DE69824584T2 - Verwendung von diterpenen wie hypoestoxiden zur herstellung eines medikamentes zur immunsuppression, krebs- und antiviralen therapie - Google Patents

Verwendung von diterpenen wie hypoestoxiden zur herstellung eines medikamentes zur immunsuppression, krebs- und antiviralen therapie Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 1. GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, die als immunsuppressive Mittel verwendet werden, sowie deren Anwendung in der Transplantationstherapie. Speziell richtet sich die Erfindung auf die Verwendung von Diterpen-Verbindungen und insbesondere auf Hypoestoxide, Derivate und Agonisten davon für Immunsuppression, Entzündung, Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung ("graft-versus-host-disease", GVHD), Hauterkrankungen und T-Zellen-vermittelte Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise Arthritis, systemischer Lupus Erythematosus, Thyroiditis, Multiple Sklerose, Glomerulonephritis, Diabetes und Allergie. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der Verbindungen zur Hemmung des Wachstums von Krebszellen und zur Hemmung des Wachstums von Lentiviren oder Herpetoviridae-Viren. Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung der Verbindungen zur Hemmung des Wachstums von Krebszellen.
  • 2. EINSCHLÄGIGER STAND DER TECHNIK
  • IMMUNSUPPRESSIVE MITTEL
  • Zahlreiche Humanerkrankungen sind gekennzeichnet durch übermäßige oder fehlerhafte Immunantworten. Bei der Transplantation greift das Immunsystem das überwiegende Histokompatibilitätskomplex (MHC)-ungleiche Spendergewebe an, was zur Transplantatabstoßung führen kann. Bei der Allergie oder Entzündung gibt es eine übermäßige Reaktion des Immunsystems auf ansonsten harmlose Antigene aus der Umgebung. Bei Autoimmunerkrankungen greift das Immunsystem normale Eigengewebe an. Bei Immunschwächeerkrankungen, wie beispielsweise der HIV-Infektion und bei AIDS, greift ein infektiöses Agens das Immunsystem des Wirtes an. Es gilt heute als anerkannt, dass die Immunsuppressionstherapie zur Behandlung jeder dieser Erkrankungen geeignet ist (Blood Reviews 1995; 9: 117–133). Die Entwicklung natürlich auftretender Sekundärmetabolite von Cyclosporin A (CsA), FK506 und Rapamycin als immunsuppressive Mittel hat die Organtransplantation durch deren Verwendung bei der Verhütung von Transplantatabstoßungen revolutioniert (TIBS 1993; 18: 334–338) sowie für GVHD (Ann. Hematol 1995; 71: 301–306). Allerdings gibt es schwerwiegende Nebenwirkungen im Zusammenhang mit der Verwendung dieser Medikamente, wie beispielsweise Nephrotoxizität, Neurotoxizität, Hepatotoxizität, endokrine Komplikationen und Knochen-Effekte (New Engl. J. Med. (1989) 321: 1725–1738; Kahan BD et al. Surgery (1985) 97: 125). Es gibt daher einen klinischen Bedarf zur Bereitstellung neuartiger Verbindungen für die wirksame Immunsuppression ohne diese Nebenwirkungen.
  • MITTEL GEGEN KREBS
  • Den stärksten Aufschwung seit vielen Jahrzehnten Forschung in der Tumorbiologie hat es mit der Hoffnung gegeben, dass sich wirksame therapeutische Mittel finden ließen, die gegen Tumorzellen zytotoxisch wirken und die sich zur Verhütung und Therapie von Krebs verwenden ließen.
  • Maligne Melanome nehmen weiterhin im Auftreten zu. Gegenwärtig liegen in der USA die malignen Melanome in der Häufigkeit ihres Auftretens von Krebs an der 5. Stelle. Während Frühstadien des Melanoms durch operatives Vorgehen in hohem Maße heilbar ist, bleibt die Prognose für Patienten mit fortgeschrittenen Schädigungen und/oder metastatischen Erkrankungen schlecht (Bezwoda, WR; Cancer Treat Rev. 1997; 23(1): 17–34). Die konventionelle Chemotherapie mit der Wirksamkeit eines einzigen Mittels zeigt eine geringe Frequenz und kurze Dauer der Reaktion (Cancer Treat Rev. 1997; 23(1): 17–34; Mayo Clin. Proc., 1997; 72: 367–371).
  • Metastatisches Nierenzellenkarzinom (RCC) ist gegenüber vielen systemischen Therapien in hohem Maße widerstandsfähig, die umfangreich untersucht wurden (Motzer RJ et al., Current Problems in Cancer, 1997; 21(4): 185–232). RCC tritt nahezu bei Männern 2 Mal so oft auf wie bei Frauen. Die erhöhte Verfügbarkeit von verbesserten und hoch komplizierten diagnostischen Methoden, wie beispielsweise die Ultraschallsonographie und die Computertomographie (CT) als Scanning-Methoden (Franklin JR et al., Seminars in Urologie Oncology, 1996; 14(2): 208–215) hat ein stetig zunehmendes Auftreten von RCC gezeigt. Die häufigste Malignität unter Frauen in den Entwicklungsländern ist das Zervixkarzinom (Morrow CP et al., J. Cell. Biochem., 1995; Erg. 23: 61–70) und steht in der Häufigkeit der Malignität des weiblichen Genitaltraktes in den Vereinigten Staaten an 3. Stelle (Miller BA et al., National Cancer Institute; NIH publication, 93–2789, 1993).
  • Alle nachfolgenden technologischen Fortschritte, einschließlich Therapie mit hoher Dosisrate, Behandlungsplanung, neue Isotope, neuartige Darstellungsmethoden und neue Maschinen, haben keinen messbaren klinischen Einfluss auf die Heilbarkeit des Zervixkarzinoms gezeigt (Morrow CP et al., J. Cell. Biochem., 1995; Erg. 23: 61–70).
  • Da Neurotoxizität und chemotherapeutische Medikamentenresistenz einige der klinischen Hauptprobleme im Zusammenhang mit dem Versagen in der Therapie des Humankrebses sind (Anticancer Drugs 1995; 6(3): 369–383; Curr Opin Oncol., 1997; 9(1): 79–87), besteht eine Nachfrage nach der Untersuchung neuartiger Mittel mit geringeren Nebenwirkungen und maximaler Wirksamkeit.
  • ANTIVIRALE MITTEL
  • Die Wechselwirkungen zwischen Viren und dem Immunsystem des Wirtes sind nicht nur kompliziert und faszinierend, sondern auch entscheidend für das Ergebnis der Infektion und die Strategie zur ihrer Verhütung. Das Ziel der antiviralen Chemotherapie besteht darin, die Replikation des viralen Genoms zu hemmen, ohne die DNA der Zelle zu beeinflussen.
  • Von der großen Zahl der Mittel, die sich für die Behandlung von Herpesvirus-Infektionen (Herpes Simplex Virus Typen 1 und 2 (HSV-1 und HSV-2), Varicella Zoster Virus (VZV), Cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr-Virus (EBV)) in der Entwicklung befinden, haben offensichtlich lediglich 10 zu einer klinischen Entwicklung geführt (Alrabiah FA and Snacks, SL; Drugs 1996: 52(1) 17–32). Obgleich Aciclovir bei der Behandlung von Herpes Simplex-Encephalitis (HSV-1) bevorzugt ist, bleiben Mortalität und Morbidität problematisch (Sköldenberg B; Scand. J. Infect Dis. Suppl., 100: 8–13, 1996). Das gleiche lässt sich von Interferon-alpha (IFN-α) und Interferon-beta (IFN-β) sagen. Obgleich beide IFN's über erhebliche antivirale und immunmodulatorische Wirkungen verfügen, ist deren Erfolg als antivirale Mittel bei Menschen durch ihre dosisbeschränkenden Nebenwirkung behindert gewesen (Balkwill, FR. Interferons; Lancet 1989; 1: 1060–1063). In den Entwicklungsländern ist HSV-2 die häufigste infektiöse Ursache für die Ulzeration der Geschlechtsorgane. Gegenwärtig ist jeder 5. Teenager (20%) in den Vereinigten Staaten mit Genitalherpes infiziert. Seit Anfang der 80er Jahre stand eine Reihe antiviraler Mittel zur Verfügung, die die Schwere der Erkrankung verringern können, jedoch hält die HSV-Infektion ein Leben lang an und wenn sie erst einmal aufgetreten ist, gibt es keine Behandlung, mit der sie eliminiert wird (Brugha, R. et al., Int. J. Epidemiol., 1997; 26: 698–709). Es besteht daher eine ungeheure Nachfrage zur Entwicklung neuer Vorgehensweisen und Mittel zur Eliminierung der HSV-Infektion.
  • Die Zahl der mit dem Human-Immunodeficiency-Virus vom Typ 1 (HIV-1) infizierten Personen wird in den Vereinigten Staaten gegenwärtig mit 1 bis 2 Millionen geschätzt und zwar bei einem weltweiten Auftreten von näherungsweise 20 Millionen. Bis zum Jahr 2000 schätzt man, dass mehr als 3 Millionen Amerikaner mit HIV-1 infiziert sein werden.
  • Bis vor Kurzem war die Behandlung von HIV-1-Infektion auf die Verwendung von Nukleosid-Inhibitoren der viralen Enzym-Revertase (RTI) beschränkt. Obgleich diese Mittel anfänglich vielversprechend waren, verfügen sie jedoch über eine lediglich mäßige antivirale Wirksamkeit und der Nutzen der Behandlung ist durch das Auftreten einer Medikamentenresistenz und dosisbeschränkender toxischer Wirkungen begrenzt (McDonald CK et. al., Arch. Inter. Med., 1997; 157(9): 951–959). Obgleich die HIV-Behandlung mit dem Nukleosid-Analog von RTI's und Protease-Inhibitoren das Grundgerüst der Anti-HIV-Therapie darstellt, sind Nicht-Nukleosid-RTI's, Immunmodulatoren und neue Zugänge in den bestehenden Klassen der pharmakologischen Mittel für die Zukunft vielversprechend (Hartman AF, Prim Care, 1997; 24(3): 531–560). Da die Kombinationstherapie mit zwei, drei oder mehreren Mitteln zum Standard der Heilbehandlung geworden ist, sind additive Toxizitäten zu einem Hauptproblem geworden.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • IMMUNSUPPRESSION
  • Die Erfindung der Anmelder beruht auf deren Entdeckung, dass eine ausgewählte Gruppe von Hypoestoxid-Analoga eine unerwartete Wirksamkeit als immunsuppressive Mittel besitzt.
  • Nach einem der Aspekte richtet sich die Erfindung auf Verbindungen der Formel
    Figure 00030001
    worin sind:
    R ist
    • (i) H, PO3 2–, Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, das substituiert oder unsubstituiert ist, geradkettig ist oder verzweigt, mit Null bis 6 Doppelbindungen, (CH2)n-Morpholin, worin n 1 bis 4 beträgt, Morpholinomethylphenyl, Orthoaminophenyl, Orthohydroxyphenyl, (CH2)nCOOR2, worin n 1 bis 4 beträgt; worin R2 H ist, ein Alkalimetallsalz, ein Erdalkalimetallsalz, NH4 +, N+(R3)4, worin R3 unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H und Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder
    • (ii) COR1, worin R1 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, (CH2)nCH3, worin n 1 bis 6 beträgt, (CH2)nCOOR2, worin n 1 bis 4 beträgt und R2 wie vorstehend festgelegt ist, (CH2)nN+(R3)4, worin n 1 bis 4 beträgt, und (CH2)nSO3 –, worin n 1 bis 4 beträgt;
    sowie pharmazeutisch zulässige Salze davon.
  • Ein verwandter Aspekt richtet sich auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame, immunsuppressive Menge der Verbindungen der Formel IV aufweisen.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zum Auslösen von Immunsuppression in Tieren, die einer immunsuppressiven Behandlung bedürfen. Das Verfahren umfasst das Verabreichen pharmazeutischer Zusammensetzungen an Tieren, die eine therapeutisch wirksame immunsuppressive Menge von Hypoestoxid (hierin bezeichnet als JO-4 und in Formel I veranschaulicht) aufweisen oder eine oder mehrere der Verbindungen der Formel IV.
  • Figure 00040001
  • MITTEL GEGEN KREBS
  • Die Erfindung der Anmelder beruht auf deren Entdeckung, dass eine ausgewählte Gruppe von Hypoestoxid-Analoga eine unerwartete Wirksamkeit als Mittel gegen Krebs besitzt. Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Hemmen des Wachstums von Krebszellen oder krebsartigen Tumoren. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Formel IV aufweist, an einen Patienten, der ein Krebsmittel oder Krebstherapie bedarf.
    Figure 00050001
    worin sind:
    R ist
    • (i) H, PO3 2–, Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, das substituiert oder unsubstituiert ist, geradkettig ist oder verzweigt, mit Null bis 6 Doppelbindungen, (CH2)n-Morpholin, worin n 1 bis 4 beträgt, Morpholinomethylphenyl, Orthoaminophenyl, Orthohydroxyphenyl, (CH2)nCOOR2, worin n 1 bis 4 beträgt; worin R2 H ist, ein Alkalimetallsalz, ein Erdalkalimetallsalz, NH4 +, N+(R3)4, worin R3 unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder
    • (ii) COR1, worin R1 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, (CH2)nCH3, worin n Null bis 6 beträgt, (CH2)nCOOR2, worin n 1 bis 4 beträgt und R2 wie vorstehend festgelegt ist, (CH2)nN+(R3)4, worin n 1 bis 4 beträgt, und (CH2)nSO3 –, worin n 1 bis 4 beträgt;
    sowie pharmazeutisch zulässige Salze davon.
  • Einer der Aspekte des Verfahrens umfasst die Verabreichung eines Hypoestoxids (hierin bezeichnet als JO-4A) mit der Formel:
  • Figure 00050002
  • ANTNIVIRALE MITTEL
  • Die Erfindung der Anmelder beruht auf deren Entdeckung, dass eine ausgewählte Gruppe von Hypoestoxid-Analoga eine unerwartete Wirksamkeit als wachstumshemmende Mittel gegen Lentiviren und gegen Viren der Familie Herpetoviridae, einschließlich, bzw. HIV-1 und HSV-1 und HSV-2, besitzt. Speziell umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Hemmen des Wachstums dieser Viren in Patienten. Das Verfahren umfasst das Verabreichen einer pharmazeutischen Zusammensetzung an einen eine antivirale Therapie bedürfenden Patienten, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Formel IV aufweist:
    Figure 00060001
    worin sind:
    R ist
    • (i) H, PO3 2–, Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, das substituiert oder unsubstituiert ist, geradkettig ist oder verzweigt, mit Null bis 6 Doppelbindungen, (CH2)n-Morpholin, worin n 1 bis 4 beträgt, Morpholinomethylphenyl, Orthoaminophenyl, Orthohydroxyphenyl, (CH2)nCOOR2, worin n 1 bis 4 beträgt; worin R2 H ist, ein Alkalimetallsalz, ein Erdalkalimetallsalz, NH4 +, N+(R3)4, worin R3 unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H und Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder
    • (ii) COR1, worin R1 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, (CH2)nCH3, worin n Null bis 6 beträgt, (CH2)nCOOR2, worin n 1 bis 4 beträgt und R2 wie vorstehend festgelegt ist, (CH2)nN+(R3)4, worin n 1 bis 4 beträgt, und (CH2)nSO3 –, worin n 1 bis 4 beträgt;
    sowie pharmazeutisch zulässige Salze davon.
  • In einem anderen Aspekt gewährt die Erfindung ein Verfahren zum Behandeln eines Patienten zur Milderung pathologischer Einflüsse des Wachstums von Viren der Lentivirus-Familie (z. B. HIV-1) und Herpetoviridae-Familie (z. B. HSV-1 und HSV-2) in dem Patienten. Das Verfahren umfasst die Verabreichung an den Patienten mindestens eines Hypoestoxids mit der Formel IV. Das Hypoestoxid wird an den Patienten in einer Menge verabreicht, die ausreichend ist, um das Wachstum dieser Viren in dem Patienten zu hemmen und dadurch die besagten Wirkungen zu hemmen.
  • Die vorstehend diskutierten Merkmale und Variablen der Erfindung und die damit zusammenhängenden Vorteile der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen leichter verstanden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die inhibitorische Wirkung von JO-4 bei einem Menschen mit gemischter Zweiwege-Lymphozytenreaktion. Es wurden PBMC's von zwei Personen in Gegenwart variierender Konzentrationen von JO-4 für 5 Tage in Co-Kultur genommen. Die Proliferation wurde mit Hilfe der 3H-Thymidin-Incorporation gemessen und als CPM und prozentuale Hemmung von Kontrollmulden ohne JO-4 ausgedrückt.
