビリンで
(1年間)治療すると、プラシーボ対照群に比べ、リンパ球の凝集率が低下し且
つ肝損傷率がはるかに低下することが判明した(Dusheikoら,1994
,Hepatology 20:206A)。この所見は、C型肝炎に対する主
要免疫応答はTh1型リンホカインにより媒介されるが、Th0/Th2表現型
のT細胞はHCVを介して感染し得る(Zignegoら,1994,未公開デ
ータ)ことを表し得、この感染は肝細胞のさらなる抗体媒介性破壊を誘発し得る
。図面の簡単な説明
表1は、ヒトT細胞の刺激48及び72時間後の上清中で測定したリンホカイ
ン、IL−2、IL−4、TNFα及びIFNγの休止レベルとPMA/イオノ
マイシン(ionomycin)活性化レベル(pg/ml)、並びにIL−2受容体(
IL−2R)及びIL−4受容体(IL−4R)の細胞表面発現(平均チャンネ
ル蛍光強度)を表す。
図1は、PMA/イオノマイシンで活性化したTリンパ球に
おけるIL−2、IL−4、TNFα及びIFNγの細胞外発現に及ぼすリバビ
リン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。結果を、PMA/イオ
ノマイシン処理のみを行った後のリンホカイン発現に対する増大率(%)として
表す。
図2は、PMA/イオノマイシンで活性化したTリンパ球におけるIL−2(
A及びC)及びIL−4(B及びD)の細胞外発現に及ぼす、2,000U/m
lのインターフェロンαの存在下の2、10又は50mMのリバビリンの作用(
左側パネル)と、10mMのリバビリンの存在下の500、1,000又は2,
000U/mlのインターフェロンαの作用(右側パネル)を表すグラフである
。
図3は、PMA/イオノマイシンで活性化したTリンパ球におけるIL−2、
IL−4及びIFNγのmRNAの発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロ
ンαの作用を表すグラフである。
図4は、PMA/イオノマイシンで活性化したTリンパ球におけるIL−2及
びIL−4受容体の細胞表面発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの
作用を表すグラフである。結果を、PMA/イオノマイシン処理のみを行った後
のリンホ
カイン受容孫発現に対する増大率(%)として表す。
図5は、休止T細胞(A及びE)、あるいはPMA/イオノマイシンのみで処
理する(B及びF)か又はPMA/イオノマイシン処理を10mMのリバビリン
の存在下(C及びG)若しくは5,000U/mlのインターフェロンαの存在
下(D及びH)に行った活性化CD4+T細胞(上部パネル)若しくはCD8+T
細胞(下部パネル)における細胞内IL−2の発現を表すグラフである。1回の
実験から得られたデータを示し、IL−2とCD4又はCD8の二重ポジティブ
染色を示す細胞の百分率として表わす。
図6は、企図されるリバビリン類似体を表すグラフである。
図7は、IL−2、TNFα、IFNγ、IL−4及びIL−5に対する種々
の濃度のリバビリン類似体の結果を示すグラフを集めたものである。発明の要旨
本発明の1つの態様によれば、リバビリン(ヌクレオシド)を、活性化T細胞
におけるリンホカイン発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。特に、
リバビリンは、Th2媒介性T細胞応答の抑制及びTh1媒介性T細胞応答の促
進に用い
る。
従って、本発明では、リバビリンをその抗ウイルス剤としての十分に認識され
た役割で投与する代わりに、リンホカイン発現の平衡異常の治療に用いる。その
ような平衡異常は、アレルギー性喘息やアトピー性皮膚炎などのアレルギー性ア
トピー性疾患、ぜん虫感染症及びリーシュマニア症、並びにウイルス感染に関連
し得るものも関連しないと考えられるものも含めた種々の原発性及び続発性免疫
不全に付随するものとして見出され得る。
本発明の他の態様によれば、1種以上のリバビリン類似体を、活性化T細胞に
おけるリンホカイン発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。リバビリ
ン類似体は、Th1又はTh2媒介性T細胞応答の抑制又は促進に用い得る。発明の詳細な説明
好ましい実施態様において、リバビリンは、平均して0.25〜12.5mg
/ml、最も好ましくは約2.5mg/mlの血清レベルが得られる投薬量で患
者に経口投与する。典型的な個体では、最適な血清レベルは、1日につき体重1
kg当たり約4.5mgであり、都合200〜1,200mgの投薬量
で投与し得る。1日当たりの投薬量を何回分かに分割して投与するのが好ましい
。
リバビリンは数年前から市販されているので、多くの剤形や投与経路が公知と
なっており、そのうちの適切なものを利用することができる。例えば、リバビリ
ンは、経口投与以外にも、公知のように、静脈内、筋肉内、腹腔内に、局所投与
したりすることができる。リバビリンを含む医薬組成物は、1種以上の医薬上許
容し得る担体をさらに含み得、該担体は、(長期貯蔵用の)安定剤、乳化剤、結
