CN111699260A

CN111699260A - 用于生物合成β羟基脂肪酸阴离子和/或其衍生物和/或与其相关的化合物的方法和材料

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Publication number: CN111699260A
Application number: CN201980011507.8A
Authority: CN
Inventors: 乔纳森·保罗·库姆; 亚历山大·布雷特·福斯特; 阿尔贾·巴曼
Original assignee: Invista Textiles UK Ltd
Current assignee: Invista Textiles UK Ltd
Priority date: 2018-02-01
Filing date: 2019-02-01
Publication date: 2020-09-22
Also published as: US11661613B2; WO2019152753A1; US20190233849A1; EP3746559A4; WO2019152753A8; EP3746559A1

Abstract

本发明提供了用于产生羟基脂肪酸阴离子的方法和材料，所述羟基脂肪酸阴离子包括2‑羟基异丁酸(2‑HIBA)和/或其衍生物和与其相关的化合物。本发明还提供了根据这些方法和材料产生的产物。

Description

用于生物合成β羟基脂肪酸阴离子和/或其衍生物和/或与其相关的化合物的方法和材料

本专利申请要求2018年2月1日提交的美国临时申请序列号62/624,910的优先权权益，该美国临时申请的内容据此全文以引用方式并入。

技术领域

本发明涉及用于产生羟基脂肪酸阴离子诸如2-羟基异丁酸(2-HIBA)和/或其衍生物和/或与其相关的化合物的生物合成方法和材料。本发明还涉及由这些方法和材料生物合成或以其他方式获得的产物。

人们正在考虑用环境友好(例如，绿色化学品)和/或“清洁技术”解决方案来替代依赖于例如化石燃料和/或潜在有毒化学品的传统化学品生产工艺，包括致力于鉴定适用于制造此类化学品的合适基本单元。参见“Conservative evolution and industrialmetabolism in Green Chemistry”，Green Chem.，2018年，第20卷，第2171-2191页。

2-HIBA已被鉴定为工业中使用的潜在基本单元，因为几乎所有具有异丁烯结构的化合物均可通过相对简单的化学转化获得(Rohde等人，Appl Environ Microbiol.，201717，第83卷第3期，第e02622-16页；Rohwerder T.和Muller R.H.，Microb.CellFactories，2010年，第9卷，第13页)。例如，2-HIBA是2，3-二羟基-甲基丙酸酯、2-丙醇和甲基丙烯酸酯的前体。甲基丙烯酸酯(也被称为甲基丙烯酸)是广泛大量用于常规利用有毒化学品(包括氰化氢、甲醛和甲基丙烯醛)生产的树脂、塑料、橡胶和义齿材料中的化学品。

Lopes Ferreira等人(Microbiology，2006年，第152卷，第1361-1374页)已描述经由羟基丁醛脱氢酶由2-甲基-2-羟基丙醇来酶促产生2-HIBA。

WO 2007/110394公开了一种用于利用来自表达3-羟基羧酸-CoA变位酶酶活性的微生物的酶提取物或通过在培养基上培养表达3-羟基羧酸-CoA变位酶酶活性的微生物，将3-羟基丁酸酶促转化成2-HIBA的方法。

公开的美国专利申请20110151530公开了一种用于生物制备2-HIBA的方法，包括利用据报道经修饰的微生物以由可再生资源诸如乙酰-CoA产生2-HIBA的发酵方法。

根据一些报道(Hoefel等人，Appl Microbiol Biotechnol.，2010年，第88卷第2期，第477-484页；Przybylski等人，Appl Microbiol Biotechnol.，2013年，第97卷第20期，第8875-8885页)，缺乏聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)合成的钩虫贪铜菌(C.necator)菌株已被用于经由来自三碳栖水菌(Aquincola tertiaricarbonis或A.tertiaricarbonis)L108(HCM)的(S)-3-羟基丁酰CoA变位酶的异源表达产生克/升量的2-HIBA。

据报道，Hoefel等人(2010年，出处同上)试图利用聚羟基链烷酸酯(PHA)途径，经由三碳栖水菌L1083-羟基丁酰-CoA变位酶(HCM)在钩虫贪铜菌H16 PHB-4中的重组表达来产生2-HIBA，该钩虫贪铜菌是携带破坏细胞中PHA合酶活性的phaCl点突变的菌株。然而，在以果糖作为唯一碳源的分批补料发酵运行期间所得的大约80pmol g^-1 h^-1的2-HIBA生产率比在类似发酵条件下天然PHA生产率低大约6-10倍(由Przybylski等人综述，2013年，出处同上)。

随后报道，在体外酶测定中，三碳栖水菌3-羟基丁酰-CoA变位酶(HCM)特异性地催化(S)-3-羟基丁酰-CoA对映体向2-羟异丁酰-CoA的异构化(Yaneva等人，J Biol Chem.，2012年，第287卷第19期，第15502-15511页)。因此，三碳栖水菌HCM不太可能从利用(R)-3-羟基丁酰-CoA的PHA途径直接输送通量。相反，预测酶利用由中心代谢(经由乙酰-CoA和乙酰乙酰-CoA)或脂肪酸降解途径(图1)产生的(S)-3-羟丁酰-CoA库。这通过比较2-HIBA生产菌株在以果糖或丁酸酯作为主要碳源的分批补料发酵实验中的性能来确定(Przybylski等人，2013年，出处同上)。以丁酸酯作为碳源时2-HIBA生产率比以果糖作为碳源时高大约2倍，这与三碳栖水菌酶的S-对映特异性一致，因为丁酸酯经由脂肪酸β-氧化途径直接进料到(S)-3-羟基丁酰-CoA合成中。

与天然PHA途径相比，经由(S)-3-羟基丁酰-CoA的2-HIBA途径的较差性能由利用相同钩虫贪铜菌2-HIBA菌株的CO₂/H₂气体发酵实验示出(Przybylski等人，Appl MicrobiolBiotechnol.，2015年，第99卷第5期，第2131-2145页)。与PHA生产率＞1mM g^-1 h^-1相比，在发酵运行的营养限制阶段期间2-HIBA生产率的峰值为155pmol g^-1 h^-1。据报道，在1g/L及以上的2-HIBA浓度下观察到对2-HIBA合成的显著产物抑制(Przybylski等人，2015年，出处同上)。

自对三碳栖水菌HCM的开创性工作以来，已在托斯卡纳科鲁比蒂斯菌(Kyrpidiatusciae或K.tusciae)(Weichler等人，Appl Environ Microbiol.，2015年，第81卷第14期，第4564-4572页)和马赛塞内加尔芽孢杆菌(Bacillus massiliosenegalensis或B.massiliosenegalensis)(Rohde等人，2017年，出处同上)中鉴别出两种R-对映选择性3-羟基丁酰-CoA变位酶(RCM)。两种酶均成功地输送来自甲基营养型扭脱甲基杆菌AMI的PHA溢流代谢的通量，从而在分批补料发酵运行中产生超过43pmol g^-1h^-1的2-HIBA，其中甲醇被用作碳源(Rohde等人，2017年，出处同上)。

需要生物合成材料和方法，包括羟基脂肪酸阴离子诸如2-HIBA和/或其衍生物和/或与其相关的化合物的产量提高的生物体。

发明内容

本发明的一个方面涉及一种用于生物合成羟基脂肪酸阴离子诸如2-HIBA和/或其衍生物和/或与其相关的化合物的方法。在一个方面，该方法包括获得能够产生2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物的生物体，改变该生物体，以及与未改变的生物体相比，在改变的生物体中产生更多的2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物。

