CN1252719A - 用于免疫抑制、抗癌和抗病毒治疗的药物组合物 - Google Patents

用于免疫抑制、抗癌和抗病毒治疗的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及含有右式化合物的药物组合物:其中:R是(i)H,PO- 3,含有1－12个碳原子及0－6个双键的直链或支链的取代或未取代烷基,(CH2)n吗啉其中n=1－4,吗啉代甲基苯基,邻氨基苯基,邻羟基苯基,(CH2)nCOOR2其中n=1－4其中R2为H、碱金属盐离子、碱土金属盐离子、NH4 +、N+(R3)4,其中R3独立地选自由H和1－4个碳原子的烷基组成的基团,或(ii)COR1,其中R1选自H,(CH2)nCH3其中n=0－6,(CH2)nCOOR2,其中n=1－4并且R2如上述定义,(CH2)nN+(R3)4其中n=1－4,和(CH2)nSO- 3其中n=1－4。

Description

用于免疫抑制、抗癌和抗病毒治疗的药物组合物
发明背景
1.发明领域
本发明涉及用作免疫抑制剂的化合物及其在移植疗法中的应用。本发明具体涉及了双萜类化合物，特别是枪刀药素氧化物(hypoestoxide)类化合物，其衍生物及其激动剂在免疫抑制、炎症、移植排斥、移植物抗宿主疾病(GVHD)、皮肤病以及T细胞介导型自身免疫病治疗中的应用，所述T细胞介导型自身免疫病例如是关节炎、全身性红斑狼疮、甲状腺炎、多发性硬化、肾小球性肾炎、糖尿病和变应性变态反应。本发明进一步涉及了所述化合物用于抑制癌细胞生长，以及抑制慢病毒属或疱疹病毒属(Herpetoviridae)病毒生长的用途。此外，本发明涉及了所述化合物抑制癌细胞生长的用途。
2.背景技术
免疫抑制剂。许多人体疾病的特征在于过度或不适当的免疫反应。在移植中，免疫系统攻击主要组织相容性复合体(MHC)—全异的供体组织，从而导致移植排斥。在变应性变态反应或炎症中，免疫系统对其它无害的环境抗原过度敏感。在自身免疫病中，免疫系统攻击正常的自体组织。在免疫缺陷性疾病如HIV感染和AIDS中，感染物侵蚀了宿主的免疫系统。迄今人们认为免疫抑制疗法适合治疗上述各种疾病(血液学评论(Blood reviews)1995；9：117-133)。将环孢菌素A(CsA)的天然二级代谢产物、FK506和雷怕霉素开发成免疫抑制剂，并且通过发挥其在防止移植排斥(TIBS 1993；18：334-338)和GVHD(Ann Hematol 1995；71：301-306)中的作用使器官移植发生了革命性的巨变。然而，这些药物在使用中存在严重的副作用，例如肾毒性、神经毒性、肝细胞毒性、内分泌并发症以及影响骨骼(新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med)(1989)321：1725-1738；Kahan BD等人；外科学(1985)97：125)。因此，需要为临床提供一类可有效免疫抑制但无上述副作用的新化合物。
抗癌药。数十年肿瘤生物学研究的最大动力在于，期望能够发现在细胞毒性水平有效对抗肿瘤细胞的治疗性药物，用于预防和治疗癌症。
恶性黑瘤的发病率正持续上升。通常，恶性黑瘤在美国是第5位发病率最高的癌症。尽管早期黑瘤通过手术方式极易治愈，但是由于伴随有较深的损害和/或迁移性疾病，患者的预后仍然不佳(Bezwoda，WR；癌症治疗评论(Cancer Treat Rev.)1997；23(1)：17-34)。使用单一药物作用的常规化疗法具有较低的频率和较短的反应有效期(癌症治疗评论1997，23(1)：17-34；Mayo Clin Proc 1997；72：367-371)。
迁移性肾细胞癌(RCC)可以高度耐受多种全身性疗法，这已得到广泛证实(Motzer RJ等人，癌症中的常见问题，1997；21(4)：185-232)。RCC在男子中的发生率约是女子的两倍。由于不断采用改进和高度复杂的诊断方法，如超声波检查法和计算机化断层造影(CT)扫描术(Franklin JR等人，泌尿科肿瘤学讨论会1996；14(2)：208-215)，人们已能够揭示出RCC的发生率正稳定上升。子宫颈癌是发展中国家妇女最常见的恶性肿瘤(Morrow CP等人，细胞生物化学杂志1995；增刊23：67-70)，在美国它也是第3位最常见的女性生殖道恶性肿瘤。(MillerBA等人，国家癌症协会；NIH出版93-2789，1993)。
所用的后继的技术改进，包括高剂量疗法、处治规划、新的同位素、新的影像技术以及新的医疗器械在临床上均没有对子宫颈癌产生可测的治愈效果(Morrow CP等人，细胞生物化学杂志1995：增刊23：61-70)。
由于神经毒性和对化疗药物的耐药性仍存在一些主要的导致人体癌症治疗失败的临床问题(抗癌药物1995，6(3)：369-383；Curr.Opin.Oncol.1997，9(1)：79-87)，所从需要研制出新的副作用较少并且疗效高的药物。
抗病毒药物。病毒和宿主免疫系统之间的相互作用不仅复杂且引人关注，而且对于对感染结果作出判断和制订预防措施亦是关键的。抗病毒化疗的目标是在不影响细胞DNA的情况下抑制病毒染色体组的复制。
在许多正在为治疗疱疹病毒[单纯疱疹病毒1型和2型(HSV-1和HSV-2)，水痘带状疱疹病毒(VZV)，巨细胞病毒(CMV)，非洲淋巴细胞瘤病毒(EBV)]感染而开发的药物中，只有10种药物明显能够到达临床开发的阶段(Alrabiah FA & Sacks，SL；药物1996；52(1)：17-32)。尽管在治疗单纯疱疹脑炎(HSV-1)时可选择无环尿苷，但死亡率和发病率仍然成问题(Skoeldenberg B；Scand.J.Infect.Dis.Suppl 100：8-13，1996)。同样的问题也存在于α干扰素(IFN-α)和β干扰素(IFN-β)。尽管干扰素类药物具有显著的抗病毒和免疫调节作用，并成为用于人体的抗病毒药物，但它们的成功都受到剂量限制副作用的阻碍(Balkwill，FR，干扰素；柳叶刀1989；1：1060-1063)。HSV-2在发达国家中是最常见的生殖器溃疡的感染原因。通常，在美国5个青年中就有1名感染有生殖器疱疹。在八十年代早期一些抗病毒药物变得有效，它们可以减轻疾病的严重程度，但HSV感染是终生的，一旦被感染，没有方法将其消除(Brugha，R.等人，Int.J.Epidemiol 1997；26：298-709)。因此，极其需要开发出一种新的途径和药物来消灭HSV感染。
在美国，被1型人免疫缺损病毒(HIV-1)感染的个体的数量据估计为1-2百万，世界上的发生率约为20百万。到2000年时，估计会有3百万以上的美国人将感染上HIV-1。
迄今为止，对HIV-1感染的治疗一直停留在使用病毒逆转录酶的核苷抑制剂(RTI)上。尽管这些药物起初时是有效的，但它们只具有一定程度的抗病毒活性，并且其治疗效果受到耐药性的出现以及剂量限制性毒性作用的制约(McDonald CK等人，Arch Intern Med1997；157(9)：951-959)。虽然用核苷类似物RTI和蛋白酶抑制剂治疗HIV构成了抗HIV疗法的支柱，但未来将在现存种类的药物中推出非核苷类RTI、免疫调节剂以及新药(Hartman AF，Prim Care 1997；24(3)：531-560)。虽然采用两种、三种或多种药物的联合疗法已成为关注的标准，但其附加毒性成为主要问题。
                     本发明的公开
免疫抑制。本申请人的本发明是基于发现并选择了一组具有意外免疫抑制效果的枪刀药素氧化物类似物。
因此，本发明一方面涉及了下式化合物或其可药用盐：
Figure A9880423500071
其中：
R是
(i)H、PO3 -、含有1-12个碳原子及0-6个双键的直链或支链的取代或未取代烷基、(CH2)n吗啉其中n＝1-4、吗啉代甲基苯基、邻氨基苯基、邻羟基苯基、(CH2)nCOOR2其中n＝1-4，
其中R2为H、碱金属盐离子、碱土金属盐离子、NH4 +、
N+(R3)4，其中R3独立地选自由H和具有1-4个碳原子的
烷基组成的组；或
(ii)COR1，其中R1选自H、(CH2)nCH3其中n＝1-6、(CH2)nCOOR2其中n＝1-4并且R2如上述定义、(CH2)nN+(R3)4其中n＝1-4和(CH2)nSO3 -其中n＝1-4。
本发明涉及含有在治疗上有效免疫抑制量的式IV化合物的药物组合物。
本发明涉及用于在需免疫治疗的动物中引起免疫抑制的方法，该方法包括给所述动物施用药物组合物，所述药物组合物中含有在治疗上有效免疫抑制量的枪刀药素氧化物(在此称为JO-4并如式I所示)或一种或多种式IV所示的化合物。
抗癌药物。本申请人的发明基于发现并选择了一组具有意外抗癌效果的枪刀药素氧化物类似物。具体而言，本发明涉及了一种抑制癌细胞或癌性肿瘤生长的方法，该方法包括给需抗癌或抗肿瘤治疗的对象施用一种药物组合物，该药物组合物含有治疗有效量的式IV化合物或其可药用盐：
Figure A9880423500091
其中：
R是
(i)H、PO3 -、含有1-12个碳原子及0-6个双键的直链或支链的取代或未取代烷基、(CH2)n吗啉其中n＝1-4、吗啉代甲基苯基、邻氨基苯基、邻羟基苯基、(CH2)nCOOR2其中n＝1-4，
其中R2为H、碱金属盐离子、碱土金属盐离子、NH4 +、
N+(R3)4，其中R3独立地选自由H和具有1-4个碳原子的
烷基组成的组；或
(ii)COR1，其中R1选自H、(CH2)nCH3其中n＝0-6、(CH2)nCOOR2其中n＝1-4并且R2如上述定义、(CH2)nN+(R3)4其中n＝1-4和(CH2)nSO3 -其中n＝1-4。
本发明的一个方面涉及了具有式II的枪刀药素氧化物(在此称为JO-4A)的给药方法：
Figure A9880423500101
抗病毒药。本申请人的发明基于发现并选择了一组具有意料外的有效抑制慢病毒属或疱疹病毒属病毒生长的枪刀药素氧化物，其中分别包括HIV-1及HSV-1和HSV-2。具体而言，本发明涉及一种抑制病毒在给药对象中生长的方法。该方法包括给需抗病毒治疗的对象施用一种药物组合物，该药物组合物中含有治疗有效量的式IV化合物或其可药用盐：
Figure A9880423500102
其中：
R是
(i)H、PO3 -、含有1-12个碳原子及0-6个双键的直链或支链的取代或未取代烷基、(CH2)n吗啉其中n＝1-4、吗啉代甲基苯基、邻氨基苯基、邻羟基苯基、(CH2)nCOOR2其中n＝1-4，
其中R2为H、碱金属盐离子、碱土金属盐离子、NH4 +、
N+(R3)4，其中R3独立地选自由H和具有1-4个碳原子的
烷基组成的组：或
(ii)COR1，其中R1选自H、(CH2)nCH3其中n＝0-6、(CH2)nCOOR2其中n＝1-4并且R2如上述定义、(CH2)nN+(R3)4其中n＝1-4和(CH2)nSO3 -其中n＝1-4。
另一方面，本发明提供一种治疗方法，用于缓解慢病毒属病毒(例如HIV-1)和疱疹病毒属(HSV-1和HSV-2)病毒在患者中生长时的病理作用。该方法包括给所述对象施用至少一种如式IV所示的枪刀药素氧化物。所述枪刀药素氧化物是以足以抑制这些病毒生长的量对患者给药，从而抑制所述的病理作用。
