WO2014044674A2 - Verfarhen zur isomerisierung von (r)-3-hydroxycarbonsäuren zu 2-hydroxy-2-methylcarbonsäuren - Google Patents

Verfarhen zur isomerisierung von (r)-3-hydroxycarbonsäuren zu 2-hydroxy-2-methylcarbonsäuren Download PDF

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WO2014044674A2
WO2014044674A2 PCT/EP2013/069272 EP2013069272W WO2014044674A2 WO 2014044674 A2 WO2014044674 A2 WO 2014044674A2 EP 2013069272 W EP2013069272 W EP 2013069272W WO 2014044674 A2 WO2014044674 A2 WO 2014044674A2
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Roland H. MÜLLER
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Judith Schuster
Martin Sajfutdinow
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Helmholtz-Zentrum Für Umweltforschung Gmbh - Ufz
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a process for the enzymatic isomerization of (J?) -3-hydroxycarboxylic acids to the corresponding 2-hydroxy-2-methylcarboxylic acids.
  • the conversion is carried out in an aqueous reaction solution in a temperature range of 20 to 80 ° C, wherein microorganisms or cell extracts or a crude extract thereof, which is a cobalamin-dependent (i?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA mutase for the isomerization of (i? ) -3- hydroxycarbonyl-CoA and 2-hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA esters or which are transfected with said mutase, are cultured.
  • the microorganism or a crude extract thereof may contain enzymatic activities (enzymes) which synthesize intracellular (7?) -3-hydroxycarbonyl-CoA ⁇ esters and convert these (T?) -3-hydroxycarbonyl-CoA esters to the corresponding 2? -Hydroxy-2-methylcarboxylic acids.
  • 2-hydroxy-2-methylcarboxylic acids and the resulting after their dehydration unsaturated 2-methylcarboxylic acids, namely the C4 acids 2-hydroxyisobutyric acid and methacrylic acid, are important building blocks for the synthesis of a variety of chemical products, such. B. of polymers and feeds.
  • mutase enzyme from strain HCM-10 is mesophilic. It has a maximum temperature of 40 ° C, even at 45 ° C, it is completely inactive (Yaneva et al., 2012, J. Biol. Chem. 287: 15502-1551 1). It is also disadvantageous that in DE 10 2006 017 760 and WO 2009/156214 only neutrophilic Gram-negative bacteria with a low resistance to acids are used. Accumulation of the desired product in the aqueous reaction solution is therefore difficult, as it is simultaneously associated with an inhibition of the microorganisms used for the synthesis.
  • the object was to find enzymes for the isomerization of 3-hydroxycarboxylic acids and 2-hydroxy-2-methylcarboxylic acids, which in the enzymatic conversion compared to the (i?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA- (S) -3-hydroxycarbonyl-CoA esters prefer and which are also available at higher temperatures.
  • the invention therefore relates to a process for the isomerization of (i?) - 3-hydroxycarboxylic acids to give corresponding 2-hydroxy-2-methylcarboxylic acids.
  • the conversion takes place in an aqueous reaction solution comprising microorganisms or crude extracts thereof, which have a cobalamin-dependent mutase for isomerization of (i?)? 3-hydroxycarbonyl-CoA and 2-hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA esters, or the are transfected with said cobalamin-dependent mutase, cultured at temperatures of 20 to 80 ° C.
  • the corresponding 2-hydroxy-2-methylcarboxylic acid is released into the medium and recovered as acid or in the form of its salts.
  • the microorganisms are used as whole cells unchanged, permeabilized or carrier-fixed in the process according to the invention.
  • cell-free crude extracts of the microorganisms can also be used.
  • This cobalamin-dependent mutase is referred to according to the invention as (i?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA mutase or as (i?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA mutase activity, since it has the (R) - enantiomer with higher conversion rates than (5) -enantiomers.
  • the ratio of conversion of (i?) Enantiomer to (5) enantiomer is preferably at least 2: 1, preferably 10: 1 to 50: 1 or higher.
  • a cobalamin-dependent (T?) -3-hydroxycarbonyl-CoA mutase according to the invention is effective both as a mesophilic and as a thermophilic enzyme.
  • the invention is based on the finding that, surprisingly, in particular thermo-acidophilic Gram-positive bacterial strains, the isomerization of (i?) - 3-hydroxycarbonyl -Co A to 2-hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA esters compared to (S) - 3- Hydroxycarbonyl-CoA esters prefer.
  • these microorganisms also have enzymatic activities for the intracellular synthesis of (R) -3-hydroxycarbonyl-CoA esters from inorganic or organic carbon sources.
  • the microorganism or a cell extract or a crude extract thereof may contain enzymatic activities which synthesize intracellularly primarily (i?) 3-hydroxycarbonyl-CoA esters and, secondly, by means of (i?) -3-hydroxycarbonyl- CoA mutase activity the (7?) -3-hydroxycarboxylic acids via the (i?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA esters to the corresponding 2-hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA esters and 2-hydroxy-2-methylcarboxylic acids convert.
  • enzymatic activities are understood as meaning enzymes or proteins or microorganisms containing them, which are able to convert a defined substrate over a specific period of time.
  • the Gram-positive bacterial strains are preferably selected from the group comprising the genera Kyrpidia, Ferrimicrobium, Sulfohacillus and Alicyclobacillus.
  • thermophilic Gram-negative bacterial strains can exhibit the enzymatic activities of the invention.
  • Preferred Gram-negative bacterial strains include e.g. the microorganisms of the genus Hydro genophil us.
  • An inventive (i?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA mutase is, as already stated, able to react preferably (i?) - 3-hydroxycarboxylic acids.
  • the enzyme causes the conversion of 3-hydroxycarboxylic acids into the corresponding 2-hydroxy-2-methylcarboxylic acids in a wide temperature range of 20 to 80 ° C.
  • the enzyme according to the invention is preferably thermophilic or contained in a preferably thermophilic microorganism comprising it. The optimum temperature is 45 to 70 °, preferably 45 to 55 ° C.
  • the invention thus also provides a process for the preparation of 2-hydroxy-2-methylcarboxylic acids using the (i?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA mutase, which is the (T?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA ester in the ratio to the (5) enantiomer preferably.
  • the ratio of the conversion of (i?) Enantiomer to (5) enantiomer is preferably at least 2: 1, preferably at least 10: 1 to 50: 1 or higher.
  • the reaction solution is incubated at temperatures of 45 to 70 ° C, preferably at 45 to 55 ° C.