在本发明的一个非限制性实施方案中，生物体为钩虫贪铜菌或具有一种或多种与其相似的特性的生物体。在一个非限制性实施方案中，改变生物体以表达RCM或具有RCM活性的多肽。在一个非限制性实施方案中，RCM包括托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmA(SEQ ID NO：9)、托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmB(SEQ ID NO：11)、马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmA(SEQ ID NO：15)或马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmB(SEQ ID NO：17)或具有相似酶活性的表现出与SEQ IDNO：9、11、15或17所示氨基酸序列或其功能片段至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的多肽。在一个非限制性实施方案中，RCM由包括托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmA(SEQ ID NO：10)、托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmB(SEQ ID NO：12)、马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmA(SEQ ID NO：16)或马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmB(SEQ ID NO：18)的核酸序列编码，或由编码具有相似酶活性的多肽的表现出与SEQ ID NO：10、12、16或18所示核酸序列或其功能片段至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的核酸序列编码。

在一个非限制性实施方案中，进一步改变生物体以表达乙酰乙酰-CoA转移酶PhaA。在一个非限制性实施方案中，乙酰乙酰-CoA转移酶PhaA是钩虫贪铜菌乙酰乙酰-CoA转移酶phaA(SEQ ID NO：19)或具有相似酶活性的表现出与SEQ ID NO：19所示氨基酸序列至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的多肽。在一个非限制性实施方案中，乙酰乙酰-CoA转移酶PhaA由包括SEQ ID NO：20的核酸序列编码，或由编码具有相似酶活性的多肽的表现出与SEQ ID NO：20所示核酸序列或其功能片段至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的核酸序列编码。

在一个非限制性实施方案中，核酸序列针对钩虫贪铜菌进行了密码子优化。

在一个非限制性实施方案中，进一步改变生物体以去除PHA合酶活性。

本发明的另一方面涉及与未改变的生物体相比经改变以产生更多2-HIBA和/或其衍生物以及与其相关的化合物的生物体。在一个非限制性实施方案中，生物体为钩虫贪铜菌或具有与其相似的特性的生物体。在一个非限制性实施方案中，改变生物体以表达RCM。在一个非限制性实施方案中，RCM包括托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmA(SEQ ID NO：9)、托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmB(SEQ ID NO：11)、马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmA(SEQ ID NO：15)或马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmB(SEQ ID NO：17)，或具有相似酶活性的表现出与SEQ ID NO：9、11、15或17所示氨基酸序列或其功能片段至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的多肽。在一个非限制性实施方案中，RCM由包括托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmA(SEQ ID NO：10)、托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmB(SEQ ID NO：12)、马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmA(SEQ ID NO：16)或马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmB(SEQ ID NO：18)的核酸序列编码，或由编码具有相似酶活性的多肽的表现出与SEQ ID NO：10、12、16或18所示核酸序列或其功能片段至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的核酸序列编码。

在一个非限制性实施方案中，改变生物体以表达、过表达、不表达或表达较少的图1所描绘的一种或多种分子。在一个非限制性实施方案中，该分子包括具有相似酶活性的表现出与对应于图1所描绘分子的氨基酸序列或其功能片段至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的多肽。

本发明的另一方面涉及由本文所公开的方法和/或改变的生物体中的任一者产生的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的产物。此类产物包括：包含至少一种生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或它们的任何组合的组合物，以及包含这些生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物；生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂、塑料和/或橡胶，其包含生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物或它们的任何组合，或者生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或它们的任何组合；通过模制生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂、塑料或橡胶或它们的任何组合获得的模制物质；生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂，其包含生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物、聚合物或树脂、塑料或橡胶，或者生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的模制物质，或者它们的任何组合；以及生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的半固体或非半固体料流，其包含生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物、聚合物、树脂、塑料或橡胶、模制物质或制剂或它们的任何组合。

本发明的另一方面涉及根据图1所描绘的示例性中心代谢来生物合成的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的产物。

本发明的另一方面涉及本文所公开的改变的生物体的外源遗传分子。在一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含密码子优化的核酸序列。在一个非限制性实施方案中，核酸序列针对钩虫贪铜菌进行了密码子优化。在一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含：包括托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmA(SEQ ID NO：10)、托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmB(SEQID NO：12)、马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmA(SEQ ID NO：16)或马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmB(SEQ ID NO：18)的核酸序列，或编码具有相似酶活性的多肽的表现出与SEQ ID NO：10、12、16或18所示核酸序列或其功能片段至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的核酸序列。在一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含：包括钩虫贪铜菌乙酰乙酰-CoA转移酶phaA(SEQID NO：20)的核酸序列，或编码具有相似酶活性的多肽的表现出与SEQ ID NO：20所示核酸序列或其功能片段至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的核酸序列。外源遗传分子的另外的非限制性示例包括例如RCM和/或乙酰乙酰-CoA转移酶的表达构建体以及例如RCM和/或乙酰乙酰-CoA转移酶的合成的或非合成的分离操纵子或其片段。

本发明的又一个方面涉及用于生物合成2-HIBA和/或其衍生物和/或与其相关的化合物的手段(means)和用于使用这些手段生物合成2-HIBA和/或其衍生物和/或与其相关的化合物的方法。

附图说明

图1是经由(R)或(S)-3-羟基丁酰-CoA变位酶(分别为RCM或HCM)由中心代谢产生2-羟基异丁酸(2-HIBA)的示例性示意图。

图2示出了用于在钩虫贪铜菌中通过(S)-3-羟基丁酰-CoA或(R)-3-羟基丁酰-CoA-依赖性途径产生2-HIBA的遗传构建体。At.meaH表示三碳栖水菌meaB G-蛋白分子伴侣(AFK77667)(SEQ ID NO：1和2)；At.hcmA表示三碳栖水菌hcmA大HCM亚基(AFK77668)(SEQID NO：3和4)；At.hcmB表示三碳栖水菌hcmB小HCM亚基(AFK77665)(SEQ ID NO：5和6)；Cn.phaAl表示钩虫贪铜菌H16phaAl(WP_010810132)(SEQ ID NO：19和20)；Ca.hbd表示丙酮丁醇梭杆菌hbd(WP_010965995)(SEQ ID NO：23和24)；Cn.paaHl表示钩虫贪铜菌H16 paaHl(WP_010814882)(SEQ ID NO：21和22)；Kt.meaB表示托斯卡纳科鲁比蒂斯菌meaB G-蛋白分子伴侣(WP_013074529)(SEQ ID NO：7和8)；Kt.rcmA表示托斯卡纳科鲁比蒂斯菌rcmA大RCM亚基(WP_013074530)(SEQ ID NO：9和10)；Kt.rcmB表示托斯卡纳科鲁比蒂斯菌rcmB小RCM亚基(WP_013074531)(SEQ ID NO：11和12)；CnphaBl表示钩虫贪铜菌H16 phaBl(WP010810131)(SEQ ID NO：25和26)；Bm.meaB表示马赛塞内加尔芽孢杆菌meaB G-蛋白分子伴侣(WP_019152978)(SEQ ID NO：13和14)；Bm.rcmA表示马赛塞内加尔芽孢杆菌rcmA大ROM亚基(WP_019152977)(SEQ ID NO：15和16)；并且Bm.rcmB表示马赛塞内加尔芽孢杆菌rcmB小ROM亚基(WP_019152976)(SEQ ID NO：17和18)。