上面探讨的本发明的特征和本发明的可变形式以及由此产生的优越性将可以通过下文并结合有附图的详细描述而更易被理解。
附图描述
图1表示：JO-4对人体双向混合淋巴细胞反应的抑制作用。将从两个个体获得的PBMC在不同浓度JO-4存在的条件下共同培养5天。用3H-胸腺嘧啶核甙掺入法测定增殖作用，并且表示为CPM和相对于无JO-4的对照孔的抑制百分率。
图2表示：JO-4对由单向MLR产生的人T淋巴细胞介导型细胞溶解的抑制作用。在JO-4存在或不存在的条件下，从单向MLR生产5-7天的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在培养结束时，收获CTL并在4个小时的51C释放分析试验中测定对活化淋巴细胞的对抗作用，所述活化淋巴细胞在单向MLR中用作刺激剂。将结果表示为裂解单位(LU)和％抑制。
图3表示：JO-4对前-炎症细胞因子合成的抑制作用。在24孔的微量滴定板中，在1.0μg/ml JO-4存在或不存在的条件下，用5μg/ml LPS将人PBMC培养24小时。培养结束时，收集上清液并在IL-β、TNF-α和IL-6存在的条件下利用EIA测定。结果表示为相对于无药物对照孔的抑制百分率和上清液中存在的细胞因子的量pg/ml。
图4表示：JO-4A对人体双向混合淋巴细胞反应的抑制作用。将从两个个体获得的PBMC在不同浓度JO-4A存在的条件下共同培养5天。用3H-胸腺嘧啶核甙掺入法测定增殖作用并且将结果表示为平均CPM。
图5表示：JO-4对LPS诱发的鼠淋巴细胞增殖的体外抑制作用。在不存在或存在不同浓度JO-4的条件下与LPS(5μ/ml)一起培养小鼠脾细胞达48小时。利用3H胸腺嘧啶核甙掺入法来测定增殖作用并表示为ACPM。
图6表示：JO-4对PHA诱发的人外周血单核细胞(PBMC)增殖的体外抑制作用。在不存在或存在不同浓度JO-4的条件下与PHA(植物凝集素)(15μg/ml)一起将人PBMC培养4天。利用3H胸腺嘧啶核甙掺入法来测定增殖作用，并且表示为ACPM和对于空白对照孔(无药物)的抑制百分率。
图7表示：JO-4对人PBMC的毒性。在不存在或存在不同浓度JO-4的条件下将人PBMC培养4天。在不同的时间间隔，利用台盼蓝不相容试验来测定存活力，并且表示为相对于计数细胞总数的存活百分率。
图8表示：JO-4A对NK细胞(天然杀伤细胞)活性的体内作用。用不同浓度的JO-4A通过静脉内(A)或口服(B)的给药方式来处理小鼠。用YAC(酵母人工染色体)-1靶物在4小时的51Cr释放试验中测定脾细胞的NK机能。
图9表示：JO-4A对不同人体癌细胞的剂量依赖性细胞毒性。在不含有或含有不同浓度JO-4A的条件下将人子宫颈上皮癌、肾癌和恶性黑素瘤的细胞系培养72小时。用比色(MTT)分析法测定细胞毒性。
图10表示：JO-4A对来源于人体不同组织的正常细胞的剂量依赖型细胞毒性。在不含有或含有不同浓度JO-4A的条件下将正常人子宫颈外上皮细胞、外周血单核细胞、乳腺上皮细胞和脐静脉内皮细胞培养72小时。用比色(MTT)分析法测定细胞毒性。
图11表示：JO-4A对小鼠恶性黑素瘤(B16-F1)细胞系的剂量依赖性细胞毒性。在不含有或含有不同浓度JO-4A的条件下将B16-F1细胞培养72小时。用比色(MTT)分析法测定细胞毒性。
图12A表示：口服给药JO-4A对C57BL/6(B6)小鼠中的小鼠恶性黑素瘤(B16-F1)体积的影响。B6小鼠经皮下(s.c.)接受50000个活的B16-F1细胞。在肿瘤植入后第4天，试验组的小鼠开始每天口服不同浓度的JO-4A。用微卡尺在第12天时测定肿瘤体积。
图12B表示：口服JO-4A对患有恶性黑素瘤(B16-F1)的B6小鼠存活率的影响。B6小鼠经皮下(s.c.)接受50000个活的B16-F1细胞。在肿瘤植入后第4-20天中，试验组的小鼠开始每天口服不同浓度的JO-4A。当未处理对照组的小鼠全部死亡时(第28天)计算出试验组小鼠的存活百分比。
图13表示：口服JO-4A对患B16-F1黑素瘤的B6小鼠存活率的影响。B6小鼠经皮下(s.c.)接受50000个活的B16-F1细胞。试验组小鼠在第4至20天中每天口服JO-4A(2mg/Kg)。
图14表示：JO-4A与IFN-α的结合对于人恶性黑素瘤生长的体外作用。
图15A表示：JO-4A对经培养的人外周血单核细胞(PBMC)中的HIV-1复制的抑制作用。用PHA活化人PBMC并用从患者中分离出的HIV-1感染。在不含有或含有不同浓度(0.0001μM-0.5μM)JO-4A的条件下将被感染的PBMC培养7天。培养结束时，收集上清液并通过ELISA对存在的p24抗原进行测定。
图15B表示：JO-4A对经培养的正常人PBMC的毒性试验，用PHA将所述人PBMC活化3天。在不存在或存在不同浓度JO-4A(0.0001μM-0.5μM)的条件下，将活化的PBMC用3％IL-2培养7天。培养结束时，利用台盼蓝不相容试验来测定PBMC的存活力。
图16A表示：JO-4对单纯疱疹-1(HSV-1)复制的抗病毒作用。利用Hybriwix探针系统测定JO-4对HSV-1的抗病毒作用，Hybriwix探针系统是得自Diagnostic Hybrids，Inc.(Athens，OH)的HSV抗病毒易感性试验试剂盒。
图16B表示：JO-4对HSV-2复制的抗病毒作用。JO-4对HSV-2的抗病毒作用如在以上关于图16A描述的方式下进行测定。
图16C表示：JO-4A对HSV-2复制的抗病毒作用。JO-4A对HSV-2的抗病毒作用如在以上关于图16A描述的方式进行测定。
图17A和17B表示：JO-4和JO-4A分别对正常、未感染非洲绿猴肾细胞(CV-1)的毒性试验结果。在不存在或存在不同浓度药物时将CV-1细胞培养72小时。通过比色(MTT)分析法测定细胞毒性。
本发明的实施方式概述和定义
本发明的实践中采用了所属领域专业人员所熟知的分子和细胞免疫学、细胞生物学、生物化学、有机及药化合成技术。这些技术将在本文中作全面解释。参见例如Abbas，A.K.等人1994年编辑的第二版《细胞和分子免疫》，W.B.Saunders Co.USA；Harlow，E. & D.Lane.《抗体学，试验手册》，Cold冷泉港实验室(Spring Harbor Laboratory)，1988；Auchincol.Jr.，H. & Sachs，D.H.移植术和移植排异：基础免疫学，Paul，W.E.编辑，1993，Raven出版社出版；Silverman，Richard B.，《药物设计的有机化学和药物作用》Academic出版公司，NY(1992)；Smith，Michael B.，《有机合成》，McGraw Hill，Inc.，NY，(1994)。也可参见癌症的化疗：原理和实践，B.A.Chabner编辑，J.M.Collins，Phil，LippincottPubl.，1990；干扰素的作用机理，第II卷，L.M.Pfeffer编辑，CRC出版社出版，Boca Raton，FL 1987；干扰素：原理和医学用途，S.Baron，D.Coppenhauer，F.Dianzani等人编辑，德克萨斯大学医学分院，Galveston，1992；Robins，R.K.，Ojo-Amaize，E.A.，Cortam，H.B.等人，基因表达的核苷与核苷酸调控：一种新的化疗途径，刊于：酶调节进展，1989，第29卷；癌症：原理和肿瘤学；Vota.Jr.，V.T.，Hellman，S.，& Rosenberg，S.A.，编辑，Lippincott Co.Philadelphia，(1993)；化疗原始资料，Perry.M.C.编辑，Williams & Wilkins Publ，Baltimore，1991；Silverman，RichardB.，《药物设计和药物作用的有机化学》，Academic Press，Inc.NY(1992)；Smith，Michael B.，《有机合成》，McGraw Hill，Inc.，NY(1994))。此外参见Bauer，D.J.，病毒疾病的特异治疗，University ParkPress，Baltimore，MD，1977；Gawler，H.，用于测定抗病毒化合物对人巨细胞病毒DNA复制影响作用的核酸杂交，抗微生物药化疗，1983，24：370-374；Collier，L.H. & Oxford，J.编辑的抗病毒治疗的进展，Academic Press，伦敦，1980；Coligan，J.E.等人编辑的免疫学中的常见治疗方案，1993；Robert B.Belshe编辑的人体病毒学手册，第2版，1991；Silverman，Richard B.，《药物设计的有机化学和药物作用》，AcademicPress，Inc.NY(1992)；Smith，Michael B.，《有机合成》，McGraw Hill，Inc.，NY(1994))。
免疫抑制。本发明说明书中所用的下列术语如下文所定义。
对于本发明的目的，术语“免疫抑制治疗”是指一种预防和控制疾病和综合征的途径，它需要治疗性地抑制淋巴细胞和免疫细胞。所述疾病和综合征包括(但不限于)：移植物抗宿主病(GVHD)，自身免疫病，如糖尿病、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、甲状腺炎、多发性硬化、肾小球性肾炎和变应性变态反应。应懂得，通常所用的免疫抑制方法包括给需此治疗的动物施用治疗有效量的免疫抑制剂(例如环孢菌素A、FK506)，或在此例举和要求保护的组合物和方法，从而抑制T细胞活性或T细胞反应。
术语“淋巴细胞和免疫细胞”是指介导特异性免疫反应的细胞。此处用该术语表示T淋巴细胞，详细可参见Abbas等人的描述。
“天然杀伤细胞”或“NK细胞”是一般为粒状形态的非T、非B淋巴细胞。NK细胞在对病毒和其他胞内病原体以及抗体依赖型细胞介导的细胞毒性(ADCC)的先天免疫中很重要。NK细胞在很大程度上是移植物抗宿主疾病(GVHD)的原因(Ferrara，J.L.M.，等人(1989)移植47：50-54；Ghayur，T等人(1987)移植44：261-267；Ghayur，T.，等人(1988)移植45：586-590。正如下列实施例所证实的，我们发现本发明的化合物和方法抑制了NK细胞的体内活性，还发现其适用于防止或克服需此治疗的动物中的GVHD。
术语“移植”通常是指将从一个个体中取出的细胞、组织或器官(称作移植物)放置在不同的、遗传相异的受体中。提供移植物的个体称作供体，接受移植物的个体称作受体或宿主。移植可引起特异性免疫反应，这种免疫反应被称作排异作用，它会损坏移植物。移植的组织包括固体器官，如肝脏、心脏和肾脏；和其他组织，如皮肤和骨髓。体内的排异作用是由T细胞介导的。通过给受体(宿主)施用治疗有效量的化合物如环孢菌素A或FK506以及此处所例举的组合物，可以免疫抑制受体(宿主)，从而防止或治疗的排异作用。绝大多数免疫抑制针对的是T细胞反应，这些免疫抑制采用的是特异性免疫抑制剂，但与本发明组合物不是不相似。此外，对供体中的NK细胞机能进行免疫抑制可在疾病如移植物抗宿主(GVHD)的治疗中发挥重要的治疗作用。因此，需要对移植供体进行预备性免疫抑制，这可在供体捐献移植物前通过给其施用治疗有效量的免疫抑制剂，从而防止受体体内的移植物抗宿主。