合剤、増粘剤、塩、保存剤、溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌
剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含み得る。医薬活性物質としてのそのような媒
質及び作用物質の使用は当業界では周知である。従来の媒質又は作用物質は、リ
バビリンに不適合である場合を除いて、治療用組成物及び製剤に用いられる。組
成物や製剤に補助有効成分を混和してもよい。
リバビリンは、本発明において企図されている治療用としての用途に加えて、
吸収、分配、細胞取込み及び効力に関する研究の実験用ツールとしても用い得る
。
さらに、今まで活性が極めて低いとして用いられていなかっ
た(既知又は未知の)数種のヴァイラゾール類似体も有意なサイトカイン活性を
有することが見出された。本発明者が調べたところ、そのような活性を有するヴ
ァイラゾール類似体は数種存在し、以下の「リバビリン類似体」というタイトル
の下にその実施例が示されている。これらの実施例は、活性組成物を得るために
ヴァイラゾールを修飾し得る位置を特定することを目的とし、従ってこの開示は
、示されている特定の修飾に限定されるものではない。さらに、これらの修飾は
、標準的なD型ヴァイラゾールにも、L型ヴァイラゾールにも適用し得るように
企図されている。実施例
細胞系及びT細胞の精製
健康なドナー由来の血液60mlをフィコール−ハイパック密度勾配遠心分離
にかけた後、バフィーコートから末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。次い
で、T細胞に特異的なLymphokwikリンパ球単離試薬(LK−25T,
OneLambda,Canoga Park,CA)を用い、PBMCからT
細胞を精製した。次いで、平均収量40〜60×106個のT細胞を、20〜3
0mlのRPMI−AP5〔20
mMのHEPES緩衝液、pH7.4、5%の自己由来血漿、1%のL−グルタ
ミン、1%のペニシリン/ストレプトマイシン及び0.05%の2−メルカプト
エタノールを含むPRMI−1640培地(ICN,Costa Mesa,C
A)〕中37℃で一晩インキュベートして、不純混合付着細胞を除去した。全て
の実験において、T細胞をRPMI−AP5で洗浄し、次いで、96ウエルマイ
クロタイタープレート上に1×106細胞/mlの細胞密度で平板培養した。
T細胞活性化及びリバビリン処理
500ngのイオノマイシン及び10ngのホルボール12−ミリステート1
3−アセテート(PMA)(Calbiochem,La Jolla,CA)
を添加してT細胞を活性化し、37℃で48〜72時間インキュベートした。P
MA/イオノマイシンで活性化されたT細胞を、活性化直後に0.5〜50mM
のリバビリン又は250〜10,000U/mlの対照抗ウイルス剤、インター
フェロンα(Accurate,Westbury,NY)で処理し、24時間
後に再処理した。各プレートからのT細胞を免疫蛍光法分析に用い、上清を細胞
外サイトカインの測定に用いた。活性化後、細胞由来サイトカ
インの産生を分析するために、各マイクロプレートから細胞上清900mlを取
り出し、別のマイクロプレートに移した。次いで、細胞を、免疫蛍光法による細
胞内サイトカインレベル及びサイトカイン受容体の発現の分析に用いた。
細胞外サイトカインの分析
各マイクロプレートからの細胞上清中で細胞由来ヒトサイトカインの濃度を定
量した。市販のELISAキット(R&Dsystems Quantikin
e kit,Minneapolis,MN)を用いるか、又はIL−2依存性
細胞系、CTLL−2(ATCC,Rockville,MD)を用いたバイオ
アッセイにかけて、活性化により誘発されたインターロイキン−2(IL−2)
のレベルの変化を定量した。ELISAキットを用い、活性化により誘発された
、インターロイキン−4(IL−4)、腫瘍壊死因子(TNFα)、インターロ
イキン−8(IL−8)(R&D Systems(Quantikine k
it,Minneapolis、MN)及びインターフェロンγ(IFNγ)(
Endogen(Cambridge,MA)のレベルの変化を定量した。全て
のELISAの結果はpg/mlとして表し、CTLL−2バイオアッ
セイは、CTLL−2細胞による3H−チミジン(ICN,Costa Mes
a,CA)のIL−2依存性細胞取込みを表す1分当たりのカウント数として表
した。
直接免疫蛍光法実験(サイトカイン受容体)
蛍光標識した細胞表面抗原に対する抗体で直接染色するために、細胞を生理食
塩液、pH7.4(Becton Dickinson,Mansfield,
MA)で2回洗浄し、50mlの生理食塩液に再懸濁し、2つの試料に分割した
。一方の試料アリコートをPE抗CD25/FITC−抗CD4又はPE−ラッ
ト抗マウスIgG+抗CDw124/FITC−抗CD4 mAbで同時染色し
、第2のアリコートをPE/FITCで標識したアイソタイプマッチド対照モノ
クローナル抗体で染色して、非特異的蛍光を評価した。蛍光標識したモノクロー
ナル抗体は全てBecton Dickinson(SanJose,CA)か