图3示出了在分批补料培养物中生长期间，由表达三碳栖水菌(S)-3-羟基丁酰-CoA变位酶或托斯卡纳科鲁比蒂斯菌/马赛塞内加尔芽孢杆菌(R)-3-羟基丁酰-CoA变位酶的钩虫贪铜菌菌株产生2-HIBA。在诱导时(T＝0小时)和诱导后11小时(T＝11小时)、37小时(T＝37小时)和61小时(T＝61小时)时，测量培养物上清液中的2-HIBA滴度。误差线表示平均值的标准偏差。EV，即空载体对照；AtHCM，即表达三碳栖水菌HCM的At.meaH-At.hcmA-At.hcmB ORFS；KtRCM，即表达托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RCM的Kt.meaB-Kt.rcmA-Kt.rcmBORFS；BmRCM，即表达马赛塞内加尔芽孢杆菌RCM的Bm.meaB-Bm.rcmA-Bm.rcmB ORFS；CnPhaA，即钩虫贪铜菌PhaAl；CnPaaHl，即钩虫贪铜菌(S)-3-羟基丁酰-CoA脱氢酶PaaHl；CaHbd，即丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(S)-3-羟基丁酰-CoA脱氢酶hbd；CnPhaB，即钩虫贪铜菌(R)-3-羟基丁酰-CoA脱氢酶phaBl。

图4是示出补加滴定系列的钴胺素类似物的钩虫贪铜菌菌株中2-HIBA产量的曲线图。

图5是示出补加0-0.1mg/L范围内的滴定系列的钴胺素类似物的钩虫贪铜菌菌株中2-HIBA产量的曲线图。

具体实施方式

本发明提供了用于生物合成羟基脂肪酸阴离子(包括2-羟基异丁酸(2-HIBA)和/或其衍生物和/或与其相关的化合物)的方法，以及经改变以增加2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物的生物合成的生物体以及与其相关的生物体、这些改变的生物体的外源遗传分子，以及通过这些方法和/或改变的生物体中的任一者生物合成或以其他方式产生的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的产物。

已公开(S)-3-羟基丁酰-CoA变位酶(HCM)将由脂肪酸的β氧化或由经由乙酰CoA和乙酰乙酰CoA的果糖代谢产生的(S)-3-羟基丁酰-CoA异构化为2-羟基丁酰-CoA。CoA部分随后被硫酯酶或CoA转移酶裂解以释放2-HIBA。本文的发明人现已发现，R-对映选择性3-羟基丁酰-CoA变位酶(RCM)经由聚羟基链烷酸酯途径的乙酰乙酰-CoA还原酶活性(phaB)提供至2-HIBA的更高通量途径(参见图1)。因此，经改变以表达RCM的生物体可根据本发明用于(特别是)生物合成更高水平的2-HIBA和与其相关的化合物的方法中。

R/S 3-羟基丁酰-CoA变位酶(E.C.5.4.99.64)是使用由维生素B₁₂辅因子生成的高反应性自由基来催化酰基-CoA酯底物的羧酸骨架的1，2重排的更广泛的酰基-CoA变位酶家族的成员(综述于Takahashi-Ifiiguez等人，Science B，2012年，第13卷，第6期，第423-437页)。酰基-CoA变位酶由具有单独的底物结合结构域和维生素B12结合结构域的全酶组成，这些结构域按多种拓扑构型与meaB/meaH家族的G-蛋白分子伴侣排列。对于3-羟基丁酰-CoA变位酶，通过较大底物结合亚基和较小维生素B12结合亚基的异源二聚化形成全酶，其中MeaB分子伴侣形成由2个全酶和1个meaB分子组成的较大复合物(Campanello等人，Journal of Biological Chemistry，2017年，第292卷，第17617-17625页)。meaB/meaH分子伴侣通过门控维生素B₁₂ 5′-脱氧腺苷钴胺素(AdoCbl)辅因子插入全酶中以及当AdoCbl辅因子因催化循环期间5′-脱氧腺苷部分的偶然损失而失活时酶的再活化来执行看家功能。

出于本发明的目的，所谓“2-羟基异丁酸(2-HIBA)及其衍生物和与其相关的化合物”意指涵盖2-羟基丁酸酯、2-羟基-2-甲基丙酸、2-甲基乳酸、2-羟基丁酸酯和α-羟基丁酸酯，以及衍生自与2-HIBA相同的底物和/或酶促反应并且具有相似化学结构的化合物，以及其中2-HIBA的一个或多个取代基被另选的取代基替代的结构类似物。

出于本发明的目的，所谓“更高水平的2-HIBA”意指与异源表达HCM或RCM的生物体和/或未改变的相同生物体相比，本发明的改变的生物体和方法能够产生增加水平的2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物。在一个非限制性实施方案中，水平增加2倍或更高。

对于含有羧酸基团的化合物诸如有机一元酸、羟基酸、氨基酸和二元羧酸，当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子替代时，或与有机碱配位时，这些化合物可形成或转变成它们的离子盐形式。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠和/或碳酸氢钠、氢氧化钠、氨等。盐可按原样作为盐从体系中分离，或通过加入酸或用酸性离子交换树脂处理，将pH降低至例如低于最低pKa，而转变成游离酸。

对于含有胺基团的化合物，诸如但不限于有机胺、氨基酸和二胺，这些化合物可通过将酸性质子加成到胺以形成铵盐而形成或转变成它们的离子盐形式，该铵盐是与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成的；或与有机酸诸如碳酸、乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、4，4′-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸或粘康酸等形成的。盐可按原样作为盐从体系中分离，或通过加入碱或用碱性离子交换树脂处理，将pH升高至例如高于最高pKa，而转变成游离胺。可接受的无机碱是本领域中已知的并包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠、氢氧化钠等。

对于含有胺基团和羧酸基团两者的化合物诸如但不限于氨基酸，这些化合物可通过下列方式形成或转化成它们的离子盐形式：1)酸加成盐，该酸加成盐是与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成的；或与有机酸诸如碳酸、乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、4，4′-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等形成的。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠和/或碳酸氢钠、氢氧化钠等，或2)当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子替代时；或与有机碱配位时。可接受的有机碱是本领域中已知的，并且包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三甲胺、N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱是本领域中已知的，并且包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠、氨等。盐可按原样从体系中分离，或通过加入酸或用酸性离子交换树脂处理，将pH降低至例如低于pKa，而转变成游离酸。在本发明的一个或多个方面，应当理解，氨基酸盐可分离为：i.在低pH下，不含铵(盐)的酸形式；ii在高pH下，胺-羧酸盐形式；和/或iii.在中性或中范围pH下，游离胺酸形式或两性离子形式。

在本发明的用于生物合成2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物的方法中，获得能够产生2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物的生物体。然后改变生物体以与未改变的生物体相比，在改变的生物体中产生更多的2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物。

在一个非限制性实施方案中，生物体为钩虫贪铜菌或具有与其相似的特性的生物体。生物体的非限制性实施方案在lgcstandards-atcc处示出，其万维网扩展为.org/products/all/17699.aspx？geo_country＝gb#generalinformation。