  • thermo-acidophilic Gram-positive or a thermophilic Gram-negative bacterial strain preferably selected from the genera Kyrpidia, Ferrimicrobium, Hydrogenophilus, Siilfobacillus and Alicyclohacillus at an incubation temperature of 20 to 80 ° C, preferably at 45 to 70 ° C.
  • a bacterial strain of the genus Kyrpidia is particularly preferred.
  • the microorganism may be used in a biotechnological process to produce 2-hydroxy-2-methylcarboxylic acids using organic carbon sources such as methane or inorganic carbon sources such as carbon monoxide or carbon dioxide in combination with hydrogen and oxygen for synthesis and conversion of (R) -3. Hydroxycarboxylic acids via the (J?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA esters are used.
  • the (1-enantiomer of a 3-hydroxycarboxylic acid can be converted into corresponding 2-hydroxy-2-methylcarboxylic acids using the enzymes according to the invention or with microorganisms containing such enzymes
  • the enzymatic conversion of a carbon source into a 2-hydroxy-2-methylcarboxylic occur in a single process step.
  • a moderately acidophilic Gram-positive bacterial strain belonging to the genus Kyrpidia has been found to be particularly suitable, which has a (i?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA mutase activity with high stereospecificity.
  • the strain Kyrpidia tusciae which is commercially available, for example, under DSM 2912, IFO 15312 and NBRC 15312 can be used in the process according to the invention.
  • the (R) -3-hydroxycarbonyl-CoA mutase activity contained in the microorganism causes the (R) -enantiomer to be distinctly superior to that in the mutase-catalyzed isomerization of eg 3-hydroxybutyryl-Co A to 2-hydroxyisobutyryl-CoA (5-enantiomer of the 3-hydroxybutyryl Co A ester is preferred.)
  • This enzyme is in contrast to the hitherto known mutase enzymes from strain HCM-10 (DE 10 2006 017 760, Yaneva et al., 2012, J. Biol. Chem. 287: 15502-1551 1) specific for the conversion of (T?) -3-hydroxycarbonyl-CoA-ester.
  • it is also effective in a wide temperature range (20 to 80 ° C).
  • the optimum temperature is 45 to 70 °, preferably 45 to 55 ° C.
  • a preferably used inventive enzyme - as (?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA mutase called - consists of two subunits A (Sequence No. 2) and B (Sequence No. 4), which only a very low homology to the subunits of in DE 10 2006 017 760 and WO 2009/156214, namely subunit A having a sequence identity of 43% to sequence 2 and subunit B having a sequence identity of 46% to sequence 4 of the enzyme from strain presented in DE 10 2006 017 760 HCM 10th Similarly low sequence identities, namely 42 to 46%, also exist for the other protein sequences of mutases mentioned in DE 10 2006 017 760 (sequences 5, 6, 9, 10, 13 and 14).
  • the (i) -hydroxycarbonyl-CoA mutase according to the invention which catalyses the isomerization of 3-hydroxycarbonyl-CoA esters to 2-hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA esters, or one of at least 50 % homologous, preferably at least 75%% homologous CoA mutase with comparable stereospecificity expressed in a suitable microbial system and used there for the isomerization of 3-hydroxycarbonyl-CoA and 2-hydroxy-2-methylcarbonyl ⁇ CoA esters.
  • the desired product eg. As 2-hydroxyisobutyric acid, released as a free acid in the culture medium, so that it can be obtained by conventional methods such as extraction.
  • the microorganism or a crude extract containing the (?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA mutase according to the invention is cultured in an aqueous reaction solution at 20 to 80 ° C, whereby the corresponding 2-hydroxy-2-methylcarboxylic acid in the medium and as Acid or in the form of their salts is obtained.
  • the (i?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA mutase used has the property of reacting the (i?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA ester relative to the (5) -enantiomer, preferably at least 2: 1 Conversion of (i?) Enantiomer to (5) enantiomer is more preferably from 10: 1 to 50: 1 or higher.
  • the enzyme according to the invention comes in a thermo-acidophilic Gram-positive bacterial strain such.
  • B. in representatives of the genera Ferrimicrohium, Sulfohacillus, Alicyclobacilhis and Kyrpidia, at an incubation temperature of 45 to 70 ° C used.
  • a particularly suitable variant of the method consists in the use of the mutase enzyme according to the invention in combination with a metabolic pathway which results in the use of (3) -hydroxycarbonyl-CoA being synthesized from simple carbon compounds in the thermophilic microorganism used.
  • the carbon source may be organic but also inorganic.
  • As the organic carbon source as a substrate for synthesizing the (?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA ester, e.g. Methane can be used.
  • an inorganic carbon source e.g. Carbon monoxide or carbon dioxide in combination with oxygen and hydrogen can be used as a substrate for the synthesis of the (i?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA ester.
  • an inorganic carbon source e.g. Carbon monoxide or carbon dioxide in combination with oxygen and hydrogen can be used as a substrate for the synthesis of the (i?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA ester.
  • Strain of the genus Kyrpidia may furthermore preferably contain representatives of the genera Hydrogenophilus (Vesteinsdottir et al., 201 1, Int., J. Syst., Evol., Microbiol., 61: 290-294) and Bacillus (Schenk & Aragno, 1979, J. Gen Microbiol. 1 15: 333-341) are used in the method according to the invention since they are known to be produced under autotrophic growth conditions, eg. Strain DSM 2912 (Bonjour & Aragno 1984, Arch. Microbiol. 139: 397-401) are capable of poly-3-hydroxybutyric acid formation.
  • strain DSM 2912 In addition to strain DSM 2912, another particularly preferred strain of the strain Bacillus massiliosenegalensis (DSM 25957 also known as strain JC6: ClinMicrobiollnfect 2012; 18: 1 185-1 193 (DOI: 10.1 1 1 1 / 1469-0691.12023)) in the process according to the invention suitable, which can be preferably cultured at 25 to 45 ° C, with an optimum at 37 ° C.
  • DSM 25957 also known as strain JC6: ClinMicrobiollnfect 2012; 18: 1 185-1 193 (DOI: 10.1 1 1 1 / 1469-0691.12023)
  • suitable which can be preferably cultured at 25 to 45 ° C, with an optimum at 37 ° C.
