DE69729796T2

DE69729796T2 - Verwendung von synergistischen zusammensetzungen von il-12 und ifn-alpha für die behandlung von infektiösen krankheiten

Info

Publication number: DE69729796T2
Application number: DE69729796T
Authority: DE
Inventors: Gottfried Alber; Anne Jacqueline Ware CARR; Albert Frank MATTNER; John Michael Rochford MULQUEEN; Kathrin Palmer; Andre Jane St. Albans ROGERSON
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1996-05-13
Filing date: 1997-05-07
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2017-05-08
Also published as: ATE270556T1; WO1997042969A1; EP0907373A1; US5928636A; AR007051A1; GB9609932D0; BR9709238A; JP3246918B2; ES2224246T3; TR199802329T2; EP0907373B1; PT907373E; CA2253490C; CA2253490A1; DE69729796D1; CN1178694C; CN1218410A; JP2000504029A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Vorbeugung und Behandlung von infektiösen Erkrankungen unter Verwendung einer synergistischen Kombination von Interleukin-12 (IL-12) und Interferon-α (IFNα). Diese Kombination ist besonders nützlich für die Prophylaxe und Behandlung von chronischen infektiösen Erkrankungen, z. B. viralen Infektionen, intrazellulären bakteriellen Infektionen und parasitären Infektionen.
Infektiöse Erkrankungen sind Hauptursachen für die Sterblichkeit und Morbidität von Erwachsenen (Marglois (1993) J. Infect. Dis. 168, 9–14). Beispielsweise wurde die durch Viren hervorgerufene Lebererkrankung mit der Induktion von Zirrhose und primären Leberkarzinomen in Zusammenhang gebracht, wodurch die damit verbundenen 1,5 Millionen Todesfälle pro Jahr erklärbar sein können. Gegenwärtige Schätzungen gehen davon aus, dass über 300 Millionen Menschen weltweit Träger einer chronischen Hepatitis B-Infektion sein können, mit mehr als 50 Millionen neuen Fällen jährlich (Finter et al. (1991) Drugs 42, 749–765). Auch chronische Hepatitis C-Infektion wurde mit der darauffolgenen Entwicklung von Leberzirrhose und hepatozellulärem Karzinom (3) in Verbindung gebracht, obwohl sie weniger häufig ist, und sie kann die Hauptursache von Lebererkrankungen in den westlichen Nationen darstellen (Scrip 2170 (1996) S. 20). Diese Virusinfektionen stellen daher Gebiete mit großem medizinischen Bedarf dar.
Die Persistenz dieser Infektionen wurde mit der Induktion von T-Zell-Toleranz und dem Misslingen, den Virus zu entfernen, in Verbindung gebracht (Reis & Rouse (1993) Immunol. Today 14, 333–335). Die gegenwärtige Therapie mit Typ I-Interferonen, insbesondere IFNα, war erfolgreich dabei, die Beseitigung des Virus zu fördern, was durch das Verschwinden von viraler RNA aus dem Serum und die Serokonversion von Patienten gemessen werden kann. Es ist jedoch im Allgemeinen nur bei einem Teil der Patienten ein anhaltender Nutzen erkennbar, wobei 25–30% der Hepatitis-B-Patienten (Finter et al., loc. cit.) langfristige Reaktionen zeigen. Hepatitis C-Patienten sprechen unterschiedlich darauf an, was vom Genotyp des infizierenden Virus abhängig sein kann (Clarysse et al. (1995) Netherlands J. Med. 47, 265–271). Die Nebenwirkungen der Typ I-IFN-Therapie einschließlich "grippeartiger" Symptompe, Müdigkeit, Gewichtsverlust und verringerter Thrombozytenzahl, limitieren die in der Klinik routinemäßig verwendete Maximaldosis und können für die beobachteten relativ geringen Antwortraten verantwortlich sein. Daher besitzen Therapien, welche die Wirkungen von Typ I-IFN ergänzen können, das Potenzial, die Antwortrate zu steigern und den klinischen Nutzen einer Immuntherapie bei chronischer Hepatitisvirusinfektion zu verbessern.
Interleukin 12 (IL-12), früher als ein die natürlichen Killerzellen stimulierender Faktor bezeichnet, (Kobayashi et al. (1989) J. Exp. Med. 170, 827–845) und zytotoxischer lymphozytischer Reifungsfaktor (Stern et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6808–6812), besitzen in verschiedenen murinen Tumormodellen eine wirksame Antitumor- und Antimetastasen-Aktivität (Brunda et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 1223–1230; Nastala et al. (1994) J. Immunol. 153, 1697–1706). Obwohl der Mechanismus, durch welchen IL-12 seine Antitumorwirkungen ausübt, nicht vollständig verstanden ist, wurde gezeigt, dass IL-12 bei natürlichen Killer- und T-Zellen in vitro eine Vielzahl von biologischen Effekten hervorruft (Manetti et al. (1994) J. Exp. Med. 179, 1273–1283; Wu et al. (1993) J. Immunol. 151, 1938–1949; Tripp et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3725–3729; Seder et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10188–10192; Bloom et al. (1994) J. Immunol. 152, 4242–4254; Cesano et al. (1993) J. Immunol. 151, 2943–2957; Chan et al. (1992) J. Immunol. 148, 92–98). Die Aktivierung von zytotoxischen T-Lymphozyten durch IL-12 wird als entscheidend für dessen Antitumorwirkung betrachtet (Brunda et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 1223–1230). Die Antitumorwirkung von IL-12 wird besonders in Mäusen mit schwerem kombiniertem Immundefekt (SCID) und in nackten Mäusen, die beide T-Zell-defizient sind, und in CD8⁺-depletierten euthymischen Mäusen aufrechterhalten (Brunda et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 1223–1230; O'Toole et al. (1993) J. Immunol. 150, 294A). Diese Ergebnisse zeigen, dass IL-12 wirksame Antitumor- und antimetastatische Wirkungen gegen Murintumore in vivo besitzt, und sie zeigen ebenso die entscheidende Rolle von CD8⁺-T-Zellen bei der Vermittlung der Antitumorwirkungen gegen subkutane Tumore.