术语“动物”是指：人体以及其他动物。
在此所用的术语“JO-4”是指双环[9，3，1]十五烷双萜类化合物，如在Z.Naturforsc 37c：558-561(1982)中和在《杂环》20：2125-2128(1983)中所述，在这些文献中将这种化合物命名为“枪刀药素氧化物”，JO-4的化学结构如式I所示。
应懂得，式IV所示的化合物属于JO-4A的前药。就式IV而言，JO-4A衍生自R为H时的JO-4。JO-4A的结构如式II所示：
Figure A9880423500171
此处所用的术语“前药”是指不具有药理学作用的化合物，它可通过代谢转化作用转变成一种活性药物。(Silverman，Richard B.，药物设计的有机化学，Academic Press，Inc.NY(1992))。在药物设计中有许多理由使用前药策略，其中最常见的理由是克服与化合物有关的问题，如溶解度、吸收作用和分布、位点特异性、不稳定性、缓释、毒性、利用度较差以及与制剂有关的问题。可获得指导无需进行大量实验就能判断药物组合物中的化合物如何到达靶位以发挥其作用，并且如何在作用位点获得免疫抑制所需的治疗有效量的文献(Harnden，M.R.等人，医学和化学杂志32：1738-1743(1989)；Lake-Bakaar，D.M.，等人，抗微生物药和化疗33：110-112(1989)；Baker，D.C.等人，医学化学21：1218-1221(1978)；Hussain，M.A.等人，药物科学杂志，76：356-358(1987)；Varia，S.A.等人，药物科学杂志73：1068-1073(1984))。
多数含有羟基或羧酸官能团的常见药物的前药形式是酯。利用所属领域专业人员的知识，可以通过改变化合物的结构来改进其药物动力学性质，从而将其转化成适于动物或人体治疗性给药的有效药物。因此，所要求保护的前药JO-4A的医药活性(即引起免疫抑制)的原理也就是JO-4本身作为天然产物是一种有效的免疫抑制剂，在存在血清酯酶的体内环境中JO-4也是JO-4A的前药，而且，在体外环境中若培养基含有附加血清(这是最常见的情况)则JO-4同样是JO-4A的前药。免疫抑制剂的优选实施方案是代谢产物JO-4A，它是游离的JO-4的醇类衍生物。JO-4充当一种适合传递JO-4A的酯类前药形式，在将JO-4对细胞或动物给药后，JO-4A在一定时间后生成。以同样的方式，许多JO-4A的酯类前药也可以用于传递JO-4A。所述前药形式及其制备方法是所属领域熟知的，如上所引用的文献。已知这些前药在与动物和人体血清中常见的酯酶接触时生成母体药物。应懂得，在此要求保护的JO-4A的前药生成了JO-4A，并且就诱发免疫抑制作用来说，其具有等于或强于天然产物JO-4的活性。
在此所用的术语“激动剂”是指能够引起与式IV所示化合物相同反应的物质(即在需此治疗的动物中诱发免疫抑制)。式IV化合物的激动剂包括但不限于JO-4A的前药，所述前药如式IV所示。
所要求保护的化合物的改性形式，即前药和/或所要求保护的化合物的激动剂，在动物中具有引起免疫抑制的能力，或抑制动物体内癌症生长的能力，或抑制需此治疗的动物中的慢病毒属和疱疹病毒属病毒生长的能力，用于判断或筛选上述能力的方法是已知的。
本发明所述的方法涉及采用式IV化合物以及式I化合物(JO-4，即枪刀药素氧化物)的免疫抑制疗法。本发明的方法具体涉及了给需此治疗的动物施用治疗有效量的式I或IV化合物。所述方法的实施方案涉及将式I或IV化合物与药物载体或稀释剂施用于动物的给药。
本发明所述方法寻找到了在抑制动物移植物排异中的用途，通过如下所述的单向和双向混合淋巴细胞反应(MLR)试验说明了JO-4或JO-4A对细胞免疫作用的影响。因此，本发明所述方法可有效抑制免疫细胞或淋巴细胞的形成或增殖，由此适于治疗自身免疫疾病，抑制对移植物的排异作用，所述移植物例如是器官移植物，如皮肤、骨髓、肾脏、肝脏和心脏移植物。JO-4或JO-4A的作用在下列试验中得到确定。
如图1-8所示，本发明的化合物及方法发现了在治疗动物自身免疫病中的用途。应懂得，T细胞的免疫抑制剂如环孢菌素A(Forsell，T等人，J.Urol，1996，5：1591-3；Yocum，D-E.等人，Rheum.Dis.Clin.North.Am.，1995，3：835-44)或tacrolimus(Ketel，B.L.，等人，Transplant.Proc.，1996，2：899)抑制了免疫反应，并且由此抑制或缓解自身免疫性疾病。已知T细胞及其产物(细胞因子)参与体内自身免疫反应的产生。
显然，对于上述的用途，所述治疗有效量或剂量是不同的，这取决于所用的化合物、给药方式和预期的治疗。但是，以约1mg-约600mg/kg动物体重的日剂量口服给药时将得到满意的结果，所述口服给药的日剂量一般是每天分1-4次或以缓释形式给药。若通过注射给药，以约1mg-约200mg/kg动物体重的日剂量给药时将得到满意的结果，所述注射给药的日剂量一般是每天分1-4次或以缓释形式给药。对于较大型的哺乳动物，全天剂量可以在约5mg-约500mg的范围内，适于口服给药的剂型含有约5mg-约500mg的所述化合物以及与之相混合或结合的固体或液体药物载体或稀释剂。用于测定本发明化合物的治疗有效量的方法是所属领域技术人员已知的。这些方法包括分析药物在免疫抑制疗法中用于引起免疫抑制、抑制淋巴细胞和免疫细胞的形成、对自身免疫疾病的治疗以及抑制动物移植物排异或其它适应症的药学/药物动力学参数(移植医学的最新发展，第一卷：新的免疫抑制药：D.Przepiorka & H.Sollinger编辑，Physicians & Scientists Pub.Co.，Glenview，IL，1994)。
本发明所述方法包括施用药物组合物，所述药物组合物含有有效量的式I、II或IV的化合物，所述化合物可以是纯净形式，或是与可药用载体或稀释剂组合的可药用的粗品浓缩物。所述组合物通常含有1％(重量)以上的式I、II或IV化合物，并且可以通过常规技术制备成常规剂型，例如胶囊、片剂、栓剂、可分散粉末、糖浆剂、酏剂、混悬剂或用于肠道或肠胃外给药的溶液。适用的药用稀释剂或载体包括，例如水，醇，天然或硬化油或蜡，碳酸钙和碳酸钠，磷酸钙，高岭土，滑石和乳糖以及适当的防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯，悬浮剂如甲基纤维素，黄芪胶和藻酸钠，湿润剂如卵磷脂，聚氧化亚乙基硬脂酸酯和聚氧化亚乙基脱水山梨糖醇单油酸酯，造粒和崩解剂如淀粉和藻酸，粘合剂如淀粉、明胶和阿拉伯胶，以及润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石，从而提供美观和可口的药物制剂。可以利用常规技术对片剂形式的组合物进行包衣，以延缓片剂的崩解和活性组分在胃肠道内的吸收，由此提供长时间的缓释作用。其它所属领域专业人员已知的用于延缓崩解或将活性组分延时或定时给药的化合物和方法也适合配制本发明方法所用的活性成分。例如，式I、II或IV的化合物可以与脂质体或其它缓释载体物质结合，以保护化合物不发生降解直至它们到达其靶位，和/或使所述化合物易于透过组织屏障进行运动。
从易于给药的角度考虑，优选的组合物是固体组合物，特别是填充有固体的明胶胶囊或片剂。
还应懂得，本发明所述方法的另一个实施方案包括将一种或多种药物以不同的给药方案(包括预防方案)合用，同时本发明所述的方法是将含有式I、II或IV的化合物的药物组合物施用给需免疫抑制治疗的动物。联合用药方案和测定其功效的方法(包括治疗药物的监测)均是已知的(Lazarus，H.M.等人，血液评论，1995，9：117-133；Aggarwal，B.B.等人编辑，1995，人细胞因子：其在疾病和治疗中的作用，BlackwellScience，Inc.，Cambridge，MA；Ambrus，J.L.等人，1993，外科学、妇科学和产科学，176：588)。适用于免疫抑制疗法并且可以与本发明所述方法中所用的式I、II或IV化合物联合给药的免疫抑制剂或药物的例子包括(但不限于)皮质类固醇、氨甲蝶呤、环孢菌素、雷怕霉素、FK506(PrografTM)、抗胸腺细胞球蛋白、单克隆抗体制剂、多克隆抗体制剂、白介素-1拮抗剂、白介素-2拮抗剂、TNF拮抗剂、免疫毒素、沙利度胺、干扰素、一氧化氮、咪唑立宾、去氧精胍菌素、来氟米物和抗粘附分子。
应进一步懂得，本发明涉及一种含有治疗有效量的一种或多种式I、II或IV化合物以及一种或多种适用于免疫抑制疗法的免疫抑制剂或药物的药物组合物，所述免疫抑制剂或药物选自皮质类固醇、氨甲蝶呤、环孢菌素、雷怕霉素、FK506(PrografTM)、抗胸腺细胞球蛋白、单克隆抗体制剂、多克隆抗体制剂、白介素-1拮抗剂、白介素-2拮抗剂、TNF拮抗剂、免疫毒素、沙利度胺、干扰素、一氧化氮、咪唑立宾、去氧精胍菌素、来氟米物和抗粘附分子。用于确定本发明药物组合物中的式I、II或IV化合物的治疗有效量的方法，以及如何选择与本发明式I、II或IV化合物合用的适于免疫抑制疗法的免疫抑制剂或药物的治疗有效量的方法均是已知的。(Lazarus，H.M.等人，血液评论，1995，9：117-133；Aggarwal，B.B.等人编辑，1995，人细胞因子：其在疾病和治疗中的作用，Blackwell Science，Inc.，Cambridge，MA；Ambrus，J.L.等人，1993，外科学、妇科学和产科学，176：588)。
抗癌。本发明说明书中的下列术语如下文所定义。
尽管“肿瘤”简单地含义是“肿大”，该术语通常等于“赘生物”，其字面含义是“新生物”。赘生物是一种异常的组织块，其在致癌物去除后持续增殖，其表观开始变化。赘生物或肿瘤存在两种类型，良性和恶性。所有恶性肿瘤通常被称作“癌”。近乎所有良性肿瘤均是包在荚膜内的。与此相反，癌性肿瘤几乎不可能包在荚膜内，而且通过浸润破坏性生长侵入到邻近组织。在不连续位点植入肿瘤细胞可随后发生侵入性生长，同时原发肿瘤经常可以通过淋巴和/或血源性途径使癌细胞扩散。这种过程称作“迁移”，肿瘤并不等同于恶性，因为尽管许多癌症可以迁移，但良性肿瘤绝不会迁移(刊于：疾病的病理学基础，第4版，Philadelphia：WB Saunders，1989；239-305)。应懂得，本发明所述的抑制癌细胞或癌性肿瘤生长的方法包括，抑制癌细胞的侵入性生长，同时抑制由迁移癌细胞产生的迁移性肿瘤生长。
术语“对象”是指人体或其它动物。
在此所有的术语“JO-4”是指双环[9，3，1]十五烷双萜类化合物，如在Z.Naturforsc 37c：558-561(1982)中和在《杂环》20：2125-2128(1983)中所述，在这些文献中将这种化合物命名为“枪刀药素氧化物”，JO-4的化学结构如式I所示：