ら入手したが、抗CDw124はPharmingen,San Diego,
CAから入手した。インキュベーションは、飽和mAb濃度を用い暗所で45分
間4℃で行った。取り込まれなかった標識をPBSで洗浄して除去した後、FA
CScanフロー・サイトメトリー(Becton
Dickinson)を用いて分析した。
ゲートをかけた生きているCD4+T細胞中で抗原密度を間接定量し、平均蛍
光チャンネル(MCF)として表した。特異的抗原(CDw124,CD25)
の表面発現を、FITC又はPE標識した抗原特異的mAb染色細胞のMCFか
らFITC又はPE標識したアイソタイプマッチド(IgG1)対照mAb染色
細胞のMCFを減算して得られた平均チャンネル変化(MCS)として表した。
あるいは、CD28mAbで染色された細胞のCD4+サブセットの表面発現を
、CD28-CD4-細胞のMCFからCD28+CD4+のMCFを減算して測定
した。
未処理対照とリバビリン処理細胞及びインターフェロンα処理細胞の生存能力
を、生体染料、ヨウ化プロピジウム(propidium iodide)(最終濃度:5mg/
ml)で染色することにより、多重ドナーの全てのオリゴヌクレオチドを有する
各バッチ中で定量した。ヨウ化プロピジウムを除去した生存細胞の百分率をフロ
ー・サイトメトリーで測定すると、用いた全ての濃度において、処理した後、>
90%(90〜99%の範囲)であった。
細胞内サイトカイン発現の免疫蛍光法分析
CD4+及びCD8+T細胞サブセットにおけるIL−2の細胞内発現を分析す
るために、先ず、48〜72時間の活性化の最後の4時間に、T細胞を10mg
のBrefeldinA(Gibco BRL,Gaithersburg,M
D)で処理して、新たに合成されるIL−2の細胞外への分泌を最小限にした。
活性化後、細胞由来サイトカインの産生を分析するために、各マイクロプレート
から細胞上清900mlを取り出し、別のマイクロプレートに移した。FITC
標識した細胞表面抗原、CD4及びCD8に対する抗体で直接染色(30分間、
4℃、暗所)する前に、細胞を生理的食塩液、pH7.4で2回洗浄し、100
〜150mlの染色緩衝液〔1%ウシ胎児血清(FCS)(Hyclone,L
ogan,UT)及び0.1%アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生食液、pH
7.4〕に再懸濁し、2つの試料に分割した。染色された細胞を1mlの染色緩
衝液で洗浄し、上清を吸引した後、細胞ペレットを100mlの固定緩衝液(P
BS中4%パラホルムアルデヒド)に再懸濁した。固定された細胞を20分間4
℃に維持し、次いで、1mlの染色緩衝液で洗浄し、細胞ペレットを50m
lの透過性化緩衝液〔PBS中0.1%サポニン(ICN,Costa Mes
a,CA)〕に攪拌下に再懸濁した。透過性となった細胞を、暗所で30分間4
℃で、PE標識したIL−2抗体で染色し、次いで、1mlの透過性化緩衝液中
で洗浄し、FACS分析にかける前に250mlの染色緩衝液に再懸濁した。
サイトカインmRNAの分析
商業用のグラニジウムチオシアネート/フェノール抽出剤〔Trizol剤(
GIBCO/BRL)〕を用い、休止T細胞、リバビリン処理T細胞及びインタ
ーフェロンα処理T細胞、並びに非処理活性化T細胞から全RNAを抽出した。
RNAを70%エタノールで洗浄し、最後に、DEPC処理した水10μlに再
懸濁した。
製造業者(Promega,Madion,WI)の指示に従ってcDNA合
成反応を行った。簡略的に言えば、金RNA(1μg)を65℃で10分間加熱
し、氷上で冷却してから、10×逆転写緩衝液〔100mMのTris HCl
(pH8.8)、500mMのKCl、1%のTriton X−100、5m
MのMgCl〕(2μl)、10mMのdNTP(各dN
TP:1mM)(2μl)、RNアーゼ阻害剤(0.5μl)、オリゴ(dT)15
プライマー(0.5μg/μgRNA)(1μl)及びAMV逆転写酵素(H
.C.)(0.65μl)と合わせた。反応混合物を42℃で1時間次いで95
℃で10分間次いで氷上で5分間インキュベートした。
GeneAmp PCRキット(Perkin−ElmerCetus,Fo
ster City,CA)を用い、PCR反応を行った。新しい試験管中で、
RT反応混合物(3μl)を、10×PCR緩衝液〔500mMのKCl、10
0mMのTris−HCl、pH8.3、15mMのMgCl2及び0.01%
(w/v)のゼラチン〕(5μl)、10mMのdNTP(1μl)並びにTa
q DNAポリメラーゼ(1U)と合わせた。用いたプライマーは以下の通りで
あった:インターロイキン−2、インターロイキン−4、インターフェロンγ(
ヒト)プライマー(Stratagene,La Jolla,CA)及びpH
E7リボソーム遺伝子。増幅条件は、94℃で45秒間、57℃で1分間、72
℃で2分間のサイクルを35回、次いで、72℃で8分間であった。臭化エチジ
ウムを含む2%アガロースゲル上でPCR産物を分析した。電気泳動させ
た後、PCR産物を20×SSC中で一晩かけてHybondN+メンブラン(
Amersham,Arlington Heights,IL)に移し、0.