  • 2 zeigt die inhibitorische Wirkung von JO-4 an einer MLR-erzeugten Einweg-Human-T-Lymphozyten-vermittelten Zytolyse. Es wurden zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) aus einer Einweg-MLR in Abwesenleit oder Anwesenheit von JO-4 für 5 bis 7 Tage erzeugt. Am Ende der Kultur wurden die CTL geerntet und in einem 4-Stunden-51Cr-Release assay gegen aktivierte Lymphozyten getestet, die als Stimulatoren in der Einweg-MLR verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Lytische Einheiten (LU) und als prozentuale Hemmung ausgedrückt,
  • 3 zeigt die inhibitorische Wirkung von JO-4 auf proinflammatorische Cytokinsynthese. Es wurden Human-PBMC mit 5 μg/ml LPS in Abwesenheit oder Anwesenheit von 1,0 μg/ml JO-4 in 24-Mikrotiterplatten für 24 Stunden in Kultur genommen. Am Ende der Kultur wurden die Überstände geerntet und mit Hilfe der EIA auf Vorhandensein von IL-1β, TNF-α und IL-6 getestet. Die Ergebnisse sind als prozentuale Hemmung der Kontrollmulden ohne Medikament und in pg/ml des in dem Überstand vorhandenen Cytokins ausgedrückt.
  • 4 zeigt die inhibitorische Wirkung von JO-4A auf Human-Zweiweg-MLR. Die PBMC's von zwei Patienten wurden in Abwesenheit oder Anwesenheit variierender Konzentrationen von JO-4A für 5 Tage in Kultur genommen. Die Proliferation wurde mit Hilfe der 3H-Thymidin-Incorporation gemessen und als mittleres CPM ausgedrückt.
  • 5 zeigt die inhibitorische Wirkung von JO-4 auf LPS-induzierte Murin-Lymphozytenproliferation in vitro. Es wurden Maus-Milzzellen entweder bei Abwesenheit oder Anwesenheit variierender Konzentrationen von JO-4 für 48 Stunden mit LPS (5 μg/ml) in Kultur genommen. Die Proliferation wurde mit Hilfe der 3H-Thymidin-Incorporation gemessen und als ACPM ausgedrückt.
  • 6 zeigt die inhibitorische Wirkung von JO-4 auf die PHA-induzierte Proliferation von Human-PBMC. Es wurden Human-PBMC mit PHA (15 μg/ml) entweder in Abwesenheit oder Anwesenheit variierender Konzentrationen von JO-4 für 4 Tage in Kultur genommen. Die Proliferation wurde mit Hilfe der 3H-Thymidin-Incorporation gemessen und als ACPM und prozentuale Hemmung der Kontrollmulden ohne Medikament ausgedrückt.
  • 7 zeigt die Toxizität von JO-4 auf Human-PBMC. Es wurden Human-PBMC entweder in Abwesenheit oder Anwesenheit variierender Konzentrationen von JO-4 in Kultur genommen. In unterschiedlichen Zeitabständen wurde die Lebensfähigkeit mit Hilfe des Trypan-Blau-Farbstoff- Ausschlusstests bestimmt und als prozentuale Lebensfähigkeit der Gesamtzahl der gezählten Zellen ausgedrückt.
  • 8 zeigt die Wirkungen von JO-4A auf die NK-Aktivität in vivo. Es wurden Mäuse mit variierenden Konzentrationen von JO-4A entweder durch intravenöse (A) oder orale (B) Verabreichung behandelt. Es wurden Milzzellen auf NK-Funktion unter Verwendung von YAC-1-Targets in einem 4-Stunden-51Cr-Release assay getestet.
  • 9 zeigt die dosisabhängigen zytotoxischen Wirkungen von JO-4A auf verschiedene Humankrebszellen. Es wurden Zelllinien von zervikalen Human-Epithelkrebs, Nierenkarzinom und malignen Melanom für 72 Stunden entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von JO-4A in Kultur genommen. Die Zytotoxizität wurde mit Hilfe eines kolorimetrischen (MTT)-Assays bestimmt.
  • 10 zeigt die dosisabhängigen zytotoxischen Wirkungen von JO-4A auf normale Humanzellen verschiedenen Gewebewsprungs. Es wurden normale zervikale Human-Ektoepithelzellen, periphere Blut-Mononuklearzellen, epitheliale Mammazellen und umbilikale Venen-endothele Zellen entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von JO-4A für 72 Stunden in Kultur genommen. Es wurde die Zytotoxizität mit Hilfe des kolorimetrischen (MTT)-Assays bestimmt.
  • 11 zeigt die dosisabhängige zytotoxische Wirkung von JO-4A auf eine Zelllinie eines malignen Maus-Melanoms (B16-F1). Es wurden B16-F1-Zellen entweder in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von JO-4A für 72 Stunden in Kultur genommen. Die Zytotoxizität wurde mit Hilfe eines kolorimetrischen (MTT)-Assays bestimmt.
  • 12A zeigt die Wirkung einer oralen Verabreichung von JO-4A auf ein malignes Maus-Melanom (B16-F1)-Volumen in C57BL/6 (B6)-Mäusen. B6-Mäuse erhielten 50.000 lebensfähige B16-F1-Zellen subkutan (s. c.). Die Mäuse in den Versuchsgruppen erhielten unterschiedliche Konzentrationen an JO-4A oral täglich beginnend vom Tag 4 nach der Tumorimplantation. Das Tumorvolumen wurde am Tag 12 unter Verwendung eines Mikrotasters gemessen.
  • 12B zeigt die Wirkung einer oralen Verabreichung von JO-4A auf das Überleben von B6-Mäusen mit malignem Melanom (B16-F1). B6-Mäuse erhielten 50.000 lebensfähige B16-F1-Zellen subkutan (s. c.). Die Mäuse in den Versuchsgruppen erhielten unterschiedliche Konzentrationen an JO-4A oral täglich ab dem 4. Tag nach der Tumorimplantation bis zum 20. Tag. Die prozentuale Überlebensrate der Mäuse in den Versuchsgruppen wurde berechnet, nachdem alle Mäuse in der nichtbehandelten Kontrollgruppe gestorben waren (Tag 28).
  • 13 zeigt die Wirkung einer oralen Verabreichung von JO-4A auf das Überleben von B6-Mäusen mit Melanom (B16-F1). B6-Mäuse erhielten 50.000 lebensfähige B16-F1-Zellen subkutan (s. c.). Die Mäuse in den Versuchsgruppen erhielten JO-4A (2 mg/kg) oral täglich vom Tag 4 bis zum Tag 20.
  • 14 zeigt die Wirkung von JO-4A in Kombination mit IFN-alpha auf das Wachstum von malignem Human-Melanom in vitro.
  • 15A zeigt die inhibitorische Wirkung von JO-4A auf die HIV-1-Replikation in aufgezogenen mononukleären Humanzellen von peripherem Blut (PBMC). Es wurden Human-PBMC mit PHA aktiviert und mit HIV-1-Isolat von einem Patienten infiziert. Die infizierten PBMC wurden für 7 Tage entweder in Abwesenheit oder in Anwesenheit variierender Konzentrationen von JO-4A (0,0001 μM bis 0,5 μM) in Kultur genommen. Am Ende der Kultur wurden die Überstände aufgenommen und mit Hilfe der ELISA auf Vorhandensein von p24-Antigen gemessen.
  • 15B zeigt die Toxizitätstests von JO-4A auf kultivierte normale Human-PBMC's, die für 3 Tage mit PHA aktiviert worden waren. Die aktivierten PBMC's wurden mit 3% IL-2 für 7 Tage entweder in Abwesenheit oder in Anwesenheit von variierenden Konzentrationen von JO-4A in Kultur genommen (0,0001 μM bis 0,5 μM). Am Ende der Kultur wurde die Lebensfähigkeit der PBMC's mit Hilfe des Trypan-Blau-Farbstoff-Ausschlusstests bestimmt.
  • 16A zeigt die antivirale Wirkung von JO-4 auf Herpes simplex-1 (HSV-1)-Replikation. Die antiviralen Wirkungen von JO-4 auf HSV-1 wurden unter Verwendung des "Hybriwix Probe System" bestimmt: Testkit für die antivirale HSV-Empfänglichkeit von Diagnostic Hybrids, Inc. (Athens, OH).
  • 16B zeigt die antivirale Wirkung von JO-4 auf HSV-2-Replikation. Die antiviralen Wirkungen von JO-4 auf HSV-2 wurden entsprechend der Beschreibung in 16A bestimmt.
  • 17A und 17B zeigen die Ergebnisse der Toxizitätstests von JO-4 und JO-4A jeweils auf normalen, nichtinfizierten Nierenzellen (CV-1) des Afrikanischen Grünen Affens. Es wurden CV-1-Zellen entweder in Anwesenheit oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von Medikamenten für 72 Stunden in Kultur genommen. Die Zytotoxizität wurde mit Hilfe eines kolorimetrischen (MTT)-Assays bestimmt.
  • AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
  • ALLGEMEINE BESCHREIBUNG UND DEFINITIONEN
  • Sofern nicht anders angegeben, wurden in der Praxis der vorliegenden Erfindung konventionelle Molekular- und Zellularimmunologie, Zellbiologie, Biochemie und organische und medizinisch-chemische Synthese im Rahmen des Standes der Technik eingesetzt. Diese Methoden sind ausführlich in der Literatur dargelegt. Siehe hierzu beispielsweise: Abbas, A. K., et al., Herausg., 1994, 2. Ausg., Cellular and Molecular Immunology, W. B. Saunders Co., USA; Harlow, E. und D, Lane, Antibodies, A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Auchinclos, Jr., H. und Sachs, D. H., Transplantation and Graft Rejection in: Fundamental Immunology, Paul, W. E. Herausg., 1993, Raven Press; Silverman, Richard B., The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, Academic Press, Inc., NY (1992); Smith, Michael B., Organic Synthesis, McGraw Hill, Inc., NY, (1994)). Siehe auch Cancer Chemotherapy: Principles and Practice, Herausg., B. A. Chabner, J. M. Collins, Phil., Lippincott Publ., 1990; Mechanisms of Interferon Actions, Bd. II, Herausg. L. M. Pfeffer, CRC Press, Boca Raton, FL, 1987; Interferons: Principles and Medical Applications, Herausg, S. Baron, D. Coppenhauer, F. Dianzani, et al., The University of Texas Medical Branch, Galveston, 1992; Robins, R. K., Ojo-Amaize, E. A., Cottam, H. B., et al., Nukleoside and nukleotide modulation of genetic expression: A new approach to chemotherapy. In: Advances in Enzyme Regulation, 1989, Bd. 29; Cancer: Principles and Practice of Oncology; Herausg. de Vita, Jr., V. T., Hellman, S., und Rosenberg, S. A., Lippincott Co., Philadelphia, 1993; The Chemotherapy Source Book, Herausg. Perry, M. C., Williams and Wilkins Publ., Baltimore, (1991). Silverman, Richard B., The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, Academic Press, Inc. NY, (1992); Smith, Michael B., Organic Synthesis, McGraw Hill, Inc., NY, (1994). Siehe ferner Bauer, D. J., The Specific Treatment of Virus Diseases, University Park Press, Baltimore, MD, 1977; Gawler, H., Nucleic Acid Hybridization for Measurement of Antiviral Compounds on Human Cytomegalvirus DNA Replication, Antimicrobial Agents Chemotherap. 1983; 24: 370–374; Collier, L. H. und Oxford, J., Herausg., Developments in Antiviral Therapy, Academic Press, London, 1980; Coligan, J. E. et al., Herausg., Current Protocols in Immunology, 1993; Robert B. Belshe, Herausg., Textbook of Human Virology. 2. Ausg, 1991; Silverman Richard B., The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, Academic Press, Inc., NY (1992); Smith, Michael B., Organic Synthesis, McGraw Hill, Inc., NY, (1994).
  • IMMUNSUPPRESSION
  • Entsprechend den nachfolgenden, in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung ausgeführten Festlegungen wird die folgende Terminologie verwendet.
  • Für die Aufgaben der Erfindung bezeichnet der Begriff "immunsuppressive Behandlung" eine Methode zur Verhütung und Handhabung von Erkrankungen und Syndromen, die eine Therapie für die Unterdrückung von Lymphozyten und Immunozyten erfordern. Derartige Erkrankungen und Syndrome schließen die Folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GVHD), Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise Diabetes, rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematosus, Thyreoiditis, Multiple Sklerose, Glomerulonephritis und Allergie. Es gilt als selbstverständlich, dass eine allgemein angewendete Methode der Immunsuppression das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines immunsuppressiven Mittels (z. B. Cyclosporin A, FK506 oder die Zusammensetzungen und Methoden, die hierin exemplifiziert und beansprucht sind) an ein Tier mit Bedarf für eine solche Behandlung umfasst, um die T-Zellen-Aktivität oder T-Zellen-Reaktion zu hemmen.
  • Die Begriffe "Lymphozyten und Immunozyten" beziehen sich auf Zellen, die die Spezifität für die Immunreaktionen vermitteln. Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe auf T-Lymphozyten, die im Detail von Abbas et al. beschrieben wurden.
  • "Natürliche Killerzellen" oder "NK-Zellen" sind Non-T, Non-B-Lymphozyten, die in der Regel eine granulare Morphologie haben. NK-Zellen sind bei angeborener Immunität gegenüber Viren und anderen intrazellulären Pathogenen sowie in der Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizität (ADCC) von Bedeutung. NK-Zellen sind in großem Maß für die Transplantat-gegen-Wirt-Krankheiten (GVHD) verantwortlich (Ferrara, J. L. M., et al. (1989); Transplantation 47: 50–54; Ghayur, T. et al., (1987) Transplantation 44: 261–267; Ghayur, T., et al. (1988) Transplantation 45: 586–590). Wie in den nachfolgenden Beispielen demonstriert wird, wurde entdeckt, dass die Verbindungen und Verfahren der Erfindung die NK-Zellaktivität in vivo unterdrückten und Anwendung bei der Verhütung oder Überwindung der GVHD bei Tieren mit Bedarf für eine solche Behandlung fanden.
  • Der Begriff "Transplantation" bezieht sich auf den Prozess der Entnahme von Zellen, Geweben oder Organen, bezeichnet als "Transplantat", von einem Individuum und normalerweise das Einsetzen dieser in einen anderen, genetisch nicht identischen Empfänger. Das Individuum, das das Transplantat bereitstellt, wird als Spender bezeichnet, und das Individuum, das das Transplantat empfängt, wird als Empfänger oder Wirt bezeichnet. Die Transplantation führt zu einer spezifischen Immunantwort, bezeichnet als Abstoßung, die das Transplantat zerstören kann. Transplantierte Gewebe schließen feste Organe ein, wie beispielsweise Leber, Herz und Nieren, und andere Gewebearten, wie beispielsweise Haut und Knochenmark. Eine in vivo-Abstoßung wird durch T-Zellen vermittelt. Die Abstoßung kann durch Immununterdrückung des Empfängers (Wirt) verhindert oder behandelt werden, indem dem Wirt therapeutisch wirksame Mengen von Verbindungen verabreicht werden, wie beispielsweise Cyclosporin A oder FK506, sowie durch das Verabreichen der hierin exemplifizierten Zusammensetzungen. Immunsuppression ist überwiegend auf T-Zellen-Reaktionen unter Verwendung spezieller immunsuppressiver Mittel gerichtet, die ähnlich den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind. Darüber hinaus spielt die Immunsuppression von NK-Zellen eine wichtige therapeutische Rolle bei der Behandlung von Erkrankungen, wie beispielsweise Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GVHD). Dementsprechend erfordern Transplantatspender eine vorbereitende Immunsuppression durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines immunsuppressiven Mittels vor dem Spenden eines Transplantat, um bei einem Empfänger die Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit zu verhindern.
  • Der Begriff "Säugetiere" ist so zu verstehen, dass er sowohl Menschen bedeutet als auch andere Tiere.
  • Wie hierin verwendet wird, bedeutet der Begriff "JO-4" eine Verbindung, die an bizyclische [9,3,1]-Pentadecanditerpen-Verbindung entsprechend der Beschreibung in Z. für Naturforsch., 37c: 558–561 (1982) und in Heterocycles 20: 2125–2128 (1983) beschrieben wird, worin diese Verbindung als "Hypoestoxid" bezeichnet wird. Die chemische Struktur von JO-4 ist in Formel I veranschaulicht.
  • Es gilt als selbstverständlich, dass die in Formel IV veranschaulichten Verbindungen die Arzneimittelvorstufen von JO-4A einschließen. in den Begriffen von Formel IV, wird JO-4A von JO-4 abgeleitet, wenn R H ist. Die Struktur von JO-4A ist in Formel II veranschaulicht.
  • Figure 00110001
  • Der Begriff "Arzneimittelvorstufe", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine pharmakologisch inaktive Verbindung, die in ein aktives Arzneimittel auf dem Wege einer metabolischen Umwandlung überführt wird (Silverman, Richard B. The Organic Chemistry of Drug Design, Acad. Press, 1992). Es gibt zahlreiche Gründe dafür, warum bei einem Aufbau eines Arzneimittels eine Strategie der Arzneimittelvorstufe angewendet wird, von denen der häufigste die Überwindung von Problemen im Zusammenhang mit der Verbindung ist, wie beispielsweise Löslichkeit, Absorption und Verteilung, Stellungsspezifität, Instabilität, verlängerte Freisetzung, Toxizität, geringe Patientenakzeptanz und Formulierung. Es steht Literatur für Richtlinien zur Verfügung, um ohne unnötiges Experimentieren zu ermitteln, wie man Verbindungen in pharmazeutischen Zusammensetzungen zu einer Stelle bringt, um sie wirken zu lassen, sowie Richtlinien dafür, wie man eine immunsuppressive, therapeutisch wirksame Menge an der Wirkungsstelle erhält (Harnden, M. R. et al., J. Med. Chem. 32: 1738–1743 (1989); Lake-Bakaar, D. M., et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 33: 110–112 (1989); Baker, D. C., et al., J. Medicinal Chemistry 21: 1218–1221 (1978); Hussain, M. A. et al., J. Pharmaceutical Sciences, 76: 356–358 (1987); Varia, S. A. et al., J. Pharmaceutical Sciences, 73: 1068–1073 (1984)).