  • an (i) -3-hydroxycarbonyl-CoA mutase according to the invention is expressed in preferably thermophilic microorganisms having the abovementioned metabolic abilities, since the mutase enzyme is then converted into e.g. resulting (i?) - 3-hydroxybutyryl-CoA isomerized to 2-hydroxyisobutyryl-CoA and thus 2-hydroxyisobutyric acid is released into the culture medium.
  • the enzymatic conversion by microorganisms is by no means limited to the examples listed above.
  • All organisms which are capable of converting 3-hydroxycarboxylic acids into 2-hydroxy-2-methylcarboxylic acids using a mutase according to the invention, in which case they prefer the (R) -3-hydroxycarboxylic acids, can be used according to the invention.
  • the genetic material for a mutase according to the invention can be transfected into a microorganism by techniques known per se. Suitable microorganisms may, for. B. E.
  • strain variants are created in which unwanted side reactions, e.g. of (i?) - 3-hydroxybutyryl-CoA metabolism, such as. As the reoxidation to acetyl-CoA or the formation of poly-3-hydroxybutyric acid, are reduced or stopped completely.
  • cell extracts and / or a cobalamin-dependent (T?) -3-hydroxycarbonyl-CoA mutase according to the invention can also be used alone or in combination with other proteins, such as, for example, As further cobalamin-binding proteins, acyl-CoA synthetases, MeaB-like chaperones, adenosyl-transferring enzymes and acyl CoA lyases, used in enriched, isolated or synthetically produced form become. In this case, 3-hydroxycarboxylic acids, for which an isomerization is desired, are added unesterified as free acids or as CoA esters.
  • a mutase enzyme according to the invention is expressed together with MeaB-like chaperones, whereby a high enzyme activity is retained.
  • coexpression can be carried out with enzymes which transfer an adenosyl group from ATP to free cobalamin, wherein the activity of such enzymes also ensures the maintenance of high mutase activity.
  • Padovani & Banerjee 2009 Proc. Nat. Acad. Be. 106: 21567-21572.
  • 3-hydroxycarboxylic acids whose isomerization is desired can also be added to a biological system which has an (i?) -3-hydroxycarbonyl-CoA mutase activity according to the invention.
  • the latter are then converted by the system into (R) -3-hydroxycarbonyl-CoA-ester and isomerized by an (i) -hydroxycarbonyl-CoA mutase according to the invention into the corresponding 2-hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA-ester ,
  • the invention also relates to nucleic acid molecules which encode a cobalamin-dependent mutase according to the invention for the isomerization of (R) -3-hydroxycarbonyl-Co A to 2-hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA esters. They are preferably selected from
  • nucleic acid molecules which encode a protein corresponding to those described under sequence no. 2 and sequence no. 4 or the amino acid sequence given under Sequence No. 5 and Sequence No. 6;
  • nucleic acid molecules which hybridize with one of the nucleic acid molecules mentioned under a) and b), and
  • a coded (i?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA mutase has the sequence sequence no. 2 and sequence no. 4 indicated amino acid sequences.
  • the (i?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA mutase which is encoded can be composed of a multiple of these various subunits according to Sequence No. 2 and sequence no. 4 together. In this case, the encoded enzymes have a sequence identity to those in the sequence no.
  • the invention also relates to the (T?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA mutase having the sequences Nos. 2 and 4 as monomer or an (i?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA mutase having at least 50% homology preferably at least 75 %%, more preferably at least 95%, or at least 99% homology to these sequences.
  • mutases which have a homology of at least 75% to the sequences 2 and 4.
  • the invention also relates to a (7i) -3-hydroxycarbonyl-CoA mutase having the sequences Nos. 5 and 6 as a monomer.
  • the sequence No. 5 has a 78% identity to the sequence 2 and the sequence 6 has a 77% identity to the sequence No. 4.
  • (T?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA mutases the oligomers of sequences Nos. 2 and 4 or their. Homologs are or have. Preferably, they are mutases of oligomers with 2 copies each of the subunits (ie 2 ⁇ A + 2 ⁇ B). These also include the (i?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA mutases having at least 50% homology, preferably at least 75%, more preferably at least 95%, or at least 99% homology to these sequences. This concerns in particular the sequences 5 and 6.
  • the invention encompasses proteins comprising the (i?) 3-hydroxycarbonyl-CoA mutases as monomer or oligomer as described above fused to additional proteins selected from the group consisting of cobalamin-binding proteins, acyl-CoA Synthetic, MeaB-like chaperones, adenosyl-transferring enzymes and / or acyl-CoA lyases are present. Included here are variants in which the other proteins are fused with only one subunit and the proteins with at least 50% homology, preferably at least 75%, more preferably at least 95%, or at least 99% homology to these sequences.
  • Seq. No. 1 shows the 1692 bp nucleotide sequence for subunit A of a cobalamin-dependent (J ⁇ ) -3-hydroxycarbonyl-CoA-mutase from DSM 2912.
  • Seq. No. 2 shows the 563 aa amino acid sequence for subunit A of a cobalamin-dependent (T?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA mutase from DSM 2912.
  • Seq. No. 3 shows the 399 bp nucleotide sequence for subunit B of a cobalamin-dependent (i?) -3-hydroxycarbonyl-CoA mutase from DSM 2912.
  • Seq. No. 4 shows the 132 amino acid sequence for subunit B of a cobalamin-dependent (i?) -3-hydroxycarbonyl-CoA mutase from DSM 2912.
  • Seq. No. 5 shows the 569 AS comprehensive amino acid sequence for the subunit AI of a cobalamin-dependent ( ⁇ ) -3-hydroxycarbonyl-CoA mutase from strain DSM 25957 (78% identity to Mut3A from strain DSM 2912).
  • Seq. No. 6 shows the amino acid sequence comprising 130 AA for the subunit B1 of a cobalamin-dependent (i?) -3-hydroxycarbonyl-CoA mutase from strain DSM 25957 (77% identity to Mut3B from strain DSM 2912).
  • Seq. No. 7 shows a codon-optimized 1692 bp nucleotide sequence for the subunit A of the cobalamin-dependent (T?) -3-hydroxycarbonyl-CoA mutase of sequence No. 2.
  • Seq. No. 8 shows a codon-optimized 399 bp nucleotide sequence for subunit B of the cobalamin-dependent (i?) -3-hydroxycarbonyl-CoA mutase of Sequence No. 4.
  • Seq. No. 9 shows the 1710 bp nucleotide sequence for subunit A of a cobalamin-dependent (i?) -3-hydroxycarbonyl-CoA mutase from DSM 25957.