钩虫贪铜菌(先前被称为真养氢单胞菌(Hydrogenomonas eutrophus)、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutropha)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)和富养沃特氏菌(Wautersia eutropha))是β-变形菌类的革兰氏阴性鞭毛土壤细菌。这种氢氧化细菌能够在无氧环境和有氧环境的界面处生长，并且容易在异养生活方式和自养生活方式之间适应。该细菌的能量来源包括有机化合物和氢两者。钩虫贪铜菌天然不含RCM的基因，因此不表达该酶。钩虫贪铜菌的另外的特性包括微需氧性、抗铜性(Makar N.S.和Casida L.E.，Int.J.of Systematic Bacteriology，1987年，第37卷第4期，第323-326页)、细菌掠食(Makar N.S.和Casida L.E.，Int.J.of Systematic Bacteriology，1987年，第37卷第4期，第323-326页)、细菌掠食(Byrd等人，Can J Microbiol，1985年，第31卷，第1157-1163页；Sillman C.E.和Casida L.E.，Can J Microbiol，1986年，第32卷，第760-762页；Zeph L.E.和Casida L.E.，Applied and Environmental Microbiology，1986年，第52卷第4期，第819-823页)和聚羟基丁酸酯(PHB)合成。此外，已报道这些细胞能够进行有氧生长和硝酸盐依赖型厌氧生长。可用于本发明的钩虫贪铜菌生物体的非限制性示例是钩虫贪铜菌H16菌株。在一个非限制性实施方案中，使用钩虫贪铜菌H16菌株的宿主，其中phaClABl基因座的至少一部分被敲除(AphaCAB)，如美国专利申请序列号15/717,216中所述，该美国专利申请的教导内容以引用方式并入本文。

在另一个非限制性实施方案中，在本发明的方法中改变的生物体具有以上提及的钩虫贪铜菌特性中的一种或多种特性。

在另一个非限制性实施方案中，生物体选自罗尔斯通菌属(Ralstonia)、沃特氏菌属(Wautersia)、贪铜菌属(Cupriavidus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、伯克氏菌属(Burkholderia)或潘多拉菌属(Pandoraea)的非致病性成员。

对于本发明的方法，改变生物体以表达RCM。

在一个非限制性实施方案中，RCM包括托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmA(SEQ ID NO：9)、托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmB(SEQ ID NO：11)、马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmA(SEQ ID NO：15)或马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmB(SEQ ID NO：17)，或具有相似酶活性的表现出与SEQ IDNO：9、11、15或17所示氨基酸序列或其功能片段至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的多肽。

在一个非限制性实施方案中，RCM由包括托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmA(SEQ ID NO：10)、托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmB(SEQ ID NO：12)、马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmA(SEQ IDNO：16)或马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmB(SEQ ID NO：18)的核酸序列编码，或由编码具有相似酶活性的多肽的表现出与SEQ ID NO：10、12、16或18所示核酸序列或其功能片段至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的核酸序列编码。

在一个非限制性实施方案中，RCM被归类在E.C.5.4.99.64中。

在一个非限制性实施方案中，phaA被归类在E.C.2.3.1.9或E.C.2.3.1.16中。

在一个非限制性实施方案中，一条或多条核酸序列针对钩虫贪铜菌进行了密码子优化。

在本发明的方法中，然后使改变的生物体经受其中产生2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物的条件。

在本文所述的方法中，可使用需要厌氧、微氧或有氧培养的发酵策略。发酵策略可能需要营养限制，诸如氮限制或磷酸盐限制或氧限制。

在营养限制的条件下，在许多细菌中发生被称为溢流代谢(也被称为能量溢出、解耦或外溢)的现象(Russell，2007年)。在其中碳源相对过量并且其他营养物质(例如磷、氮和/或氧)正在抑制细胞生长的生长条件下，溢流代谢导致该过剩能量(或碳)不用于生物质形成，而是用于代谢物(通常为有机酸)的排泄。在钩虫贪铜菌中，发生溢流代谢的修改形式，其中过量的碳在细胞内沉入贮藏碳水化物聚羟基丁酸酯(PHB)中。在缺乏PHB合成的钩虫贪铜菌菌株中，这种溢流代谢可导致产生细胞外溢流代谢物。已在PHB缺陷型钩虫贪铜菌菌株中检测到的代谢物的范围包括乙酸盐、丙酮、丁酸盐、顺乌头酸盐、柠檬酸盐、乙醇、延胡索酸盐、3-羟基丁酸盐、丙-2-醇、苹果酸盐、甲醇、2-甲基-丙酸盐、2-甲基-丁酸盐、3-甲基-丁酸盐、2-氧戊二酸盐、内消旋-2,3-丁二醇、乙偶姻、DL-2，3-丁二醇、2-甲基丙-1-醇、丙-1-醇、乳酸盐、2-氧代-3-甲基丁酸盐、2-氧代-3-甲基戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、甲酸和丙酮酸盐。在特定发酵中产生的溢流代谢物的范围可取决于所应用的限制(例如氮、磷酸盐、氧)、限制的程度和所提供的碳源(Schlegel H.G.和Vollbrecht D.，Journal ofGeneral Microbiology，1980年，第117卷，第475-481页；Steinbiichel A.和SchlegelH.G.，Appl Microbiol Biotechnol，1989年，第31卷，第168页；Vollbrecht等人，Eur JAppl Microbiol Biotechnol，1978年，第6卷，第145-155页；Vollbrecht等人，EuropeanJ.Appl.Microbiol.Biotechnol.，1979年，第7卷，第267页；Vollbrecht D.和SchlegelH.G.，European J.Appl.Microbiol.Biotechnol.，1978年，第6卷，第157页；Vollbrecht D.和Schlegel H.G.，European J.Appl.Microbiol.Biotechnol.，1979年，第7卷，第259页)。

因此，在限定的发酵条件下应用合适的营养限制可导致通过特定代谢节点的通量增大。将该知识应用于经基因修饰以经由相同代谢节点产生期望化学产物的钩虫贪铜菌菌株可导致期望产物的产量增加。

使用陶瓷中空纤维膜的细胞保留策略可用于在发酵期间实现和维持高细胞密度。补加至发酵的主要碳源可来源于生物原料或非生物原料。生物原料可为或可来源于单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、三甘油酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩酒糟或城市垃圾。非生物原料可为或可来源于天然气、合成气、CO₂/H₂、甲醇、乙醇、非挥发性残余物(NVR)、来自环己烷氧化过程的碱洗废物流或来自化学工业诸如但不限于炭黑工业或氢精炼工业或石油化学工业的废物流。

在一个非限制性实施方案中，2-HIBA生产方法的酶转化中的至少一种酶转化包括在重组钩虫贪铜菌宿主，或罗尔斯通菌属、沃特氏菌属、产碱杆菌属、伯克氏菌属和潘多拉菌属的成员，以及具有上文提及的钩虫贪铜菌特性中的一种或多种特性的其他重组生物体内的气体发酵。在一个非限制性实施方案中，气体发酵可包括以下中的至少一者：天然气、合成气、CO₂/H₂、CO、H₂、O₂、甲醇、乙醇、非挥发性残余物、来自环己烷氧化过程的碱洗或来自化学工业诸如但不限于炭黑工业或氢精炼工业或石油化学工业的废物流。在一个非限制性实施方案中，气体发酵包括CO、H₂、CO₂、O₂或CO₂/H₂。