Interferone (IFNs) sind natürlich auftretende Proteine, die antivirale, antiproliferative und immunoregulatorische Aktivität besitzen. Es ist bekannt, dass vier bestimmte Klassen von Interferonen in Menschen existieren (Pestka et al. (1987) Ann. Rev. Biochem. 56, 727–777 und Emanuel & Pestka (1993) J. Biol. Chem. 268, 12565–12569). Die IFNα-Familie stellt die vorherrschende Klasse von IFNs dar, die durch stimulierte peripherale Blutleukozyten gebildet wird (Pestka et al. loc. cit.; Havell et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 2185–2187; Cavalieri et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 3287–3291), und lymphoblastoide und myeloblastoide Zelllinien (Familletti et al. (1981) Antimicrob. Agents. Chemother. 20, 5–9). Die antivirale Wirkung von IFNα wird nicht durch direkten Einfluss auf die Viren selbst, sondern durch eine Wirkung auf ihre Zielzellen im Sinn eines Schutzes gegen die Virusinfektion erzielt. Die Interferone können Wirkungen auf Krebstumore ausüben, und sie können das Immunsystem des Körpers beeinflussen, indem sie beispielweise Makrophagen und NK-Zellen aktivieren und die Expression von verschiedenen immunologisch signifikanten Bestandteilen der Zellmembran steigern. Einzelheiten der Bildung von Interferon-cDNA und deren direkte Expression insbesondere in E. coli waren Gegenstand vieler Publikationen. So ist z. B. die Herstellung von rekombinanten Interferonen aus Nature 295 (1982), 503–508, Nature 284 (1980), 316–320, Nature 290 (1981), 20–26, Nucleic Acids Res. 8 (1980), 4057–4074, und auch aus den europäischen Patenten Nr. 32134, 43980 und 211 148 bekannt.
IFNα hat sich bei der Behandlung von viralen Infektionen, z. B. von sowohl Hepatitis-B- als auch Hepatitis C-Virus (HBV, HCV)-Infektionen als wirksam erwiesen, obwohl eine beachtliche Anzahl von Patienten nicht auf dieses Zytokin reagieren. Die Fähigkeit von IL-12 sowohl die Th1-Maturation als auch die Steigerung der CTL- und NK-Aktivität zu fördern, ist wohl entscheidend für dessen Fähigkeit, in Mausmodellen von viralen Infektionen gegen eine Erkrankung zu schützen (Orange et al. (1994) J. Immunol. 152, 1253–1264).
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Vorbeugung und Behandlung von infektiösen Erkrankungen unter Verwendung von IL-12 in einer synergistischen Kombination mit IFNα. Überraschenderweise fördern suboptimale Dosen von IL-12 und IFNα den wirksamen Schutz gegen infektiöse Erkrankungen in vitro und in vivo, insbesondere gegen virale und parasitäre Infektionen und intrazelluläre bakterielle Infektionen.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird eine synergistische Kombination von IL-12 und IFNα zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger bereitgestellt, die bei der Behandlung und Prophylaxe von infektiösen Erkrankungen, bevorzugt chronischen infektiösen Erkrankungen und weiter bevorzugt viralen Infektionen, z. B. Herpes (HSV), HIV, Hepatitis B, Hepatitis C, etc., intrazellulären baktierellen Infektionen, z. B. Tuberkulose, Salmonellose, Listeriose, etc., und parasitären Infektionen, z. B. Malaria, Leishmaniase, Schistosomiase, wirksam ist. Diese Zusammensetzungen sind durch die synergistische Zusammenwirkung von IL-12 und IFNα gekennzeichnet. Sie werden auf verschiedene Wege, einschließlich parenteral, leicht verabreicht und können in Dosierungen gegeben werden, die sicher und ausreichend sind, um infektiöse Erkrankungen zu behandeln oder ihnen vorzubeugen. Die obigen pharmazeutischen Zusammensetzungen können zusätzliche Verbindungen enthalten, die zur Behandlung von infektiösen Erkrankungen nützlich sind. Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung der obigen Verbindungen zur Herstellung von Medikamenten für die Behandlung und Prophylaxe von infektiösen Erkrankungen, die oben erwähnt wurden, bereit.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: In vitro-Differenzierung von murinen T-Helfer-Lymphozyten in mature Th1- oder Th2-Zellen. CD4⁺-T-Lymphozyten wurden aus Mausmilz gereinigt. Die Zellen wurden mit immobilisierten Anti-CD3-Antikörpern aktiviert. Nach 5 Tagen Inkubation mit IL-12, IL-4 und/oder IFNα wurden die Überstände durch ELISA auf IFNγ und IL-10 analysiert.
2: IFNγ-Bildung durch T-Helfer-Lymphozyten, die mit IL-12 und/oder IFNα differenziert wuren. Gereinigte CD4⁺-Splenozyten wurden mit Anti-CD3 aktiviert. Die Zellen wurden für 5 Tage in einem IL-12- und/oder IFNα-haltigen Medium inkubiert.
3: IL-10-Bildung durch T-Helfer-Lymphozyten, die mit IL-12 und/oder IFNα differenziert wurden. Gereinigte CD4⁺-Splenozyten wurden mit Anti-CD3 aktiviert. Die Zellen wurden für 5 Tage in einem IL-12- und/oder IFNα-haltigen Medium inkubiert. IL-10 wurde durch ELISA bestimmt.