  • Seq. No. 10 shows the 393 bp nucleotide sequence for subunit B of a cobalamin-dependent (i?) -3-hydroxycarbonyl-CoA mutase from DSM 25957.
  • Sequence 1 gene sequence mut3A
  • Sequence 2 protein sequence Mut3A
  • Sequence 3 gene sequence mut3B
  • Sequence 7 gene sequence mut3 ⁇ codon optimized for E. coli
  • Sequence 8 gene sequence mut3B codon optimized for E. coli
  • Sequence 9 gene sequence mut3Al
  • Sequence 10 gene sequence mut3Bl
  • Sequence 1 gene sequence mut3A
  • Sequence 2 protein sequence Mut3A
  • Sequence 3 gene sequence mut3B
  • Sequence 5 protein sequence Mut3Al
  • GGC ACC AGG GCG GTG CAG GAG GTG GGG TGC GCC ATC GCC AAC GCC ATC GCC ACG
  • GAA TCC CGG GGC GGC ATC ATC GCC GTC GTG GAA AGG GGG TGG CTG CAC CGG GAA
  • Sequence 9 gene sequence must be AI
  • Sequence 10 gene sequence mut3Bl
  • BLAST BLASTN or BLASTP
  • matrix BLOSUM62
  • Basal medium (mg / L)
  • reaction mixtures (Table 2) with the CoA esters mentioned in the examples as substrates with protein from crude extracts or with purified enzyme subunits incubated at the temperatures and substrate concentrations indicated in the examples.
  • CoA esters which were used as substrates in the enzyme assay for the determination of (?) - 3-hydroxycarbonyl-CoA mutase activity, were prepared from the free acids by the relevant method via activation with thiophenol and subsequent transesterification with coenzyme A (CoA ) prepared as z.
  • Padmakumar et al. 1993 Padmakumar et al., 1993, A rapid method for the synthesis of methyl amlonyl-coenzyme A and other CoA esters, Anal. Biochem. 214: 318-320).
  • the CoA ester substrates used in the enzyme assay and the resulting products were determined by HPLC.
  • the mobile phase used was a mobile phase consisting of 14.5% by volume of acetonitrile, 10 mM of tetrabutylammonium hydrogen sulfate and 100 mM of sodium phosphate having a pH of 4.5.
  • Non-esterified organic acids which served or were formed as substrate when incubated with whole cells, were also determined by HPLC.
  • the mobile phase used was a mobile phase consisting of 10 mN sulfuric acid in water.
  • the acids were separated on the column Nucleogel Ion 300 OA (Macherey-Nagel). Detection was performed using a refractive index detector.
  • the protein concentration of the crude protein extracts and the enzyme preparations was determined using the Bradford reagent (Merck) according to the manufacturer's protocol. Bovine serum albumin served as standard.
  • DSM 2912 on 2-hydroxyisobutyric acid was also vitamin B12-dependent, suggesting a cobalamin-dependent step in the underlying dissimilatory metabolism.
  • the strain was incubated in a 1 L fermenter with pH and temperature control. The pH was kept constant by automatic titration with 0.2 M solutions of sodium hydroxide solution and hydrochloric acid. The growth was monitored by measuring the optical density at 700 nm by photometer.
  • the first region with the Locus tag Btus 1313 probably codes for a methylmalonyl CoA mutase, as the sequence of the corresponding gene product is very similar to the enzyme from Propionibacterium rejoicing "subsp. Sherman NCIB 9885 shows.
  • the second region with locus tag Btus_1053 probably codes for an isobutyryl-CoA mutase fused to the MeaB-like chaperone meal, as has been recently described for other bacterial strains (Cracan et al., 2010, J. Biol. Chem. 285: 655-666).
  • the third gene region with the locus tags Btus_0469 and Btus_0470 shows no greater similarity to known mutases, so that an assignment could not be made. Therefore, the two genes coding for subunits A (Btus_0469) and B (Btus_0470), which are called mutSA and mut3B, were cloned and expressed in two E. coli TOP10 strains.
  • genomic DNA from strain DSM 2912 was first obtained using the DNA Extraction Kit (Macherey-Nagel). Thereafter, using this DNA, the genes mut3A and muBB coding for the subunits A and B of the mutase were amplified by means of PCR. The PCR was carried out with the proof-reading OneTaq DNA polymerase (NEB) under the conditions recommended by the manufacturer.
  • NEB proof-reading OneTaq DNA polymerase
  • Primer pairs were for mutSA: 5'-AGC GGC TCT TCA ATG GCT GAT CAA GAG AAG CTC TTT A-3 '(forward primer sequence # 1 1) and 5' AGC GGC TCT TCT CCC AAC CAA AGG GAA CTG CCA CA -3 '(reverse primer - sequence no. 12); and for mut3B: 5'-AGC GGC TCT TCA ATG GAG AAA AAG ATC AAG GTG A-3 '(forward primer sequence # 13) and 5'-AGC GGC TCT TCT CCC ATC CCG ATC CGG AAA CCG G-3' (reverse primer - sequence no. 14).
  • PCR reactions were incubated for 30 cycles at 94 ° C for 20 seconds each, 57 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 3 minutes for muANA and 1.5 minutes at 68 ° C for mutSB.
  • the PCR products thus obtained were each cloned into the vector pASG-IBA43 (IBA Göttingen) according to the manufacturer's protocol.
  • the transformation of E. coli TOP 10 was also carried out according to the protocol of IBA Göttingen.
  • E. coli TOP10 pASG-IBA43 :: / "w / J.4 and E. coli TOP10 pASG-IBA43: mut3B thus obtained were grown on LB medium in the presence of ampicillin (100 mg / L).
  • the induction of the mutase genes was carried out with Anhydrotetracyclin (200 ⁇ / L) for 3 hours 30 ° C.
  • the bacterial cells were harvested by centrifugation as described above in Example 1 for the cells of the strain DSM 2912 and digested.
  • the 2-hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA mutase from strain DSM 2912 which had been purified by heterologous expression by affinity chromatography and consisting of subunits A and B, showed high enzyme activity with the substrates 2-hydroxyisobutyryl-CoA and 3-hydroxybutyryl-CoA.
  • 2-hydroxyisobutyryl-CoA as the substrate (starting concentration 150 ⁇ )
  • high specific activities were achieved at 30 to 70 ° C ( Figure 3), with the optimum being 50 ° C.
  • With 3-hydroxybutyryl-CoA as substrate starting concentration 200 ⁇ ), a high activity was also achieved at 50 ° C.