在一个非限制性实施方案中，条件包括以果糖作为主要碳源，或在一些情况下作为唯一碳源的分批发酵运行。

本发明的方法还可包括回收所产生的羟基脂肪酸阴离子，诸如2-HIBA或其衍生物或与其相关的化合物。一旦产生，可使用任何方法将2-HIBA或与其相关的化合物分离。

本发明也提供改变的生物体，与未改变的生物体相比，该改变的生物体能够生物合成增加量的羟基脂肪酸阴离子如2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物。在一个非限制性实施方案中，本发明的改变的生物体是经遗传工程改造的能够产生2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物的钩虫贪铜菌菌株。在另一个非限制性实施方案中，要改变的生物体选自罗尔斯通菌属、沃特氏菌属、产碱杆菌属、贪铜菌属、伯克氏菌属和潘多拉菌属的非致病性成员，以及具有上文提及的钩虫贪铜菌特性中的一种或多种特性的其他生物体。在一个非限制性实施方案中，本发明涉及能够经由RCM途径产生2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物的改变的生物体的基本上纯的培养物。

如本文所用，改变的生物体的“基本上纯的培养物”是该微生物的培养物，其中培养物中活细胞总数量的小于约40％(即，小于约35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.5％、0.25％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％或甚至更少)是除改变的微生物之外的活细胞，例如细菌、真菌(包括酵母)、支原体或原生动物细胞。在该上下文中，术语“约”意指相关百分比可为高于或低于指定百分比的15％的指定百分比。因此，例如，约20％可为17％至23％。此类改变的微生物的培养物包括细胞和生长、贮藏或运输培养基。培养基可为液体、半固体(例如，凝胶状培养基)或冷冻的。培养物包括在液体中或在半固体培养基中/上生长或者在贮藏或运输培养基(包括冷冻贮藏或运输培养基)中贮藏或运输的细胞。培养物位于培养容器或贮藏容器或底物(例如培养皿、烧瓶或管或贮藏小瓶或管)中。

本发明的改变的生物体包含至少一个编码酶的基因组整合的合成操纵子。

在一个非限制性实施方案中，通过将编码RCM的合成操纵子整合到宿主基因组中来产生改变的生物体。

在一个非限制性实施方案中，改变的生物体通过整合包含SEQ ID NO：10、12、16或18的合成操纵子产生。

在一个非限制性实施方案中，改变的生物体还包含具有SEQ ID NO：20的合成操纵子。

如本文所公开的两条氨基酸序列之间的百分比同一性(和/或同源性)可如下测定。首先，使用来自含有BLASTP版本2.0.14的BLAST独立版本的BLAST 2序列(Bl2seq)程序对氨基酸序列进行比对。该BLAST独立版本可获自美国政府的国家生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)。解释如何使用B12seq程序的说明可见于BLASTZ附带的readme文件中。B12seq使用BLASTP算法在两条氨基酸序列之间进行比较。为了比较两条氨基酸序列，B12seq的选项设置如下：-i设为含有要比较的第一氨基酸序列的文件(例如，C：\seq1.txt)；-j设为含有要比较的第二氨基酸序列的文件(例如C：\seq2.txt)；-p设为blastp；-o设为任何期望的文件名(例如，C：\output.txt)；并且所有其他选项都设为其默认设置。例如，以下命令可用于生成含有两条氨基酸序列之间的比较的输出文件：C：\B12seq-i c：\seq1.txt-j c：\seq2.txt-p blastp-o c：\output.txt。如果两条比较的序列具有同源性(同一性)，则指定的输出文件会以经比对序列的形式呈现那些同源性区域。如果两条比较的序列不具有同源性(同一性)，则指定的输出文件不会呈现经比对的序列。对于核酸序列可遵循类似的程序，不同的是使用biastn。

一旦进行了比对，就通过对两条序列中都存在的相同氨基酸残基的位置的数目进行计数来确定匹配数目。同一性(同源性)百分比通过将匹配数目除以全长多肽氨基酸序列的长度，然后将所得值乘以100来确定。需注意，同一性(同源性)百分比值四舍五入至最接近的小数点后第一位。例如，90.11、90.12、90.13和90.14向下舍入至90.1，而90.15、90.16、90.17、90.18和90.19向上舍入至90.2。还需注意，长度值始终为整数。

应当理解，多种核酸可编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性是本领域熟知的；即，对于许多氨基酸，存在多于一个核苷酸三联体用作氨基酸的密码子。例如，可修饰给定酶的编码序列中的密码子，使得使用该物种的适当密码子偏倚表在特定物种(例如细菌或真菌)中获得最佳表达。

本文所述的多肽或核酸序列中的任一者的功能片段也可用于本文所公开的方法和生物体中。如本文所用，术语“功能片段”是指多肽的肽或片段或者编码多肽的肽片段的核酸序列片段，其具有对应成熟、全长多肽的至少约25％(例如，至少：30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、100％或甚至大于100％)的活性。功能片段通常可(但不总是)由多肽的连续区域构成，其中该区域具有功能活性。

功能片段的长度可在初始全长序列的约10％至最多99％的范围内(包括其间的所有百分比)。

本文档还提供(i)在本文档的方法中使用的酶的功能变体和(ii)上述功能片段的功能变体。酶和功能片段的功能变体可含有相对于相应野生型序列的添加、缺失或置换。具有置换的酶通常将具有不超过50个(例如不超过一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、12个、15个、20个、25个、30个、35个、40个或50个)氨基酸置换(例如保守置换)。这适用于本文所述的酶和功能片段中的任一者。保守置换是一个氨基酸被另一个具有相似特征的氨基酸置换。保守置换包括下列组内的置换：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。可以认为上文提及的极性、碱性或酸性基团中的一个成员被同一组中的另一个成员的任何置换是保守置换。相比之下，非保守置换是一个氨基酸被另一个具有相异特征的氨基酸置换。

缺失变体可缺乏(两个或更多个氨基酸的)一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸片段或不连续的单个氨基酸。添加(添加变体)包括融合蛋白，该融合蛋白含有：(a)本文所述的酶或其片段中的任一者；和(b)内部或末端(C或N)不相关或异源氨基酸序列。在此类融合蛋白的上下文中，术语“异源氨基酸序列”是指除(a)之外的氨基酸序列。异源序列可以是例如用于纯化重组蛋白的序列(例如FLAG、多组氨酸(例如六组氨酸)、血凝素(hemagluttanin，HA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或麦芽糖结合蛋白(MBP))。异源序列也可以是用作可检测标记物的蛋白，例如荧光素酶、绿荧光蛋白(GFP)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。在一些实施方案中，融合蛋白含有来自另一种蛋白的信号序列。在某些宿主细胞(例如酵母宿主细胞)中，可通过使用异源信号序列来增加目标蛋白的表达和/或分泌。在一些实施方案中，融合蛋白可含有可用于例如引发用于抗体生成的免疫应答的载体(例如KLH)或ER或高尔基体保留信号。异源序列可具有不同的长度，并且在一些情况下可为比异源序列所附接的全长目标蛋白更长的序列。

也可破坏为了在本发明中使用而改变的生物体的内源性基因，以防止不期望的代谢物形成或防止中间体通过作用于此类中间体的其他酶而在途径中损失。在一个实施方案中，进一步改变用于本发明的生物体以去除PHA合酶活性。