Figure A9880423500221
应懂得，式IV所示的化合物属于JO-4A的前药。就式IV而言，JO-4A衍生自R为H时的JO-4。JO-4A的结构如式II所示：
Figure A9880423500231
此处所用的术语“前药”是指不具有药理学作用的化合物，它可通过代谢转化作用转变成一种活性药物。(Silverman，Richard B.，药物设计的有机化学，Acad.Press，Inc.1992)。在药物设计中有许多理由使用前药策略，其中最常见的理由是克服与化合物有关的问题，如溶解度、吸收作用和分布、位点特异性、不稳定性、缓释、毒性、利用度较差以及与制剂有关的问题。指导如何判断药物组合物中的化合物到达靶位发挥其作用，如何在作用位点获得抑制癌性肿瘤生长的治疗有效量的文献是可得到的，无需进行大量的实验(Brunda，M.J.Wright，R.B.Luistro，L.等人，采用白介素-1α和干扰素-α的联合疗法提高对小鼠的抗肿瘤功效，免疫学杂志，(1994)15：233-241；Bezwoda，W.R.，对干扰素类作用具有特定参比意义的散播性黑素瘤治疗，Vinca Alkaloids &Tamoxifen，癌症治疗评论，(1997)23：17-34；Wedge，S.R.，Porteous，J.K.，Newlands，E.S.，单剂量和多剂量O6-苄基鸟嘌呤/temozolomide混合物给药的作用：一个对人黑素瘤异种移植模型的评估，癌症的化疗和药理学，(1997)40：266-272)。
多数含有羟基或羧酸官能团的常见药物的前药形式是酯。利用所属领域专业人员的知识，可以通过改变化合物的结构来改进其药物动力学性质，从而将其转化成适于动物或人体治疗性给药的有效药物。在存在血清酯酶的体内环境中JO-4是JO-4A的前药，而且，在体外环境中若培养基含有附加血清(这是最常见的情况)则JO-4同样也是JO-4A的前药。本发明所述方法中用于抑制癌性肿瘤生长的枪刀药素氧化物的优选例子是代谢产物JO-4A，它是游离的JO-4的醇类衍生物。JO-4充当一种适合传递JO-4A的酯类前药形式，在将JO-4对细胞或动物给药后，JO-4A在一段时间后生成。以相同的方式，许多JO-4A的酯类前药可用于JO-4A的传递。所述前药形式及其制备方法是所属领域熟知的，如上所引用的文献。已知这些前药适合在与动物和人体血清中常见的酯酶接触时生成母体药物。应懂得，在所要求保护的JO-4A的方法中可用的生成了JO-4A，并且就抑制癌性肿瘤的生长来说，其是有活性的。
在此所用的术语“激动剂”是指能够引起与式IV所示化合物相同反应的物质(即在需此治疗的动物中抑制癌性肿瘤的生长)。式IV化合物的激动剂包括(但不限于)JO-4A的前药，所述前药如式IV所示。
枪刀药素氧化物的改性形式，即所要求保护的前药和/或其激动剂，在需此治疗的动物中具有抑制癌性肿瘤生长的能力，用于判断或筛选这种能力的方法是已知的(Stinson，S.，Alley，M.C.Kopp，W.C.等人，在定向抗癌药物筛选中使用的人肿瘤细胞系的形态学和免疫细胞化学特性，抗癌研究(991)12：1035-1054)。
本发明所述方法涉及了抗癌或抗肿瘤疗法，即抑制癌细胞生长，由此，当癌细胞生长造成一种或多种肿瘤发生时，可利用式IV化合物，特别是式II化合物(JO-4A，即枪刀药素氧化物)抑制癌性肿瘤的生长。特别是，本发明所述方法涉及了对需此治疗的对象施用治疗有效量的至少一种式IV所示的枪刀药素氧化物类化合物，特别是式II所示的化合物(JO-4A)。所述方法的实施方案涉及了用式IV或具体而言是式II化合物以及可药用载体或稀释剂对所述对象进行给药。
本发明所述方法寻找到了在体外抑制小鼠癌性细胞生长(如图9所述)和癌细胞或癌性肿瘤生长(如图12和13所示)的用途。因此，发现本发明所述方法对癌性细胞或癌性肿瘤具有细胞毒性和生长抑制作用，并且在同样的剂量水平时对正常细胞相对无毒性作用(图10)，这种不同的毒性作用似乎抑制了癌性肿瘤生长，并且由此适合于对不同类型的癌症进行抗肿瘤治疗(图9)。JO-4A的作用通过下列试验加以证实，如图9-13所示，其表明本发明所述方法可有效治疗需抗癌治疗的对象。
显然，对于上述用途，治疗有效量或剂量取决于所用的化合物、给药方式和所需的治疗。但是，通常，以约0.01mg-约1000mg/kg动物体重的日剂量口服给药时将得到满意的结果，所述口服给药的日剂量一般是每天分1-4次或以缓释形式给药。若通过注射给药，以约0.01mg-约200mg/kg动物体重的日剂量给药时将得到满意的结果，所述注射给药的日剂量一般是每天分1-4次或以缓释形式给药。对于较大型的哺乳动物，全天剂量可以在约1mg-约1000mg的范围内，适于口服给药的剂型含有约1mg-约1000mg的所述化合物以及与之混合的相关的固体或液体药物载体或稀释剂。用于确定本发明方法中所用化合物的治疗有效剂量的方法在本领域是已知的。所述方法包括了对抗癌或抗肿瘤疗法(即抑制癌性肿瘤生长)中药理学/药物动力学参数的分析(Wedge.S.R.，Porteus，J.K.，Newlands，E.S.，癌症的化疗和药理学，(1997)40：266-272；Legha，S.S，肿瘤学研讨(1997)24：S4-24-31；Motzer，R.J.，Vogelzang，N.J.肾细胞癌的化疗，Raghaven，D.，Scher，H.I.，Leibel，S.A.，等人：泌尿生殖肿瘤学的原理和实践，Lippincott-Raven Publ.，Philadephia，885-96，1997；Bloom，H.J.，在迁移性肾癌治疗中的醋酸甲羟孕酮(Provera)，英国癌症杂志(1971)25：250-65)。
本发明所述方法包括施用一种药物组合物，所述药物组合物含有有效量的一种或多种式IV的化合物，特别是式II化合物(JO-4A)以及可药用载体或稀释剂，所述化合物可以是纯净形式，或是可药用的粗品浓缩物。所述组合物通常含有1％(重量)以下，优选约0.2％(重量)的式IV化合物，特别是式II化合物，并且可以通过常规技术制备成常规剂型，例如胶囊、片剂、栓剂、可分散粉末、糖浆剂、酏剂、混悬剂或用于肠道或肠胃外给药的溶液。适用的药用稀释剂或载体包括，例如水、醇、天然或硬化油或蜡、碳酸钙和碳酸钠、磷酸钙、高岭土、滑石和乳糖以及适当的防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯，悬浮剂如甲基纤维素、黄芪胶和藻酸钠，湿润剂如卵磷脂、聚氧化亚乙基硬脂酸酯和聚氧化亚乙基脱水山梨糖醇单油酸酯，造粒和崩解剂如淀粉和藻酸，粘合剂如淀粉、明胶和阿拉伯胶，以及润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石，从而提供美观和可口的药物制剂。可以利用常规技术对片剂形式的组合物进行包衣，以延缓片剂的崩解和活性组分在胃肠道内的吸收，由此提供长时间的缓释作用。其它所属领域专业人员已知的用于延缓崩解或将活性组分延时或定时给药的化合物和方法也适合用来配制本发明方法所用的活性成分。例如，式IV化合物，特别是式II化合物可以与脂质体或其它缓释载体物质结合，以保护化合物在它们到达其靶位前不发生降解，和/或使所述化合物易于透过组织屏障进行运动。
从易于给药的角度考虑，优选的组合物是固体组合物，特别是填充有固体的明胶胶囊或片剂。
还应懂得，本发明所述方法的另一个实施方案包括将一种或多种药物以不同的给药方案(包括预防性方案)合用，同时本发明所述的方法是将含有式IV，特别是式II化合物的药物组合物施用给需要抑制癌性肿瘤生长的治疗对象。联合用药的方案和测定其功效的方法(包括治疗药物的监测)均是本领域已知的。适合在治疗中抑制癌性肿瘤生长并与本发明方法所用的式IV，特别是式II化合物联合给药的抗癌药或其他药物的例子包括(但不限于)放疗药、干扰素-α、白介素-1、白介素-2、长春花生物碱、三苯氧胺、紫杉醇、deearbazine、生物反应调节剂、铂类化合物、vinvlatine、博来霉素、dexverapaimil、nifedioine、双嘧达莫、卡氮芥、顺铂。
应进一步懂得，本发明涉及一种抑制癌性肿瘤生长的方法，该方法包括将含有治疗有效量的一种或多种式IV和/或式II(JO-4A)化合物以及抗癌药或一种或多种适于抑制或预防癌性肿瘤生长的药物的药物组合物施用给需要抗癌治疗的对象，所述抗癌药物可选自放疗药、干扰素-α、白介素-1、白介素-2、长春花生物碱、三苯氧胺、紫杉醇、decarbazine、生物反应调节剂、铂类化合物、vinvlatine、博来霉素、dexverapaimil、nifedioine、双嘧达莫、卡氮芥、顺铂。用于确定本发明药物组合物中的式IV或II化合物的治疗有效量的方法，以及如何选择抗癌药或与本发明药物组合物中式IV或II化合物合用的适于抗癌治疗的药物的方法均是本领域已知的(William S.D.编辑，癌症中的常见问题，第21卷，第4期，1997；第186-221页：Bezwoda，W.R.，癌症治疗评论，1997，23：17-34)。
抗病毒。本发明说明书中的下列术语如下文所定义。
在此所用术语“抑制生长”是针对对人体或其他哺乳动物有病理学作用的慢病毒属和疱疹属病毒而言的。例如，对于慢病毒属的HIV，“抑制生长”是指抑制该病毒的生产，这是通过病毒培养物中HIVp24减少的水平来测定的。抑制HIV的生长将使病毒量减少，由此可减轻HIV感染的病理作用。应懂得，此处所用“刺激生长”是指有效减少所述DNA或RNA病毒的病毒含量，从而改善DNA或RNA病毒所致感染的病理作用。
可以用慢病毒HIV的生活周期及其在宿主中的作用来说明此处所用术语“病理作用”。可以理解，慢病毒属病毒包括HIV-1、HIV-2，和HTIV，本发明所述方法涉及了刺激HIV-1，HIV-2或HTLV在对象中的生长。1型人免疫缺损病毒(HIV-1)作为一种反转录病毒是一种单链RNA，其染色体组被包封在蛋白质核芯颗粒内并包裹在脂质被膜中，在该被膜中镶嵌有外克(被膜)蛋白质gp120。T-辅助(CD4 +)的淋巴细胞和单核细胞的感染始于将病毒粒子吸附到细胞表面，这是由病毒被膜蛋白与CD4分子在细胞表面上的特异性反应介导的。病毒侵入后，病毒脱壳并复制，单链RNA染色体组在病毒酶-反转录酶(RT)的作用下反转录成双链DNA染色体组。在HIV-1染色体转录和转译后其整合到宿主DNA中(Arch.Intern，Med，1997，157：951-959)
HIV的病理性/致细胞病的作用包括细胞融合以及形成合胞体并继发细胞死亡(Belshe，R.B.编辑，人病毒学手册，第2版，1991)，从而导致免疫缺损的恶化。AIDS(获得性免疫缺损综合征)的前期包括淋巴结综合征以及全身综合征的出现(AIDS相关综合征或ARC)。淋巴结病综合征被定义为由HIV感染以外的其他可识别诱因导致的淋巴结肥大。随机性感染包括由许多普遍存在的寄生物导致的疾病，这些寄生虫对有免疫能力的人体无害，而只有在免疫缺损存在的条件下才可能产生致病性。较高百分比的HIV感染病患显示出神经病学变化，这无法用随机感染或肿瘤来解释。经常还可以观察到皮肤病学症状。带状疱疹是较早的临床表现。