4: Die gemeinsame Verabreichung von IL-12 und IFNα schützt gegen eine systemische HSV-Infektion: BALB/c-Mäuse (15 pro Gruppe) wurden nach Behandlung mit IL-12, IFNα oder einer Kombination dieser beiden Zytokine mit HSV-2 infiziert, wie im Abschnitt Methoden beschrieben. Die Sterblichkeit wurde bis zum 20. Tag p. i. täglich untersucht und mit der von infizierten, nicht behandelten Kontrolltieren verglichen.
5: Wirkung der IFNγ-Depletion auf den IL-12 + IFNα-Schutz gegen HSV-Infektion: An den Tagen –3, –1, 0, 2 und 4, bezogen auf den Zeitpunkt der Infektion mit HSV-2, wurde Anti-Interferon-γ-Antikörper (XMG 1,2, 100 μg i. p.) verabreicht. Die Tiere wurden wie in den Beispielen erläutert mit IL-12 und IFNα behandelt.
6: IFNγ-Bildung durch Milzzellkulturen, die mit HSV-2-Antigen stimuliert wurden: IFNγ-Bildung aus UV-aktivierten HSV-2-stimulierten Milzzellen, die am Tag 10 nach Infektion kultiviert wurden.
7: Die gemeinsame Verabreichung von IL-12 + IFNα schützt gegen eine systemische mCMV-Infektion: BALB/c-Mäuse (15 pro Gruppe) wurden nach Behandlung mit IL-12, IFNα oder einer Kombination dieser beiden Zytokine mit mCMV infiziert, wie im Abschnitt Methoden erläutert. Die Sterblichkeit wurde bis zum Tag 14 p. i. täglich untersucht.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung einer synergistischen Kombination von IL-12 und IFNα für die Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von infektiösen Erkrankungen, insbesondere chronischen infektiösen Erkrankungen, bereit. Diese infektiösen Erkrankungen werden durch die Übertragung von viralen, bakteriellen, parasitären und anderen Mikroorganismen verursacht. Eine besondere Verwendung der synergistischen Kombination von IL-12 und IFNα gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von Medikamenten zur Prophylaxe und Behandlung von viralen Erkrankungen, bevorzugt chronischen viralen Infektionen, z. B. Hepatitis, Herpes, Papilloma, oder humanen immundefizienten Virusinfektionen. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung der obigen Verbindungen zur Prophylaxe und Behandlung von bakteriellen infektiösen Erkrankungen, bevorzugt intrazellulären bakteriellen infektiösen Erkrankungen, z. B. Tuberkulose, Salmonellose oder Listeriose. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der obigen Verbindungen zur Behandlung von parasitären Infektionen. Parasitäre infektiöse Erkrankungen umfassen Infektionserkrankungen wie Malaria, Leishmaniase oder Schistosomiase.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung auch die entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zur Behandlung der obigen Erkrankungen nützlich sind. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine synergistische Kombination aus IL-12, IFNα und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten. Diese Zusammensetzungen können ein oder mehrere zusätzliche Komponenten enthalten, die für die Prophylaxe und Behandlung von infektiösen Erkrankungen nützlich sind.
Die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung zeigen, dass suboptimale Dosen an IL-12 und IFNα synergistisch wirken können, um einen Schutz gegen infektiöse Erkrankungen bereitzustellen, und dies wird zumindest teilweise durch IFNγ vermittelt. Überraschenderweise zeigen Daten aus in vitro-Experimenten eine erhöhte Bildung von IFNγ aus Milzzellen von mit IL-12/IFNα behandelten Tieren. Somit unterstreicht eine gesteigerte Th1-Reaktion auf infektiöse Erkrankungen die nützlichen Wirkungen einer IFNα/IL-12-Kombinationstherapie.
Es wurde ein in vivo Th1/Th2-Differenzierungssystem angewendet, um die Rolle von IFNα und IL-12 zu analysieren. 1 veranschaulicht die prinzipiellen Merkmale der in vivo-Differenzierung von T-Helfer-Lymphozyten in mature Th1- oder Th2-Zellen. Das in 2 gezeigte Experiment zeigt eine synergistische Wirkung von IFNα mit suboptimalen Dosen von IL-12 bei der Induktion von IFNγ als ein Maß der Th1-Zellaktivität. Dies hängt mit der Inhibition der IL-10-Bildung (einem Th2-Lymphokin) durch IFNα zusammen (3).
Diese Daten werden in Herpesvirus-Infektionsmodellen, bei denen Herpes simplex-Virus-Typ 2 (HSV-2) und muriner Cytomegalovirus (mCMV) verwendet wird, weiter gestützt.
Systemische Infektion mit HSV-2
Nach einer i. p.-Infektion verteilt sich HSV-2 auf zahlreiche Stellen, insbesondere das peripherale und zentrale Nervensystem. Durch darauffolgende Replikation innerhalb des ZNS wird eine letale Enzephalitis gebildet. Es wurde gezeigt, dass sowohl IL-12 als auch IFNα einen dosisabhängigen Schutz vor den letalen Wirkungen von systemischer HSV-2-Infektion bieten. In Beispiel 2 wurden 50 ng IL-12 s. c. pro Maus und 20 ng IFNα i. p. pro Maus als suboptimale Dosen an Zytokinen verwendet, die noch 100% bzw. 80% HSV-induzierte Sterblichkeit erlauben (4). Wenn diese subtherapeutischen Dosen von sowohl IL-12 als auch IFNα zusammen verabreicht wurden, wurde eine sehr entscheidende Verbesserung des Überlebens am Tag 20 p. i. (p < 0,01) beobachtet, mit einer Verringerung der Sterblichkeit um 22% ± 9 (Tabelle 1), verglichen mit 94% ± 4 in Kontrollgruppen. Überstände, die aus mit UV-inaktivierten HSV-2-stimulierten Milzzellkulturen entnommen wurden, zeigten in den Kulturen, die von Tieren entnommen wurden, die Co-Therapie erhielten, größere Mengen an IFNγ als in solchen, die einer Monotherapie mit jedem Zytokin allein unterzogen wurden (6). Die stark erhöhte Überlebensrate, die bei Co-Therapie beobachtet wird, kann durch vorherige IFNγ-Depletion der Tiere unter Verwendung der IFNγ neutralisierenden Antikörper XMG 1,2 teilweise umgekehrt werden. Im Vergleich zur Co-Therapie ohne IFNγ-Depletion wird das Überleben um 30% verringert (p < 0,06) (5). Dies zeigte, dass IFNγ nur teilweise für den Schutz, der durch Co-Therapie geboten wird, verantwortlich ist.