  • Die häufigste Form der Arzneimittelvorstufe für Medikamente, die als funktionelle Gruppen Alkohol oder Carbonsäure enthalten, ist ein Ester. Unter Anwendung auf dem Fachgebiet gut bekannter Methoden ist es möglich, die Struktur der Verbindung so zu verändern, dass ihre pharmakokinetischen Eigenschaften verbessert werden und diese dadurch in ein nützliches Medikament für die therapeutische Verabreichung an ein Tier oder Menschen umgewandelt werden. Dementsprechend besteht das Grundprinzip für die medizinische Wirksamkeit (d. h. das Auslösen einer Immunsuppression) der beanspruchten Arzneimittelvorstufen von JO-4A darin, dass JO-4 selbst, das eigentliche Produkt ein starkes immunsuppressives Mittel ist. JO-4 ist außerdem eine Arzneimittelvorstufe für JO-4A in Gegenwart von Serum-Esterasen bei der in vivo-Einstellung und in der in vitro-Einstellung dann, wenn das Kulturmedium zugesetztes Serum enthält (was zumeist der Fall ist). Eine bevorzugte Ausführungsform des immunsuppressiven Mittels ist der Metabolit JO-4A, bei dem es sich um ein freies Alkohol-Derivat von JO-4 handelt. JO-4 dient als eine Esterform der Arzneimittelvorstufe für die Zuführung von JO-4A, die im Verlaufe einer Zeitdauer nach Verabreichung von JO-4 an Zellen oder Tieren gebildet wird. In ähnlicher Weise ermöglichen zahlreiche andere Ester-Arzneimittelvorstufen von JO-4A die Zuführung von JO-4A. Derartige Formen von Arzneimittelvorstufen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung sind, wie bereits zitiert wurde, auf dem Fachgebiet gut bekannt. Von diesen Arzneimittelvorstufen ist bekannt, dass die angestrebten Ausgangsformen des Arzneimittels bei Exponierung an Esterasen erhalten werden, wie sie üblicherweise in Serum von Tieren und Menschen angetroffen werden. Es gilt als selbstverständlich, dass die Arzneimittelvorstufen von JO-4A, die hierin beansprucht werden, JO-4A liefern und hinsichtlich der Auslösung einer Immunsuppression wirksam oder wirksamer sind als das eigentliche Produkt JO-4.
  • Der hierin verwendete Begriff "Agonisten" bezeichnet Substanzen, die die gleiche Reaktion hervorbringen (d. h. Auslösung einer Immunsuppression in Tieren, die einer solchen Behandlung bedürfen) wie die in Formel IV angegebenen Verbindungen. Die Agonisten der Verbindungen der Formel IV schließen die Arzneimittelvorstufen von JO-4A ein, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, d. h. Arzneimittelvorstufen, wie sie in Formel IV veranschaulicht sind.
  • Auf dem Fachgebiet sind Methoden zum Bestimmen oder für das Screening modifizierter Formen der beanspruchten Verbindungen wohl bekannt, d. h. Arzneimittelvorstufen und/oder Agonisten der beanspruchten Verbindungen, im Bezug auf ihre Fähigkeit zur Auslösung einer Immunsuppression in Tieren oder im Bezug auf ihre Fähigkeit zur Hemmung des Wachstums von Krebs in Tieren oder für ihre Fähigkeit zur Hemmung des Wachstums von Lentiviren oder Herpetoviridae-Viren in Tieren, die einer solchen Behandlung bedürfen.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung richten sich auf eine Immunsuppressionstherapie unter Verwendung der Verbindungen der Formel IV sowie der Verbindungen der Formel I (JO-4, d. h. Hypoestoxid). Insbesondere umfassen die Verfahren der vorliegenden Erfindung das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindungen der Formeln I oder IV an ein Tier, der einer solchen Behandlung bedarf. Eine Ausführungsform der Verfahren umfasst das Zusammenbringen von Verbindungen der Formeln I oder IV mit pharmazeutischen Trägern oder Streckmitteln zur Verabreichung an ein Tier.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren findet zur Unterdrückung der Abstoßung von Transplantaten in Tieren Anwendung, wie es durch die Wirkungen von JO-4 oder JO-4A auf die Zellularimmunität in den nachfolgend ausgeführten Einweg- und Zweiweg-MLR-Tests veranschaulicht wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist somit in der Unterdrückung der Erzeugung oder Proliferation von Immunozyten oder Lymphozyten anwendbar und ist daher in der Behandlung von Autoimmunerkrankungen anwendbar sowie bei der Unterdrückung der Abstoßung von Transplantaten, d. h. Organtransplantaten, wie beispielsweise Haut-, Knochenmark-, Nieren-, Leber- und Herztransplantaten. Die Wirkungen von JO-4 oder JO-4A wurden in den nachfolgend beschriebenen Tests bestätigt.
  • Wie in den 1 bis 8 gezeigt wird, finden Verbindungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung Anwendung bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen in Tieren. Es gilt als selbstverständlich, dass Immunsuppressiva für T-Zellen, wie beispielsweise Cyclosporin A (Forsell, T. et al., J. Urol., 1996, 5: 1591–3; Yocum, D. E., et al., Rheum. Dis. Clin. North. Am., 1995, 3: 835–44) oder Tacrolimus (Ketel, B. L., et al., Transplant. Proc., 1996, 2: 899) das die Immunreaktionen unterdrückt und zur Hemmung oder Milderung von Autoimmunerkrankungen führt. T-Zellen und ihre Produkte (Cytokine) sind dafür bekannt, dass sie bei der Erzeugung und Produktion von Autoimmunreaktionen in vivo beteiligt sind.
  • Bei all den vorgenannten Anwendungen wird die therapeutisch wirksame Menge oder Dosierung selbstverständlich in Abhängigkeit von der zum Einsatz gelangenden Verbindung, der Art und Weise der Verabreichung und der gewünschten Behandlung variieren. Im Allgemeinen lassen sich jedoch zufriedenstellende Ergebnisse bei oraler Verabreichung mit einer täglichen Dosierung von etwa 1 mg bis 600 mg pro kg Körpergewicht des Tieres erreichen, die bequemerweise unterteilt in 1 bis 4 Dosismengen pro Tag oder in Form einer verzögerten Freisetzung gegeben werden. Bei Verabreichung durch Injektion werden in der Regel zufriedenstellende Ergebnisse erhalten, wenn die Verabreichung mit einer täglichen Dosierung von etwa 1 mg bis etwa 200 mg pro kg Körpergewicht des Tieres erfolgt, die bequemerweise in unterteilten Dosen von 1 bis 4 Mal täglich oder in Form einer verzögerten Freisetzung gegeben werden. Bei größeren Säugern würde die tägliche Gesamtdosis im Bereich von etwa 5 bis etwa 500 mg liegen, wobei Dosierungsformen, die für die orale Verabreichung geeignet sind, etwa 5 mg bis etwa 500 mg der Verbindung in Zumischung oder in Verbindung mit einem festen oder flüssigen pharmazeutischen Träger oder Streckmittel aufweisen. Die Methoden zum Bestimmen der therapeutisch wirksamen Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Diese Methoden umfassen die Analyse pharmazeutischer/pharmakokinetischer Parameter in der Immunsuppressionstherapie zur Auslösung einer Immunsuppression, bei der Unterdrückung der Erzeugung von Lymphozyten und Immunozyten, bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen und bei der Unterdrückung der Abstoßung von Transplantaten bei Tieren oder anderen Indikationen (Recent Developments in Transplantation Medicine, Bd. 1: New Immunosuppressive Drugs, Herausg. D. Przepiorka und H. Sollinger, Physicians and Scientists Pub. Co., Glenview, IL, 1994).
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung schließt das Verabreichen einer pharmazeutischen Zusammensetzung ein, die eine wirksame Menge der Verbindungen der Formeln I, II oder IV in reiner Form oder als ein pharmazeutisch zulässiges rohes Konzentrat in Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger oder Streckmittel aufweisen. Diese Zusammensetzungen enthalten günstigenfalls mehr als 1 Gew.-% der Verbindungen der Formel I, II oder IV und lassen sich mit Hilfe konventioneller Methoden in konventionellen Formen herstellen, wie beispielsweise Kapseln, Tabletten, Suppositorien, dispergierbaren Pulvern, Sirupen, Elixieren, Suspensionen oder Lösungen für die enterale oder parenterale Verabreichung. Geeignete pharmazeutische Streckmittel oder Träger schließen beispielsweise ein: Wasser, Alkohol, natürliche oder gehärtete Öle und Wachse, Calcium- und Natriumcarbonate, Calciumphosphat, Kaolin, Talkum und Lactose sowie geeignete Konservierungsmittel, wie beispielsweise Ethyl-p-hydroxybenzoat, Suspendiermittel, wie beispielsweise Methylcellulose, Traganth und Natriumalginat, Benetzungsmittel, wie beispielsweise Lecithin, Polyoxyethylenstearat und Polyoxyethylensorbitan-Monooleat, Granuliermittel und Zerfallmittel, wie beispielsweise Stärke und Alginsäure, Bindemittel, wie beispielsweise Stärke, Gelatine und Gummi arabicum, sowie Gleitmittel, wie beispielsweise Magnesiumstearat, Stearinsäure und Talkum, um ein angenehmes und schmackhaftes pharmazeutisches Präparat bereitzustellen. Die Zusammensetzungen in Tablettenform können mit Hilfe konventioneller Methoden beschichtet sein, um den Zerfall der Tablette und die Aufnahme des Wirkstoffes im gastrointestinalen Trakt zu verzögern und dadurch eine verzögerte Wirkung über eine lange Zeitdauer zu ermöglichen. Andere Verbindungen und Methoden, die auf dem Gebiet für den verzögerten Zerfall oder für zeitverzögerte oder zeitbestimmte Freisetzung der Wirkstoffe bekannt sind, finden ebenfalls Anwendung bei der Formulierung der Wirkstoffe für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren. Beispielsweise können die Verbindungen der Formel I, II oder IV mit Liposomen oder anderen Trägermitteln mit verzögerter Freisetzung zum Schutz der Verbindungen vor Zerfall kombiniert werden, bis sie ihr Ziel erreichen, und/oder den Transport der Verbindungen durch Gewebebarrieren erleichtern.
  • Die bevorzugten Zusammensetzungen sind vom Standpunkt einer leichten Verabreichung feste Zusammensetzungen und speziell mit festem Stoff gefüllte Gelatinekapseln oder -tabletten.
  • Es gilt außerdem als selbstverständlich, dass eine weitere Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung die Kombination von einem oder mehreren Mitteln in einer Vielzahl von Protokollen umfasst, einschließlich Prophylaxe, wobei in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Verabreichen pharmazeutischer Zusammensetzungen für die immunsuppressive Behandlung an Tieren, die eine solche bedürfen, die Verbindungen der Formeln I, II oder IV aufweisen. Kombinationsprotokolle und Methoden zur Bestimmung ihrer Wirksamkeit schließen ein therapeutisches Medikamentenmonitoring ein, wie es auf dem Gebiet gut bekannt ist (Lazarus, H. M. et al., Blood Reviews, 1995, 9: 117–133; Aggarwal, B. B., et al., Herausg., 1995, Human Cytokines; Their role in Disease and Therapy, Blackwell Science, Inc., Cambridge, MA; Ambrus, J. L. et al., 1993, Surgery, Gynecology & Obstetrics, 176: 588). Beispiele für immunsuppressive Mittel oder Mittel, die in der Immunsuppressionstherapie verwendbar sind und die mit dem Verabreichen der Verbindungen der Formeln I, II oder IV in dem Verfahren der Erfindung kombiniert werden können, schließen die Folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Corticosteroide, Methotrexat, Cyclosporin, Rapamycin, FK506 (PrografTM), Antithymozytenglobulin, monoklonale Antikörperpräparate, polyklonale Antikörperpräparate, Interleukin-1-Antagonisten, Interleukin-2-Antagonisten, TNF-Antagonisten, Immunotoxine, Thalidomid, Interferon, Stickstoffmonooxid, Mizoribin, Desoxyspergualin, Leflunomid und Anti-Haftmoleküle.
  • Es gilt ferner als selbstverständlich, dass in der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung einbezogen ist, die eine therapeutisch wirksame Menge einer oder mehrerer der Verbindungen der Formeln I, II oder IV in Verbindung mit einem oder mehreren Mitteln aufweist, die ausgewählt sind aus der Gruppe von immunsuppressiven Mitteln oder Mitteln, die in der Immunsuppressionstherapie verwendbar sind, bestehend aus Corticosteroiden, Methotrexat, Cyclosporin, Rapamycin, FK506 (PrografTM), Antithymozytenglobulin, monoklonale Antikörperpräparate, polyklonale Antikörperpräparate, Interleukin-1-Antagonisten, Interleukin-2-Antagonisten, TNF-Antagonisten, Immunotoxine, Thalidomid, Interferon, Stickstoffmonooxid, Mizoribin, Desoxyspergualin, Leflunomid und Anti-Haftmoleküle. Methoden zur Bestimmung der therapeutisch wirksamen Menge der Verbindungen der Formeln I, II oder N sowie der Mittel, die ausgewählt sind aus der Gruppe der immunsuppressiven Mitteln oder Mitteln, die in der Immunsuppressionstherapie in Verbindung mit den Verbindungen der Formeln I, II oder N in pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung verwendbar sind, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (Lazarus, H. M. et al., Blood Reviews, 1995, 9: 117–133; Aggarwal, B. B., et al., Herausg., 1995, Human Cytokines: Their rote in Disease and Therapy, Blackwell Science, Inc., Cambridge, MA; Ambrus, J. L. et al., 1993, Surgery, Gynecology & Obstetrics, 176: 588).
  • KREBSBEKÄMPFUNG
  • Entsprechend den nachfolgend ausgeführten Festlegungen zur Beschreibung der vorliegenden Erfindung gelangt die folgende Terminologie zur Anwendung.
  • Obgleich der Begriff "Tumor" einfach "Schwellung" bedeutet, wird der Begriff in der Regel mit "Neoplasma" gleichgesetzt, was wörtlich "Neuwachstum" bedeutet. Ein Neoplasma ist eine anomale Gewebemasse, die nach der Entfernung des Karzinogens besteht und proliferiert, das seine Erscheinung ausgelöst hat. Es gibt zwei Arten von Neoplasmen oder Tumoren, benigne und maligne. Der übliche Begriff für alle maligne Tumore ist "Krebs". Nahezu alle benigne Tumore sind gekapselt. Im Gegensatz dazu sind krebsartige Tumore zumeist nicht gekapselt, dringen jedoch durch infiltratives zerstörendes Wachstum in angrenzendes Gewebe ein. Dem invasiven Wachstum kann eine Tumorzellenimplantation an von dem ursprünglichen Tumor getrennten Stellen folgen, und zwar normalerweise durch lymphatische und/oder hämatogene Ausbreitung der Krebszellen. Dieser Prozess wird als "Metastase" bezeichnet und kennzeichnet einen Tumor eindeutig als maligne, da ein benigner Tumor niemals metastasiert, während die meisten Krebsarten metastasieren können (in: Pathologische Grundlagen der Krankheiten, 4. Ausg., Philadelphia: WB Saunders, 1989; 239–305). Es gilt als selbstverständlich, dass das erfindungsgemäße Verfahren zum Hemmen des Wachstums von Krebszellen oder krebsartigen Tumoren das Hemmen des invasiven Wachstums von Krebszellen sowie das Hemmen des Metastasenwachstums von Tumoren aus metastasierten Krebszellen einschließt.
  • Der Begriff "Patient" ist so zu verstehen, dass Menschen sowie andere Tiere gemeint sind.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "JO-4" eine Verbindung, bei der es sich um eine bizyclisch[9,3,1]-Pentadecanditerpen-Verbindung entsprechend der Beschreibung in Z. Naturforsch., 37c: 558–561 (1982) und in Heterocycles 20: 2125-2128 (1983) handelt, worin diese Verbindung als "Hypoestoxid" bezeichnet wird. Die chemische Struktur von JO-4 ist in Formel I veranschaulicht.
  • Figure 00160001
  • Es gilt als selbstverständlich, dass die in Formel N veranschaulichten Verbindungen Arzneimittelvorstufen von JO-4A einschließen. In den Begriffen von Formel IV wurden JO-4A von JO-4 deriviert, wenn R H ist. Die Struktur von JO-4A ist in Formel II veranschaulicht.