因此，如本文所述，改变的生物体可包括如本文所述的编码RCM的外源核酸，以及对内源性基因的修饰。

如本文所用，关于核酸(或蛋白)和生物体的术语“外源”是指并不会像自然界中存在的那样存在于该特定类型的细胞中(并且无法从其中获得)的核酸或由此类核酸编码的蛋白。因此，一旦非天然存在的核酸被生物体或宿主利用或用于生物体或宿主中，就认为非天然存在的核酸对于生物体或宿主而言是外源的。重要的是需注意，非天然存在的核酸可含有存在于自然界中的核酸亚序列或核酸序列的片段，前提是该核酸就整体而论不存在于自然界中。例如，在表达载体内含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，因此在被引入宿主中之后对于宿主细胞而言是外源的，因为核酸分子就整体而论(基因组DNA加上载体DNA)不存在于自然界中。因此，认为就整体而论不存在于自然界中的任何载体、自主复制质粒或病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)是非天然存在的核酸。因此，认为通过PCR或限制性内切核酸酶处理产生的基因组DNA片段以及cDNA是非天然存在的核酸，因为它们作为不存在于自然界中的单独分子存在。因此，任何含有在自然界中不存在的排列的启动子序列和多肽编码序列(例如cDNA或基因组DNA)的核酸是非天然存在的核酸。天然存在的核酸对于特定宿主微生物而言可以是外源的。例如，一旦将从酵母x的细胞分离的整条染色体引入酵母y的细胞中，该染色体就是相对于酵母y的细胞的外源核酸。

相比之下，如本文所用，关于核酸(例如，基因)(或蛋白)和宿主的术语“内源性的”是指会像自然界中存在的那样存在于该特定宿主中(并且可从其中获得)的核酸(或蛋白)。此外，“内源性表达”核酸(或蛋白)的细胞会像自然界中存在的相同特定类型的宿主那样表达该核酸(或蛋白)。此外，“内源性产生”或“内源性生产”核酸、蛋白或其他化合物的宿主会像自然界中存在的相同特定类型的宿主那样产生该核酸、蛋白或化合物。

本发明还提供了本文所公开的非天然存在的生物体的外源遗传分子，诸如但不限于密码子优化的核酸序列、表达构建体和/或合成操纵子。

在一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含针对钩虫贪铜菌优化的密码子优化的核酸序列。在一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含：包括托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmA(SEQ ID NO：10)、托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmB(SEQ ID NO：12)、马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmA(SEQ ID NO：16)或马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmB(SEQ ID NO：18)的核酸序列，或编码具有相似酶活性的多肽的表现出与SEQ ID NO：10、12、16或18所示核酸序列或其功能片段至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的核酸序列。在一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含：包括钩虫贪铜菌乙酰乙酰-CoA转移酶phaA(SEQ ID NO：20)的核酸序列，或编码具有相似酶活性的多肽的表现出与SEQ ID NO：20所示核酸序列或其功能片段至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的核酸序列。

在另一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含ROM表达构建体。

在另一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含编码ROM和/或乙酰乙酰-CoA转移酶PhaAl的合成操纵子。

本发明还提供了根据本文所述的方法中的任一种方法从改变的生物体中生物衍生的2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物。

此外，本发明涉及用于生物合成2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物的手段和用于使用这些手段生物合成2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物的方法。此类手段的非限制性示例包括如本文所述的改变的生物体和外源遗传分子以及如图1所描绘的分子中的任何分子。

此外，本发明提供了使用本文所公开的方法和/或改变的生物体产生的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的产物。在一个非限制性实施方案中，根据图1所描绘的示例性中心代谢产生生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的产物。此类产物的示例包括但不限于：包含至少一种生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或它们的任何组合的组合物，以及包含生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或组合物、它们的组合或产物中的一者或多者的聚合物、树脂、塑料和橡胶、模制物质、制剂和半固体或非半固体料流。

对比先前表征的三碳栖水菌HCM酶评估RCM在经遗传工程改造的钩虫贪铜菌菌株中增加2-HIBA生物合成的效用。为了去除PHA合酶活性，创建了引入整个phaClABl操纵子或仅phCl ORF的缺失的两个钩虫贪铜菌H16基础菌株。虽然两个菌株均缺乏PHA合成，但是AphaCl菌株保留了在钩虫贪铜菌内编码(R)-3-羟基丁酰-CoA脱氢酶活性的一整套基因(phaB1、phaB2和phaB3)，而AphaClABl缺失去除最大量表达的(R)-3-羟基丁酰-CoA脱氢酶基因phaBl。因此，预期AphaCl菌株最大化托斯卡纳科鲁比蒂斯菌和马赛塞内加尔芽孢杆菌RCM酶的通量，而预期AphaClABl菌株通过减少(R)-3-羟基丁酰-CoA副产物形成引导更多通量通过HCM-依赖性途径。

为了在钩虫贪铜菌中在RCM-依赖性途径和HCM-依赖性途径之间进行直接比较，组装了一系列阿拉伯糖诱导型表达构建体，该一系列阿拉伯糖诱导型表达构建体编码所测试的3-羟基丁酰-变位酶的各两个亚基和它们各自的meaB G-蛋白分子伴侣。将合成操纵子克隆到基于pBBR1的质粒中。除了这些表达核心(R/S)-3-羟基丁酰-CoA变位酶活性的基本构建体之外，还装配了较大的操纵子，该较大的操纵子也表达钩虫贪铜菌乙酰乙酰-CoA转移酶phaA以及(S)或(R)-3-羟基丁酰-CoA脱氢酶以最大化HCM/RCM底物可用性(图2)。通过电穿孔将所有7个HCM/RCM表达构建体引入AphaCl钩虫贪铜菌菌株中。也将3个HCM构建体引入AphaClABl敲除菌株中，以实现直接比较两种钩虫贪铜菌遗传背景并确定是否可通过phaBl的缺失而将更多通量引导通过HCM-依赖性途径。

在以果糖作为唯一碳源的分批补料发酵运行期间评估十个钩虫贪铜菌菌株。维生素B12以0.1g/L的浓度添加。将菌株以分批模式培养12小时，然后通过添加0.3％w/v阿拉伯糖诱导HCM/RCM操纵子表达，并将菌株以分批补料模式运行大约36小时。然后关闭培养基进料，并将菌株在饥饿条件下再培养24小时。在分批补料阶段的最后，在阿拉伯糖诱导37小时后观察到最大2-HIBA滴度，其中与HCM构建体的大约0.5g/L的峰值滴度相比，四个RCM菌株产生1.5g/L至2.7g/L的2-HIBA(图3)。该比较表明，可在钩虫贪铜菌中通过RCM依赖性途径实现更高的2-HIBA滴度，并因此实现更高的生产率。在发酵运行的培养基饥饿阶段期间，观察到RCM菌株的2-HIBA水平显著降低，并且在无培养基补充的情况下培养24小时后，所有四个菌株的最终滴度均低于0.3g/L。

这与沿相反方向操作的RCM-依赖性途径一致，以使得一旦优选的碳源果糖被耗尽，钩虫贪铜菌就能够利用2-HIBA作为碳源。

以下部分提供了本发明的方法和材料的进一步说明。这些实施例仅是说明性的，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。

实施例

构建并测试一系列产生2-羟基异丁酸的钩虫贪铜菌菌株，该钩虫贪铜菌菌株表达来自三碳栖水菌L108的(S)-3-羟基丁酰-CoA变位酶(HCM)或来自托斯卡纳科鲁比蒂斯菌或马赛塞内加尔芽孢杆菌的(R)-3-羟基丁酰-CoA变位酶(RCM)。