Tabelle 1: Überlebensrate von Mäusen mit systemischer HSV-2 (333)-Infektion
Zosteriform-Infektion mit HSV2
Die Co-Verabreichung von IL-12 und IFNα verbesserte die Überlebensraten in dem Modell der schlimmeren Zosteriform-HSV-2-Infektion. Die Inokulation von HSV-2 auf der Hautoberfläche führt zu einer Infektion der sensorischen Neuronen, rückgerichtetem axonalem Transport des Virus zur sensorischen Ganglia und Replikation an dieser Stelle. Daraufhin tritt der Virus an Hautstellen auf, die von Axons der infizierten Ganglia innerviert sind, um die charakteristische Zosterläsion zu bilden. Die Tiere zeigen außerdem eine progressive Infektion des ZNS mit der Entwicklung von letaler Enzephalitis. Das Überleben dieser Infektion wurde durch die Verwendung von IL-12 und IFNα-Co-Therapie (Tabelle 2) entscheidend erhöht, um 40% verglichen mit unbehandelten Virus-infizierten Mäusen oder Mäusen, die allein mit Monotherapie behandelt wurden (p < 0,01). Durch die Co-Therapie wurde auch die Schwere der Zosterläsionsentwicklung verringert, obwohl diese Wirkung unterschiedlicher war (bedeutende Verringerung in 2 von 3 Versuchen).
Systemische Infektion mit mCMV
Die murine CMV-Infektion ruft in mehreren Geweben im Körper pathologische Veränderungen hervor, die Hauptstelle der viralen Replikation sind jedoch die azinösen Zellen der Speicheldrüsen. Man geht davon aus, dass der Tod aufgrund einer Schädigung des Organgewebes und der damit verbundenen immunmediierten Pathologie auftritt. Bei dieser letalen mCMV-Infektion ergaben in Kombination dosierte IL-12 und IFNα größere Überlebensraten als bei den Gruppen, die allein mit Monotherapie behandelt wurden. Eine Dosierung mit IL-12 allein mit 5–50 ng pro Maus i. p. an den Tagen –2 und –1 ergab 100%-igen Schutz vor letaler mCMV-Infektion, während eine Dosierung nach Infektion die Erkrankungspathologie nicht veränderte. Um eine suboptimale Dosierungsweise für IL-12 abzuleiten, wurde der Zeitpunkt der Infektion bezogen auf den Zeitpunkt der IL-12-Therapie um 2, 4 oder 6 Tage verzögert. Therapeutisch dosiertes IFNα ergab einen 20–30%-igen Schutz gegen mCMV-induzierte Sterblichkeit ohne klare dosisverwandte Wirkung. Frühere Experimente deuteten darauf hin, dass 400 ng IFNα i. p. pro Maus eine suboptimale Dosis darstellt. Eine Co-Administration dieser Dosis an IFNα zusammen mit IL-12-Therapie ergab erhöhte Überlebensraten gegenüber Kontrollen, die eine Virusinfektion oder allein Monotherapie erhielten (Tabelle 3). Diese Ergebnisse spiegeln die NK-Aktivität wider, die bei Verwendung von Milzzellen in einem ⁵¹Cr-Freisetzungsassay von Tieren, die auf dieselbe Weise mit IL-12 behandelt wurden, gemessen wurde. Die NK-Aktivität erfolgte maximal 2 Tage nach der IL-12-Behandlung und sank danach in einer zeitabhängigen Weise ab (Daten nicht gezeigt). Dies lässt vermuten, dass die NK-Aktivität bei dem in diesem Modell beobachteten IL-12-vermittelten Überleben eine Rolle spielt.
Tabelle 2: Überlebensrate von Mäusen mit HSV-2 (333)-Zosteriforminfektion
Tabelle 3: Überlebensrate von Mäusen, die mit murinem CMV infiziert wurden
Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass suboptimale Dosen von IL-12 und IFNα zusammen in vitro und in vivo einen wirksamen Schutz gegen infektiöse Erkrankungen begünstigten. Die Studien deuten an, dass ein verbessertes Überleben mit einer Erhöhung der Th1-Induktion zusammenhängen kann, da Milzzellen, denen eine Co-Therapie verabreicht wurde, nach in vitro-Stimulation hohe Mengen an IFNγ bildeten.
Auch bei der Verteidigung gegen intrazelluläre Bakterien (Listeria monocytogenes) ist die zentrale Rolle von IFNγ gezeigt worden. Durch eine Anti-IFNγ-Behandlung vor der Infektion wird die Suszeptibilität erhöht, während rekombinantes IFNγ die Resistenz steigert. Eine Hauptfunktion von IFNγ ist die Aktivierung von Makrophagen für deren mikrozide Wirkungen, z. B. Bildung von reaktiven oxidativen Intermediaten. Außerdem haben verschiedene Ergebnisse die Bedeutung von IFNγ für die Eliminierung von intrazellulären Parasiten (L. major) durch infizierte Wirte gezeigt. Es wurde gezeigt, dass die Zerstörung von Parasiten durch murine Makrophagen auf die IFNγ-induzierte Bildung von Stickoxiden durch diese Zellen zurückzuführen ist.