  • cells of strain DSM 2912 were incubated at 55 ° C in basal medium (pH 6.8) with vitamin B 12 on acetate (1 g / L ) plus 2-hydroxyisobutyric acid (1 g / L).
  • the cells were then harvested by centrifugation and suspended in N-free basal medium, a cell concentration of 0.52 g / L (dry weight) adjusted and acetate (1.2 g / L) at 55 ° C in the presence of the translation inhibitor Chloramphenicol (1 mM) was further incubated, whereby the overflow metabolism was stimulated via acetyl-CoA towards (R) -3-hydroxybutyryl-CoA. It has been expected that by the prior induction of (i) -hydroxy carbonyl-Co A mutase activity, 2-hydroxyisobutyric acid is now synthesized from acetate via 3-hydroxybutyryl-Co A.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von (R)- 3-Hydroxycarbonsäuren zu den entsprechenden 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren. Die Umwandlung erfolgt in einer wässrigen Reaktionslösung in einem Temperaturbereich von 20 bis 80°C, wobei Mikroorganismen bzw. Zellextrakte oder ein Rohextrakt davon, die eine Cobalamin-abhängige (R)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase zur Isomerisierung von (R)-3- Hydroxycarbonyl-CoA- und 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA-Estern aufweisen oder die mit der genannten Mutase transfiziert sind, kultiviert werden. Die entsprechende 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäure wird ins Medium abgegeben und als Säure oder in Form ihrer Salze gewonnen.

Description

Verfahren zur Isomerisierung von (R)-3-Hydroxycarbonsäuren zu 2-Hydroxy-2- methylcarbonsäuren
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von (J?)- 3-Hydroxycarbonsäuren zu den entsprechenden 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren. Die Umwandlung erfolgt in einer wässrigen Reaktionslösung in einem Temperaturbereich von 20 bis 80°C, wobei Mikroorganismen bzw. Zellextrakte oder ein Rohextrakt davon, die eine Cobalamin-abhängige (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase zur Isomerisierung von (i?)-3- Hydroxycarbonyl-CoA- und 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA-Estern aufweisen oder die mit der genannten Mutase transfiziert sind, kultiviert werden. Die entsprechende 2-Hydroxy- 2-methylcarbonsäurc wird ins Medium abgegeben und als Säure oder in Form ihrer Salze gewonnen. In einer Verfahrensvariante kann der Mikroorganismus oder ein Rohextrakt davon enzymatische Aktivitäten (Enzyme) enthalten, die intrazellulär (7?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA~ Ester synthetisieren und diese (T?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Ester zu den korrespondierenden 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren umwandeln.
2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren und die nach ihrer Dehydratisierung entstehenden ungesättigten 2-Methylcarbonsäuren, namentlich die C4- Säuren 2-Hydroxyisobuttersäure und Methacrylsäure, sind wichtige Bausteine für die Synthese einer Vielzahl von chemischen Produkten, wie z. B. von Polymeren und Beschickungen.
Da die industrielle Herstellung zurzeit nur durch nicht-enzymatische Prozesse erfolgt und mit großem Energieaufwand und erheblicher Umweltbelastung verbunden ist, sind biotechnologische Prozesse gefragt, die es ermöglichen, 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren Ressourcen schonender und umweltfreundlicher zu produzieren. In diesem Zusammenhang wurde die biotechnologische Herstellung von 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren über 3- Hydroxycarbonsäuren auf der Basis einer in dem Bakterienstamm HCM- 10 (DSM 18028) gefundenen 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA-Mutase- Aktivität durch die Patente DE 10 2006 017 760 und WO 2009/156214 bekannt gemacht. Der Stoffwechselweg zur Synthese von (i?)-3 -Hydroxycarbonyl-CoA und Poly-(i?)-3-hydroxyalkanoaten ist biotechnologisch gut etabliert (Rohwerder & Müller 2010, Microbial Cell Factories 9: 13). Jedoch der entscheidende Nachteil des in DE 10 2006 017 760 und WO 2009/156214 beschriebenen Verfahrens besteht darin, dass bei der enzymatischen Umwandlung durch das Mutase-Enzym aus Stamm HCM-10 das (5)-Enantiomer des 3-Hydroxycarbonyl-CoA-Esters bei der Isomerisierung bevorzugt wird (Yaneva et al. 2012, J. Biol. Chem. 287: 15502-1551 1).
Dadurch wird eine Kombination der Mutase-Reaktion mit einem bereits biotechnologisch gut etablierten Stoffwechselweg zur Synthese von (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA und Poly-(i?)-3- hydroxyalkanoaten (Rohwerder & Müller 2010, Microbial Cell Factories 9: 13) nur durch Ergänzung mit entsprechend racemisch wirkenden enzymatischen Aktivitäten möglich. Zudem wird der Ertrag durch Nebenreaktionen wie z. B. durch den Stoffwechselweg der so genannten Beta-Oxidation der Fettsäuren, der spezifisch für die (5)-Enantiomere der 3- Hydroxycarbonyl-CoA-Ester ist und diese zu Acetyl-CoA oxidiert, verringert.
Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass das Mutase-Enzym aus Stamm HCM-10 mesophil ist. Es weist ein Temperaturmaximum von 40 °C auf, bereits bei 45 °C ist es vollständig inaktiv (Yaneva et al. 2012, J. Biol. Chem. 287: 15502-1551 1). Von Nachteil ist auch, dass in DE 10 2006 017 760 und WO 2009/156214 nur neutrophile Gram-negative Bakterien mit einer geringen Resistenz gegenüber Säuren zum Einsatz kommen. Eine Akkumulation des angestrebten Produkts in der wässrigen Reaktionslösung ist also schwierig, da damit gleichzeitig eine Hemmung der für die Synthese verwendeten Mikroorganismen verbunden ist.