4M NaOHを用いて固定化した。ブロットをRapid−hyb緩衝液(A
mersham)中42℃で1時間、32P−γATP標識オリゴヌクレオチドプ
ローブとハイブリダイズさせた。(指示に従って)各サイトカインプライマーミ
ックスを放射線標識プローブとして用いた。pHE7センスプライマーから作製
したプローブとハイブリダイズさせた後、処理量が等しいことを確認した。次い
で、洗浄したブロットをPhosphorImagerで分析した。
活性化T細胞における細胞外サイトカインレベルに及ぼすリバビリンの作用
ヒトT細胞をPMA/イオノマイシンで処理(48〜72時間)すると、分析
した全てのサイトカイン、即ち、IL−2、IL−4、TNFα、IFNγのレ
ベルが実質的に増大した(表2)。各セルの最初の数字は算術平均を示し、括弧
内の数字は関連範囲を示す。N=4である。図1に示されている代表的な実験に
おいて、リバビリンを0.5〜50mMの用量範囲
で添加すると、Th1サイトカイン、IL−2及びTNFαの活性化レベルが、
それぞれ5mM(30%)及び20mM(36%)で極大増大を示した。それに
対し、インターフェロンαを添加すると、非処理活性化T細胞におけるレベルに
比べ、IL−2及びTNFαの発現が用量依存的に阻害された(250〜10,
000U/ml、極大阻害率はそれぞれ33%及び38%)。さらに、リバビリ
ンはTh2型サイトカイン、IL−4の活性化レベルの同時低下を媒介した(2
mMで74%のピーク阻害率)が、インターフェロンαは細胞外IL−4を最大
で26%増大させた(10,000U/ml)。図2は、リバビリンとインター
フェロンαを組み合わせて用いると、2,000U/mlの定濃度のインターフ
ェロンαは活性化IL−2レベルのリバビリン用量依存性増大を抑制し(A)、
活性化IL−4レベルの阻害を逆転させた(C)ことを示している。同様に、1
0mMの定濃度のリバビリンは、活性化IL−2レベルのインターフェロンα媒
介性用量依存性阻害を逆転させ(B)、活性化IL−4レベルの増大を抑制した
(D)。
活性化T細胞におけるサイトカインmRNAレベルに及ぼすリバビリンの作用
活性化細胞外サイトカインレベルに及ぼすリバビリンとインターフェロンαの
上記対立作用は転写レベルにおいても認められた。図3は、ヒトT細胞をPMA
/イオノマイシンで処理すると、IL−2、IL−4及びIFNγのmRNAレ
ベルが実質的に増大することを示している。T細胞を活性化した後でリバビリン
(2、5及び10mM)で処理すると、IL−2のmRNAレベルは増大し、I
L−4のmRNAレベルは低下するが、IFNγのmRNAレベルには影響がな
い。それに対し、1,000、2,000及び5,000U/mlのインターフ
ェロンαで処理すると、IL−2のmRNAレベルは低下し、IL−4のmRN
Aレベルは増大し、IFNγのmRNAレベルは低下する。従って、IL−2、
TNFα及びIL−4のmRNAの発現に及ぼすリバビリンとインターフェロン
αそれぞれの用量依存性作用はELISA分析と一致した。これらのデータは、
リバビリンが、活性化ヒトT細胞において、Th1型サイトカイン、IL−2及
びTNFαの合成を促進し、Th2型サイトカイン、IL−4の発現を阻害する
ことを示唆している。
活性化T細胞におけるIL−2及びIL−4受容体レベルに
及ぼすリバビリンの作用
FACS分析を用い、活性化T細胞におけるIL−2受容体(CD25)及び
IL−4受容体(CDw124)の発現に及ぼすリバビリンとインターフェロン
αの作用を比較した。PMA/イオノマイシンで処理すると、CD25とCDw
124の発現が、それぞれ50.16±0.45及び62.31±1.46の休
止レベルから162.48±2.89及び87.53±3.98の活性化レベル
に増大する(n=4)。図4は、3回の実験のうち代表的なものでは、リバヒリ
ン(1〜50mM)はIL−2及びIL−4受容体の活性化レベルには殆ど作用
しないが、インターフェロンαは、250〜10,000U/mlの用量範囲で
、対照活性化T細胞における受容体レベルに比べ、用量依存的にIL−2受容体