疱疹属病毒具有若干成员，其是广泛散播的人体病原体。其中包括单纯疱疹病毒(HSV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)和带状疱疹病毒。应理解，本发明所述方法涉及了对疱疹属病毒生长的抑制作用，其中包括HSV-1或-2、CMV和带状疱疹病毒。迄今已在分子水平对1型和2型HSV进行了详细的研究，这是因为它们复制周期快并且在组织培养物中产率高(Belshe，R.B.编辑，人病毒学手册，第2版，1991)。对于HSV，术语“刺激生长”是指抑制病毒的复制周期，减少了病毒生成率或生产率。复制周期包括：附着、侵入、脱壳、早期转录、DNA复制、后期转录以及病毒装配。当细胞被感染时复制就产生了病理作用。HSV感染从两个水平改变了细胞结构，换言之，改变了胞内结构以及细胞的相互作用。病毒蛋白质抑制了细胞蛋白质和DNA的合成。感染期间，染色体片段和残余物重新位于核膜的内表面上，由此清除了病毒复制所需的核心。在另一水平，细胞间的相互作用由于HSV的感染而改变，HSV感染的影响方式是通过病毒株或细胞型，或两者兼具。圆形细胞聚集程度和细胞融合程度的改变表明了这一点。用不同HSV的变型感染的培养细胞经常表现出已改变了的细胞-细胞关联，同时合胞体形成的凝块增加。
1型HSV的病理作用可引起单纯疱疹脑炎(HSE)，这是具有高死亡率并且幸存者中死亡率很高的威胁生命的疾病。急性病灶、坏死性脑炎包括脑部炎症和带有瘀斑的肿大，其会造成大量出血，这种疾病是HSE病理学的构成特征(Scand.J.Infect，Dis Suppl，100：8-13，1996)。HSV-2的病理学作用在发达国家中引起生殖器溃疡。存在于所有人群中的疱疹病毒包括单纯疱疹病毒，带状疱疹病毒，EBV，CMV和人疱疹病毒-6、7和8。
在此所用的术语“改善”、“减缓”、“减轻”是指减弱或减少或使其更耐受。
术语“对象”是指人体或其它动物。
此处所用的术语“前药”是指不具有药理学作用的化合物，它可通过代谢转化作用转变成一种活性药物。(Silverman，Richard B.，药物设计的有机化学，Acad.Press，Inc.1992)。在药物设计中有许多理由使用前药策略，其中最常见的理由是克服与化合物有关的问题，如溶解度、吸收作用和分布、位点特异性、不稳定性、缓释、毒性、利用度较差以及与制剂有关的问题。指导如何判断药物组合物中的化合物到达靶位发挥其作用，如何在作用位点分别获得抑制病理性RNA或DNA病毒(包括HIV或HSV)生长的治疗有效量的文献是可得到的，无需进行大量的实验。(McDonald，C.K.，Kuritzkes，D.R.，1型人免疫缺损病毒蛋白质酶抑制剂，Arch.Intern.Med.，，1997 157：951-959；Klagstaff，A.J.，Faulds，D.，Goa，K.L.无环鸟苷：对其抗病毒活性、药物动力学性质和治疗功效的重新估价，药物，1994，47(1)：153-205；Hayashi，K.，等人，倍半萜和tiptofordin的抗病毒活性的特性，抗微生物和化疗杂志，1996，37：759-768)。
多数含有羟基或羧酸官能团的常见药物的前药形式是酯。利用所属领域专业人员的知识，可以通过改变化合物的结构来改进其药物动力学性质，从而将其转化成适于动物或人体治疗性给药的有效药物。在存在血清酯酶的体内环境中JO-4是JO-4A的前药，而且，在体外环境中若培养基含有附加血清(这是最常见的情况)则JO-4同样也是JO-4A的前药。本发明所述方法中用于抑制所述对象体内HIV或HSV生长的枪刀药素氧化物的优选例子是代谢产物JO-4A，它是游离的JO-4的醇类衍生物。JO-4充当一种适合传递JO-4A的酯类前药形式，在将JO-4对细胞或动物给药后，JO-4A在一段时间后生成。以相同的方式，许多JO-4A的酯类前药可用于JO-4A的传递。所述前药形式及其制备方法是所属领域熟知的，如上所引用的文献。已知这些前药适合在与动物和人体血清中常见的酯酶接触时生成母体药物。应懂得，在所要求保护方法中可用的JO-4A的前药生成了JO-4A，并且就抑制HIV或HSV的生长来说，它是有活性的。
在此所用的术语“激动剂”是指能够引起与式IV所示化合物相同反应的物质(即在需此治疗的对象中抑制HIV或HSV的生长)。式IV化合物的激动剂包括(但不限于)JO-4A的前药，所述前药如式IV所示。
所述枪刀药素氧化物的改性形式，即所要求保护的化合物的前药和/或其激动剂，在需此治疗的对象中具有抑制HIV或HSV生长的能力，用于判断或筛选这种能力的方法是已知的(Belshe，R.B.编辑，人体病毒学手册第2版1991)。
本发明所述方法涉及了利用式IV，特别是式II(JO-4A)化合物的抗病毒疗法，即抑制慢病毒属或疱疹病毒属病毒生长。本发明所述的方法包括：给需此治疗的对象施用治疗有效量的至少一种式IV的枪刀药素氧化物。本发明所述方法中优选采用的枪刀药素氧化物是JO-4(式II)和JO-4A(式II)。本发明所述方法另一方面包括：治疗一对象以分别改善由于慢病毒属或疱疹病毒属病毒(如HIV或HSV)生长造成的病理作用。HIV和HSV的病理作用是该领域中熟知的，在此将作描述。应懂得，抑制对象中HIV或HSV的生长可以改善与这些感染有关的病理，正如文献中所公开的(Belshe，R.B.编辑，人体病毒学手册第2版1991)。
本发明所述方法的一个实施方案包括将式IV化合物以及药物载体或稀释剂施用给所述对象。
如下列实施例详细描述那样，将JO-4A施用给受HIV-1感染的PBMC可以体外抑制HIV-1的生长(如图15A和15B所示)。以相同的剂量水平给药时，JO-4A对PBMC无毒(如图15B所示)。图16C说明了JO-4A对HSV-2生长的抑制作用。
显然，对于上述在感染了慢病毒属或疱疹病毒属病毒(分别例如HIV或HSV)对象中的用途，治疗有效量或剂量取决于所用的化合物、给药方式和所需的治疗。但是，通常，以约0.001mg-约1000mg/kg动物体重的日剂量口服给药或静脉内给药时将得到满意的结果，所述日剂量一般是每天分1-4次或以缓释形式给药。若通过注射给药，以约0.001mg-约200mg/kg动物体重，优选约50mg-约200mg/kg体重的日剂量给药时将得到满意的结果，所述注射给药的日剂量一般是每天分1-4次或以缓释形式给药。对于较大型的哺乳动物，全天剂量可以在约0.00amg-约200mg的范围内，适于口服给药的剂型含有约0.001mg-约1000mg的所述化合物以及与之相混合的相关的固体或液体药物载体或稀释剂。用于测定本发明方法所用化合物的治疗有效量的方法是所属领域技术人员所熟知的。所述方法还包括分析抗病毒，即抑制慢病毒属或疱疹病毒属病毒(例如(但不限于)HIV或HSV)生长的治疗中的药理学/药物动力学参数(Elion，G.B.，无环尿苷：发现、作用机理和选择性，J.Med.Virol，Suppl.1：2-6，1997；Wagstaff，A.J.等人，药物，1994，47(1)：153-205)。
本发明所述方法包括施用一种药物组合物，所述药物组合物含有有效量的一种或多种式IV的化合物。优选的实施方案将与药用载体或稀释剂结合的JO-4A用于HIV或HSV-2感染，所述JO-4A可以是纯净形式，或是可药用的粗品浓缩物；并且将JO-4用于HSV-1或HSV-2感染。所述组合物通常含有1％(重量)以下，优选约0.2％(重量)的式I化合物，并且可以通过常规技术制备成常规剂型，例如胶囊、片剂、栓剂、可分散粉末、糖浆剂、酏剂、混悬剂或用于肠道或肠胃外给药的溶液。适用的药用稀释剂或载体包括，例如水，醇，天然或硬化油或蜡，碳酸钙和碳酸钠，磷酸钙、高岭土，滑石和乳糖以及适当的防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯，悬浮剂如甲基纤维素，黄芪胶和藻酸钠，湿润剂如卵磷脂，聚氧化亚乙基硬脂酸酯和聚氧化亚乙基脱水山梨糖醇单油酸酯，造粒和崩解剂如淀粉和藻酸，粘合剂如淀粉、明胶和阿拉伯胶，以及润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石，从而提供美观和可口的药物制剂。可以利用常规技术对片剂形式的组合物进行包衣，以延缓片剂的崩解和活性组分在胃肠道内的吸收，由此提供长时间的缓释作用。其它所属领域专业人员已知的用于延缓崩解或将活性组分延时或定时给药的化合物和方法也适合用来配制本发明方法所用的活性成分。例如，式IV化合物，特别是式II化合物可以与脂质体或其它缓释载体物质结合，以保护化合物不发生降解直至它们到达其靶位，和/或使所述化合物易于透过组织屏障进行运动。
从易于给药的角度考虑，优选的组合物是固体组合物，特别是填充有固体的明胶胶囊或片剂。
还应懂得，本发明所述方法的另一个实施方案包括将一种或多种药物以不同的方案(包括预防性方案)合用，同时本发明所述的方法是将含有式IV化合物的药物组合物施用给需要抑制慢病毒属或疱疹病毒属病毒生长的治疗对象，或施用给须需缓解上述病毒生长所致的病理作用的对象。联合用药的方案和测定其功效的方法(包括治疗药物的监测)均是已知的(Belshe，R.B.编辑，人体病毒学手册第2版1991)。适合在治疗中抑制HIV或HSV生长并且可与本发明方法所用的式IV化合物联合给药的抗病毒药或其他药物的例子包括(但不限于)：泛西洛维、无环尿苷、索力夫定(BV-arall)、BW882C87、甘西络维、溴夫定、cidofovir(HPMPC)、lobucavir、ISIS-2922、噻喹努佛、ritonavir、indinavir、nelfinavir(蛋白酶抑制剂)；干扰素-α/β，叠氮胸苷(AZT，叠氮脱氧胸苷，齐多夫定)、二脱氧胸苷(DDC)、二脱氧腺苷、二脱氧肌苷(DDI)、三氮唑核苷、多肽T、可溶性重组CD4受体。用于确定本发明药物组合物中的式IV化合物的治疗有效量的方法，以及如何选择抗癌药或与本发明药物组合物中式IV化合物合用的适于抗病毒治疗的药物的方法均是已知的。
                      实施例
下列非限定实施例采用如下的材料和方法。
免疫抑制作用
供血者：通过静脉穿刺术从捐献者抽取肝素化的血样(30cc)。混合白细胞培养(MLC)通常需要两个具有不同遗传背景的供体。
培养基：在RPMI-1640培养基(Fisher Scientific Co.，Santa Clara，CA)中补加20％的热灭活的人AB血清和1％的青霉素/链霉素混合物。
单核白细胞的分离：通过将存在于Hanks-平衡盐溶液(H-BSS)中适当稀释的血液在菲可帕克梯度液上分层并且随后离心，可从血液中分离出单核白细胞。将回收的白细胞用培养基洗涤3次，通过台盼蓝染料不相容法测定存活力。将细胞浓度调至为2×106/ml完全培养基。
混合白细胞反应(MLR)：