Biotechnologische Verfahren zur Herstellung von 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren, die die Isomerisierung der (i?)-Enantiomere von 3-Hydroxycarbonyl-CoA-Estern zu entsprechenden 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA-Estern gewährleisten bzw. bevorzugen, sind deshalb von Vorteil. Außerdem sind für industrielle Prozesse Verfahren, die auch bei höheren Temperaturen durchgeführt werden können, wünschenswert, da dadurch erhöhte Syntheseraten möglich sind.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, ein biotechnologisches, industriell durchführbares Verfahren bereitzustellen, das mit hoher Stereospezifität die Isomerisierung der (i?)-Enantiomere von 3-Hydroxycarbonyl-CoA-Estern zu entsprechenden 2-Hydroxy-2- methylcarbonyl-CoA-Estern gewährleistet und damit zur effektiven Herstellung von 2- Hydroxy-2-methylcarbonsäuren geeignet ist. Gleichzeitig bestand die Aufgabe darin, Enzyme zur Isomerisierung von 3-Hydroxycarbonsäuren und 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren zu finden, die bei der enzymatischen Umwandlung die (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA- gegenüber (S)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Estern bevorzugen und, die darüber hinaus auch bei höheren Temperaturen zur Verfügung stehen.
Auf der Suche nach einer Lösung dieser Aufgabe wurde gefunden, dass bestimmte Mikroorganismen die Fähigkeit besitzen, Cobalamin-abhängige Mutasen zur Isomerisierung von überwiegend (7?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA- und entsprechenden 2-Hydroxy-2- methylcarbonyl-CoA-Ester zu produzieren.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Isomerisierung von (i?)-3- Hydroxycarbonsäuren zu entsprechenden 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren. Die Umwandlung findet in einer wässrigen Reaktionslösung statt, wobei Mikroorganismen oder Rohextrakte davon, die eine Cobalamin-abhängige Mutase zur Isomerisierung von (i?)~3- Hydroxycarbonyl-CoA- und 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA-Estern aufweisen oder die mit der genannten Cobalamin-abhängige Mutase transfiziert sind, bei Temperaturen von 20 bis 80 °C kultiviert werden. Die entsprechende 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäure wird ins Medium abgegeben und als Säure oder in Form ihrer Salze gewonnen.
In einer Ausführungsvariante der Erfindung werden die Mikroorganismen als ganze Zellen unverändert, permeabilisiert oder trägerfixiert im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt. In einer weiteren Variante können auch zellfreie Rohextrakte der Mikroorganismen eingesetzt werden.
Diese Cobalamin-abhängige Mutase wird erfindungsgemäß als (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA- Mutase oder als (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase-Aktivität bezeichnet, da sie das (R)- Enantiomere mit höheren Umsatzraten als (5)-Enantiomere umsetzt. Das Verhältnis des Umsatzes von (i?)-Enantiomerem zu (5)-Enantiomerem liegt bevorzugt bei mindestens 2: 1 , vorzugsweise bei 10: 1 bis 50: 1 oder höher.
Eine erfindungsgemäße Cobalamin-abhängige (T?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase ist sowohl als mesophiles als auch thermophiles Enzym wirksam.
Die Erfindung beruht dabei auf der Erkenntnis, dass überraschenderweise insbesondere thermo-acidophile Gram-positive Bakterienstämme die Isomerisierung von (i?)-3- Hydroxycarbonyl -Co A- zu 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA-Estern gegenüber (S)-3- Hydroxycarbonyl-CoA-Estern bevorzugen. Darüber hinaus können diese Mikroorganismen auch enzymatische Aktivitäten für die intrazelluläre Synthese von (R)-3 -Hydroxycarbonyl- CoA-Estern aus anorganischen oder organischen Kohlenstoffquellen aufweisen.
In einer Verfahrensvariante kann deshalb der Mikroorganismus bzw. ein Zellextrakt oder ein Rohextrakt davon enzymatische Aktivitäten enthalten, die zum einen intrazellulär vorrangig (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Ester synthetisieren und zum anderen mittels (i?)-3- Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase-Aktivität die (7?)-3 -Hydroxycarbonsäuren über die (i?)-3- Hydroxycarbonyl-CoA-Ester zu den korrespondierenden 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA- Estem und 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren umwandeln.
Unter enzymati sehen Aktivitäten werden im Sinne der Erfindung Enzyme bzw. Proteine oder sie enthaltende Mikroorganismen verstanden, die ein definiertes Substrat in einem bestimmten Zeitraum umsetzen können. Die Gram-positiven Bakterienstämme sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Gattungen Kyrpidia, Ferrimicrobium, Sulfohacillus und Alicyclobacillus. Darüber hinaus können auch thermophile Gram-negative Bakterienstämme die erfindungsgemäßen enzymati sehen Aktivitäten aufweisen. Zu den bevorzugten Gramnegativen Bakterienstämmen gehören z.B. die Mikroorganismen der Gattung Hydro genophil us .
Eine erfindungsgemäße (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase ist, wie bereits ausgeführt, in der Lage, bevorzugt (i?)-3-Hydroxycarbonsäuren umzusetzen. Das Enzym bewirkt die Umwandlung von 3 -Hydroxycarbonsäuren in die entsprechenden 2-Hydroxy-2- methylcarbonsäuren in einem breiten Temperaturbereich von 20 bis 80°C. Das erfindungsgemäße Enzym ist bevorzugt thermophil oder in einem es umfassenden vorzugsweise thermophilen Mikroorganismus enthalten. Das Temperaturoptimum liegt bei 45 bis 70°, bevorzugt bei 45 bis 55 °C. Gegenstand der Erfindung ist damit auch ein Verfahren zur Herstellung von 2-Hydroxy-2- methylcarbonsäuren unter Verwendung der (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase, die den (T?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Ester im Verhältnis zum (5)-Enantiomeren bevorzugt umsetzt. Das Verhältnis des Umsatzes von (i?)-Enantiomerem zu (5)-Enantiomerem liegt bevorzugt bei mindestens 2: 1, vorzugsweise bei mindestens 10: 1 bis 50: 1 oder höher. In einer Variante des Verfahrens wird die Reaktionslösung bei Temperaturen von 45 bis 70 °C inkubiert, vorzugsweise bei 45 bis 55°C.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet man in einem wässrigen Medium vorzugsweise einen thermo-acidophilen Gram-positiven oder einen thermophilen Gram-negativen Bakterienstamm, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen Kyrpidia, Ferrimicrobium, Hydrogenophilus, Siilfobacillus und Alicyclohacillus bei einer Inkubationstemperatur von 20 bis 80°C, vorzugsweise bei 45 bis 70 °C. Besonders bevorzugt ist ein Bakterienstamm der Gattung Kyrpidia. Der Mikroorganismus kann in einem biotechnologischen Prozess zur Produktion von 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren unter Einsatz organischer Kohlenstoffquellen, wie Methan, oder anorganischer Kohlenstoffquellen, wie Kohlenmonoxid oder Kohlendioxid in Kombination mit Wasserstoff und Sauerstoff zur Synthese und Umwandlung von (R)-3 -Hydroxycarbonsäuren über die (J?)-3- Hydroxycarbonyl-CoA-Ester eingesetzt werden.