の発現を低下させ且つIL−4受容体の発現を増大させたことを示している。従
って、これらのデータは、サイトカイン合成に及ぼすリバビリンの作用は、サイ
トカイン受容体の発現とは独立に作用することを示している。それに対し、IL
−2及ひIL−4受容体に及ぼすインターフェロンα処理の作用は、活性化IL
−2及びIL−4発現に及ぼすインターフェロンαの作用と相関関係にある。
活性化T細胞のCD4+及びCD8+サブセットにおける細胞内IL−2レベルに
及ぼすリバビリンの作用
IL−2発現に及ぼすリバビリンの作用がCD4+T細胞とCD8+T細胞のど
ちらかに特異的であるかを調べた。固定され且つ透過性化された活性化T細胞に
おける細胞内IL−2の発現を、蛍光標識したCD4又はCD8抗体及びIL−
2抗体を用い、2色フロー・サイトメトリーにより定量した。図5は、10mM
のリバビリンで処理した後では、IL−2を発現しているCD4+T細胞は82
%から91%に増大し、IL−2を発現しているCD8+T細胞は81%から9
1%に増大したことを示している。対照的に、インターフェロンα(5,000
U/ml)で処理した後では、IL−2を発現しているCD4+及びCD8+T細
胞は、それぞれ81%と71%であった。これらのデータは、リバビリンが、C
D4+T細胞サブセットとCD8+T細胞サブセットとを区別せずに細胞内IL−
2発現に作用を及ぼすことを示している。それに対し、インターフェロンαによ
る処理は、CD4+T細胞には殆どを作用を及ぼさず、しかも、CD8+T細胞サ
ブセットではIL−2の発現を低下させさえする。
リバビリン類似体
臨床的にTh1又はTh2媒介性T細胞応答の調節に有効であると考えられる
リバビリン類似体は数種存在する。該類似体には、図6の一般式〔式中、Xは、
O、S、CH2、CHOH又はN−CO−R11であり;A、B及びCは独立に、
N、P、CH、C−OH、C−CH3、C−アルキル、C−アルケニル、C−C
H2、−CN、C−ハロゲン、C−CN、C−COOCH3、C−NH2、C−S
NH2、C−SO2−NH2、C−CONH2、C−CS−NH2、C−C(NH)
NH2、CPO2−NH2又はC−複素環系であり;Dは、S、Se、Te、PH
、NH又はNR12であり;R1は、H、(CH2)p(OH)、ハロゲン、CN、
(CH2)pONH2、(CH2)pNH2、CH3、CH2SPH又は(CH2)−
複素環であり;R2は、H、OH、OCH3、SH、SCH3、ハロゲン、CN、
NH2、ONH2、NHCH3、(CH2)OH、(CH2)pNH2、CH3又はC
OOMeであり;R3、R4、R5、R6、R7及びR8は独立に、H、OH、OCH3
、SH、SCH3、ハロゲン、CN、NH2、ONH2、NHCH3、(CH2)O
H、(CH2)pNH2、CH3、COOMe又はフェニ
ルであり;R9は、H、ハロゲン、NH2、CH3、CONH、CSNH2、COO
Me、SNH2、SO2NH2、PO2NH2、(CH2)p、(CH2)p−複素環
系又は(CH2)p−グルコースであり;R10は、H、ハロゲン、NH2、CH3
、CONH、CSNH2、COOMe、SNH2、SO2NH2、PO2NH2、(C
H2)p、(CH2)p−複素環系、(CH2)p−グルコース、O−CH3、O−
CH2CH3又はアミノ酸であり;Yは、O、S、NH・HCl、NOH、NOC
H3又はNOCH2PHであり;R10とYは一緒になると、チアゾール、イミダゾ
ールなどのような複素環系を形成し;R11は、CH3(CH2)pNH2、(CH2
)p−複素環、(CH2)p−アミノ酸又は(CH2)p−糖(グルコースなど)
であり;pは0〜8の整数である〕を有する分子が含まれ、該分子には、Lヌク
レオシドもDヌクレオシドも包含される。
そのような分子は、以下に例示する図式の1つ以上に従って製造し得る。
1. ICN1369(ピラゾマイシン)の合成:該化合物の合成法は、以下
の参考文献に記載されている:(a)J.Farkas,Z.Flegelov
a及びF.Sorm,Te
trahedron Letts.,22,2279(1972);(b)S.