MLR是一种为所属领域技术人员熟知的分析试验，它是体内免疫抑制活性的一个体外预测试验。MLR是T细胞对外源主要组织相容性复合体(MHC)基因产物识别的体外模型，并且作为一种细胞介导型移植排异反应的预测性试验(Abbas，A.K.等人编辑，1994，第2版，细胞和分子免疫学，W.B.Saunders Co.USA)。移植排异是由于T细胞对MHC分子的识别并破坏移植物造成的。该过程可以是体内的研究试验，但深入的分析试验，尤其是对人的分析试验，需要开发出例如MLR般的体外移植排异相关试验法(Janeway，Chas. & Travers，Paul.免疫生物学，第2版，Garland Pubishing，Inc，New York(1996))。已知MLR是通过将从一个个体获得的单核白细胞与从另一个体衍生的单核白细胞共培养来诱发的。若两个个体之间存在的MHC基因的等位基因不同，则大部分单核细胞将在4-7天的时间内增殖，这被视作同种异基因的MLR。通过将3H-胸腺嘧啶核苷在细胞复制期间掺混到DNA中可以测定出增殖反应的水平。由于从各个供体获得的细胞彼此反应并增殖，因此所得反应被视作“双向MLR”。在MLR中试验JO-4以测定其“免疫抑制”的能力。
在微量滴定板中建立“双向MLR”
首先将各个供体的单核细胞(2×106/ml)在50ml试管内以1∶1的体积比混合完全。将该混合物以100μl/孔的体积分配在96孔的U形底的微量滴定板中。分别将化合物或待测免疫抑制剂以100μl/孔的体积以1.0、0.5或0.25μg/ml的不同浓度加入到培养基中。将无药物的100μl培养基加入到对照孔内。将培养物保存在气氛为5％CO2、温度为37℃的加湿培养箱中达5天。在收获前的第4小时，在各个孔的培养物内加入1μCi氚代胸腺嘧啶(比活性为719.5mCi/mg；Dupont，Wilmington，DE)。将细胞收获到带有96孔自动细胞收集器(TOMTECHamden，CT)的玻璃纤维过滤器(Packard，Downers Grove，IL)上，并且在Matrix 9600β计数器(Packard)上直接计数。结果如图1所示。
数据按照下列公式表示为抑制百分率(％抑制)：
％抑制＝100-[(含药培养孔的每分钟计数(CPM))/无药物孔的CPM]×100
“单向人MLR”培养物中MHC限制的溶细胞CD8+T淋巴细胞的生成
在含有得自于不同供体的单核细胞的组织培养瓶中以上述“双向MLR”建立“单向MLR”。但是，在“单向MLR”中，在培养前将两种单核白细胞群中的一种通过用丝裂霉素C(一种抗有丝分裂药)处理使其无法增殖。在此“单向MLR”中，被处理细胞仅充当刺激物，同时，未经处理的细胞仍然能够增殖并充当反应物。反应物细胞在5-7天地培养期中表达为CD8+表型，而不是CD4+。这些CD8+细胞仅充当溶细胞T淋巴细胞(CTL)，其将来源于与原始刺激物细胞群相同的个体的靶细胞溶解。在移植中，这些MHC限制的细胞毒性CD8+T细胞溶解了MHC全异(MHC-disparate)的供体靶组织，导致移植排异(Abbas，A.K.编辑，第2版，细胞和分子免疫学，W.B.Saunders Co.USA；Imagawa，D.K.等人，Aggarwal，B.B.等人编辑，人体细胞因子：其在疾病和治疗中的作用，Blackwell Science，Inc.Cambridge，MA)。结果如图2所示。
在组织培养瓶中建立“单向”MLR
首先，在15ml包裹有铝箔的试管中用丝裂霉素C(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)(50μg/50×106细胞)处理一个供体的单核细胞并在37℃的水浴中保温1小时。保温结束时，用组织培养基将细胞洗涤3次并调成2×106/ml的浓度，充当刺激物。将未用丝裂霉素C处理的得自另一供体的单核细胞调至2×106/ml并用作反应物。将反应物和刺激物以1∶1的体积比混合，并在1.0μg/mlJO-4存在或只有培养基存在的条件下，将其在组织培养瓶中保温5-7天。在CTL分析试验中，将一些刺激物细胞(未经丝裂霉素C处理)用PHA活化，进而在作为靶物的经IL-2调节的介质中培养5或7天。
JO-4A对天然杀伤(NK)细胞活性的抑制作用-细胞毒性分析试验
用不同剂量的JO-4A以不同的处理期通过静脉内或口服给药处理小鼠。在处理阶段结束后，取出脾脏用于测试脾对YAC-1肿瘤细胞(一种小鼠NK-易感细胞系(Ojo-Amaize，E.等人，Scand.J.Immuno.(1978)7：297-306))的NK活性，4小时的51C释放分析试验用于描述离体小鼠CTL分析试验。结果表示为％溶解/LU和％胞溶抑制作用(Ojo-Amaize，E.等人，(1994)，临床感染疾病18(增刊1)：S157-9)。
CTL试验
在培养阶段结束时，用51Na2CrO4(51C)标记靶细胞并调至0.5×106/ml。收集效应器细胞(即反应细胞)，用培养基洗涤2次并将肝脏细胞调至2.5×106/ml。将效应器细胞和靶细胞以效应器细胞∶靶细胞(E∶T)为25∶1的比例在96孔U底微量滴定板中混合并在37℃/5％CO2的培养箱中培养4小时。在培养结束时，基本按照上述用于51C释放分析试验(Ojo-Amaize，E.等人，(1994)，临床感染疾病18(增刊1)：S157-9)的方法对胞溶靶细胞进行测定，并且结果表示为％特异性胞溶作用。
JO-4对诱发的前-炎症细胞因子合成的抑制作用
在1μg/ml JO-4或培养基存在的条件下，用B细胞促细胞分裂剂LPS(Gibco BRL，Grand Island，NY，3μg/ml)在24孔平板中对每1.0ml体积2×106/ml的人外周血单核细胞(PBMC)培养48小时。在5％CO2的37℃培养箱中进行培养。在培养结束时收集培养物上清液并在细胞因子存在的条件下进行酶免疫测定，所用细胞因子为：白介素-1β，-6和TNF-α。结果表示为对细胞因子生产的抑制作用。结果如图3所示。
JO-4A对人MLR的抑制作用
在不存在JO-4A或存在不同浓度JO-4A(0.1、1.0、10和100μM)的条件下建立双向MLR。结果如图4所示。
JO-4对LPS诱发的鼠淋巴细胞组织增殖的体外抑制作用
LPS是一种小鼠B细胞的促细胞分裂剂，并且已知其在鼠和人体单核细胞中均可诱发前-炎症细胞因子，如TNF-α，IL-6和IL-1β(Cunningham，A.J.编辑；理解免疫学1978；Academic Press，Inc.，NY，USA)。在JO-4不存在或以不同浓度(1.5、2.5、5.0、10.0和50.0μg/ml)存在的条件下，用LPS体外刺激鼠淋巴细胞。结果如图5所示。
JO-4对PHA诱发的人外周血单核细胞增殖作用的体外抑制作用
在不存在JO-4或以不同浓度(1.25、2.5、5.0、10.0和50.0μg/ml)存在的条件下将人PBMC培养4天。结果如图6所示。PHA是一种有效的T细胞促细胞分裂剂，可以刺激T细胞生产IL-2。
JO-4对人PBMC的无毒性
为了测定JO-4对人体体外细胞是否有毒，在JO-4不存在或以不同浓度(1.25、2.5和5μg/ml)存在的条件下将人PBMC培养不同的天数(2、5和7天)。在各个培养期结束时，通过台盼蓝染料不相容法(trypanblue dye exclusion method)测定细胞的存活力。结果如图7所示。本发明的化合物
本发明所述方法中试验的化合物包括JO-4A(式II)、JO-4(式I)(JO-4A的酯)，和JO-4B(式V)。化合物的制备
JO-4A的制备将JO-4结晶(82mg，0.22mmol)溶解在加热的甲醇(3ml)和二氧六环(3ml)的混合物中，随后冷却至室温。加入新制的甲醇钠粉末以达到pH10。将该混合物在室温下搅拌过夜，并且用Dowex-50H+树脂中和澄清、橘黄色的反应混合物，过滤并真空蒸发，得到浅黄色糖浆，该糖浆在冰箱内过夜使其缓慢结晶。生成65mg，90％。
JO-4B的制备(E.J.Corey & G.Schmidt，的方法，Tetrahedron Letter，399-402，1979)。将JO-4A(50mg，0.15mmol)溶解在二氯甲烷(1ml)并冷却至0℃，在有效的搅拌下加入1.5mol当量的重铬酸吡啶鎓盐。在室温下将反应混合物搅拌6小时并随后用乙醚稀释，过滤并蒸发，生成米色固体(30mg，60％)。
JO-4的酯类化合物如式IV所示，本发明所述化合物包括JO-4A的酯类化合物，但不包括公开在杂环学20：2125-2128(1983)和Z.Naturoorsch 37c：558-561(1982)中的枪刀药素氧化物(JO-4)。但应注意，本发明所述的引起免疫抑制的方法包括施用式II的化合物，其中包括枪刀药素氧化物。
因此，本发明的一方面涉及了式IV的化合物或其可药用盐。R是
(i)H，PO3 -，含有1-12个碳原子及0-6个双键的直链或支链的取代或未取代烷基，(CH2)n吗啉其中n＝1-4，吗啉代甲基苯基，邻氨基苯基，邻羟基苯基，(CH2)nCOOR2其中n＝1-4
其中R2为H、碱金属盐离子、碱土金属盐离子、NH4 +、N+(R3)4，其中R3独立地选自由H和1-4个碳原子的烷基组成的基团，或
(ii)COR1，其中R1选自H，(CH2)nCH3，其中n＝1-6，(CH2)nCOOR2，其中n＝1-4，并且R2如上述定义，(CH2)nN+(R3)4，其中n＝1-4，和(CH2)nSO3 -，其中n＝1-4。本发明一方面涉及了含有治疗上免疫抑制有效量的式IV化合物的药物组合物。
本发明所述用于在动物中引起免疫抑制的方法包括给需此治疗的动物施用一种药物组合物，该药物组合物含有治疗有效量的式IV化合物或其可药用盐。
从枪刀药中分离JO-4
从干燥的枪刀药(Hypoestes rosea)植物原料中分离纯净JO-4的常见方法包括在大型索格斯利特萃取器中用沸腾的己烷进行固体/液体萃取。枪刀药是一种刺(Acantheceae)科灌木(Okugun，J.I.等人，Z.Naturforsch 37c：558-561(1982))。将蒸发己烷得到的粗产物进行闪式硅胶柱层析，采用的分步梯度溶剂系统是从石油醚(30-60bp)开始并逐步采用的石油醚中含5％乙酸乙酯，进而10％乙酸乙酯，随后20％乙酸乙酯。当含有30％乙酸乙酯时，JO-4从层析柱被洗脱出来。将适当的馏分合并并浓缩至干，加入石油醚或己烷，得到结晶JO-4。一个这种过程可从植物叶子的10g粗提物中生产出240mg纯JO-4。
应着重注意：首先将粗提物溶解在尽可能少的乙酸乙酯中并吸附在硅胶上，在上样到预含在石油醚中的层析柱前将其蒸发至干。对植物特定部分的提取表明，叶子而不是茎含有主要的JO-4。
结果：
如上所述，发现式IV化合物具有意料外的作为免疫抑制药物和抗炎药物的功效，这得自于其在标准的体外和体内试验中所显示出的对细胞免疫性的作用，所述标准体外和体内试验是指预测化合物在人体或其他动物中的免疫抑制活性的试验。
式IV和II化合物，特别是在此所验证的JO-4A和JO-4化合物，它们免疫抑制了免疫细胞或淋巴细胞的形成或增殖或机能，并由此抑制了移植组织如器官移植物(如皮肤、骨髓、肾脏、心脏和肺)的排异；同时适用于预防移植物抗宿主疾病(GVHD)和T细胞介导的自身免疫病如多发性硬化(MS)、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性心肌炎、全身性红斑狼疮(SLD)、类风湿性关节炎(RA)，阿耳茨海默氏病(AD)、糖尿病和肾小球性肾炎。