Insbesondere IL-12 und IFNα in einer synergistischen Kombination bieten bei der Behandlung von viralen Erkrankungen einen klaren und neuen Vorteil gegenüber Monotherapie, wie mit Modellen von experimenteller Herpesvirus-Infektion gezeigt wurde.
Die synergistische Kombinationstherapie bot einen bemerkenswerten Schutz gegen ansonsten letale systemische Virusinfektion (hier: HSV-2), in Dosisbereichen, die einzeln verabreicht nur geringfügig wirksam waren. Durch die Kombinationstherapie wurde auch die mit letaler HSV-2-Zosteriform-Infektion zusammenhängende Sterblichkeit entscheidend verringert, und es konnte entscheidenderweise gezeigt werden, dass dadurch in diesem Modell der Infektion auch die Schwere der Läsion verringert wird. Diese letztere Beobachtung bietet einen Hinweis darauf, dass eine Kombinationstherapie bei der Begrenzung klinischer Manifestationen von viralen Erkrankungen wirksam wäre. IL-12 und IFNα in einer synergistischen Kombination verbesserten außerdem deutlich die Überlebensrate bei einer ansonsten letalen mCMV-Infektion, die wir bisher mit denselben Behandlungen einzeln verwendet nicht beeinflussen konnten.
In den Beispielen wurde IL-12 prophylaktisch verabreicht, d. h. zu einem Zeitpunkt bevor die Mäuse viralem Antigen ausgesetzt wurden. Es schien somit wahrscheinlich, dass der Beitrag von IL-12 zu der bemerkenswerten Wirkung der Kombinationstherapie durch nicht-spezifische Mechanismen bewirkt würde, insbesondere durch die Induktion von IFNγ. Die Daten zeigten, dass ein wesentlicher Teil des Schutzes, der durch Co-Therapie geboten wird, aufgrund der Induktion von IFNγ erfolgte. Die synergistische Wirkung von IL-12/IFNα in Kombination auf das in vivo beobachtete Überleben kann mit der Antigenspezifischen Induktion der IFNγ-Produktion durch Milzzellen in vitro in Beziehung gesetzt werden.
Sowohl IL-12 als auch IFNα sind natürlich auftretende Moleküle, die einen Einfluss auf Wirts-Immunreaktionen ausüben, und beide Zytokine besitzen ein Potenzial für die Behandlung von Viruserkrankungen. Soweit bekannt ist, sind die Wirkungsweisen von IL-12 und IFNα ziemlich unterschiedlich, obwohl derzeitige Hinweise darauf schließen lassen, dass es einen Weg geben könnte, durch den IFNα die Expressionswerte von IL-12 beeinflusst. Die Folge der Induktion jedes einzelnen Zytokins (oder beider Zytokine) ist, dass eine immunologische Umgebung bereitgestellt wird, die für eine andauernde virale Infektion feindselig ist.
IL-12 übt antivirale Wirkungen aus, indem der Immunstatus beeinflusst wird. Insbesondere bewirkt IL-12 die Induktion von IFNγ, Steigerung der NK-Zell-Lyse von Virus-infizierten Zellen und die Induktion einer Th1-Typ-Antwort. Eine Folge der Entwicklung einer zellulären Antwort des Th1-Phänotyps ist, dass die Zytotoxizität von CD8⁺-T-Zellen auf Virus-infizierte Zellen gesteigert wird, und dass ein Wechsel der Immunglobulin-Klasse zu IgG2a, mit einer Inhibition der IgE-Synthese auftritt. Somit wird durch IL-12 die Umgebung für eine wirksame Virus Clearance optimiert.
Man nimmt an, dass IFNα im Gegensatz zu IL-12 nicht primär durch Immunmodulation wirkt, sondern eher einen allgemeinen antiviralen Zustand in einer infizierten Zelle induziert (Gresser et al. (1976) J. Exp. Med. 144, 1316–1323). An dem antiviralen Zustand ist die Induktion zellulärer Mechanismen beteiligt, die auf eine Reihe von Schritten in einem viralen Replikationszyklus zielen. IFNα aktiviert die durch Interferon stimulierten Antwortelemente (ISRE) im Zellkern, wodurch die Bildung mehrerer Proteine hervorgerufen wird. Diese beinhalten das Mx-Protein mit seiner spezifischen antiviralen Funktion (Weitz et al. (1986), J. Int. Res. 9, 679–689), eine Proteinkinase, die durch doppelsträngige RNA aktiviert wird, um den eukaryontischen Initiationsfaktor 2 zu phosphorylieren und im Gegenzug die Translation und somit Virusassemblierung zu blockieren (Hovanessian (1989) J. Interferon Res. 9, 641–647), und 2',5-Oligoadenylat-Synthetase, die an dem Abbau von neu gebildeten Viruskomponenten beteiligt ist (Pestka et al., loc. cit.).
Eine Kombination der IFNα-Therapie mit IL-12 würde Patienten auf doppelte Weise helfen, erstens kann die zentrale Rolle von IL-12 bei der Steuerung von Immunreaktionen die Toleranz gegenüber einem infektiösen Antigen brechen und zweitens würde die Wirkung von IL-12 auf zytotoxische T-Zell-Reaktionen dabei helfen, sicherzustellen, dass diese Reaktion ausreichend wäre, um eine völlige Clearance von dem infektiösen Mittel zu erleichtern. Dieser Zytokin-Kombinationsansatz für die Behandlung von infektiösen Erkrankungen besitzt das Potenzial für Auswirkungen in einem Gebiet mit entscheidendem medizinischen Bedarf.
Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass suboptimale Dosen von IL-12 und IFNα zusammen in vitro und in vivo einen wirksamen Schutz gegen infektiöse Erkrankungen bieten. Die Studien deuten an, dass besseres Überleben mit einer Erhöhung der Th1-Induktion in Beziehung gesetzt werden kann, da Milzzellen, denen eine Co-Therapie verabreicht wurde, nach in vitro-Stimulierung große Mengen an IFNα bildeten.