De Bernardo及びM.Weigele,J.Org.Chem.,4
1,287(1976);(c)J.G.Buchanan,A.Stobie
及びR.H.Wightrnan,J.Chem.Soc.Chem.Comm
un.,916(1980);N.Karagiri,K.Takashima
,T.Haneda及びT.Kato,J.Chem.Soc.Perkin
Transd.,553(1984)。
2. ICN3438(1−β−D−キシロフラノシル−1,2,4−トリア
ゾール−3−カルボキサミド)の合成:該化合物の合成は、J.T.Witko
wski,M.Fuertes,P.D.Cook及びR.K.Robins,
J.Carbohydr.Nucleosides,Nucleotides
2(1)、1(1975)に記載の手順に従って行った。
3. ICN3844(1(5−O−スルファモイル−β−D−リボフラノシ
ル)−1,2,4−トリアゾール−3−カルボキサミド)の合成:該化合物は、
G.D.Kini、B.M.Henry、R.K.Robins、S.B.La
rson、
J.J.Marr,R.L.Berens,C.J.Bacchi,H.C.N
athan及びB.S.Keithly,J.Med.Chem.,33,44
(1990)に開示されている手順に従って製造した。
4. ICN4625(1(3−デオキシ−β−D−エリスロペントフラノシ
ル)−1,2,4−トリアゾール−3−カルボキサミド)の合成:該化合物は、
以下の合成法を用いて製造した。
5. ICN5531(5−アミノ−1−β−D−リボフラノシルピラゾール
−4−カルボキサミド)の合成:標記化合物は、B.K.Bhattachar
ya,R.K.Robins及びG.R.Revankar,J.Hetero
cycl
ic Chem.,21,795(1990)に記載の合成法に従って製造した
。
6. ICN5676(1−β−D−アラビノフラノシル−1,2,4−トリ
アゾール−3−カルホキサミド)の合成:該化合物の合成は、J.T.Witk
owski,M.Fuefles,P.D.Cook及びR.K.Robins
,J.Carbohydr.Nucleosides,Nucleotides
,2(1),1(1975)に記載の手順に従って行った。
7. ICN5839(1−β−D−エリスロフラノシル−1,2,4−3−
カルボキサミド)の合成:該化合物は、以下に記載の合成順序を用いて製造した
:
8. ICN6242(2−ブロモ−1−β−D−リボフラノシルイミダゾー
ル−4−カルボキサミド)の合成:ICN6242は、以下に示されている方法
に従って製造した。 9. ICN11808(1−β−D−リボフラノシル−ピラゾール−3,4
−ジカルボキサミド)の合成:該化合物の合成は、Y.S.Sanghvi,B
.K.Bhattacharya,G.D.Kini,S.S.Matsumo
to,S.B.Larson,W.J.Jolley,R.K.Robins及
びG.R.Revankar,J.Med.Chem.,
33,336(1990)に記載されている方法に従って行った。
10. ICN12204(2−(β−D−リボフラノシル)イミダゾール−
5−カルボキサミド)の合成:該化合物の合成は、J.Igoleo,T.H.
Dinh,A.Keib及びC.Perreur,Chimie Therap
eutique,207(1972)に記載の手順に従って行った。
リバビリン類似体の炭素環式4′−チオ糖及び4′−アザ糖誘導体を得るには
、以下の糖を適切な複素環式化合物と縮合し、上記図式及び参考文献に記載の方
法で誘導体化し得る。
1. 炭素環式糖は、以下の文献に記載の手順に従って製造し得る:M.Yo
shikawa,Y.Yoshikawa,Y.Inoue,S.Yamagu
chi及びN.Murakami,Tetrahedron,50,9961(
1994);L.Agrofoglio,E.Suhas,A.Parese,
R.Condom,S.R.Challand,RA.Earl及びR.Gue
dj,Tetrahedron,50,10611(1994)。
2. 4−アザ糖は、E.J.Reist,D.E.Gueffroy及びL
.Goodman,J.Am.Chem.Soc.87,677(1965)に
記載の手順に従って製造した。
3. 4−チオ−D−リボフラノースは、M.Hobek及びR.L.Whi
stler,“Methods in Carbohydrate Chemi
stry”,第1巻,292(1962)に記載の手順に従って製造した。
Th1型及びTh2型サイトカインの調節にリバビリンが有効であるという証
拠が図7及び以下の表に示されている。該図及び表に示されているアッセイは、
テストした35種のリバビ
リン類似体のうち注目すべきもののリストを含み、アッセイは全て3回実施した
。一般に、テストした化合物は主要な3種:(1)IFNγ、IL−2、IL−
4、IL−S及びTNFαを抑制したICN1369及びICN3844などの
化合物;(2)IL−2及びTNFαを促進し、ILA及びIL−5を抑制した
リバビリンなどの化合物;及び(3)IL−2及びIFNγを促進し、IL−4
及びIL−5を抑制したICN6242,ICN3839及びICN3531な
どの化合物に分類されることがわかるであろう。上記にリストしたような活性は
、サイトカインの調節が適切な免疫応答に強い影響を与えるであろうという見通
しのために潜在的に有用であると考えられる。 このように、リバビリン及びリバビリン類似体は、活性化T細胞においてリン