由于本发明所述化合物抑制了前-炎症细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6)的合成，因此发现了此类化合物在抑制变应性反应、哮喘、接触性皮炎和皮肤病(如牛皮癣)中的用途。
本发明所述化合物的免疫抑制作用是在上述试验中测定，其结果如上所示。业已发现，本发明所述化合物在体外和小鼠体内试验中所显示的免疫抑制活性构成了本发明人结论的基础，该结论是：所述化合物以及含有其的药物组合物在动物或人体宿主中对其免疫系统具有体内抑制功效。
图1是利用不同对的供体进行各个试验的若干实验中的代表性结果。该结果证实，JO-4抑制双向MLR。可以得出抑制浓度50(IC50)，即达到50％抑制作用时的药物浓度，是在0.5μg/ml-5.0μg/ml间。
图2表示JO-4对MHC不同的刺激靶细胞胞溶作用的抑制作用，所述胞溶作用是有I型MHC限制的细胞毒性T细胞介导的。在组织排异反应中，抑制MHC限制的细胞毒性CD8+T使MHC不同的供体组织胞溶，导致移植物排异(Abbas等人，细胞和分子免疫学，1994，W.B.Saunders Co.USA；Imagawa D.K.等人，InAggarwal，B.B.，等人，人体细胞因子：其在疾病和治疗中的作用，Blackwell Science，Inc，CambridgeMA，1995)。在此实验中，已证实，JO-4显著(82％)抑制了这种细胞毒性T细胞的溶细胞能力，细胞毒性T细胞得自“单向人MLR”，发现了本发明所述化合物体外免疫抑制作用，以及对动物或人体宿主的免疫系统的体内抑制功效。
图3是得自于3个实验的代表性结果，所述实验证实了JO-4对前-炎症细胞因子合成(IL-1α、TNF-β和IL-6)的抑制或免疫抑制作用。已知这些细胞因子参与了炎症和内毒素休克综合征(Watkins等人，Pain1995，63：289-302：免疫作用：前-炎症细胞因子在炎症、疾病反应和病理疼痛态中的作用)。
图4表示JO-4A对人体双向MLR的抑制作用。JO-4A的IC50似乎在5.0μM～10.0μM间，在10.0μM时，JO-4A对双向MLR产生64％抑制作用。
图5表示JO-4对LPS-诱发型鼠科淋巴细胞增殖的体外抑制作用。在所有被测浓度(1.5μg/ml-50μg/ml)下增殖作用均被抑制50％以上。由于LPS是一种有效的鼠科B淋巴细胞粗细胞分裂剂，所以B淋巴细胞是可抗体分泌的血浆细胞的产物(Cunningham，A.J.编辑，Academic Press，Inc；：理解免疫学)，JO-4和本发明的化合物适用于在自身免疫疾病(例如但不限于：全身性红斑狼疮，类风湿性关节炎)中防止自身抗体的产生。
图6表示JO-4对PHA诱发的人淋巴细胞增殖的体外抑制作用。PHA活化的淋巴细胞导致IL-2生成，IL-2是维持或引起MLR反应所必需的。因此，可以作为解释而不是限定的是，JO-4对PHA诱发的人淋巴细胞增殖的抑制作用可能是对MLR的抑制作用。
图7表示JO-4在抑制淋巴细胞增殖的浓度下对淋巴细胞无毒。由此，JO-4对淋巴细胞增殖作用的抑制应归因于其抑制DNA合成的能力，而不是使其中毒。
图8表示通过静脉内或口服给药的JO-4A可以抑制体内的NK活性。该发现证实，本发明化合物可有效地通过抑制供体中NK细胞的体内活性来抑制移植物抗宿主疾病，所述NK细胞在全身急性移植物抗宿主疾病中是重要的效应器细胞。因此，本发明化合物以及JO-4适用于预防移植受体中的GVHD的方法，该方法包括：给移植供体施用一种药物组合物，该组合物含有治疗有效量的所述化合物。治疗有效量的所述化合物足以抑制供体内的NK细胞的机能，从而当NK细胞被移植到受体体内时避免或防止或缓解了GVHD。对于所属领域专业人员来说，如何测定所述化合物对供体的最佳剂量和给药时间，从而达到缓解、避免或防止移植受体中发生GVHD是已知的。
抗癌
下列非限定实施例中采用如下所述的材料和方法。
肿瘤细胞：由ATCC(Rockville，MD)预购得人子宫颈上皮癌(HeLa)，人肾清除细胞癌(CAKI-1)、人恶性黑素瘤(RPMI-7951)和小鼠恶性黑素瘤(B16-F1)，并体外保存在补加有10％热灭活胎牛血清(American Qualex，San Clemente，CA)、10mM谷酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Sigma Chemicals，Saint Louis，MO)的MEM介质(Mediatech，Inc，Hemdon，VA)(完全培养基)内。
正常细胞：由Clonetics(San Diego，CA)得到正常人子宫颈上皮细胞(CrEc-Ec)、正常人乳腺上皮细胞(HMEC)和正常人脐静脉内皮细胞，并且将它们分别培养在Clonetics推荐和获得的组织培养基中。
外周血单核细胞(PBMC)：从健康成年志愿者获得肝素化的静脉血并通过在菲可帕克(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上离心分离出PBMC。所述细胞用HBSS(Hanks平衡盐溶液)洗涤3次，并精细地重新悬浮在完全培养基中。通过台盼蓝染料不相容实验来测定细胞的存活性，并且将细胞数量调至所需的浓度。
MTT比色法：利用比色法(Mosmann，T.，免疫学方法杂志65：55-63，1983)体外测定式I和II(JO-4A)所示的枪刀药素氧化物类化合物的细胞毒性作用。简单地说，在96孔平底平板的每个孔内加入1000个细胞(100μl)，在只存在培养基或存在不同浓度药物的条件下，将其在37℃、5％CO2-95％空气的加湿培养箱内培养72小时。培养结束时，在每个孔中加入10μl溶于PBS中的5mg/ml 3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)(Sigma Chemicals，Saint Louis，MO)，并且继续保温4小时。在所有孔中加入酸-异丙醇(100μl 0.04N HCl，存在于异丙醇内)并在室温下保存30分钟。用多通道移液管混合以将蓝黑色结晶溶解，并在545-650nm下经ELISA平板读取器测定吸收度。
小鼠：由Charles River实验室(Wilmington，MA)购得8周龄的雌性C57BL/6(B6)小鼠。
小鼠肿瘤体积的测定方法：在用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(IrvinScientific，Irvine，CA)体外培养15分钟后收获呈指数生长的B16-F1黑素瘤细胞。在小鼠的右侧皮下注射50000活细胞(Fidler，I，癌症研究杂志35：218-224，1975)。注射4天后，令试验组中的小鼠管饲口服溶于0.2ml水中的不同浓度的JO-4A，对照组只接受水。用微卡钳测定肿瘤，以下列公式计算肿瘤体积：长度×宽带×高度×0.5236(Jungwirth，A.等人Proc.Natl，Acad，Sci，USA，94：5810-5813，1997)。
统计学分析：利用学生t-检验计算显著性水平。
所以，本发明所述方法包括了给所述对象施用治疗有效量的至少一种具有式IV的枪刀药素氧化物化合物及其可药用盐。
本发明的优选实施方案涉及用于抑制癌性肿瘤生长的药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的式II化合物(JO-4A)。
如上述实施例所示，发现了式IV化合物，特别是式II化合物(JO-4A)意外地具有作为抑制癌性肿瘤生长药物的有效作用，这表现在其在标准体外和体内试验中对癌性肿瘤细胞生长的抑制作用，所述体外和体内试验可预测化合物在人体或其他动物中的抗肿瘤活性。
式IV化合物，特别是在此所证实的式II(JO-4A)化合物抑制了癌性肿瘤细胞的形成或增殖或机能，并由此适用于需抗癌治疗的对象中抑制癌性肿瘤生长的方法。
式IV化合物的作用是在上述试验中得到测定，其结果如下所示。迄今已发现了式IV化合物在体外和小鼠体内试验中用于抑制癌性肿瘤生长的医学作用，其构成本发明人的结论基础，所述结论是：所述化合物和含有它们的药物组合物在动物或人体宿主中具有抑制癌性肿瘤生长的体内功效。
                    实施例1
         JO-4A对体外癌细胞的细胞毒性作用
图9是若干试验中JO-4A对不同人体外癌细胞毒性作用的代表性结果。结果证实，JO-4A对人子宫颈上皮癌(HeLa)细胞的依赖剂量的细胞毒性作用。抑制浓度50(IC50)，即半数抑制浓度，在10μM-12.5μM。
同样，JO-4A对肾癌(CAKI-1)细胞的IC50在20μM-40μM间，对迁移至淋巴结(RPMI-7951)的恶性黑素瘤的IC50为10μM-12.5μM。
图10表示JO-4A对正常人体细胞的细胞毒性作用。当在比色法中采用正常人体子宫颈上皮细胞，抑制相对于人子宫颈上皮癌(HeLa)的空白对照细胞系，JO-4A的IC50＞100μM。HeLa的IC50剂量(10μM-12.5μM)对于其正常对照物仅仅产生6％的细胞毒性作用。此外，JO-4A对于正常外周血单核细胞无细胞毒性作用。JO-4A对于正常人乳腺上皮细胞和正常人脐静脉内皮细胞的IC50浓度是相同的(25μM-50μM)。
图11是若干试验中JO-4A对体外恶性黑素瘤细胞(B16-F1)的细胞毒性作用的代表性结果。这些结果证实，JO-4A对B16-F1细胞具有剂量依赖型细胞毒性作用。IC50浓度在6.25μM-12.5μM。
                      实施例2
           JO-4A对黑素瘤生长的体内作用
图12表示JO-4A对C57BL(B6)小鼠中的B16-F1黑素瘤的体内作用。在肿瘤移植后第4天开始每天给B6小鼠口服施用JO-4A，所有4种被测的JO-4A给药浓度均可明显减小肿瘤体积(图12A)。此外，JO-4A的口服给药还增加了试验组中B6小鼠的幸存率。虽然未处理组中的所有(n-6)小鼠到28天时全部死亡，而84％的用2mg/kgJO-4A处理的小鼠(5/6)存活。此外，用1mg/kg处理组幸存67％(4/6)，用0.5mg/kg(3/5)处理组幸存了60％，用0.1mg/kg处理组幸存17％(1/6)(图12B)。
图13表示用2mg/kg JO-4A处理组的各个幸存小鼠对未处理组的对比。虽然事实上处理在第20天停止，但用2mg/kg JO-4A处理组的小鼠比未处理组的存活时间长。
                      实施例3
        JO-4A对与干扰素-α结合中的体外抑制作用