  • Figure 00160002
  • Der Begriff "Arzneimittelvorstufe", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine pharmakologisch inaktive Verbindung, die in ein aktives Arzneimittel auf dem Wege einer metabolischen Umwandlung überführt wird (Silverman, Richard B. The Organic Chemistry of Drug Design, Acad. Press, 1992). Es gibt zahlreiche Gründe dafür, warum bei einem Aufbau eines Arzneimittels eine Strategie der Arzneimittelvorstufe angewendet wird, von denen der häufigste die Überwindung von Problemen im Zusammenhang mit der Verbindung ist, wie beispielsweise Löslichkeit, Absorption und Verteilung, Stellungsspezifität, Instabilität, verlängerte Freisetzung, Toxizität, geringe Patientenakzeptanz und Formulierung. Es steht Literatur für Richtlinien zur Verfügung, um ohne unnötiges Experimentieren zu ermitteln, wie man Verbindungen in pharmazeutischen Zusammensetzungen zu einer Stelle bringt, um sie wirken zu lassen, sowie Richtlinien dafür, wie man eine therapeutisch wirksame Menge zum Hemmen des Wachstums von krebsartigen Tumoren an der Wirkungsstelle erhält (Brunda, M. J., Wright, R. B., Luistro, L. et al., Enhanced Antitumor Efficacy in Mice by Combination Treatment with Interleukin-1α and Interferon-α, J. Immunother, (1994) 15: 233–241; Bezwoda, W. R., The Treatment of Disseminated Melanoma with Special Reference to the Role of Interferons, Vinca Alkaloids, and Tamoxifen, Cancer Treatment Review, (1997) 23: 17–34, Wedge, S. R., Porteous, J. K., Newlands, E. S., Effect of Single and Multiple Administration of an O6-benzylguanine/temozolomid Combination: An evaluation in a Human Melanoma Xenograft Model, Cancer Chemother, Pharmacol. (1997) 40: 266–272).
  • Die häufigste Form der Arzneimittelvorstufe für Medikamente, die als funktionelle Gruppen Alkohol oder Carbonsäure enthalten, ist ein Ester. Unter Anwendung auf dem Fachgebiet gut bekannter Methoden ist es möglich, die Struktur der Verbindung so zu verändern, dass ihre pharmakokinetischen Eigenschaften verbessert werden und diese dadurch in ein nützliches Medikament für die therapeutische Verabreichung an ein Tier oder Menschen umzuwandeln. JO-4 ist eine Arzneimittelvorstufe für JO-4A in Gegenwart von Serum-Esterasen bei der in vivo-Einstellung und in der in vitro-Einstellung dann, wenn das Kulturmedium zugesetztes Serum enthält (was zumeist der Fall ist). Eine bevorzugte Ausführungsform der Hypoestoxid-Verbindung zur Anwendung in dem Verfahren zum Hemmen des Wachstums von Krebszellen ist der Metabolit JO-4A, bei dem es sich um ein freies Alkohol-Derivat von JO-4 handelt. JO-4 dient als eine Esterform der Arzneimittelvorstufe für die Zuführung von JO-4A, die im Verlaufe einer Zeitdauer nach Verabreichung von JO-4 an Zellen oder Tieren gebildet wird. In ähnlicher Weise ermöglichen zahlreiche andere Ester-Arzneimittelvorstufen von JO-4A die Zuführung von JO-4A. Derartige Formen von Arzneimittelvorstufen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung sind, wie bereits zitiert wurde, auf dem Fachgebiet gut bekannt. Von diesen Arzneimittelvorstufen ist bekannt, dass die angestrebten Ausgangsformen des Arzneimittels bei Exponierung an Esterasen erhalten werden, wie sie üblicherweise in Serum von Tieren und Menschen angetroffen werden. Es gilt als selbstverständlich, dass die Arzneimittelvorstufen von JO-4A, die in dem beanspruchten Verfahren verwendbar sind, JO-4A liefern und in Bezug auf das Hemmen des Wachstums von krebsarigen Tumoren wirksam sind.
  • Der hierin verwendete Begriff "Agonisten" bezeichnet Substanzen, die die gleiche Reaktion hervorbringen (d. h. Hemmen des Wachstums von krebsartigen Tumoren bei Patienten, die einer solcher Behandlung bedürfen) wie die in Formel IV angegebenen Verbindungen. Die Agonisten der Verbindungen der Formel IV schließen die Arzneimittelvorstufen von JO-4A ein, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, d. h. Arzneimittelvorstufen, wie sie in Formel IV veranschaulicht sind.
  • Methoden für das Bestimmen und Screening von modifizierten Formeln der Hypoestoxid-Verbindungen, d. h. Arzneimittelvorstufen und/oder Agonisten der beanspruchten Verbindungen, auf ihre Fähigkeit zur Hemmung des Wachstums von krebsartigen Tumoren in Patienten, die einer solchen Behandlung bedürfen, sind auf dem Gebiet gut bekannt (Stinson, S., Alley, M. C., Kopp, W. C., et al., Morphological and Immunocytochemical Characteristics of Human Tumor Cell Lines for Use in a Disease-Oriented Anticancer Drug Screen, Anticancer Research (1992), 12: 1035–1054).
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung richtet sich auf Krebs- und Tumortherapie, d. h. auf das Hemmen des Wachstums von Krebszellen und damit, wenn das Wachstum von Krebszellen zu der Entwicklung von einem oder mehreren Tumoren führt, auf das Hemmen des Wachstums von krebsartigen Tumoren unter Verwendung der Verbindungen der Formel IV und speziell der Verbindungen der Formel II (JO-4A, d. h. Hypoestoxid). Insbesondere umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens einer Hypoestoxid-Verbindung der Formel IV und speziell der Verbindung der Formel II (JO-4A) an einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf.
  • Das Verfahren der Erfindung findet Anwendung beim Hemmen des Wachstums von Krebszellen in vitro, wie in 9 veranschaulicht wird, und zum Hemmen des Wachstums von Krebszellen oder krebsartigen Tumoren in Mäusen, wie in den 12 und 13 gezeigt wird. Damit findet das erfindungsgemäße Verfahren insofern Anwendung, dass es eine zytotoxische, wachstumshemmende Wirkung auf Krebszellen oder krebsartige Tumore hat und, bei der gleichen Dosierungsmenge, eine relativ nichttoxische Wirkung auf normale Zellen hat (10), wobei die differentialtoxische Wirkung das Wachstum von krebsartigen Tumoren zu hemmen scheint und daher als eine Tumorbehandlung mindestens eine Reihe von Krebsarten anwendbar ist, wie in 9 gezeigt wird. Die Wirkungen von JO-4A wurden in den nachfolgend beschriebenen Tests ermittelt, wie in den 9 bis 13 veranschaulicht wird, womit gezeigt wird, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung von Patienten mit einem Bedarf für eine Krebstherapie wirksam ist.
  • Bei der vorstehend ausgeführten Anwendung wird die therapeutisch wirksame Menge oder Dosierung selbstverständlich in Abhängigkeit von der zum Einsatz gelangenden Verbindung, der Art und Weise der Verabreichung und der gewünschten Behandlung variieren. In der Regel werden jedoch zufriedenstellende Ergebnisse erhalten, wenn eine orale Verabreichung bei einer Tagesdosis von etwa 0,01 mg bis etwa 1.000 mg/kg Körpergewicht des Tieres erfolgt, die ohne weiteres in unterteilten Dosierungen 1 bis 4 Mal täglich oder in Form einer verzögerten Freisetzung gegeben werden kann. Bei Verabreichung durch intravenöse Injektion werden in der Regel zufriedenstellende Ergebnisse erhalten, wenn die Verabreichung mit einer Tagesdosis von etwa 0,01 mg bis etwa 200 mg/kg Körpergewicht des Tieres erfolgt, die ohne weiteres in unterteilten Dosierungen 1 bis 4 Mal täglich oder in Form einer verzögerten Freisetzung erfolgen kann. Bei den größeren Säugern wird die gesamte Tagesdosis im Bereich von etwa 1 bis etwa 1.000 mg liegen, wobei Dosierungsformen, die für die orale Verabreichung geeignet sind, von etwa 1 mg bis etwa 1.000 mg der Verbindung in Zumischung oder in Verbindung mit einem festen oder flüssigen pharmazeutischen Träger oder Streckmittel aufweist. Die Methoden zur Bestimmung der therapeutisch wirksamen Mengen der Verbindungen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Diese Methoden umfassen die Analyse der pharmazeutisch/pharmakokinetischen Parameter in der Krebs- oder Tumortherapie, d. h. beim Hemmen des Wachstums krebsartiger Tumore (Wedge, S. R., Porteus, J. K., Newlands, E. S., Cancer Chemother. Pharmacol. (1997) 40: 266–272; Legha, S. S., Seminar in Ocology, (1997) 24: S4-24–31; Motzer, R. J., Vogelzang, N. J., Chemotherapy for Renal Cell Carcinoma. In: Raghaven, D., Scher, H. I., Leibel, S. A., et al.: Herausg: Principles and Practice of Genitowinary Oncology, Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, S. 885–96, 1997; Bloom, H. J., Medroxyprogesterone acetat (Provera)in the treatment of metastatic renal cancer, Br. J. Cancer (1971) 25: 250–65).
  • In das Verfahren der vorliegenden Erfindung einbezogen ist die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine wirksame Menge einer oder mehrerer der Verbindungen der Formel IV aufweist und speziell die Verbindung der Formel II (JO-4A) in reiner Form oder als pharmazeutisch zulässiges rohes Konzentrat in Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger oder Streckmittel. Diese Zusammensetzungen enthalten im günstigen Fall weniger als 1 Gew.-% und bevorzugt etwa 0,2 Gew.-% der Verbindungen der Formeln IV oder speziell II und können mit Hilfe konventioneller Methoden in konventionellen Formen hergestellt werden, wie beispielsweise Kapseln, Tabletten, Suppositorien, dispergierbaren Pulvern, Sirupen, Elixieren, Suspensionen oder Lösungen für die enterale oder parenterale Verabreichung. Geeignete pharmazeutische Streckmittel oder Träger schließen beispielsweise ein: Wasser, Alkohole, natürliche oder gehärtete Öle und Wachse, Calcium- und Natriumcarbonate, Calciumphoshpat, Kaolin, Talkum und Lactose sowie geeignete Konservierungsmittel, wie beispielsweise Ethyl-p-hydroxybenzoat, Suspendiermittel, wie beispielsweise Methylcellulose, Traganth und Natriumalginat, Benetzungsmittel, wie beispielsweise Lecithin, Polyoxyethylenstearat und Polyoxyethylensorbitan-Monooleat, Granuliermittel und Zerfallmittel, wie beispielsweise Stärke und Alginsäure; Bindemittel, wie beispielsweise Stärke, Gelatine und Gummi arabicum, sowie Gleitmittel, wie beispielsweise Magnesiumstearat, Stearinsäure und Talkum, um ein angenehmes und schmackhaftes pharmazeutisches Präparat bereitzustellen. Zusammensetzungen in Tablettenform können mit Hilfe konventioneller Methoden beschichtet werden, um den Zerfall der Tablette und die Aufnahme des Wirkstoffes im gastrointestinalen Trakt zu verzögern und dadurch eine verzögerte Wirkung über eine längere Zeitdauer zu bieten. Andere Verbindungen und Methoden, die auf dem Gebiet zum verzögerten Zerfall oder zur zeitverzögerten oder zeitbestimmten Bereitstellung der Wirkstoffe bekannt sind, finden ebenfalls Anwendung beim Formulieren der Wirkstoffe für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren. Beispielsweise können die Verbindungen der Formeln IV oder speziell II auch mit Liposomen oder anderen Trägermitteln mit verzögerter Freisetzung kombiniert werden, um die Verbindungen vor dem Zerfall zu schützen, bis sie ihr Ziel erreichen und/oder den Transport der Verbindungen durch Gewebebarrieren zu erleichtern.
  • Die bevorzugten Zusammensetzungen sind vom Standpunkt der Leichten Verabreichung feste Zusammensetzungen und speziell mit Feststoff gefüllte Gelatinekapseln oder Tabletten.
  • Es gilt außerdem als selbstverständlich, dass eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens das Kombinieren von einem oder mehreren Mitteln in einer Vielzahl von Protokollen umfasst, einschließlich Prophylaxe, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Verabreichen von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die Verbindungen der Formeln IV oder speziell II aufweisen, an Patienten, die eine Behandlung zum Hemmen des Wachstums von krebsartigen Tumoren bedürfen. Die Kombinationsprotokolle und Methoden zum Bestimmen ihrer Wirksamkeit schließen das therapeutische Medikamentenmonitoring ein und sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Beispiele für Krebsmittel und andere Mittel, die in der Therapie zum Hemmen des Wachstums von krebsartigen Tumoren verwendbar sind und die mit dem Verabreichen der Verbindungen der Formel IV oder speziell II in dem erfindungsgemäßen Verfahren kombiniert werden können, schließen die Folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Bestrahlung, Interferon-α, Interleukin-1, -2, Vinkaalkaloiden, Tamoxifen, Taxol, Decarbazin, biologische Modifikationsmittel für das Ansprechen, Platinverbindungen, Bleomycin, Dipyridamol, Carmustin, Cisplatin.
  • Es gilt ferner als selbstverständlich, dass in die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Hemmen des Wachstums von krebsartigen Tumoren einbezogen ist, welches das Verabreichen einer pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten mit Bedarf für eine Krebsbehandlung umfasst, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge einer oder mehrerer Verbindungen der Formeln IV und/oder II (JO-4A) gemeinsam mit einem oder mehreren Mitteln aufweist, die ausgewählt sind aus der Gruppe von Mitteln gegen Krebs oder Mitteln, die zum Hemmen oder Verhindern des Wachstums krebsartiger Tumore verwendbar sind, bestehend aus Bestrahlung, Interferon-α, Interleukin-1, -2, Vinkaalkaloiden, Tamoxifen, Taxol, Decarbazin, Mitteln zur Modifikation der biologischen Reaktion, Platinverbindungen, Bleomycin, Dipyridamol, Carmustin, Cisplatin. Es sind Methoden auf dem Fachgebiet zum Bestimmen therapeutisch wirksamer Mengen der Verbindungen der Formeln IV oder II gut bekannt sowie Mittel, die ausgewählt sind aus der Gruppe von Mitteln gegen Krebs oder Mitteln, die in der Krebstherapie in Verbindung mit den Verbindungen der Formeln IV oder II in pharmazeutischen Zusammensetzungen in dem Verfahren der Erfindung verwendbar sind (William, S. D., Herausg., Current Problems in Cancer, Bd. 21, Nr. 4, 1997; S. 186–221; Bezwoda, W. R., Cancer Treatment Reviews, 1997, Bd. 23: 17–34).
  • ANTIVIRAL
  • Entsprechend den in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung nachfolgend ausgeführten Festlegungen wird die folgende Terminologie verwendet.
  • Der Begriff "hemmen des Wachstums von" wird im Zusammenhang mit Lentiviren und Herpetoviridae-Viren verwendet, die für den Menschen oder andere Säuger pathologisch sind. Beispielsweise bedeutet im Zusammenhang mit dem Lentivirus HIV "hemmen des Wachstums von" die Hemmung der Viruserzeugung, was mit Hilfe herabgesetzter HIV p24-Mengen in Viruskultur ermittelt wird. Das Hemmen des Wachstums von HIV führt zur verringerten Virusbelastung, was wiederum die pathologischen Wirkungen der HIV-Infektion mildert. Es gilt als selbstverständlich, dass, wie hierin verwendet wird, "Anregen des Wachstums von" wirksam die virale Belastung für einen DNA- oder RNA-Virus von Interesse vermindert, was wiederum die pathologischen Wirkungen der Infektion durch diesen DNA- oder RNA-Virus mildert.
  • Der hierin verwendete Begriff "pathologische Wirkungen" wird durch ein Verständnis des Lebenszyklus des Lentivirus HIV und seiner Wirkungen in einem Wirt veranschaulicht. Es gilt als selbstverständlich, dass Lentiviren HIV-1, HIV-2 und HTLV einschließen und dass das Verfahren der Erfindung auf das Anregen des Wachstums von HIV-1, HIV-2 oder HTLV in Patienten gerichtet ist. Der Human-Immunodeficiency-Virus Typ l (HIV-1), ein Retrovirus, ist ein einsträngiges RNA-Genom, das im Inneren eines Protein-Kernpartikels verpackt ist und von einer Lipid-Hülle umgeben ist, in der das Protein der äußeren Schicht (Hüllprotein), gp120, eingebettet ist. Die Infektion von T-Helfer (CD4+)-Lymphozyten und -monozyten beginnt mit der Aufnahme von Virionen auf der Zelloberfläche, vermittelt durch die spezifische Wechselwirkung des Virus-Hüllproteins mit CD4-Molekülen auf der Zelloberfläche. Nach dem viralen Eintritt enthüllt sich der Virus und das duplizierte einsträngige RNA-Genom wird in das doppelsträngige DNA-Genom durch das virale Enzym Revertase (RT) reverse-transkribiert. Der Integration in die Wirts-DNA folgt die Transkription und Translation von HIV-1-Genen (Arch. Intern. Med., 1997, 157: 951–959).