Interleukin-12 kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden, die z. B. in der europäischen Patentanmeldung Nr. 433 827, in den internationalen Patentanmeldungen WO 9005147 und WO 9205256, in Kobayashi et al., J. Exp. Med. 170, 827–845 (1989) und Stern et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6808–6812 beschrieben sind. Interleukin-12 kann durch bekannte herkömmliche chemische Synthesen oder durch rekombinante Methoden hergestellt werden, oder es kann aus natürlichen Quellen gereinigt werden.
IFNα, welches in der vorliegenden Zusammensetzung enthalten sein soll, kann von einem beliebigen natürlichen Material (z. B. Leukozyten, Fibroblasten, Lymphozyten) abgeleitet sein, oder es kann aus davon abgeleitetem Material (z. B. Zelllinien) erhalten werden oder durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden. Einzelheiten des Klonierens von IFNα und dessen direkte Expression insbesondere in E. coli waren Gegenstand vieler Veröffentlichungen. Die Hersellung von rekombinanten IFNs ist z. B. aus Gray et al. (1982) Nature 295, 503–508, Goeddel et al. (1980) Nature 284, 316–320 und (1981) Nature 290, 20–26, und dem europäischen Patent Nr. 174 143 bekannt. Es gibt viele Arten von IFNα wie beispielsweise IFNα1, IFNα2 und außerdem deren Subtypen einschließlich, aber nicht begrenzt auf IFNα2A, IFNα2B, IFNα2C und IFNα2II (auch als IFNα_II oder ω-IFN bezeichnet).
Die für pharmazeutische Zusammensetzungen geeigneten Bezeichnungen "IL-12" und "IFNα" umfassen auch Polypeptide, die dem gereinigten und/oder rekombinanten Protein gleichen aber Modifikationen aufweisen, die natürlich auftreten oder künstlich ausgearbeitet wurden, z. B. Moleküle, die Inversionen, Deletionen, Insertionen und Modifikationen enthalten (wie beispielsweise pegylierte Formen von IFNα und/oder IL-12) ebenso wie beliebige Hybrid- oder Konsens-IL-12- oder IFNα-Moleküle, die aus den vorhergehend erwähnten Molekülen erhältlich sind.
Um die synergistische Kombinationstherapie dieser Erfindung durchzuführen, wird IL-12 dem Patienten zusammen mit IFNα verabreicht, d. h. das IFNα wird innerhalb der gleichen oder verschiedenen Zeiträumen, während denen der Patient IL-12 erhält, verabreicht.
Pharmazeutisch annehmbare Formulierungen im Zusammenhang mit dieser Erfindung, die synergistische Kombinationen von IL-12 und IFNα enthalten, können unter Verwendung von Formulierungsverfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Formulierungen können durch Standardwege verabreicht werden. Im Allgemeinen können die Formulierungen parenteral verabreicht werden (z. B. intravenös, subkutan oder intramuskulär), wobei auch topische, transdermale, orale oder rektale Wege geeignet sind. Außerdem können die Formulierungen in bioabbaubaren Polymeren enthalten sein, wodurch eine andauernde Freisetzung von IL-12 und/oder IFNα ermöglicht wird, wobei die Polymere in der Umgebung der Stelle, wo die Zufuhr des Arzneimittels benötigt wird, implantiert werden. Die bioabbaubaren Polymere und ihre Verwendung werden beispielsweise ausführlich in Brem et al. (1991) J. Neurosurg. 74, 441–446 beschrieben. Die Dosierung von IL-12 und IFNα wird von der behandelten Erkrankung, der bestimmten Verbindung und anderen klinischen Faktoren wie beispielsweise Gewicht und Zustand des Menschen oder Tiers und dem Weg der Verabreichung von IL-12 abhängen. Es soll so verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung sowohl für menschliche als auch veterinäre Verwendung eingesetzt werden kann. Für eine parenterale Verabreichung beim Menschen ist im Allgemeinen eine Dosierung von zwischen ungefähr 1000 ng IL-12 und 10 ng/kg Körpergewicht, bevorzugt zwischen ungefähr 300 ng und 30 ng/kg 1 bis 3× wöchentlich ausreichend. Für IFNα ist im Allgemeinen eine Dosierung von zwischen ungefähr 50 μg und 0,1 μg/kg Körpergewicht, bevorzugt zwischen ungefähr 15 μg und 1 μg 1 bis 3× wöchentlich ausreichend. Es wird jedoch angenommen, dass die angegebene obere und untere Grenze überschritten werden kann, wenn dies angezeigt ist.
Die Formulierungen beinhalten solche, die für parenterale (einschließlich subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intradermale, intratracheale und epidurale) Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen können günstigerweise in Dosierungseinheitsform dargeboten werden und sie können durch herkömmliche pharmazeutische Techniken hergestellt werden. Solche Techniken beinhalten den Schritt, bei dem IL-12 und/oder IFNα und der/die pharmazeutische(n) Träger oder Hilfsstoff(e) zusammengebracht werden. Im Allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt, indem IL-12 und IFNα einheitlich und gründlich mit flüssigen Trägern in Verbindung gebracht werden. Für parenterale Verabreichung geeignete Formulierungen schließen wässrige und nicht wässrige sterile Injektionslösungen ein, die Antioxidanzien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten können, welche die Formulierung isotonisch mit dem Blut des bestimmten Empfängers machen; und sie schließen wässrige und nicht wässrige sterile Suspensionen ein, die Suspendiermittel und Verdicker enthalten können. Die Formulierungen können in Dosiseinheits- oder Multidosisbehältern dargereicht werden, beispielsweise in verschlossenen Ampullen und Vials, und sie können in gefriergetrocknetem (lyophilisiertem) Zustand gelagert werden, so dass nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers, z. B. Wasser für Injektionen, direkt vor der Verwendung erforderlich ist.