图14表示与干扰素-α(IFN-α)结合中所用的JO-4A对体外人恶性黑素瘤产生一个附加的生长抑制作用。该结果表明，使用了JO-4A的结合试验可以将IFN-α的剂量减少到8分之一，但不降低IFN-α的预期功效。该结果发现了对病患进行IFN-α治疗的实用性，因为IFN-α的毒性极强(肿瘤学研讨，第24卷，增刊4，1997)。因此，本发明包括了一种用于改善IFN-α疗法的毒性的方法，该方法包括将足够量的JO-4A在接受IFN-α的病患中联合给药，以确保降低IFN-α的剂量，从而减小IFN-α对患者的毒性风险。
抗病毒
下列非限定实施例采用如下所述的材料和方法。
外周血单核细胞(PBMC)：从健康成年志愿者获得肝素化的静脉血并通过在菲可帕克(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上离心分离出PBMC。所述细胞用HBSS(Hanks平衡盐溶液)洗涤3次，并精细地重新悬浮在补加有20％热灭活胎牛血清(American Qualex，San Clemente，CA)、10mM谷酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(SigmaCHemicals，Saint Louis，MO)的RPMI-1640介质(Mediatech，Inc，Herndon，VA)(完全培养基)内。通过台盼蓝染料不相容实验来测定细胞的存活性，并且将细胞数量调至所需的浓度。
正常的非洲绿猴肾细胞(CV-1)：从HybriwixTM Probe Systems获得CV-1细胞：采用抗疱疹病毒敏感试验试剂盒(Diagnostic Hybrids，Inc.Athens，OH)通过MTT法试验JO-4A的毒性。
对体外HIV-1复制的测定：采用一种用于测定药物对从临床分离的人HIV-1的敏感性的标准外周血单核细胞培养试验(Japour AJ等人，Antimicro Agents Chemother 1993；37：1095-1101)。在完全培养基和37℃、5％CO2-95％空气的湿培养箱中用PHA(5μg/ml)刺激外周血单核细胞(2×106细胞/ml)达72小时。将400g的经PHA刺激3天后的PBMC在20-24℃下沉积10分钟。去除上清液。将细胞重新悬浮在补加有3％IL-2的完全培养基中。用0.4％台盼蓝测定细胞的存活率。存活率高于85％。将细胞浓度调至4×106/ml。将细胞以50μl(2×105/孔)的体积分配在含有50μl完全培养基的96孔微量滴定板中。将HIV-1感染的培养物用从病患分离出的感染复数(MOI)分别为0.05和0.1的HIV-1引发。在孔内加入50μl体积的不同浓度(0.001μM-0.5μM)的JO-4A。将平板在37℃下和5％C2的加湿室内保温7天。在第4天，弃去半数失效分培养基(100μl)，将50μl新鲜的完全培养基和50μl JO-4A(如上所述的不同浓度)加入到含有失效JO-4A的孔内。将100μl新鲜培养基加入到无药物的孔内。第7天时，停止培养并测试上清液的HIVp24抗原，试验采用了制造商推荐的酶免疫法(EIA)试剂盒测定的(CoulterTMHIVp24抗原测定：Immunotech，Inc.，Westbrook，Maine)。
体外单纯疱疹病毒(HSV)(1和2型)复制的测定：利用HybriwixTMProbe System(抗疱疹吡啶敏感试验试剂盒：Diagnostic Hybrids，Inc，Athens，OH)测定药物的抗病毒活性。简单来说，在37℃和5％CO2的加湿培养箱中将HSV-1或HSV-2分离物(ATTC，Rockville，MD)预吸附在置于24孔平底平板中的非洲绿猴肾细胞上。预吸附后，将病毒接种物取出，并将含有不同浓度适当药物的生长培养基加入到适当的孔内。将培养物继续培养48小时以扩增病毒。通过核酸杂交法定量测定各孔中的HSV DNA病毒。用DNA wicking试剂使细胞和/或病毒胞溶，并利用垂直毛细管吸附wicking试剂/DNA溶液，从而将单链DNA固定在HybriwixTM滤膜上。利用含有基因序列的放射活性(I125)-HSVDNA探针测定HSV靶定DNA的量，所含序列与HSV-1或HSV-2序列类似。HybriwixTM上存在的放射性的量取决于培养后HSV DNA的量，并且可以在γ计数器(Packard Instrument Co.，Meriden，CT)中测出。
MTT比色法：利用比色法(Mosmann，T.，免疫学方法杂志65：55-63，1983)测定药物的体外细胞毒性作用。简单地说，在96孔平底平板的每个孔内加入1000个细胞(100μl)，在只存在培养基或存在不同浓度药物的条件下，将其在37℃、5％CO2-95％空气的加湿培养箱内培养72小时。培养结束时，在每个孔中加入10μl溶于PBS中的5mg/ml3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)(SigmaChemicals，Saint Louis，MO)，并且继续保温4小时。在所有孔中加入酸-异丙醇(100μl 0.04N HCl，存在于异丙醇内)并在室温下保存30分钟。用多通道移液管混合以将蓝黑色结晶溶解，并在545-650nm下经ELISA平板读取器测定吸收度。
所述方法采用的化合物
本发明所述方法中测试的枪刀药素氧化物类化合物(式IV)包括JO-4A(式II)以及JO-4(式I)(JO-4A的酯)。
所以，本发明所述方法包括给所述对象施用治疗有效量的至少一种式IV所示枪刀药素化合物及其可药用盐。本发明所述方法的优选实施方案是施用含有治疗有效量的式II(JO-4A)化合物的药物组合物，以抑制HIV和HSV-2的生长。本发明所述方法的另一优选实施方案是施用含有治疗有效量的式I(JO-4)化合物的药物组合物用于抑制HSV-I或IV和HSV-2的生长。
如下列实施例所述，由其对病毒生长的作用可以发现，式IV(JO-4)和II(JO-4A)化合物分别具有意外的抑制HSV1和HSV2，以及HIV和HSV-2生长的有效作用，这表现在预测化合物在人体或其他动物体内的抗病毒作用的标准体外试验中。
在此利用一个为所属领域技术人员熟知的预测抗HSV-1或抗HSV-2活性的筛选试验，证实式I(JO-4)化合物抑制了HSV-1和HSV-2在非洲绿猴肾细胞的复制和生长，从该试验中专业人员将认识到，JO-4适用于在需抗病毒治疗的对象中抑制HSV-1或HSV-2的生长，由此改善HSV-1或HSV-2感染的病理作用。
在此分别利用所属领域技术人员熟知的预测抗HIV或抗HSV-2活性的筛选试验，证实式II(JO-4A)化合物可以抑制人PBMC中的HIV和非洲绿猴肾细胞中的HSV-2的复制和生长，从这些试验中，专业人员将了解到，JO-4A适用于在需抗病毒治疗的对象中抑制HIV或HSV-2的生长，由此改善HIV或HSV-2感染的病理作用。
             实施例
             实施例1
JO-4A对PBMC中HIV生长的抗病毒作用
图15A：表示了若干试验中JO-4A对从患者分离的HIV-1的抑制作用的代表性结果。这些结果证明，JO-4A对HIV-1复制具有剂量依赖型抑制作用，并且可推断出抑制浓度50(IC50)，即半数抑制浓度，在0.0001μM-0.01μM内。
图15B：表示利用台盼蓝人体不溶性试验测定出的JO-4A对经培养人PBMC的细胞毒性结果。在任何试验浓度下JO-4A均无毒性作用，由此，JO-4A对HIV-1复制的抑制作用不归因于JO-4A对PBMC的细胞毒性。
               实施例2
JO-4对HSV-1和HSV-2生长的抗病毒作用
图16A表示JO-4对HSV-1复制的抗病毒作用。在用不同浓度JO-4培养2天后，HSV-1在非洲绿猴肾细胞中的复制，在12.5μM JO-4的条件下被抑制60％，在3.125μM JO-4下时被抑制53％。因此，测出JO-4抑制HSV-1的IC50剂量为～3.125μM。
图16B表示JO-4对HSV-2复制的抗病毒作用。在用不同浓度JO-4培养2天后，HSV-2在非洲绿猴肾细胞中的复制，在12.5μM JO-4下被抑制65％，在3.125μMJO-4下时被抑制58％。因此，测出JO-4抑制HSV-2的IC50剂量为＜3.125μM。
图16C表示JO-4A对HSV-2复制的抗病毒作用。在用不同浓度JO-4培养2天后，HSV-2在非洲绿猴肾细胞中的复制，在12.5μM JO-4A下被抑制61％，在3.125μM JO-4A下时被抑制51％，在0.75μM JO-4A下时被抑制20％，。因此，测出JO-4抑制HSV-2的IC50剂量为～3.125μM。
                      实施例3
        JO-4和JO-4A对培养细胞的细胞毒性作用
图17A和17B表示JO-4和JO-4A对正常的、未感染的非洲绿猴肾细胞(CV-1)的细胞毒性的结果。当在不存在或存在不同浓度JO-4和JO-4A的条件下，将CV-1培养72小时，只有到化合物处于较高的浓度(JO-4＞50μM JO-4A～25μM)时，其细胞毒性在50％以上。由此，JO-4和JO-4A对HSV-1和HSV-2复制的抑制作用不归因于各药物对CV-1细胞的细胞毒性。
本发明的宗旨和范围将不限制在优选的描述方式内。其他多种改动、改编和改进均在本发明所述范围内。

Claims (9)

1.含有下式化合物的药物组合物：
Figure A9880423500021
其中：
R是
(i)H、PO3 -、含有1-12个碳原子及0-6个双键的直链或支链的取代或未取代烷基、(CH2)n吗啉其中n＝1-4、吗啉代甲基苯基、邻氨基苯基、邻羟基苯基、(CH2)nCOOR2其中n＝1-4，
其中R2为H、碱金属盐离子、碱土金属盐离子、NH4 +、
N+(R3)4，其中R3独立地选自由H和具有1-4个碳原子的
烷基组成的基团，或
(ii)COR1，其中R1选自H、(CH2)nCH3其中n＝0-6、(CH2)nCOOR2其中n＝1-4并且R2如上述定义、(CH2)nN+(R3)4其中n＝1-4、和(CH2)nSO3 -其中n＝1-4。
2.权利要求1所述的药物组合物，其中R是H。
3.具有权利要求1所定义的式(I)所示的化合物在制备免疫抑制剂中的应用。
4.具有权利要求1所定义的式(I)所示的化合物在制备用于抑制癌细胞生长的药物组合物中的应用。
5.权利要求4所述的应用，所述癌细胞选自子宫颈癌、迁移性黑素瘤、肾细胞癌、睾丸的胚胎性癌和结肠癌。
6.具有如权利要求1所定义的式(I)所示的化合物在制备抑制慢病毒属或疱疹病毒属病毒生长的药物组合物中的应用。
7.权利要求6所述的应用，其中所述慢病毒属病毒选自HIV-1、HIV-2和HTLV。
8.权利要求6所述的应用，其中所述疱疹病毒属病毒选自单纯疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒和带状疱疹病毒。
9.具有权利要求1所定义的式(IV)所示的化合物，其中对于所述的(CH2)nCH3而言n＝1-6，而其他取代基和可变基团如上所述。
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