基因选择和RCM/HCM表达载体构建

对于所测试的每种(R/S)-3-羟基异丁酰-CoA变位酶，由编码酶特异性MeaB/MeaHG-蛋白分子伴侣以及CoA变位酶本身的大亚基和小亚基的单独合成基因装配表达构建体。为了最大化底物可用性，还装配了较大的合成操纵子，该较大的合成操纵子共表达钩虫贪铜菌乙酰乙酰CoA转移酶PhaA以及分别针对R-和S-对映特异性CoA变位酶的钩虫贪铜菌(R)-3-羟基丁酰-CoA脱氢酶PhaBl或两种(S)-3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(钩虫贪铜菌PaaHl和丙酮丁醇梭菌Hbd)中的一种(S)-3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(图2)。所有合成基因均经密码子优化以在钩虫贪铜菌中表达。所有载体均通过标准克隆技术装配，诸如例如Green和Sambrook，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，2014年11月18日中所述。

构建表达(R/S)-3-羟基丁酰-CoA变位酶的产生2-HIBA的钩虫贪铜菌菌株

通过电穿孔将完整的RCM/HCM表达载体系列转化到钩虫贪铜菌H16AphaCl敲除菌株中来创建十个2-HIBA测试菌株，并将完整的RCM/HCM表达载体系列转化到钩虫贪铜菌H16AphaClABl敲除菌株中来创建三个三碳栖水菌HCM构建体。在具有适当抗生素的TSB琼脂板上选择转化体。

产生2-HIBA的钩虫贪铜菌菌株的分批补料发酵

种子扩增

首先将培养物温育过夜，然后继代培养并且再温育16小时。这些被用作发酵分批补料培养的直接种菌。

发酵

使用Sartorious Ambrl5F平台在分批补料操作模式中筛选2-HIBA生产菌株。该系统允许控制多个变量，诸如溶解氧和pH。每个容器(总体积为15mL)装载有8mL的分批生长培养基，该分批生长培养基包括0.1g/L维生素B12。将初始搅拌设定为1500rpm，将pH控制在6.6并且以0.1mL/min充气。通常，将以下工艺条件标准化并按照制造商的说明书运行。

直接由种子扩增物(如上所述)将容器接种以得到0.2的最终起始OD₆₀₀(通常1％vv转移)。让培养物以分批模式生长大约12小时，这将总是与80-90％的DO相符。此时，用以0.3％w/v的最终浓度添加的阿拉伯糖诱导培养物，并且通过以1.5μL/min的速率连续添加补料培养基(包括0.1g/L维生素B12)36小时来引发发酵的分批补料阶段。在无培养基补充的情况下继续再发酵24小时，以评估产生2-HIBA的碳限制效应。为了测量发酵培养基中的2-HIBA聚积，在发酵实验期间周期性地采集500μL培养物样品，以与诱导的生长阶段(接种后12小时)、诱导后12小时(接种后24小时)、进料结束(接种后48小时)和运行结束(72小时)大概相符。

用于分析的样品制备

使用液相色谱-质谱(LC-MS)定量来自培养物样品的细胞外2-HIBA。样品体积为500μl，其中，100μl用于OD₆₀₀测定，并400μL经处理后用于分析。将液体培养基样品离心，并且取决于预期的分析物浓度，将所得的上清液在90％LC-MS级乙腈/10％LC-MS级水中稀释介于10至1000之间的倍数。

通过LC-MS测量2-羟基异丁酸酯

使用美国加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦科技公司(Agilent Technologies(Santa Clara，CA，USA))1290系列Infinity HPLC系统偶联Agilent 6530系列Q-TOF质谱仪进行LC-MS。使用BEH Amide UPLC柱：2.1mm直径×50mm长度×1.7pm粒度(美国马萨诸塞州米尔福德市的沃特世公司(Waters，Milford，MA，USA))，按照制造商的说明书进行。

外标曲线用于定量。在基质匹配溶液(通常为空白培养基，其在乙腈中稀释至与样品相同的水平)中构建0.01pg/mL、0.02pg/mL、0.05pg/mL、0.1pg/mL、0.2pg/mL、0.5pg/mL、1pg/mL、2pg/mL、5pg/mL和10pg/mL的校准水平。使用Agilent MassHunter定量分析软件，通过对照校准曲线内推样品响应来确定浓度。

不同维生素B12类似物的滴定系列

构建表达马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmA(SEQ ID NO：15)、马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmB(SEQ ID NO：17)和马赛塞内加尔芽孢杆菌MeaB(SEQ ID NO：13)的钩虫贪铜菌H16 ΔA0006-9 AphaCl菌株。基因经密码子优化以在钩虫贪铜菌中表达。

用该菌株的独立质粒转化体建立预培养物(10mL TSB，300pg/mL卡那霉素)并在30℃、230rpm下温育，直至达到稳定期(OD₆₀₀＞1.5AU)。

通过以3220g离心15分钟使来自每种预培养物的细胞沉淀，重悬于1mL分批生长培养基中，然后用于接种补充有300pg/L卡那霉素的50mL分批生长培养基。在用0.3％(w/v)的L-阿拉伯糖溶液诱导RCM表达之前，将培养物在30℃、230rpm下温育至OD₆₀₀～0.6-0.7。将钴胺素(维生素B12)类似物(氰钴胺素，CN/Cbl；腺苷钴胺素，Ad-Cbl；甲基钴胺素，Me-Cbl；羟钴胺素，OH-Cbl；二氰钴胺素，diCN-Cbl)以相关量添加到培养物中，以使钴胺素(维生素B12)类似物的最终浓度为0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、10mg/L和25mg/L。将培养物在30℃、230rpm下再温育38-40小时。

通过以≈21,000g离心30分钟使500μL培养物样品澄清并用于如实施例“通过LC-MS测量2-羟基异丁酸酯”中所述的2-羟基异丁酸酯LC-MS分析。

下表1中的值表示2-HIBA浓度，单位为ppm(即，mg/L)。

表1

该滴定系列的结果描绘于图4和图5中，并且显示在钴胺素(维生素B12)浓度为约0.1-0.5ppm的情况下，菌株显示2-HIBA/OD₆₀₀的最佳产率。较高浓度的钴胺素(维生素B12)不提高反应的产率。这表明在0.1mg/L和0.5mg/L之间达到维生素B12的限制浓度。

序列表中序列的序列信息

表2

Claims

1.一种用于生物合成2-HIBA和/或其衍生物和/或与其相关的化合物的方法，所述方法包括：

获得能够产生2-HIBA、其衍生物和/或与其相关的化合物的生物体；

改变所述生物体；以及

与未改变的生物体相比，通过所述改变的生物体产生更多的2-HIBA和/或其衍生物和/或与其相关的化合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物体为钩虫贪铜菌(C.necator)或具有与其相似的特性的生物体。