Bevorzugte Dosierungseinheitsformulierungen sind solche, die eine Tagesdosis oder Einheit, sub-tägliche Dosis wie hierin oben bezeichnet oder einen entsprechenden Teil des verabreichten Wirkstoffs enthalten.
Für die Herstellung von Tabletten, beschichteten Tabletten, Dragees oder harten Gelatinekapseln können den erfindungsgemäßen Verbindungen pharmazeutisch inerte, anorganische oder organische Hilfsstoffe beigemischt werden. Beispiele für geeignete Hilfsstoffe für Tabletten, Dragees oder harte Gelatinekapseln beinhalten Lactose, Maisstärke oder Derivate davon, Talkum oder Stearinsäure oder Salze davon.
Geeignete Hilfsstoffe für die Verwendung in weichen Gelatinekapseln beinhalten beispielsweise pflanzliche Öle, Wachse, Fette, halbfeste oder flüssige Polyole etc. Für die Herstellung von Lösungen und Sirups können Hilfsstoffe verwendet werden, einschließlich beispielsweise Wasser, Polyolen, Saccharose, Invertzucker und Glukose. Für injizierbare Lösungen beinhalten Hilfsstoffe, die verwendet werden können, beispielsweise Wasser, Alkohole, Polyole, Glyzerin und pflanzliche Öle. Für Suppositorien und eine lokale oder perkutane Anwendung enthalten Hilfsstoffe, welche verwendet werden können, z. B. natürliche oder gehärtete Öle, Wachse, Fette und halbfeste oder flüssige Polyole. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch Konservierungsmittel, Lösemittel, Stabilisatoren, Benetzungsmittel, Emulgatoren, Süßstoffe, Farbstoffe, Duftstoffe, Salze für die Variation des osmotischen Drucks, Puffer, Beschichtungsmittel oder Antioxidanzien enthalten. Sie können auch andere therapeutisch wertvolle Mittel enthalten.
Die folgenden Beispiele sollen Einzelheiten der Erfindung veranschaulichen.
Beispiele
Beispiel 1: In vitro-Maturation von Th1-Zellen
Die Experimente, welche die in vitro-Maturation von Th1-Zellen betreffen, wurden wie folgt durchgeführt:
a) murine Milzzellen:
Es wurden Milzen von 8–10 Wochen alten weiblichen C57BL7/6-Mäusen verwendet, um eine Einzelzellsuspension von Milzzellen in Hanks-Medium +1% FCS herzustellen. Erythrozyten wurden mit Geys-Lösung entfernt und voraktivierte Zellen wurden mit einer Percoll-Gradienten-Zentrifugation gemäß Standardverfahren entfernt (Cambier et al. (1987) Scand. J. Immunol. 27, 59).
b) Reinigung von CD4⁺
10⁷ Splenozyten pro ml wurden in Hanks-Medium inkubiert, 10 μg/ml mAb Anti-IA/IE (Klon M5/114, Bhattacharya et al. (1981) J. Immunol. 127, 2488) und 10 μg/ml mAb Anti-CD8 (Klon 53–6,7, Ledbetter et al. (1979) Immunol. Rev. 47, 63) wurden zugegeben. Nach 30 min Inkubation auf Eis und Waschen (3×) wurden die Zellen wieder suspendiert mit 5 × 10⁶ Zellen/ml. 100 μl magnetische Dynabeads (Schaf-Anti-Ratte) wurden zugegeben und nach 30 min Rotation bei 4°C wurden die Zielzellen (an die Partikel gebunden) mit einem Magnet entfernt. Die Reinheit der CD4⁺-Zellen betrug mehr als 90%. Diese Zellen wurden in Komplett-IMDM mit 10⁶ Zellen/ml wieder suspendiert.
c) Aktivierung von CD4⁺-Zellen
Es wurden 48-Well Zellkulturplatten mit mAb Anti-CD3 (Klon 2C11, Leo et al. (1987) PNAS 84, 1374) mit 5 μg/ml) beschichtet. Die Platten wurden gewaschen (3×) und es wurden pro Well 500 μl gereinigte CD4⁺-Zellsuspension und Zytokine (IL-12, IL-4, IFNα A/D, natives IFNα) und deren Kombinationen zugegeben. Nach einer Inkubation von 5 Tagen bei 37°C und 7,5% CO₂ wurden die Zellkulturen unter Verwendung kommerziell erhältlicher Lymphokin-spezifischer ELISAs auf IFNα und IL-10 untersucht.
Beispiel 2: Virusinfektion
a) Mäuse
Spezifizierte pathogenfreie weibliche BALB/c-Mäuse, im Alter von 6–8 Wochen, erhältlich von Harlan-Olac.
b) Virusstammlösungen
HSV-2 (Stamm 333) WT und mCMV-Smith-Stamm (ATCC Nr. VR-194) wurden in Zellkulturmonoschichten von Vero (ATCC Nr. CCL-81) und 3T3L1 (ECACC Nr. 86052701)-Zellen jeweils unter Verwendung von DMEM-Kulturmedium (Gibco Nr. 22320–022), welches 2% FCS enthielt, gezüchtet. Konfluente Zellmonoschichten wurden durch Rühren aus den Kolben entfernt, wenn vollständiger zytopathischer Effekt beobachtet wurde. Anschließend erfolgte Frost-Tau-Wechsel und Sonifikation, um den Virus freizusetzen, gefolgt von Klärung durch Zentrifugation bei 3000 rpm für 15 min. Durch ein Standard-Plaqueassay an Zellmonoschichten wurden die Virustiter bestimmt. Die von der Zellkultur erhaltene Stammlösung an mCMV ist in Mäusen in diesem Zustand nicht virulent, es wurde daher eine virulente Stammlösung hergestellt indem sie dirch Mäuse durchgeleitet wurde. Kurz, die abgeschwächte Stammlösung wurde in Mäuse i. p. injiziert und 10 Tage nach Infektion wurden die Speicheldrüsen ennommen. Das gesammelte Gewebe wurde anschließend homogenisiert, um den Virus freizusetzen und es wurde durch Zentrifugation bei 1400 rpm für 10 min geklärt. Der Überstand, der den infektiösen Virus enthielt, wurde anschließend erneut durch Mäuse durchgeleitet, um eine Stammlösung des Virus zu bilden, der eine 10%-ige Sterblichkeit in vivo hervorrufen könnte.