Mit den erfindungsgemäßen Enzymen bzw. mit Mikroorganismen, die solche Enyzme enthalten, kann gezielt insbesondere das (^-Enantiomer einer 3 -Hydroxycarbonsäure zu entsprechenden 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren umgewandelt werden. In einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante kann die enzymatische Umsetzung einer Kohlenstoffquelle zu einer 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäure in einem einzigen Verfahrensschritt erfolgen.
Als besonders geeignet hat sich ein gemäßigt acidophiler Gram-positiver Bakterienstamm, der zur Gattung Kyrpidia gehört, erwiesen, der eine (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase- Aktivität mit hoher Stereospezifität besitzt. Besonders kann im erfindungsgemäßen Verfahren der Stamm Kyrpidia tusciae eingesetzt werden, der z.B. unter DSM 2912, IFO 15312 und NBRC 15312 kommerziell verfügbar ist. Die in dem Mikroorganismus enthaltene (R)-3- Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase-Aktivität bewirkt, dass bei der Mutase-katalysierten Isomerisierung von z.B. 3 -Hydroxybutyryl-Co A zu 2-Hydroxyisobutyryl-CoA das (R)~ Enantiomer deutlich gegenüber dem (5 -Enantiomer des 3 -Hydroxybutyryl-Co A-Esters bevorzugt wird. Dieses Enzym ist im Gegensatz zu den bisher bekannten Mutase-Enzymen aus Stamm HCM-10 (DE 10 2006 017 760; Yaneva et al. 2012, J. Biol. Chem. 287:15502- 1551 1) spezifisch für die Umwandlung von (T?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Ester. Überraschenderweise ist es darüber hinaus in einem breiten Temperaturbereich wirksam (20 bis 80°C). Das Temperaturoptimum liegt bei 45 bis 70°, bevorzugt bei 45 bis 55 °C.
Ein bevorzugt verwendetes erfindungsgemäßes Enzym - als ( ?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA- Mutase bezeichnet - besteht aus zwei Untereinheiten A (Sequenz Nr. 2) und B (Sequenz Nr. 4), die nur eine sehr geringe Homologie zu den Untereinheiten des in DE 10 2006 017 760 und WO 2009/156214 beschriebenen Enzyms aufweisen, nämlich Untereinheit A mit einer Sequenzidentität von 43 % zu Sequenz 2 und Untereinheit B mit einer Sequenzidentität von 46 % zu Sequenz 4 des in DE 10 2006 017 760 vorgestellten Enzyms aus Stamm HCM-10. Ähnlich geringe Sequenzidentitäten, nämlich 42 bis 46 %, bestehen auch zu den anderen in DE 10 2006 017 760 genannten Proteinsequenzen von Mutasen (Sequenzen 5, 6, 9, 10, 13 und 14). Dabei erfolgte die Berechnung der Sequenzübereinstimmung mithilfe des BLASTP- Programms (Altschul et al. 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410) mit allen relevanten Parametern in der Grundeinstellung (Matrix = BLOSUM62) und den vollständigen Aminosäuresequenzen der Untereinheiten A und B des neuen Enzyms (s. auch Allgemeine Methoden).
In einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante wird die erfindungsgemäße (i?)-3- Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase, die die Isomerisierung von 3-Hydroxycarbonyl-CoA-Estern zu 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA-Estern katalysiert, oder eine zu mindestens 50% homologe, vorzugsweise zu mindestens 75% % homologe CoA-Mutase mit vergleichbarer Stereospezifität in einem geeigneten mikrobiellen System exprimiert und dort zur Isomerisierung von 3-Hydroxycarbonyl-CoA- und 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl~CoA-Estern genutzt. Von dem mikrobiellen System wird dann das gewünschte Produkt, z. B. 2- Hydroxyisobuttersäure, als freie Säure in das Kulturmedium abgegeben, so dass es durch übliche Verfahren wie Extraktion gewonnen werden kann.
Der Mikroorganismus oder ein Rohextrakt, der die erfindungsgemäße ( ?)-3- Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase aufweist, wird in einer wässrigen Reaktionslösung bei 20 bis 80°C kultiviert, wodurch die entsprechende 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäure ins Medium abgegeben und als Säure oder in Form ihrer Salze gewonnen wird. Die verwendete (i?)-3- Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase hat die Eigenschaft, dass sie den (i?)-3-Hydroxycarbonyl- CoA-Ester im Verhältnis zum (5)-Enantiomeren von bevorzugt mindestens 2: 1 umsetzt, Der Umsatz von (i?)-Enantiomerem zu (5)-Enantiomerem liegt besonders bevorzugt bei 10: 1 bis 50: 1 oder höher. Vorzugsweise kommt das erfindungsgemäße Enzym in einem thermo-acidophilen Grampositiven Bakterienstamm, wie z. B. in Vertretern der Gattungen Ferrimicrohium, Sulfohacillus, Alicyclobacilhis und Kyrpidia, bei einer Inkubationstemperatur von 45 bis 70 °C zum Einsatz.
Die Verwendung von vorzugsweise acidophilen Gram-positiven Bakterien, die eine gute Resistenz gegenüber Säuren besitzen, erlaubt eine Akkumulation des angestrebten Produkts in der wässrigen Reaktionslösung. Von Vorteil ist weiterhin, dass das erfindungsgemäße Verfahren im mesophilen aber auch im thermophilen Temperaturbereich angewandt werden kann, welcher für industrielle Prozesse aufgrund erhöhter Syntheseraten günstig ist.