  • Pathologisch/cytopathische Wirkungen von HIV bestehen speziell in einer Zellfusion mit der Bildung von Synzytien und dem nachfolgenden Zelltod (Belshe, R. B., Herausg., Textbook of Human Virology, 2. Ausg., 1991), was zur Entwicklung der Immunschwäche führt. AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrom)-Vorstufen schließen das Lymphadenopathie-Syndrom ein und das Auftreten konstitutioneller Symptome (AIDS-related Complex oder ARC). Das Lymphadenopathie-Syndrom ist als eine Vergrößerung der Lymphknoten mit beliebigen anderen erkennbaren Ursachen außer der HIV-Infektion definiert. Opportunistische Infektionen, umfassen Erkrankungen mit zumeist allgegenwärtigen Parasiten, die in immunologisch kompetenten Personen harmlos sind und Pathogenität lediglich bei Vorhandensein von Immunschwäche erwerben. Ein hoher Prozentsatz von HIV-infizierten Patienten zeigt neurologische Veränderungen, die durch opportunistische Infektionen oder Tumore nicht erklärt sind. Häufig werden dermatologische Manifestationen festgestellt. Ein erstes klinisches Anzeichen ist Herpes Zoster.
  • Die Familie der Herpetoviridae-Viren hat zahlreiche Vertreter, die weit verbreitete Human-Pathogene sind. Diese schließen den Herpes Simplex-Virus (HSV) ein, Epstein-Barr-Virus (EBV), Cytomegalovirus (CMV) und Varicella-Zoster-Virus. Es gilt als selbstverständlich, dass das Verfahren der Erfindung auf die Hemmung des Wachstums von Herpetoviridae-Viren gerichtet ist, einschließlich HSV-1 oder -2, EBV, CMV und Varicella-Zoster. HSV Typ 1 und 2 sind detailliert auf molekularer Ebene aufgrund ihres schnellen Replikationszyklus und hoher Ausbeuten in der Gewebekultur untersucht worden (Belshe, R. B., Herausg., Textbook of Human Virology, 2. Ausg., 1991). In Verbindung mit HSV bedeutet der Begriff "anreizen des Wachstums von" die Hemmung des Replikationszyklus, die Verringerung einer hohen Ausbeute oder Produktion von Virus. Der "Replikationszyklus" umfasst: Anhaftung, Penetration, Enthüllung, erste Transkription, DNA-Replikation, späte Transkription und Virusgruppierung. Pathologische Wirkungen ergeben sich aus der Replikation, wenn Wirtszellen infiziert sind. Die HSV-Infektion verändert die Zellorganisation auf zwei Ebenen, nämlich Änderungen in den intrazellularen Strukturen sowie in den Zell-Wechselwirkungen. Zellprotein und DNA-Synthese werden durch virales Protein/virale Proteine gehemmt. Chromosomen brechen während der Infektion auf und Bruchstücke werden zur Innenseite der Kernmembran verschoben, wodurch das Zentrum des Kerns für virale Replikation frei wird. Auf verschiedenen Ebenen werden Wechselwirkungen zwischen den Zellen als Ergebnis der HSV-Infektionen in einer Weise verändert, die durch Virusstamm oder Zelltyp oder durch beide beeinflusst wird. Dieses zeigt sich durch variierende Grade der Aggregation von rundlichen Zellen und Zellfusionen. In Kultur genommene Zellen, die mit Varianten von HSV infiziert wurden, zeigen oftmals veränderte Zell-Zell-Assoziationen mit erhöhter Klumpenbildung von Synzytienerzeugung.
  • Pathologische Wirkungen von HSV Typ 1 führen zur Herpes Simplex-Encephalitis (HSE), bei der es sich um eine lebensbedrohende Erkrankung mit hoher Mortalität und signifikanter Morbidität bei Überlebenden handelt. Akut fokale, nekrotisierende Encephalitis und einschließlich Entzündung und Schwellung des Gehirngewebes mit Petechien führen zu größerer Hämorrhagie als zuverlässige Merkmale der Pathologie von HSE (Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 100: 8–13, 1996). In den entwickelten Ländern führen pathologische Wirkungen von HSV-2 zur genitalen Ulzeration. Die Herpes Viren, die in allen Humanpopulationen endemisch sind, schließen Herpes Simplex-Virus ein, Varicella-Zoster-Virus, EBV, CMV und Human Herpes-Viren-6, 7 und 8.
  • Wie hierin verwendet wird, bedeutet der Begriff "mildern" schwächer werden oder verringern oder erträglicher machen.
  • Der Begriff "Patient" bedeutet sowohl Menschen als auch Tiere.
  • Der Begriff "Arzneimittelvorstufe", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine pharmakologisch inaktive Verbindung, die in ein aktives Arzneimittel auf dem Wege einer metabolischen Umwandlung überführt wird (Silverman, Richard B. The Organic Chemistry of Drug Design, Acad. Press, 1992). Es gibt zahlreiche Gründe dafür, warum bei einem Aufbau eines Arzneimittels eine Strategie der Arzneimittelvorstufe angewendet wird, von denen der häufigste die Überwindung von Problemen im Zusammenhang mit der Verbindung ist, wie beispielsweise Löslichkeit, Absorption und Verteilung, Stellungsspezifität, Instabilität, verlängerte Freisetzung, Toxizität, geringe Patientenakzeptanz und Formulierung. Es steht Literatur für Richtlinien zur Verfügung, um ohne unnötiges Experimentieren zu ermitteln, wie man Verbindungen in pharmazeutischen Zusammensetzungen zu einer Stelle bringt, um sie wirken zu lassen, sowie Richtlinien dafür, wie man eine therapeutisch wirksame Menge zum Hemmen des Wachstums von pathologischen RNA- oder DNA-Viren, einschließlich HIV oder HSV, ohne auf diese beschränkt zu sein, erhalten kann und an der Wirkungsstelle erhält (McDonald, C. K., Kuritzkes, D. R., Human Immunodeficiency Virus Typ 1 Protease Inhibitors, Arch. Intern. Med., 1997, 157: 951–959); Klagstaff A. J., Faulds, D., Goa, K. L., Aciclovir: A Reappraisal of its Antiviral Activity, Pharmacokinetic Properties, and Therapeutic Efficacy, Drugs, 1994, 47(1): 153–205; Hayashi, K., et al., Characterization of Antiviral Activity of Sesquiterpene, triptofordin, J. Antimicrob. Chemother., 1996, 37: 759–768).
  • Die häufigste Form der Arzneimittelvorstufe für Medikamente, die als funktionelle Gruppen Alkohol oder Carbonsäure enthalten, ist ein Ester. Unter Anwendung auf dem Fachgebiet gut bekannter Fähigkeiten ist es möglich, die Struktur der Verbindung so zu verändern, dass ihre pharmakokinetischen Eigenschaften verbessert werden und diese dadurch in ein nützliches Medikament für die therapeutische Verabreichung an ein Tier oder Menschen umgewandelt wird. JO-4 ist eine Arzneimittelvorstufe für JO-4A in Gegenwart von Serum-Esterasen bei der in vivo-Einstellung und in der in vitro-Einstellung dann, wenn das Kulturmedium zugesetztes Serum enthält (was zumeist der Fall ist). Eine bevorzugte Ausführungsform der Hypoestoxid-Verbindung zur Verwendung in dem Verfahren zum Hemmen des Wachstums von HIV oder HSV in Patienten, um die pathologischen Wirkungen des Wachstums von HIV oder HSV in Patienten zu mildern, ist der Metabolit JO-4A, der das freie Alkohol-Derivat von JO-4 ist. JO-4 diente als eine Esterform der Arzneimittelvorstufe für die Zuführung von JO-4A, die im Verlaufe einer Zeitdauer nach Verabreichung von JO-4 an Zellen oder Tieren gebildet wird. In ähnlicher Weise ermöglichen zahlreiche andere Ester-Arzneimittelvorstufen von JO-4A die Zuführung von JO-4A. Derartige Formen von Arzneimittelvorstufen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung sind, wie bereits zitiert wurde, auf dem Fachgebiet gut bekannt. Von diesen Arzneimittelvorstufen ist bekannt, dass die angestrebten Ausgangsformen des Arzneimittels bei Exponierung an Esterasen erhalten werden, wie sie üblicherweise in Serum von Tieren und Menschen angetroffen werden. Es gilt als selbstverständlich, dass die Arzneimittelvorstufen von JO-4A, die in dem beanspruchten Verfahren verwendbar sind, JO-4A liefern und in Bezug auf das Hemmen des Wachstums von HIV oder HSV wirksam sind.
  • Der hierin verwendete Begriff "Agonisten" bezeichnet Substanzen, die die gleiche Reaktion hervorbringen (d. h. Hemmen des Wachstums von HIV und HSV in Patienten, die einer solchen Behandlung bedürfen) wie die in Formel IV angegebenen Verbindungen. Die Agonisten der Verbindungen der Formel N schließen die Arzneimittelvorstufen von JO-4A ein, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, d. h. Arzneimittelvorstufen, wie sie in Formel N veranschaulicht sind.
  • Auf dem Fachgebiet sind Methoden zum Bestimmen oder Screening modifizierter Formen der Hypoestoxidverbindungen gut bekannt, d. h. Arzneimittelvorstufen und/oder Agonisten der beanspruchten Verbindungen in Bezug auf ihre Fähigkeit zum Hemmen des Wachstums von HIV oder HSV in Patienten mit Bedarf für eine solche Behandlung. (Belshe, R. B., Herausg., Textbook of Human Virology, 2. Ausg., 1991).
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung richtet sich auf eine antivirale Therapie, d. h. Hemmung des Wachstums von Lentiviren oder Herpetoviridae-Viren in Patienten unter Verwendung der Verbindungen der Formel N und speziell der Verbindungen der Formel II (JO-4A). Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens einer Hypoestoxidverbindung der Formel IV an einen Patienten mit Bedarf für eine solche Behandlung. Bevorzugte Hypoestoxide zur Verwendung in dem Verfahren sind JO-4 (Formel I) und JO-4A (Formel II). Ein anderer Aspekt des Verfahrens umfasst das Behandeln eines Patienten zur Milderung der pathologischen Wirkungen des Wachstums von Lentiviren oder Herpetoviridae-Viren, wie beispielsweise HIV oder HSV in dem Patienten. Die pathologischen Wirkungen von HIV und HSV sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und wurden hierin beschrieben. Es gilt ebenfalls als selbstverständlich, dass das Hemmen des Wachstums von HIV oder HSV in einem Patienten die Pathologie im Zusammenhang mit diesen Infektionen mildert, wie in der Literatur ausreichend dokumentiert ist (Belshe, R. B., Herausg., Textbook of Human Virology, 2. Ausg., 1991).
  • Eine Ausführungsform des Verfahrens umfasst das Zusammenbringen von Verbindungen der Formeln IV mit einem pharmazeutischen Träger oder Streckmittel zur Verabreichung an einen Patienten.
  • Wie in den nachfolgenden Beispielen detailliert wird, hemmt das Verabreichen von JO-4A an HIV-1 infizierten PMBC in vitro das Wachstum von HIV-1, wie in den 15A und 15B veranschaulicht wird. Bei der gleichen Dosierungsmenge war JO-4A für PBMC's nicht toxisch (15B). Die wachstumshemmende Wirkung von JO-4A auf HSV-2 ist in 16C veranschaulicht.
  • Selbstverständlich wird bei der vorstehend erwähnten Verwendung in Patienten, die mit Lentivirus oder Herpetoviridae-Viren, beispielsweise HIV oder HSV, infiziert sind, die therapeutisch wirksame Menge oder Dosierung in Abhängigkeit von der zum Einsatz gelangenden Verbindung, von der Art und Weise der Verabreichung und von der gewünschten Behandlung variieren. Allerdings werden in der Regel zufriedenstellende Ergebnisse erhalten, wenn die Verabreichung oral oder intravenös mit einer Tagesdosis von etwa 0,001 mg bis etwa 1.000 mg/kg Körpergewicht des Tieres erfolgt, die ohne weiteres in unterteilten Dosierungen von 1 bis 4 Mal täglich oder in Form einer verzögerten Freisetzung gegeben werden können. Bei Verabreichung durch Injektion werden in der Regel zufriedenstellende Ergebnisse erhalten, wenn die Verabreichung bei einer Tagesdosis von etwa 0,001 mg bis etwa 200 mg/kg Körpergewicht des Tieres und vorzugsweise im Bereich von etwa 50 mg bis etwa 200 mg/kg erfolgt, die ohne weiteres in unterteilten Dosierungen mit 1 bis 4 Mal täglich oder in Form einer verzögerten Freisetzung gegeben werden kann. Bei größeren Säugern liegt die gesamte Tagesdosis im Bereich von etwa 0,001 bis etwa 200 mg, wobei Dosierungsformen, die für die orale Verabreichung geeignet sind, von etwa 0,001 mg bis etwa 1.000 mg der Verbindung in Zumischung oder in Verbindung mit einem festen oder flüssigen pharmazeutischen Träger oder Streckmittel aufweisen. Die Methoden zum Bestimmen der therapeutisch wirksamen Mengen der Verbindungen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Derartige Methoden umfassen die Analyse der pharmazeutisch/pharmakokinetischen Parameter in der antiviralen Therapie, d. h. zum Hemmen des Wachstums von Lentiviren oder Herpetoviridae-Viren, wie beispielsweise HIV oder HSV in Patienten, ohne auf diese beschränkt zu sein (Elion, G. B., Acyclovir: Discovery, Mechanism of Action, and Selectivity, J. Med. Virol. Suppl. 1: 2–6, 1997; Wagstaff, A. J., et al., Drugs 1994, 47(1): 153–205).
  • In das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung einbezogen, die eine wirksame Menge von einer oder mehreren der Verbindungen der Formel IV aufweist. Bevorzugte Ausführungsformen sind JO-4A in reiner Form oder als pharmazeutisch zulässiges rohes Konzentrat in Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger oder Streckmittel bei HIV- oder HSV-2-Infektion und JO-4 bei HSV-1- oder HSV-2-Infektion. Diese Zusammensetzungen enthalten im besten Fall weniger als 1 Gew.-% und bevorzugt etwa 0,2 Gew.-% der Verbindungen der Formel I und können mit Hilfe konventioneller Methoden in konventionellen Formen hergestellt werden, wie beispielsweise Kapseln, Tabletten, Suppositorien, dispergierbare Pulver, Sirupe, Elixiere, Suspensionen oder Lösungen zur enteralen oder parenteralen Verabreichung. Geeignete pharmazeutische Streckmittel oder Träger schließen beispielsweise ein: Wasser, Alkohole, natürliche oder gehärtete Fette und Wachse, Calcium- und Natriumcarbonate, Calciumphosphat, Kaolin, Talkum und Lactose sowie geeignete Konservierungsmittel, wie beispielsweise Ethyl-p-hydroxybenzoat, Suspendiermittel, wie beispielsweise Methylcellulose, Traganth und Natriumalginat, Benetzungsmittel, wie beispielsweise Lecithin, Polyoxyethylenstearat und Polyoxyethylensorbitan-Monooleat, Granuliermittel und Zerfallmittel, wie beispielsweise Stärke und Alginsäure, Bindemittel, wie beispielsweise Stärke, Gelatine und Gummi arabicum, sowie Gleitmittel, wie beispielsweise Magnesiumstearat, Stearinsäure und Talkum, um ein angenehmes und schmackhaftes pharmazeutisches Präparat bereitzustellen. Die Zusammensetzungen in Tablettenform können mit Hilfe konventioneller Methoden beschichtet sein, um den Zerfall der Tablette und die Aufnahme des Wirkstoffes im gastrointestinalen Trakt zu verzögern und dadurch eine verzögerte Wirkung über eine lange Zeitdauer zu ermöglichen. Andere Verbindungen und Methoden, die auf dem Gebiet für den verzögerten Zerfall oder für zeitverzögerte oder zeitbestimmte Freisetzung der Wirkstoffe bekannt sind, finden ebenfalls Anwendung bei der Formulierung der Wirkstoffe für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren. Beispielsweise lassen sich die Verbindungen der Formel IV auch mit Liposomen oder anderen Trägermitteln mit verzögerter Freisetzung kombinieren, um die Verbindungen vor dem Zerfall zu schützen, bis sie ihre Ziele erreichen, und/oder den Transport der Verbindungen durch Gewebebarrieren zu erleichtern.
  • Die bevorzugten Zusammensetzungen sind vom Standpunkt der leichten Verabreichung feste Zusammensetzungen und speziell mit Feststoff gefüllte Gelatinekapseln oder Tabletten.