c) HSV-2-Infektion von Mäusen
Für eine systemische Infektion wurden die Tiere mit einer einzelnen i. p.-Injektion von 10⁴ bis 10⁵ pfu/100 μl infiziert. Die Tiere wurden täglich bis zum Tag 20 nach Infektion (p. i.) auf Sterblichkeit untersucht. Für die Zosteriform-Infektion wurden die Tiere an ihrer linken Flanke nach Skarifikation mit einer 25G-Nadel und Applikation eines 10 μl-Tröpfchens mit 10⁶ pfu Virus, infiziert. Die Tiere wurden täglich bis zum Tag 14 p. i. auf die Entwicklung von Zosteriformläsion und Sterblichkeit untersucht.
d) mCMV-Infektion von Mäusen
In allen Experimenten für eine letale Infektion wurden die Mäuse i. p. mit 5 × 10³ pfu Viruszubereitung, die aus Speicheldrüsen erhalten wurde, infiziert. Die Tiere wurden täglich auf Anzeichen der Infektion untersucht und die Todesraten bis zum Tag 15 p. i. aufgezeichnet.
e) Dosierung mit IL-12 und IFNα
50 ng rekombinantes murines-IL-12 (spezifische Aktivität 2,1 × 10⁶ U/mg (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ) wurde entweder i. p. oder subkutan (s. c.), einmal täglich in PBS + 1% w/v BSA in einem Volumen von 5 ml pro kg Körpergewicht durch Injektion verabreicht. Die therapeutische Dosierung begann 6 h nach Infektion und wurde anschließend täglich für weitere 4 Tage fortgesetzt. Die prophylaktische Therapie bestand aus zwei täglichen Injektionen vor der Infektion zu den in den Ergebnissen beschriebenen Zeitpunkten. Rekombinantes humanes IFNα-A/D (spezifische Aktivität 5 × 10⁷ U/mg (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ) wurde 2 Stunden vor Infektion in PBS + 1% w/v BSA in einem Volumen von 5 ml pro kg Körpergewicht durch i. p.-Injektion verabreicht und anschließend 4, 24, 48 und 72 Stunden p. i. Die Dosis lag im Bereich zwischen 20 und 400 mg/Tag.
f) In vivo-Depletion von IFNα
Ratten-anti-Maus-IFNγ-Antikörper, XMG 1,2 (Pestka et al. (1987) loc. cit.). Dieser IFNα-neutralisierende Antikörper wurde i. p. mit 5 ml pro kg Körpergewicht in sterilem Wasser zur Injektion verabreicht. Um eine IFNγ-Depletion in vivo zu bewirken, wurden den Mäusen an den Tagen –3 und –1 bezogen auf die Infizierung, und am Tag 0 und an den Tagen 2 und 5 nach Infektion insgesamt 5 Dosierungen von 100 μg pro Maus an IFNγ-Antikörper verabreicht. Durch diese Behandlung wurden die Werte an Serum-IFNγ, das in Reaktion auf IL-12-Behandlung gebildet wird, in vivo um ungefähr 95% verringert.
g) In vitro-IFNγ-Bildung
Von jeder Gruppe wurden am Tag 7 bis 10 nach Infektion Einzelzellsuspensionen aus Milzen gewonnen und anschließend bei 37°C in 5% CO₂ für 48 h in Komplett-RPMI 1640 (Gibco Kat. Nr. 52400–033) in Anwesenheit von 10³ pfu an UV-inaktiviertem HSV-2 kultiviert. Die Überstände wurden anschließend entfernt und bei –80°C eingefroren, bevor sie unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (Amersham Kat. Nr. RPN 2717) durch ELISA auf IFNγ-Werte untersucht wurden.

Claims

Verwendung einer synergistischen Kombination von Interleukin-12 (IL-12) und Interferon-alpha (IFN-) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und Vorbeugung von Infektionen.
Verwendung nach Anspruch 1 wobei die Infektion eine chronische Infektion ist.
Verwendung nach Anspruch 2 wobei die Infektion eine chronische Virusinfektion ist.
Verwendung nach Anspruch 3 wobei die Infektion eine Hepatitis-, Papillom-, Humanimmundefizienz- oder eine Herpesvirusinfektion ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 wobei die Infektion eine bakterielle Infektion ist.
Verwendung nach Anspruch 5 wobei die Infektion Tuberkulose, Salmonellose oder Listeriose ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 wobei die Infektion eine parasitäre Infektion ist.
Verwendung nach Anspruch 7 wobei die Infektion Malaria, Leishmaniase oder Schistosomiase ist.
Interleukin-12 und Interferon- in einer synergistischen Kombination zur Behandlung von Krankheiten wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 erwähnt.
Interleukin-12 und Interferon- in einer synergistischen Kombination mit einer oder mehreren weiteren Verbindungen zur Behandlung von Krankheiten wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 erwähnt.
Pharmazeutische Zusammensetzung die eine synergistische Kombination von Interleukin-12 und Interferon- zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger beinhaltet.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11 welche eine oder mehrere weitere Verbindungen enthält die zur Behandlung von Infektionskrankheiten nützlich sind.