ホカインの発現の調節に有効であることが証明された。特定の実施態様及び用途
を記載したが、当業者には、本発明の概念を逸脱せずにさらに多くの変更を実施
し得ることが明らかであろう。従って、本発明は、以下の請求の範囲の精神にお
いてのみ制限されるものとする。
【手続補正書】特許法第184条の8第1項
【提出日】1998年2月16日(1998.2.16)
【補正内容】
請求の範囲
1. 患者の活性化T細胞におけるTh1型及びTh2型応答を調節する方法で
あって、リバビリンを、Th1型応答を促進し且つTh2型応答を抑制する投薬
量で、T細胞に投与することを含む前記方法。
2. ウイルス疾患の治療をさらに含む、請求項1に記載の方法。
3. Th1が抑制され且つTh2が促進されるサイトカインプロフィールを特
徴とする非ウイルス疾患を有する患者を治療する方法であって、該患者に、Th
1型応答を促進し且つTh2型応答を抑制するプロトコル下にリバビリンを投与
することを含む前記方法。
4. 前記疾患がアレルギーを包含する、請求項3に記載の方法。
5. 前記疾患が自己免疫疾患を包含する、請求項3に記載の方法。
6. 前記疾患が寄生虫病を包含する、請求項3に記載の方法。
7. ウイルス性要因と、活性化Tリンパ球のTh1レベルが
低下し且つTh2レベルが上昇していることを特徴とする非ウイルス性要因とを
含む疾患を有する患者を治療する方法であって、患者に、Th1型応答の促進且
つTh2型応答の抑制に十分なプロトコル下にリバビリンを投与することを含む
前記方法。
8. 前記疾患が原発性免疫不全を包含する、請求項7に記載の方法。
9. 前記疾患が続発性免疫不全を包含する、請求項7に記載の方法。
10. 前記ウイルス性要因にはヒト免疫不全ウイルスが関与する、請求項7に
記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】1998年12月28日(1998.12.28)
【補正内容】
(1)請求の範囲を別紙の通り補正する。
(2)明細書第13頁第14行から16行に「好ましい実施態様において、リバビリン
は、平均して0.25〜12.5mg/ml、最も好ましくは約2.5mg/m
lの血清レベルが得られる投薬量で患者に経口投与する。」とあるのを「好まし
い実施態様において、リバビリンは、平均して0.25〜12.5μM、最も好
ましくは約2.5μMの血清レベルが得られる投薬量で患者に経口投与する。」
と補正する。請求の範囲
1.有効量のリバビリンを含有するサイトカイン発現の平衡異常の治療用薬剤で
あって、有効量が哺乳動物の活性化T細胞におけるTh1反応を促進し、且つTh2反
応を抑制する量である薬剤。
2.前記サイトカイン発現の平衡異常が、Th1が抑制され、Th2が亢進されている
サイトカインプロフィールを特徴とする非ウイルス性疾患から成る請求項1に記
載の薬剤。
3.前記サイトカイン発現の平衡異常が、アレルギーから成る請求項1に記載の
薬剤。
4.前記サイトカイン発現の平衡異常が、自己免疫性疾患から成る請求項1に記
載の薬剤。
5.前記サイトカイン発現の平衡異常が、蠕虫病から成る請求項1に記載の薬剤
。
6.ウイルス性要因と非ウイルス性要因を含む疾患に罹患している哺乳動物の治
療用薬剤であって、非ウイルス性要因が活性化T細胞におけるTh1レベルの低下
とTh2レベルの上昇を特徴とし、該薬剤が有効量のリバビリンを含有し、該有効
量が活性化T細胞におけるTh1反応を亢進し、Th2反応を抑制する量であることを
特徴とする治療用薬剤。
7.前記疾患が原発性免疫不全を伴う請求項6に記載の薬剤。
8.前記疾患が続発性免疫不全を伴う請求項6に記載の薬剤。
9.前記ウイルス性要因がヒト免疫不全ウイルスを含む請求項6に記載の薬剤。
10.進行の少なくとも一部がT細胞の関与を受ける疾患の治療用薬剤であって
、該薬剤が有効量のリバビリンを含有し、該有効量がTh1反応を亢進しTh2反応を
抑制する用量であることを特徴とする治療用薬剤。
11.前記疾患がC型肝炎から成る請求項10に記載の薬剤。
12.有効量が一日あたり、哺乳動物の体重1kgに対して約4.5mgであることを特
徴とする請求項10に記載の薬剤。
13.有効量が哺乳動物のリバビリン血中濃度を約0.25〜12.5μMに達しさせ
る量であることを特徴とする請求項10に記載の薬剤。
14.前記疾患がC型肝炎であり、有効量が患者のリバビリン血中濃度を約0.25
〜12.5μMに達しさせる量であることを特徴とする請求項10に記載の薬剤。
15.前記疾患がアレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、蠕虫感染およびリーシ
ュマニア症から成る群から選択される請求項10に記載の薬剤。
16.前記疾患が原発性あるいは続発性免疫不全症である請求項10に記載の薬
剤。
17.Th1反応の亢進が、インターロイキン2(IL-2)、腫瘍壊死因子(TNF
α)およびインターフェロンガンマ(IFNγ)の産生増加を特徴とする請求項1
0に記載の薬剤。
18.更にインターフェロンαを含む請求項10から16に記載の薬剤。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61P 37/08 A61K 31/00 637E
// C07H 19/056 C07H 19/056
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S
Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD
,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ
,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,
CU,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,G
E,HU,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR
,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,
MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,P
L,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK
,TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,UZ,
VN
(72)発明者 ラマサミー,カンダサミー
アメリカ合衆国、カリフオルニア・92653、
ラグナ・ヒルズ、ロツキー・クリーク・レ
イン・5
(72)発明者 アベレツト,デブロン
アメリカ合衆国、カリフオルニア・92612、
アービン、トリニテイ・26
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. 患者の活性化T細胞におけるリンホカインの発現を調節するためのリバビ リンの使用。 2. Th1のレベルを上昇させ、Th2のレベルを低下させるのに有効な投薬 量でリバビリンを投与する、請求項1に記載の使用。 3. Th1を標準以下に低下させ且つTh2を標準以上に増大させるサイトカ インプロフィールを特徴とする非ウイルス疾患を治療するためのリバビリンの使 用。 4. 前記疾患がアレルギーを包含する、請求項3に記載の使用。 5. 前記疾患が自己免疫疾患を包含する、請求項3に記載の使用。 6. 前記疾患が寄生虫病を包含する、請求項3に記載の使用。 7. ウイルス性要因と非ウイルス性要因とを有する疾患の非ウイルス性要因を 治療するためのリバビリンの使用であって、該非ウイルス性要因は、活性化Tリ ンパ球のTh1レベルが低く且つTh2レベルが高いことを特徴とする前記使用 。 8. 前記疾患が原発性免疫不全を包含する、請求項7に記載の使用。 9. 前記疾患が続発性免疫不全を包含する、請求項7に記載の使用。 10. 前記ウイルス性要因にはヒト免疫不全ウイルスが関与する、請求項7に 記載の使用。 11. Th1又はTh2の発現の調節における以下の化合物:〔ここで、Xは、O、S、CH2、CHOH又はN−CO−R11であり; A、B及びCは独立に、N、P、CH、C−OH、C−CH3、C−アルキル 、C−アルケニル、C−CH2、−CN、C−ハロゲン、C−CN、C−COO CH3、C−NH2、C−SNH2、C−SO2−NH2、C−CONH2、C−CS −NH2、C−C(NH)NH2、CPO2−NH2又はC−複素環系であり; Dは、S、Se、Te、PH、NH又はNH12であり; R1は、H、(CH2)p(OH)、ハロゲン、CN、(CH2)pONH2、( CH2)pNH2、CH3、CH2SPH又は(CH2)−複素環であり; R2は、H、OH、OCH3、SH、SCH3、ハロゲン、CN、NH2、ONH2 、NHCH3、(CH2)OH、(CH2)pNH2、CH3又はCOOMeであり ; R3、R4、R5、R6、R7及びR8は独立に、H、OH、OCH3、SH、SC H3、ハロゲン、CN、NH2、ONH2、NHCH3、(CH2)OH、(CH2) pNH2、CH3、COOMe又はフェニルであり; R9は、H、ハロゲン、NH2、CH3、CONH、CSNH2、COOMe、S NH2、SO2NH2、PO2NH2、(CH2)p、(CH2)p−複素環系又は( CH2)p−グルコースであり; R10は、H、ハロゲン、NH2、CH3、CONH、CSNH2、COOMe、 SNH2、SO2NH2、PO2NH2、(CH2)p、(CH2)p−複素環系、( CH2)p−グルコース、O−CH3、O−CH2CH3又はアミノ酸であり; Yは、O、S、NH・HCl、NOH、NOCH3又はNOCH2PHであり; R10とYは組み合わされると、チアゾール、イミダゾールなどの複素環系を形 成し; R11は、CH3(CH2)pNH2、(CH2)p−複素環、(CH2)p−アミ ノ酸又は(CH2)p−糖(グルコースなど)であり; pは0〜8の整数であり; 上記には、LヌクレオシドもDヌクレオシドも包含される〕のいずれかの使用 。
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2008
- 2008-01-09 JP JP2008002369A patent/JP2008133293A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2009529543A (ja) * | 2006-03-14 | 2009-08-20 | ホールサム バイオファーム ピーティーワイ エルティーディー | アレルギー性疾患を治療するための方法および組成物 |
JP7109056B2 (ja) | 2018-05-17 | 2022-07-29 | 静岡県公立大学法人 | S-icaリボシルホモシステインの製造方法 |
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