  • Es gilt außerdem als selbstverständlich, dass eine weitere Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung das Kombinieren von einem oder mehreren Mitteln in einer Vielzahl von Protokollen umfasst, einschließlich Prophylaxe, wobei in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Verabreichen pharmazeutischer Zusammensetzungen an Patienten, die eine Behandlung zum Hemmen des Wachstums von Lentiviren oder Herpetoviridae-Viren oder zur Milderung der pathologischen Wirkungen des Wachstums solcher Viren bei einem Patienten bedürfen, die Verbindungen der Formeln IV aufweisen. Die Kombinationsprotokolle und Methoden zum Bestimmen ihrer Wirksamkeit schließen das therapeutische Medikamentenmonitoring ein und sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (Belshe. R. B., Herausg., Textbook of Human Virology, 2. Ausg. 1991). Beispiele für antivirale Mittel und andere Mittel, die in der Therapie zum Hemmen des Wachstums von HIV oder HSV verwendbar sind und die mit dem Verabreichen der Verbindungen der Formeln IV in dem erfindungsgemäßen Verfahren kombiniert werden können, schließen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Famciclovir, Aciclovir, Valaciclovir, Sorivudin (BV-Arall), BW882C87, Ganciclovir, Brivudin, Cidofovir (HPMPC), Lobucavir, ISIS-2922, Saquinavir, Ritonavir, Indinavir, Nelfinavir (Proteasehemmer); Interferon-α/β, Azidothymidin (AZT, Retrovir, Zidovudin), Didesoxycytidin (DDC), Didesoxyadenosin, Didesoxyinosin (DDI), Ribavirin, Peptid-T, löslicher rekombinanter CD4-Rezeptor. Methoden zur Bestimmung der therapeutisch wirksamen Mengen der Verbindungen der Formeln IV und der Mittel, die ausgewählt sind aus der Gruppe der antiviralen Mittel oder Mittel, die in der antiviralen Therapie in Verbindungen der Formel IV in pharmazeutischen Zusammensetzungen in dem Verfahren der Erfindung verwendbar sind, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Materialien und Methoden wurden in den nachfolgend ausgeführten nicht einschränkenden Beispielen eingesetzt.
  • IMMUNSUPPRESSION
  • BLUTSPENDER
  • Heparinisiertes Blut (30 ml) wurden durch Venenenfiahme von Freiwilligen erhalten. Zum Ansetzen einer gemischten Leukozytenkultur (MLC) sind in der Regel zwei Spender mit verschiedenem genetischen Hintergrund erforderlich.
  • KULTURMEDIUM
  • RPMI-1640, Medium (Fisher Scientific Co., Santa Clara, CA) wurde mit 20%igem wärmeaktiviertem Human AB-Serum und 1% Penicillin/Streptomycin-Mischung ergänzt.
  • ISOLATION MONONUKLEÄRER LEUKOZYTEN
  • Es wurden mononukleäre Leukozyten aus Blut durch Überschichten von geeignetem verdünnten Blut in nach Hanks-gepufferter Salzlösung (H-BSS) auf Ficoll®-Hypaque-Gradienten gefolgt von einer Zentrifugation isoliert. Die gewonnenen Zellen wurden 3 Mal in Kulturmedium gewaschen und mit Hilfe der Trypan-Blau-Farbstoff-Ausschlussmethode auf Lebensfähigkeit bestimmt. Die Zellkonzentration wurde in komplettem Kulturmedium auf 2 Mal 106/ml eingestellt.
  • GEMISCHTE LEUKOZYTENREAKTION (MLR)
  • Die MLR ist ein Assay, die von der Fachwelt als eine in vitro-Prognose der in vivo-immunsuppressiven Wirksamkeit anerkannt ist. Die MLR ist ein in vitro-Modell der T-Zellen-Erkennung von fremdem Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Genpradukten und wurde als prognostischer Test der zellvermittelten Transplantatabstoßung verwendet (Abbas, A. K., et al., Herausg., 1994, 2. Ausg., Cellular and Molecular Immunology, W. B. Saunders Co., USA). Eine Transplantatabstoßung erfolgt durch T-Zellen, die MHC-Moleküle erkennen und das Transplantat zerstören. Dieser Prozess lässt sich in vivo untersuchen, allerdings erfordert eine Tiefenanalyse speziell bei Menschen die Entwicklung von Tests, wie beispielsweise den MLR als ein in vitro-Korrelat der Transplantatabstoßung (Janeway, Chas. and Travers, Paul, Immunobiology, 2. Ausg., Garland Publishing, Inc., New York, (1996)). In der Fachwelt ist hinlänglich bekannt, dass der MLR durch Co-Kultivierung von mononukleären Leukozyten von einem Individuum mit mononukleären Leukozyten angesetzt wird, die von einem anderen Individuum abgenommen werden. Wenn es in den Allelen der MHC-Gene zwischen den zwei Individuen Unterschiede gibt, wird sich ein großer Anteil der mononukleären Zellen über eine Dauer von 4 bis 7 Tagen entwickeln und wird als allogenes MLR bezeichnet. Die Stärke des proliferativen Ansprechens wird durch Inkorporation von 3H-Thymidin in DNA während der Zellreplikation gemessen. Da die Zellen von jedem Spender untereinander reagieren und proliferieren, ist die resultierende Reaktion als ein "Zweiwege-MLR" bekannt. JO-4 wurde in der MLR auf seine Fähigkeit zur "Immunsuppression" getestet.
  • DER "ZWEIWEGE-MLR"-ANSATZ IN MIKROTITERPLATTEN
  • Es wurden zunächst mononukleäre Zellen (bei 2 × 106/ml) jedes Spenders untereinander gründlich in einem 50 ml-Rohr im Volumenverhältnis von 1 : 1 gemischt. Die Mischung wurde in die Mulden einer 96-U-Mikrotiterplatte mit Volumina von 100 μl pro Mulde gegeben. Die Verbindungen oder in Frage kommenden immunsuppressiven Mittel wurden in Kulturmedium in Volumina von 100 μm pro Mulde mit variierenden Konzentrationen von 1,0, 0,5 oder 0,25 μg/ml gegeben. In die Kontrollmulden wurde 100 μl Kulturmedium ohne Medikament gegeben. Die Kulturen wurden in einem feuchten Inkubator bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO2 für 5 Tage gehalten. 4 Stunden vor der Ernte wurden die Kulturen in jeder Mulde mit 1 μCi tritiiertem Thymidin (spezifische Aktivität 719,5 mCi/mg; Dupont, Wilmington, DE) gepulst. Die Zellen wurden auf Glasfaserfiltern (Packard, Downers Grove, IL) mit einem 96-well-Zellharvester-Automaten (TOMTEC, Hamden, CT) geerntet und direkt auf einem Matrix 9600-beta-Zähler (Packard) ausgezählt. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
  • Die Daten wurden als prozentuale Hemmung (% Hemmung) nach der folgenden Gleichung dargestellt: % Hemmung = 100 – (Zählungen/min (CPM) von Mulden mit Medikament × 100)/CPM für Mulden ohne Medikament
  • ERZEUGUNG VON MHC-BESCHRÄNKTEN CYTOLYTISCHEN CD8+T-LYMPHOZYTEN IN "EINWEG-HUMAN-MLR"-KULTUREN
  • Der "Einweg-MLR" wurde in Gewebekulturflaschen mit mononukleären Zellen von 2 verschiedenen Spendern entsprechend der vorstehenden Beschreibung in "Zweiwege-MLR" angesetzt. Allerdings wurde in der "Einweg-MLR" eine der beiden mononukleären Leukozytenpopulationen zur Proliferation durch Behandlung mit Mitomycin C, einem antimitotischen Medikament, vor der Inkulturnahme unfähig gemacht. In diesem "Einweg-MLR" dienten die Zellen ausschließlich als Stimulatoren, während die unbehandelten Zellen, die immer noch zur Proliferation fähig waren, als die Responder fungierten. Die Responder-Zellen exprimierten während einer Kulturdauer von 5 bis 7 Tagen den CD8+-phänotyp, nicht jedoch den CD4+. Diese CD8+-Zellen dienten ausschließlich als zytolytische T- Lymphozyten (CTL), die die Target-Zellen von dem gleichen Individuum wie der ursprünglichen Stimulator-Zellpopulation lysierten. In der Transplantation lysieren diese MHC-beschränkten zytotoxischen CD8+-T-Zellen MHC-ungleiche Spender-Gewebetargets, die zur Transplantatabstoßung kommen (Abbas, A. K., Herausg., 1994, 2. Ausg., Cellular and Molecular Immunology, W. B. Saunders Co., USA; Imagawa, D. K., et al., in Aggarwal, B. B., et al., Herausg., 1995, Human Cytokines: Their role in Disease and Therapy, Blackwell Science, Inc., Cambridge, MA). Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
  • "EINWEG-MLR"-ANSATZ IN GEWEBEKULTURFLASCHEN
  • Es wurden mononukleäre Zellen von einem der Spender zuerst mit Mitomycin C (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) (50 μg/50 × 106-Zellen) in 15 ml-Röhrchen behandelt, die in Aluminiumfolie eingewickelt waren, und in einem Wasserbad bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen 3 Mal mit Gewebekulturmedium gewaschen und auf 2 × 106/ml eingestellt und dienten als Stimulatoren. Von einem anderen Spender wurden mononukleäre Zellen, die nicht mit Mitomycin C behandelt worden waren, auf 2 × 106/ml eingestellt und als Responder verwendet. Responder und Stimulatoren wurden in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 gemischt und in Gewebekulturflaschen für 5 bis 7 Tage in Gegenwart entweder von 1,0 μm/ml JO-4 oder ausschließlich in Gegenwart von Medium inkubiert. Einige der Stimulatorzellen, die nicht mit Mitomycin C behandelt waren, wurden mit PHA aktiviert und anschließend in IL-2-konditionierten Medium zur Verwendung als Targets am Ende von 5 oder 7 Tagen in dem CTL-Assay in Kultur genommen.
  • INHIBITORISCHE WIRKUNG VON JO-4 AUF DIE INDUKTION DER PROINFLAMMATORISCHEN CYTOKIN-SYNTHESE
  • Es wurden mononukleäre Zellen von peripherem Human-Blut (PBMC) mit B-Zellen-Mitogen-LPS (Gibco BRL, Grand Island, NY) mit 3 μg/ml bei 2 × 106/ml in 1,0 ml Volumina in 24-Mikrotiterplatten in Gegenwart entweder von 1 μg/ml JO-4 oder Medium für 48 in einem Inkubator bei 37°C mit 5% CO2 in Kultur genommen. Die Kulturüberstände wurden am Ende der Inkubationsdauer aufgenommen und mit Hilfe eines Enzymimmunoassays auf Vorhandensein der Cytokine: Interleukin-1β, -6 und TNF-α, untersucht. Die Ergebnisse sind als Hemmung der Cytokinerzeugung in 3 dargestellt.
  • INHIBITORISCHE WIRKUNG VON JO-4A AUF HUMAN-MLR
  • Es wurde eine Zweiwege-MLR in Abwesenheit oder Anwesenheit variierender Konzentrationen von JO-4A (0,1, 1,0, 10 und 100 μM) angesetzt. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
  • INHIBITORISCHE WIRKUNG VON JO-4 AUF DIE LPS-INDUZIERTE MURIN-LYMPHOZYTENPROLIFERATION IN VITRO
  • LPS ist ein B-Zell-Mitogen in Mäusen und ist außerdem dafür bekannt, dass es proinflammatorische Cytokine induziert, wie beispielsweise TNF-α, IL-6 und IL-1β, und zwar sowohl in mononukleären Zellen von Mäusen als auch von Menschen (Cunningham, A. J., Herausg.; Understanding Immunology 1978; Academic Press, Inc., New York, USA). Es wurden Mäuselymphozyten mit LPS in vitro in Abwesenheit und Anwesenheit variierender Konzentrationen von JO-4 (1,5, 2,5, 5,0, 10,0 und 50,0 μg/ml) stimuliert. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
  • DIE INHIBITORISCHE WIRKUNG VON JO-4 AUF PHA-INDUZIERTE PROLIFERATION VON MONONUKLEÄREN ZELLEN VON PERIPHEREM HUMAN-BLUT IN VITRO
  • Es wurden Human-PBMC's für 4 Tage in Abwesenheit oder Anwesenheit von variierenden Konzentrationen von JO-4 (1,25, 2,5, 5,0, 10,0 und 50,0 μg/ml) in Kultur genommen. Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt. PHA ist ein starkes T-Zell-Mitogen und stimuliert T-Zellen zur Erzeugung von IL-2.
  • FEHLENDE TOXIZITÄT VON JO-4 AUF HUMAN-PBMC
  • Um zu ermitteln, ob JO-4 auf Human-Zellen in vitro toxisch wirkt, wurden Human-PBMC in Abwesenheit oder Anwesenheit variierender Konzentrationen von JO-4 (1,25, 2,5 und 5 μg/ml) für eine unterschiedliche Zahl von Tagen (2, 5 und 7 Tage) in Kultur genommen. Am Ende jeder Inkubationsdauer wurde die Lebensfähigkeit der Zellen mit Hilfe der Trypan-Blau-Farbstoff-Ausschlussmethode ermittelt. Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt.
  • VERBINDUNGEN DER ERFINDUNG
  • Die Verbindungen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet wurden, schließen JO-4A (Formel II) ein und JO-4 (Formel I), bei dem es sich um einen Ester von JO-4A handelt.
  • HERSTELLUNG DER VERBINDUNGEN
  • HERSTELLUNG VON JO-4A
  • Es wurden JO-4-Kristalle (82 mg, 0,22 mM) in einer Mischung von Methanol (3 ml) und Dioxan (3 ml) unter Erwärmen aufgelöst und anschließend bis Raumtemperatur gekühlt. Es wurde frisches Natriummethoxid-Pulver bis zum pH-Wert 10 zugesetzt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und das klare, orange-gelbe Reaktionsgemisch mit Dowex-50H+-Harz neutralisiert, filtriert und im Vakuum eingedampft, um einen blassgelben Sirup zu ergeben, der im Gefrierapparat über Nacht langsam kristallisierte. Ausbeute: 65 mg, 90%.
  • ESTER VON JO-4
  • Wie in Formel IV gezeigt wird, umfassen die Verbindungen der Erfindung Ester von JO-4A, allerdings unter Ausschluss von Hypoestoxid (JO-4), die in Heterocycles 20: 212502128 (1983) und in Z. Naturforsch. 37c: 558–561 (1982) offenbart wurden. Ebenfalls ist allerdings zu beachten, dass das erfindungsgemäße Verfahren zum Auslösen der Immunsuppression das Verabreichen der Verbindungen der Formel II umfasst, in die Hypoestoxid einbezogen ist.
  • Nach einem der Aspekte der Erfindung richtet diese sich auf Verbindungen der Formel IV:
    Figure 00290001
    worin sind
    R ist
    H, PO3 2–, Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, das substituiert oder unsubstituiert ist, geradkettig ist oder verzweigt, mit Null bis 6 Doppelbindungen, (CH2)n-Morpholin, worin n = 1 bis 4 beträgt, Morpholinomethylphenyl, Orthoaminophenyl, Orthohydroxyphenyl, (CH2)nCOOR2, worin n = 1 bis 4 beträgt;
    worin R2 H ist, ein Alkalimetallsalz, ein Erdalkalimetallsalz, NHa+, N+(R3)4, worin R3 unabhängig; ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H und Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen;
    COR1, worin R1 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, (CH2)nCH3, worin n = 1 bis 6 beträgt, (CH2)nCOOR2, worin n = 1 bis 4 beträgt und R2 wie vorstehend festgelegt ist, (CH2)nN+(R3)4, worin n = 1 bis 4 beträgt, und (CH2)nSO3 –, worin n = 1 bis 4 beträgt, sowie pharmazeutisch zulässige Salze davon. Ein verwandter Aspekt der Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame, immunsuppressive Menge der Verbindungen der Formel IV aufweisen.
  • Die Verfahren der Erfindung zum Auslösen der Immunsuppression in Säugern umfasst das Verabreichen einer pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Säuger mit Bedarf für eine solche Behandlung, welche pharmazeutische Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindungen der Formel IV und pharmazeutisch zulässige Salze davon aufweist.
  • ISOLATION VON JO-4 AUS HYPOESTESROSEA
  • Die allgemeine Prozedur zur Isolation von reinem JO-4 (Formel I) aus getrocknetem Pflanzenmaterial von Hypoestes rosea umfasst die Fest/Flüssig-Extraktion unter Verwendung von siedenden Hexanen in einem großen Soxhlet-Apparat. Hypoestes rosea ist ein Strauch der Familie Acantheceae (Okugun, J. I., et al., Z. Naturforsch., 37c: 558–561 (1982)). Der aus den Hexanen bei der Verdampfung erhaltene rohe Extrakt wurde einer Flash-Säulenchromatographie auf Silicagel unter Verwendung eines Stufengradienten-Lösemittelsystems unterworfen, beginnend mit Petrolether (30° bis 60° Sp) und abgestuft auf 5% Ethylacetat und anschließend auf 10% und sodann 20%. Das 30%ige Ethylacetat-JO-4 wurde aus der Säule eluiert. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereint und bis zur Trockene konzentriert und Petrolether oder Hexane zugesetzt, um kristallines JO-4 zu erhalten. Eine dieser Prozeduren lieferte 240 mg reines JO-4 aus 10 g rohem Extrakt von Blättern.