3.根据权利要求1所述的方法，其中改变所述生物体以表达R-对映选择性3-羟基丁酰CoA变位酶(RCM)。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述RCM包括托斯卡纳科鲁比蒂斯菌(K.tusciae)RcmA(SEQ ID NO：9)、托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmB(SEQ ID NO：11)、马赛塞内加尔芽孢杆菌(B.massiliosenegalensis)RcmA(SEQ ID NO：15)或马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmB(SEQ IDNO：17)，或具有相似酶活性的表现出与SEQ ID NO：9、11、15或17所示氨基酸序列或其功能片段至少约50％的序列同一性的多肽。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述RCM由包括托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmA(SEQID NO：10)、托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmB(SEQ ID NO：12)、马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmA(SEQID NO：16)或马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmB(SEQ ID NO：18)的核酸序列编码，或由编码具有相似酶活性的多肽的表现出与SEQ ID NO：10、12、16或18所示的所述核酸序列或其功能片段至少约50％的序列同一性的核酸序列编码。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中进一步改变所述生物体以表达乙酰乙酰-CoA转移酶PhaA。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述乙酰乙酰-CoA转移酶PhaA是钩虫贪铜菌乙酰乙酰-CoA转移酶PhaA(SEQ ID NO：19)或具有相似酶活性的表现出与SEQ ID NO：19所示氨基酸序列至少50％的序列同一性的多肽。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述乙酰乙酰-CoA转移酶PhaA由包括SEQ ID NO：20的核酸序列编码，或由编码具有相似酶活性的多肽的表现出与SEQ ID NO：20所示的所述核酸序列或其功能片段至少约50％的序列同一性的核酸序列编码。

9.根据权利要求5或8所述的方法，其中所述核酸序列针对钩虫贪铜菌进行了密码子优化。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中进一步改变所述生物体以去除PHA合酶活性。

11.一种与未改变的生物体相比能够产生更多2-HIBA的改变的生物体。

12.根据权利要求11所述的改变的生物体，所述改变的生物体为钩虫贪铜菌或具有与其相似的特性的生物体。

13.根据权利要求11所述的改变的生物体，所述改变的生物体表达RCM。

14.根据权利要求13所述的改变的生物体，其中所述RCM包括托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmA(SEQ ID NO：9)、托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmB(SEQ ID NO：11)、马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmA(SEQ ID NO：15)或马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmB(SEQ ID NO：17)，或具有相似酶活性的表现出与SEQ ID NO：9、11、15或17所示氨基酸序列或其功能片段至少约50％的序列同一性的多肽。

15.根据权利要求13所述的改变的生物体，其中所述RCM由包括托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmA(SEQ ID NO：10)、托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmB(SEQ ID NO：12)、马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmA(SEQ ID NO：16)或马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmB(SEQ ID NO：18)的核酸序列编码，或由编码具有相似酶活性的多肽的表现出与SEQ ID NO：10、12、16或18所示的所述核酸序列或其功能片段至少约50％的序列同一性的核酸序列编码。

16.根据权利要求11至15中任一项所述的改变的生物体，其中进一步改变所述生物体以表达乙酰乙酰-CoA转移酶PhaA。

17.根据权利要求16所述的改变的生物体，其中所述乙酰乙酰-CoA转移酶PhaA是钩虫贪铜菌乙酰乙酰-CoA转移酶PhaA(SEQ ID NO：19)或具有相似酶活性的表现出与SEQ IDNO：19所示氨基酸序列至少约50％的序列同一性的多肽。

18.根据权利要求16所述的改变的生物体，其中所述乙酰乙酰-CoA转移酶PhaA由包括SEQ ID NO：20的核酸序列编码，或由编码具有相似酶活性的多肽的表现出与SEQ ID NO：20所示的所述核酸序列或其功能片段至少约50％的序列同一性的核酸序列编码。

19.根据权利要求15或18所述的改变的生物体，其中所述核酸序列针对钩虫贪铜菌进行了密码子优化。

20.根据权利要求11至19中任一项所述的改变的生物体，进一步改变所述改变的生物体以去除PHA合酶活性。

21.一种由根据权利要求1至10中任一项所述的方法或根据权利要求11至20中任一项所述的改变的生物体产生的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的产物，其中所述产物包括：

(i)组合物，所述组合物包含至少一种生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或它们的任何组合；

(ii)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物包含(i)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物或它们的任何组合；

(iii)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂、塑料或橡胶，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂、塑料或橡胶包含(i)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或它们的任何组合，或者(ii)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或它们的任何组合；

(iv)模制物质，所述模制物质通过模制(ii)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或(iii)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂、塑料或橡胶或它们的任何组合获得；

(v)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂包含(i)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物，(i)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物，(ii)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，(iii)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂、塑料或橡胶，或者(iv)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的模制物质，或者它们的任何组合；或者

(vi)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的半固体或非半固体料流，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的半固体或非半固体料流包含(i)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物，(i)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物，(ii)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，(iii)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂、塑料或橡胶，(iv)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂，或者(v)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的模制物质，或者它们的任何组合。

22.一种根据图1所描绘的中心代谢产生的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的产物。

23.一种根据权利要求11至21中任一项所述的改变的生物体的外源遗传分子。

24.根据权利要求23的外源非天然存在的遗传组分，所述外源非天然存在的遗传组分包含密码子优化的核酸序列。

25.根据权利要求24的外源非天然存在的遗传组分，所述外源非天然存在的遗传组分针对钩虫贪铜菌进行了密码子优化。

26.根据权利要求25的外源非天然存在的遗传组分，所述外源非天然存在的遗传组分包含：包括托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmA(SEQ ID NO：10)、托斯卡纳科鲁比蒂斯菌RcmB(SEQID NO：12、马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmA(SEQ ID NO：16)或马赛塞内加尔芽孢杆菌RcmB(SEQID NO：18)的核酸序列；或编码具有相似酶活性的多肽的表现出与SEQ ID NO：10、12、16或18所示的所述核酸序列或其功能片段至少约50％的序列同一性的核酸序列。

27.根据权利要求25的外源非天然存在的遗传组分，所述外源非天然存在的遗传组分包含钩虫贪铜菌乙酰乙酰-CoA转移酶phaA(SEQ ID NO：20)或编码具有相似酶活性的多肽的表现出与SEQ ID NO：20所示的所述核酸序列或其功能片段至少约50％的序列同一性的核酸序列。

28.根据权利要求23的外源非天然存在的遗传组分，所述外源非天然存在的遗传组分选自用于RCM和/或乙酰乙酰-CoA转移酶PhaA的表达构建体或合成操纵子。

29.一种用于生物合成2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物的方法，所述方法包括提供能够产生参与2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物的生物合成的化合物的手段，以及利用所述手段产生参与2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物的生物合成的化合物。

30.一种用于生物合成2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物的方法，所述方法包括：

用于执行以下功能的步骤：改变能够产生2-HIBA、其衍生物和/或与其相关的化合物的生物体，使得与对应未改变的生物体相比，所述改变的生物体产生更多的2-HIBA、其衍生物和/或化合物；和

用于执行以下功能的步骤：在所述改变的生物体中产生2-HIBA、其衍生物和/或与其相关的化合物。

31.一种用于生物合成2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物的方法，所述方法包括：

用于执行以下功能的步骤：改变能够产生2-HIBA、其衍生物和/或与其相关的化合物的生物体，使得与对应未改变的生物体相比，所述改变的生物体产生更多的2-HIBA、其衍生物和/或化合物。

32.一种用于生物合成2-HIBA及其衍生物和与其相关的化合物的方法，所述方法包括：

用于执行以下功能的步骤：在能够产生2-HIBA、其衍生物和/或与其相关的化合物的生物体中产生2-HIBA、其衍生物和/或与其相关的化合物，其中已经改变所述生物体，使得与对应未改变的生物体相比，所述生物体产生更多的2-HIBA、其衍生物和/或化合物。