  • Wichtiger Hinweis: Der rohe Extrakt wurde zuerst in einem Minimum von Ethylacetat aufgelöst und auf Silicagel absorbiert und bis zu einem trockenen Pulver eingedampft, bevor es auf die Säule geladen wurde, die im Petrolether vorgepackt war. Die Extraktion der spezifischen Anteile der Pflanze zeigte, dass die Blätter Strukturen waren, die zum großen Teil das JO-4 im Gegensatz zu den Stängeln enthielten.
  • ERGEBNISSE
  • Wie vorstehend ausgeführt, wurde von den Verbindungen der Formel IV festgestellt, dass sie über eine unerwartete Wirksamkeit als immunsuppressive und antiinflammatorische Mittel verfügen, die durch ihre Wirkungen auf die Zellularimmunität gezeigt wurde, was in in vitro- und in vivo-Standardtests nachgewiesen wurde, die für die immunsuppressive Wirksamkeit in vivo in Menschen oder anderen Säugern für eine Verbindung prognostisch sind.
  • Die Verbindungen der Formeln IV und II und speziell JO-4A und JO-4 führen, wie hierin demonstriert wurde, zur Immunsuppression der Erzeugung, Proliferation oder Funktion von Immunozyten oder Lymphozyten und sind daher bei der Unterdrückung der Abstoßung von transplantierten Geweben verwendbar, z. B. Organtransplantaten, wie beispielsweise Haut, Knochenmark, Niere, Herz und Lunge; und sind verwendbar zur Verhütung der Transplantat-Wirtsreaktion (GVHD) und 7-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise Multiple Sklerose (MS), Autoimmun-Thyroiditis, Autoimmun-Myocarditis, systemischer Lupus erythematosus (SLD), rheumatoide Arthritis (RA), Alzheimer Krankheit (AD), Diabetes und Glomerulonephritis.
  • Da die erfindungsgemäßen Verbindungen die Synthese proinflammatorischer Cytokine (IL-1β, TNF-α, IL-6) unterdrücken, finden die Verbindungen zur Unterdrückung allergischer Reaktionen, Asthma, Kontaktdermatitis und Hauterkrankungen, wie beispielsweise Psoriasis, Anwendung.
  • Die immunsuppressiven Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen wurden in den vorstehend beschriebenen Tests ermittelt, deren Ergebnisse nachfolgend ausgeführt werden. Es wurde festgestellt, dass die immunsuppressive medizinische Wirksamkeit der beanspruchten Verbindungen in den in vitro- und in vivo-Tests bei Mäusen die Grundlage für die Schlussfolgerungen der Erfinder dafür bildete, dass die beanspruchten Verbindungen und die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese aufweisen, über eine in vivo-Wirksamkeit in Bezug auf die Hemmung des Immunsystems in einem Tier- oder Human-Wirt verfügen.
  • 1 ist für die Ergebnisse von mehreren Versuchen unter Verwendung unterschiedlicher Paare von Spendern für den jeweiligen Versuch repräsentativ. Die Ergebnisse demonstrieren, dass JO-4 den Zweiwege-MLR hemmte.
  • 2 zeigt die inhibitorische Wirkung von JO-4 auf MHC-Klasse I-beschränkte zytotoxische T-Lymphozyten-vermittelte Lyse von MHC-ungleichen Stimulator-Targetzellen. Von Reaktionen der Gewebeabstoßung ist bekannt, dass MHC-beschränkte, zytotoxische CD8+-T-Zellen-Lyse von MHC-ungleichen Spendergewebe zur Transplantatabstoßung führt (Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 1994, W. B. Saunders Co., USA; Imagawa D. K., et al., In Aggarwal, B. B., et al., Herausg., Human cytokines: Their rote in Disease and Therpay, Blackwell Science, Inc., Cambridge, MA, 1995). In diesem Versuch wurde demonstriert, dass JO-4 die lytische Fähigkeit solcher zytotoxischer T-Zellen, die aus "Einweg-Human-MLR"-Kulturen erzeugt wurden, weitgehend hemmte (82%), so dass es sich um ein Ergebnis handelt, mit dem die immunsuppressive Wirksamkeit in vitro und zu erwartende in vivo-Wirksamkeit der Hemmung des Immunsystems in einem Tier oder Mensch als Wirt für die beanspruchten Verbindungen nachweist.
  • 3 ist repräsentativ für die Ergebnisse aus 3 Versuchen, die die inhibitorische oder immunsuppressive Wirkung von JO-4 auf die proinflammatorische Cytokinsynthese (IL-1α, TNF-β und IL-6) demonstrierte. Diese Cytokine sind dafür bekannt, dass sie bei Entzündung und dem Endotoxin-Schocksyndrom beteiligt sind. (Watkins et al.; Pain, 1995, 63: 289–302: Immune activation: the rote of proinflammatory cytokines in inflammation, illness responses and pathological pain states).
  • 4 zeigt die inhibitorische Wirkung von JO-4A auf Human-Zweiwege-MLR. Der IC50-Wert von JO-4A zeigte sich zwischen 5,0 μM und 10,0 μM. Bei 10,0 μM induzierte JO-4A 64% Hemnmung vom Zweiwege-MLR.
  • 5 zeigt die inhibitorische Wirkung von JO-4 auf LPS-induzierte Proliferation von Mäuse-Lymphozyten in vitro. Die Proliferation wurde um mehr als 50% bei allen getesteten Konzentrationen (1,5 μg/ml bis 50 μg/ml) gehemmt. Da LPS ein starkes murines B-Lymphozyten-Mitogen ist und B-Lymphozyten die Erzeuger von Plasmazellen sind, die Antikörper sekretieren (Cunningham, A. J., Herausg., 1978; Academic Press, Inc.: Understanding Immunology), finden JO-4 und die Verbindungen der Erfindung Anwendung zur Verhütung der Erzeugung von Autoantikörpern in Autoimmunkrankheiten, wie beispielsweise bei systemischem Lupus erythromatosus, rheumatoider Arthritis, ohne auf diese beschränkt zu sein.
  • 6 zeigt die inhibitorische Wirkung von JO-4 auf PHA-induzierte Proliferation von Human-Lymphozyten in vitro. Die PHA-Aktivierung von Lymphozyten führt zur IL-2-Erzeugung, die erforderlich ist, um eine MLR-Reaktion aufrecht zu erhalten oder auszulösen. Die inhibitorische Wirkung von JO-4 auf PHA-induzierte Lymphozytenproliferation könnte daher dessen inhibitorische Wirkung auf MLR erklären, was als eine Erklärung dient, nicht jedoch im Sinne einer Einschränkung.
  • 7 zeigt, dass JO-4 auf Lymphozyten bei Konzentrationen, wie sie zum Hemmen der Lymphozytenproliferation gezeigt wurden, nicht toxisch ist. Damit ist die inhibitorische Wirkung von JO-4 auf Lymphozytenproliferation auf dessen Vermögen zum Hemmen der DNA-Synthese ohne Toxizität zurückzuführen.
  • 8 zeigt, dass JO-4A die NK-Aktivität in vivo durch intravenöse oder orale Verabreichung hemmt. Dieses Ergebnis demonstriert, dass die Verbindungen der Erfindung zur Unterdrückung der Transplantat-Wirt-Reaktion verwendbar sind, indem in vivo die Aktivität der NK-Zellen im Spender unterdrückt wird, die wichtige Effektor-Zellen sind, wenn sie in systemisch akuter Transplantat-Wirt-Reaktion transplantiert werden. Dementsprechend finden die Verbindungen der Erfindung wie auch JO-4 in einer Methode zur Verhütung von GVHD in einem Transplantatempfänger Anwendung, wobei die Methode das Verabreichen einer pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Transplantatspender umfasst und die pharmazeutische Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge dieser Verbindungen aufweist. Eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung ist ausreichend, um die NK-Zellfunktion in dem Spender zu unterdrücken, um eine GVHD zu vermeiden oder zu verhüten oder zu mildern, wenn die NK-Zellen zu einem Empfänger transplantiert werden. Es gilt als eine fachmännische Routine, die optimalen Dosierungen und den Zeitablauf der Verabreichung der Verbindungen an die Spender zu bestimmen, um eine GVHD in einem Transplantatempfänger zu mildern, zu vermeiden oder zu verhüten.
  • GEGEN KREBS
  • In den nachfolgenden nicht einschränkenden Beispielen wurden die folgenden Materialien und Methoden eingesetzt.
  • TUMORZELLEN
  • Human-zervikale Epithelzellenkarzinome (HeLa), humanes klarzelliges Nierenkarzinom (CAKI-1), human-malignes Melanom (RPMI-7951) und Maus-malignes Melanom (B16-F1) wurden von der ATCC (Rockville, MD) erworben und in vitro mit MEM-Medim (Mediatech, Inc., Herndon, VA) ergänzt mit 10%igem wärmeinaktiviertem fetalen Rinderserum gehalten (American Qualex, San Clemente, CA), 10 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Sigma Chemicals, Saint Louis, MO) (komplettes Medium).
  • NORMALZELLEN
  • Normale human-zervikale Ektoepithelzellen (CrEc-Ec), normale human-Mamma-Epithelzellen (HMEC) und normale human-umbilikale Venen-Endothelzellen (HUVEC) wurden von Clonetics (San Diego, CA) erhalten und mit entsprechendem, von Clonetics erhaltenem und empfohlenem Gewebekulturmedium in Kultes genommen.
  • MONONUKLEÄRE ZELLEN VON PERIPHEREM BLUT (PBMC)
  • Heparinisiertes venöses Blut wurde von gesunden erwachsenen Freiwilligen erhalten und PBMC durch Zentrifugation über Ficoll®-Hypaque (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) separiert. Die Zellen wurden 3 Mal mit HBSS (Hanks-gepufferte Salzlösung) gewaschen und abschließend erneut in komplettem Medium suspendiert. Die Lebensfähigkeit der Zelle wurde mit Hilfe des Trypan-Blau-Farbstoff-Ausschlusstests bewertet und die Zellzahl auf die erforderliche Konzentration eingestellt.
  • KOLORIMETRISCHER MTT-ASSAY
  • Die zytotoxischen Wirkungen der Hypoestoxidverbindungen der Formeln I und II (JO-4A) wurden in vitro mit Hilfe eines kolorimetrischen Assays bestimmt (Mosmann, T., J. Immunol. Methods, 65: 55–63, 1983). Kurz gesagt wurden 1.000 Zellen pro Mulde (100 μl) in einer 96 Flachbodenmikrotiterplatte entweder mit dem Kulturmedium allein oder mit verschiedenen Konzentrationen des Arzneimittels bei 37°C in einem mit 5% CO2 und 95% Luft befeuchteten Inkubator für 72 Stunden in Kultes genommen. Am Ende der Kultur wurden 10 μl von 5 mg/ml sterile Lösung von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2y1)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (Sigma Chemicals, Saint Louis, MO) in PBS pro Mulde zugesetzt und die Inkubation für weitere 4 Stunden fortgesetzt. Allen Mulden wurde saures Isopropanol (100 μl 0,04 N HCl in Isopropanol) zugegeben und für 30 min bei Raumtemperatur gehalten. Mit dem Mischen mit einer Mehrkanal-Pipettenvorrichtung lösten sich die dunkelblauen Kristalle auf und der unter Verwendung eines ELISA-Plattenlesers gemessene Absorptionsgrad ergab 545 bis 650 nm.
  • MÄUSE
  • Es wurden 8 Wochen alte weibliche C57BL/6 (B6)-Mäuse von Charles River Laboratories (Wilmington, MA) erworben.
  • DIE MESSUNG DES TUMORVOLUMENS IN MÄUSEN
  • Es wurden B16-F1-Melanom-Zellen, die in vitro exponentiell wachsen, nach 15 min Inkubation mit 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung (Irvin Scientific, Irvine, CA) geerntet. Den Mäusen wurden subkutan (s. c.) Injektionen von 50.000 lebenden Zellen an der rechten Seite gegeben (Fidler, I. J. Cancer Research 35: 218–224, 1975). 4 Tage nach der Injektion erhielten die Mäuse in der Versuchsgruppe oral mit einer Sonde verschiedene Konzentrationen von JO-4A in 0,2 ml Wasser und die Kontrollgruppe erhielt Wasser allein. Die Tumore wurden mit einem Mikrotaster gemessen und das Tumorvolumen mit Hilfe der folgenden Formel berechnet:
    Länge × Breite × Höhe × 0,5236
    (Jungwirth, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 5810–5813, 1997)
  • STATISTISCHE ANALYSE
  • Zur Berechnung des Signifikanzniveaus wurde der Student-T-Test verwendet.
  • Dementsprechend umfasst das erfindungsgemäße Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens einer Hypoestoxidverbindung mit der Formel IV und pharmazeutisch zulässige Salze davon an Patienten.
  • Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung schließen pharmazeutische Zusammensetzungen ein, die eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung der Formel II (JO-4A) zum Hemmen des Wachstums von krebsartigen Tumoren aufweisen.
  • Wie in den nachfolgenden Beispielen gezeigt wird, wurde von den Verbindungen der Formel IV und speziell der Formel II (JO-4A) festgestellt, dass sie über eine unerwartete Wirksamkeit als Mittel zum Hemmen des Wachstums von krebsartigen Tumoren verfügen, was durch ihre Wirkungen auf das Zellwachstum von krebsartigem Tumor gezeigt wurde, was in in vitro- und in vivo-Standardtests nachgewiesen wurde, die für die Zusammensetzung der Antitumorwirksamkeit in vivo in Menschen oder anderen Tieren prognostisch sind.
  • Die Verbindungen der Formel IV und speziell Formel II (JO-4A) hemmen, was hierin demonstriert wird, das Wachstum, die Erzeugung oder Proliferation oder Funktion von krebsartigen Tumorzellen und sind daher in einem Verfahren zum Hemmen des Wachstums von krebsartigen Tumoren in Patienten mit einem Bedarf für eine Krebsbehandlung verwendbar.
  • Die Wirkungen der Verbindungen der Formel IV wurden in den vorstehend beschriebenen Tests ermittelt, deren Ergebnisse nachfolgend ausgeführt werden. Es wurde festgestellt, dass die medizinische Wirksamkeit der Verbindungen der Formel IV zum Hemmen des Wachstums von krebsartigen Tumor in den in vitro- und Maus-in vivo-Tests die Grundlage für die Schlussfolgerungen der Erfinder bildeten, dass die beanspruchten Verbindungen und diese aufweisenden pharmazeutischen Zusammensetzungen über eine in vivo-Wirksamkeit hinsichtlich der Hemmung des Wachstums krebsartiger Tumore in einem Tier oder Menschen als Wirt verfügen.
  • BEISPIEL 1
  • ZYTOTOXISCHE WIRKUNGEN VON JO-4A AUF KREBSZELLEN IN VITRO
  • 9 ist repräsentativ für die Ergebnisse mehrerer Versuche über die zytotoxischen Wirkungen von JO-4A auf verschiedene Human-Krebszellen in vitro. Die Ergebnisse demonstrieren, dass JO-4A auf human-zervikale Epithelkarzinomzellen (HeLa) eine dosisabhängige zytotoxische Wirkung haben. Die inhibitorische Konzentration50 (IC50), d. h. die Medikamentenkonzentration, die in der Lage ist, eine Zytotoxizität von 50% zu induzieren, lag zwischen 10 μM und 12,5 μM.
  • In ähnlicher Weise zeigte JO-4A einen IC50-Wert zwischen 20 μM und 40 μM an renalen Karzinomzellen (CAKI-1) und zwischen 10 μM und 12,5 μM an malignem Melanom, der zum Lymphknoten metastasierte (RPMI-7951).
  • 10 zeigt die zytotoxischen Wirkungen von JO-4A auf normale Human-Zellen. Bei Verwendung normaler human-zervikaler Ektoepithelzellen, eine Kontroll-Zelllinie für human-zervikales Epithelkarzinom (HeLa) in dem kolorimetrischen Assay hatte JO-4A einen IC50-Wert von > 100 μM. Die IC50-Dosis für HeLa (zwischen 10 μM und 12,5 μM) hatte lediglich eine 6%ige zytotoxische Wirkung auf ihren normalen Gegenspieler. Ferner hatte JO-4A keine zytotoxische Wirkung auf normale mononukleäre Zellen von peripherem Human-Blut. Die IC50-Konzentration von JO-4A für normale Human-Mamma-Epithelzellen und normale umbilikale Humanvenen-Endothelzellen waren ähnlich (zwischen 25 μM und 50 μM).
  • 1 ist repräsentativ für die Ergebnisse mehrerer Versuche über die zytotoxischen Wirkungen von JO-4A auf maligne Melanomzellen von Mäusen (B16-F1) in vitro. Die Ergebnisse demonstrierten, dass JO-4A eine dosisabhängige zytotoxische Wirkung auf B16-F1-Zellen hatte. Die IC50-Konzentration lag zwischen 6,25 μM und 12,5 μM.
  • BEISPIEL 2
  • IN VIVO-WIRKUNG VON JO-4A AUF DAS WACHSTUM VON MELANOM-TUMOR
  • 12 zeigt die in vivo-Wirkung von JO-4A auf B16-F1-Melanom-Tumor in C57BL/6 (B6)-Mäusen. Die tägliche orale Verabreichung von JO-4A an B6-Mäusen ab dein 4. Tag nach der Tumorimplantation hatte das Tumorvolumen mit allen vier getesteten Konzentrationen von JO-4A (12A) signifikant verringert. Darüber hinaus erhöhte die orale Verabreichung von JO-4A auch das Überleben von B6-Mäusen in der Versuchsgruppe. Während alle Mäuse (n = 6) in der nicht behandelten Gruppe am 28. Tag tot waren, überlebten 84% der mit 2 mg/kg JO-4A behandelten Mäuse (5/6). Darüber hinaus überlebten 67% (4/6) der mit 1 mg/kg behandelten Gruppe, 60% (3/5) der mit 0,5 mg/kg behandelten Gruppe, und 17% (1/6) der mit 0,1 mg/kg behandelten Gurppe (12B).
  • 13 zeigt einen Überlebensvergleich jeder Maus der mit 2 mg/kg JO-4A behandelten Gruppe gegenüber der nicht behandelten Gruppe. Die mit 2 mg/kg JO-4A behandelte Gruppe von Mäusen überlebte länger als die nicht behandelte Gruppe trotz der Tatsache, dass die Behandlung am Tag 20 angehalten wurde.
  • BEISPIEL 3
  • ANTIVIRAL
  • Bei den nachfolgend ausgeführten nicht einschränkenden Beispielen wurden die folgenden Materialien und Verfahren eingesetzt.
  • MONONUKLEÄRE ZELLEN VON PERIPHEREM BLUT (PBMC)
  • Es wurde heparinisiertes venöses Blut von gesunden erwachsenen Freiwilligen erhalten und die PBMC's durch Zentrifugation über Ficoll®-Hypaque (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) separiert. Die Zellen wurden 3 Mal mit HBSS (Hanks-gepufferte Salzlösung) gewaschen und abschließend erneut in RPMI-1640-Medium (Mediatech, Inc., Herndon, VA) ergänzt mit 20% fetalem Rinderserum (American Qualex, San Clemente, CA), 10 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Sigma Chemicals, Saint Louis, MO) (komplettes Medium) resuspendiert. Die Überlebensfähigkeit der Zellen wurde mit Hilfe des Trypan-Blau-Farbstoff-Ausschlusstests bewertet und die Zellzahl auf die erforderliche Konzentration eingestellt.
  • NIERENZELLEN VON NORMALEN AFRIKANISCHEN GRÜNAFFEN (CV-1)
  • CV-1-Zellen von den HybriwixTM-Sondensystemen: Test-Kit auf antivirale Herpesempfmdlichkeit (Diagnostics Hybrids, Inc., Athens, OH) wurden für die Tests auf JO-4A mit Hilfe des MTT-Assays verwendet.
  • IN VITRO HIV-1-REPLIKATIONSASSAY
  • Für die Bestimmung der Medikamentenempfindlichkeiten klinischer Human-HIV-1-Isolate wurde ein standardisierter Assay von mononukleärer Zellkultur von peripherem Blut eingesetzt (Japour, A. J. et al. Antimicro Agents Chemother. 1993; 37: 1095–1101). Mononukleäre Zellen von peripherem Blut (2 × 106 Zellen/ml) wurden mit PHA (5 μg/ml) in komplettem Kulturmedium bei 37°C in einem mit 5% CO2-95% Luft befeuchteten Inkubator für 72 Stunden stimuliert. Das 3 Tage alte PHA-stimulierte PBMC wurde bei 400 g für 10 min bei 20° bis 24°C sedimentiert. Der Überstand wurde entfernt und verworfen. Die Zellen wurden erneut in komplettem Kulturmedium resuspendiert und mit 3% IL-2 ergänzt. Die Überlebensfähigkeit der Zelle wurde mit 0,4% Trypan-Blau bestimmt. Die Überlebensfähigkeit war größer als 85%. Die Zellkonzentration wurde auf 4 × 106/ml eingestellt. Die Zellen wurden mit 50 μl Volumina (2 × 105/Mulde) in 96 Mulden-Mikrotiterplatten gegeben, die 50 μl komplettes Kulturmedium enthielten. Die HIV-1-infizierten Kulturen wurden mit dem Isolat eines HIV-1-Patienten (50 μl/Mulde) mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,05 bzw. 0,1 initiiert. JO-4A wurde den Mulden in 50 μl Volumina bei variierenden Konzentrationen (0,0001 μM bis 0,5 μM) zugesetzt. Die Platten wurden bei 37°C und in 5% CO2 in einer befeuchteten Kammer für 7 Tage inkubiert. Am 4. Tag wurde die Hälfte des verbrauchten Mediums (100 μl) verworfen und 50 μl frisches komplettes Medium und 50 μl frisches JO-4A (variierende Konzentrationen wie vorstehend) den Mulden zugegeben, die verbrauchtes JO-4A enthielten. 100 μl frisches Medium wurden in den Mulden ohne Arzneimittel zugegeben. Am 7. Tag wurde die Kultur abgebrochen und die Überstände auf HIV p-24-Antigen mit Hilfe des Enzymimmunoassays (EIA)-Kit entsprechend den Empfehlungen des Herstellers getestet (CoulterTM HIV p24 Antigen Assay: Immunotech, Inc., Westbrook, Maine).
  • IN VITRO-HERPES SIMPLEX-VIRUS (HSV) (TYP 1 UND 2)-REPLIKATIONSASSAY
  • Die antivirale Wirksamkeit des Arzneimittels wurde unter Verwendung der HybriwixTM-Sondensysteme (Test-Kit auf antivirale Herpesempfmdlichkeit: Diagnostic Hybrids, Inc., Athens, OH) bestimmt. Kurz gesagt wurden entweder HSV-1 oder HSV-2-Isolate (ATTC, Rockville, MD) bei 37°C und 5% CO2 in einem befeuchteten Inkubator für 60 min auf Nierenzellen von Afrikanischen grünen Affen in einer 24 Mulden-Flachbodenplatte voradsorbiert. Nach der Voradsorption wurde das virale Impfgut entfernt und das Wachstumsmedium, das verschiedene Konzentrationen des entsprechenden Arzneimittels enthielt, in entsprechende Mulden gegeben. Die Kultur wurde für 48 Stunden zur Verstärkung des Virus fortgesetzt. Die Quantifizierung der in jeder Mulde vorhandenen HSV-DNA wurde mit Hilfe der Methode der Nucleinsäure-Hybridisierung ermittelt. Die Zellen und/oder Virus wurden mit einem DNA-Mittel mit Dochtmittel lysiert und die einsträngige DNA auf einem HybriwixTM-Filter mit Hilfe einer vertikalen Kapillarabsorption des Saugmittels/DNA-Lösung immobilisiert. Die Menge an HSV-Target-DNA von jeder Mulde wurde unter Verwendung einer (I125)-HSV-DNA-Radiosonde, die genetische Sequenzen enthielt ermittelt, bei denen es sich um Homologe zu HSV-1- oder HSV-2-Sequenzen handelte. Die Menge der auf dem HybriwixTM vorhandenen Radioaktivität war abhängig von der Menge der nach der Kultur vorhandenen HSV-DNA und wurde in einem Gammazähler (Packard Instrument Co., Meriden, CT) bestimmt.
  • KOLORIMETRISCHER MTT-ASSAY
  • Die zytotoxischen Wirkungen von Arzneimitteln wurden in vitro mit Hilfe eines kolorimetrischen Assays bestimmt (Mosmann, T., J. Immunol. Methods, 65: 55–63, 1983). Kurz gesagt wurden 1.000 Zellen pro Mulde (100 μl) in einer 96 Flachbodenmikrotiterplatte entweder mit dem Kulturmedium allein oder mit verschiedenen Konzentrationen des Arzneimittels bei 37°C in einem 5% CO2-95% luftbefeuchteten Inkubator für 72 Stunden in Kultur genommen. Am Ende der Kultur wurden 10 μl von 5 mg/ml steriler Lösung von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromid (MTT) (Sigma Chemicals, Saint Louis, MO) in PBS pro Mulde zugesetzt und die Inkubation für zusätzliche 4 Stunden fortgesetzt. Allen Mulden wurde saures Isopropanol (100 μl 0,04 N HCl in Isopropanol) zugesetzt und diese für 30 min bei Raumtemperatur gehalten. Durch das Mischen mit einer Mehrkanal-Pipettenvorrichtung wurden die dunkelblauen Kristalle aufgelöst und der Absorptionsgrad unter Verwendung eines ELISA-Plattenlesers mit 545 bis 650 nm gemessen.
  • IN DEM VERFAHREN ZUR ANWENDUNG GELANGENDE VERBINDUNGEN
  • In die in dem erfindungsgemäßen Verfahren getesteten Hypoestoxidverbindungen (Formel IV) waren JO-4A (Formel II) und JO-4 (Formel I) einbezogen, bei dem es sich um einen Ester von JO-4A handelte.
  • Dementsprechend umfasst das Verfahren der Erfindung das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens einer Hypoestoxidverbindung mit der Formel IV und pharmazeutisch zulässiger Salze davon an Patienten. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren werden pharmazeutische Zusammensetzungen verabreicht, die eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung der Formel II (JO-4A) zum Hemmen des Wachstums von HIV und HSV-2 aufweist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden pharmazeutische Zusammensetzungen verabreicht, die eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung der Formel I (JO-4) zum Hemmen des Wachstums von HSV-1 oder IV und HSV-2 aufweisen.
  • Wie in den Beispielen nachfolgend gezeigt wird, wurde von den Verbindungen der Formeln IV (JO-4) und II (JO-4A) festgestellt, dass sie über eine unerwartete Wirksamkeit als Mittel zum Hemmen des Wachstums von HSV-1 bzw. HSV-2 und HIV und HSV-2 verfügen, wie durch ihre Wirkungen auf das virale Wachstum gezeigt wurde, was standardgemäß in vitro prognostisch für die antivirale Wirksamkeit der Verbindung in vivo bei Menschen oder anderen Tieren nachgewiesen wurde.
  • Wie hierin demonstriert wurde, hemmte die Verbindung der Formel I (JO-4) die Replikation und das Wachstum von HSV-1 und HSV-2 in Nierenzellen von Afrikanischen grünen Affen, einem auf dem Fachgebiet gut bekannten Screeningtest zur Vorhersage einer Anti-HSV-1- oder Anti-HSV-2-Wirksamkeit in einem Patienten, woraus man mit angemessener Fachkenntnis auf dem Gebiet für JO-4 als anwendbar in einem Verfahren zum Hemmen des Wachstums von HSV-1 oder HSV-2 in Patienten mit Bedarf für eine antivirale Therapie betrachten kann, wodurch die pathologischen Wirkungen von HSV-1- oder HSV-2-Infektion gemildert werden.
  • Wie hierin demonstriert wurde, hemmte die Verbindung der Formel II (JO-4A) die Replikation und das Wachstum von HIV in Human-PBMC und HSV-2 in Nierenzellen von Afrikanischen grünen Affen, einem auf dem Fachgebiet gut bekannten Screeningtest zur Vorhersage einer Anti-HIV- oder Anti-HSV-2-Wirksamkeit in einem Patienten, woraus man mit angemessener Fachkenntnis auf dein Gebiet für JO-4A als anwendbar in einem Verfahren zum Hemmen des Wachstums von HIV oder HSV-2 in Patienten mit Bedarf für eine antivirale Therapie betrachten kann, wodurch die pathologischen Wirkungen von HIV- oder HSV-2-Infektion gemildert werden.
  • Es ist festgestellt worden, dass die medizinische Wirkung der Verbindungen der Formel IV und speziell JO-4 und JO-4A, zum Hemmen des Wachstums von HIV oder HSV in in vitro-Tests, wie sie nachfolgend erläutert werden, die Grundlage für die Schlussfolgerungen der Erfinder bildete, dass die Verbindungen und dass die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese aufweisen, über eine in vivo-Wirksamkeit zum Hemmen des Wachstums von HIV oder HSV in einem Tier oder Menschen als Wirt verfügen.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • ANTIVIRALE WIRKUNG VON JO-4A AUF DAS HIV-WACHSTUM IN PBMC'S
  • 15A ist repräsentativ für die Ergebnisse aus mehreren Versuchen über die inhibitorischen Wirkungen von JO-4A auf HIV-1-Isolat von einem Patienten. Die Ergebnisse demonstrieren, dass JO-4A über die dosisabhängige inhibitorische Wirkung auf die HIV-1-Replikation verfügt und es wurde geschlussfolgert, dass die inhibitorische Konzentration50 (IC50), d. h. die Medikamentenkonzentration, die zum Hemmen von 50% in der Lage ist, zwischen 0,0001 μM und 0,01 μM liegt.
  • 15B zeigt die Ergebnisse der Toxizitätstests von JO-4A auf in Kultur genommenen Human-PBMC mit Hilfe des Trypan-Blau-Farbstoff Ausschlusstests. JO-4A hat keinerlei toxische Wirkung bei irgendeiner der getesteten Konzentrationen. Daher ist die inhibitorische Wirkung auf die HIV-1-Replikation durch JO-4A keine Folge der Zytotoxizität von JO-4A auf PBMC's.
  • BEISPIEL 2
  • ANTIVIRALE WIRKUNG VON JO-4 AUF HSV-1- UND HSV-2-WACHSTUM
  • 16A zeigt die antivirale Wirkung von JO-4 auf die HSV-1-Replikation. Die nachfolgenden 2 Tage nach der Inkulturnahme mit verschiedenen Konzentrationen von JO-4 wurde die HSV-1-Replikation in Nierenzellen von Afrikanischen grünen Affen um 60% mit 12,5 μM und um 53% mit 3,125 μM gehemmt. Damit wurde die IC50-Dosis für JO-4 auf die HSV-1-Hemmung mit etwa 3,125 μM ermittelt.
  • 16B zeigt die antivirale Wirkung von JO-4 auf die HSV-2-Replikation. Zwei Tage nach der Inkulturnahme mit verschiedenen Konzentationen von JO-4 wurde die HSV-2-Replikation in Nierenzellen von Afrikanischen grünen Affen um 65% mit 12,5 μM und um 58% mit 3,125 μM gehemmt. Die IC50-Dosis für JO-4 auf die HSV-1-Hemmung wurde mit < 3,125 μM ermittelt.
  • BEISPIEL 3
  • TOXIZITÄTSUNTERSUCHUNG VON JO-4 UND JO-4A AUF KULTIVIERTE ZELLEN
  • 17A und 17B zeigen die Ergebnisse der Toxizitätstests von JO-4 und JO-4A auf normale Nierenzellen von nicht infizierten Afrikanischen grünen Affen (CV-1). Wenn CV-1-Zellen entweder in Gegenwart oder bei Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von JO-4 und JO-4A für 72 Stunden in Kultur genommen wurden, wurde eine Zytotoxizität größer als 50% lediglich bei höheren Konzentrationen der Verbindungen erhalten (> 50 μM für JO-4 und etwa 25 μM für JO-4A). Damit war die inhibitorische Wirkung von JO-4 und JO-4A auf die HSV-1- und HSV-2-Replikation keine Folge der Zytotoxizität der entsprechenden Arzneimittel auf CV-1-Zellen.

Claims (9)

  1. Pharmazeutische Zusammensetzung, aufweisend einen pharmazeutischen Träger oder Streckmittel und eine Verbindung der Formel:
    Figure 00390001
    worin R H ist, COR1; PO3 2–; ein Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, substituiert oder unsubstituiert, geradkettig oder verzweigt, Null bis 6 Doppelbindungen; (CH2)n-Morpholin, worin n 1 bis 4 beträgt; Morpholinomethylphenyl; Orthoaminophenyl; Orthohydroxyphenyl; (CH2)nCOOR2, worin n 1 bis 4 beträgt; – worin R2 H ist; ein Alkalimetallsalz; ein Erdalkalimetallsalz; NH4 +; N+(R3)4; – worin R3 unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H und Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; – worin R1 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H; (CH2)nCH3, worin n Null bis 6 beträgt; (CH2)nCOOR2, worin n 1 bis 4 beträgt und R2 wie vorstehend festgelegt ist; (CH2)nN+(R3)4, worin n 1 bis 4 beträgt und (CH2)nSO3 –, worin n 1 bis 4 beträgt; sowie pharmazeutisch zulässige Salze davon.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin R H ist.
  3. Verwendung der Verbindung mit der Formel (IV) nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Immunsuppressivums.
  4. Verwendung der Verbindung mit der Formel (IV) nach Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung des Wachstums von Krebszellen.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, worin die Krebszellen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Krebszellen von Zervixkarzinom, metastatischem Melanom, hypernephroidem Karzinom, embryonalem Hodenkarzinom, Dickdarmkarzinom.
  6. Verwendung der Verbindung mit der Formel (IV) nach Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung des Wachstums von Lentiviren oder Herpetoviridae-Viren.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, worin das Lentivirus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus HIV-1, NIV-2 und HTLV.
  8. Verwendung nach Anspruch 6, worin das Herpetoviridae-Virus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Herpes-Simplex-Virus, Epstein-Barr Virus, Cytomegalovirus und Varicella-Zoster-Virus.
  9. Verbindung mit der Formel (IV) nach Anspruch 1, worin R1 (CH2)nCH3 ist und n 1 bis 6 beträgt.
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