Eine besonders geeignete Variante des Verfahrens besteht in dem Einsatz des erfindungsgemäßen Mutase-Enzyms in Kombination mit einem Stoffwechselweg, der dazu führt, dass in dem verwendeten thermophilen Mikroorganismus (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA aus einfachen Kohlenstoffverbindungen synthetisiert wird. Dabei kann die Kohlenstoffquelle organisch aber auch anorganisch sein. Als organische Kohlenstoffquelle kann als Substrat zur Synthese des ( ?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Esters z.B. Methan verwendet werden. Als eine anorganische Kohlenstoffquelle kann z.B. Kohlenmonoxid oder Kohlendioxid in Kombination mit Sauerstoff und Wasserstoff als Substrat zur Synthese des (i?)-3- Hydroxycarbonyl-CoA-Esters eingesetzt werden. Neben dem o.g. Stamm der Gattung Kyrpidia (DSM 2912) können weiterhin vorzugsweise Vertreter der Gattungen Hydrogenophilus (Vesteinsdottir et al. 201 1 , Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61 :290-294) und Bacillus (Schenk & Aragno 1979, J. Gen. Microbiol. 1 15:333-341) im erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden, da sie bekanntermaßen unter autotrophen Wachstumsbedingungen, z. B. Stamm DSM 2912 (Bonjour & Aragno 1984, Arch. Microbiol. 139:397-401) zur Poly-3-hydroxybuttersäure-Bildung befähigt sind. Somit ist ein Stoffwechselweg über Acetyl-CoA und Acetoacetyl-CoA zu (R)-3 -Hydroxybutyryl-Co A induziert. Die Umwandlung in entsprechende 2-Hydroxy-2-methycarbonsäuren erfolgt dann in der Gegenwart einer erfindungsgemäßen Mutase.
Neben Stamm DSM 2912 ist ein weiterer besonders bevorzugter Stamm der Stamm Bacillus massiliosenegalensis (DSM 25957 auch bekannt als Stamm JC6: ClinMicrobiollnfect 2012; 18: 1 185-1 193 (DOI: 10.1 1 1 1/1469-0691.12023)) im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet, der vorzugsweise bei 25 bis 45°C kultiviert werden kann, mit einem Optimum bei 37°C.
In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante wird eine erfindungsgemäße (i?)-3- Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase in vorzugsweise thermophilen Mikroorganismen mit den oben genannte Stoffwechselfähigkeiten exprimiert, da das Mutase-Enzym dann das z.B. entstehende (i?)-3-Hydroxybutyryl-CoA zu 2-Hydroxyisobutyryl-CoA isomerisiert und somit 2-Hydroxyisobuttersäure ins Kulturmedium abgegeben wird. Die enzymatische Umsetzung durch Mikroorganismen ist keinesfalls auf die oben aufgeführten Beispiele beschränkt. Sämtliche Organismen, die in der Lage sind mithilfe einer erfindungsgemäßen Mutase 3-Hydroxycarbonsäuren in 2-Hydroxy-2-rnethylcarbonsäuren umzuwandeln, wobei sie die (R)- 3-Hydroxycarbonsäuren bevorzugen, können erfindungsgemäß eingesetzt werden. Dazu kann das genetische Material für eine erfindungsgemäße Mutase in einen Mikroorganismus nach an sich bekannten Techniken transfiziert werden. Geeignete Mikroorganismen können z. B. E, coli, Cupriavidus necator, Azohydromonas lata, Pseudomonas oleovorans, Methylosinus spp., Methylocyctis trichosporium, Methylobacter spp., Methylobacterium organophilum, Methylobacterium extorq ens, Methylobacterium rhodesianum, Ideonella spp., Rhodococcus ruber, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis, Bacillus macerans, Bacillus laterosporus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus brevis, Bacillus sphaericus, Bacillus circulans, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Streptomyces coelicolor, Streptomyces fradiae, Streptomyces parvus, Nocardia corallina u.a. sein. In einer weiteren Variante werden durch Optimierung des Stoffwechsels durch Erzeugung von Deletions-Mutanten oder ähnlichen Techniken Stammvarianten geschaffen, bei denen unerwünschte Nebenreaktionen z.B. des (i?)-3-Hydroxybutyryl-CoA- Stoffwechsels, wie z. B. die Rückoxidation zu Acetyl-CoA oder die Bildung von Poly-3-hydroxybuttersäure, reduziert oder ganz gestoppt sind.
Im Sinne der Erfindung können auch Zellextrakte und/oder eine erfindungsgemäße Cobalamin-abhängige (T?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase allein oder in Kombination mit anderen Proteinen, wie z. B. weiteren Cobalamin-bindenden Proteinen, Acyl-CoA- Synthetasen, MeaB-ähnlichen Chaperonen, Adenosyl-transferierenden Enzymen und Acyl- CoA-Lyasen, in angereicherter, isolierter oder synthetisch hergestellter Form eingesetzt werden. Dabei können 3-Hydroxycarbonsäuren, für die eine Isomerisierung angestrebt wird, unverestert als freie Säuren oder als CoA-Ester zugegeben werden.
In einem bevorzugten biologischen System wird ein erfindungsgemäßes Mutase-Enzym zusammen mit MeaB-ähnlichen Chaperonen exprimiert, wobei eine hohe Enzymaktivität erhalten bleibt. Ebenso kann eine Co-Expression mit Enzymen durchgeführt werden, die eine Adenosyl-Gruppe von ATP auf freies Cobalamin übertragen, wobei die Aktivität derartiger Enzyme ebenfalls den Erhalt einer hohen Mutase- Aktivität gewährleistet. Entsprechende Methoden sind z.B. von Padovani & Banerjee 2009, Proc. Nat. Acad. Sei. 106:21567-21572 beschrieben.
Erfindungsgemäß können auch zu einem biologischen System, das eine erfindungsgemäße (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase- Aktivität besitzt, 3-Hydroxycarbonsäuren zugegeben werden, deren Isomerisierung angestrebt wird. Letztere werden dann durch das System in (R)~ 3-Hydroxycarbonyl-CoA-Ester umgewandelt und durch eine erfindungsgemäße (i?)-3- Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase in die korrespondierenden 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl- CoA-Ester isomerisiert.
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuremoleküle, die eine erfindungsgemäße Cobalamin- abhängige Mutase zur Isomerisierung von (R)-3 -Hydroxycarbonyl-Co A- zu 2-Hydroxy-2- methylcarbonyl-CoA-Estern codieren. Sie sind bevorzugt ausgewählt aus
a) Nukleinsäuremoleküle, die ein Protein codieren, das die unter Sequenz-Nr. 2 und Sequenz-Nr. 4 oder die unter Sequenz Nr. 5 und Sequenz Nr. 6 angegebene Aminosäuresequenz umfasst;
b) Nukleinsäuremoleküle, die die unter Sequenz-Nr. 1 und Sequenz-Nr. 3 dargestellte
Nukleotidsequenz oder die unter Sequenz Nr. 7 und Sequenz Nr. 8 oder die unter Sequenz Nr. 9 und Sequenz Nr. 10 umfassen;
c) Nukleinsäuremoleküle, die mit einem der unter a) und b) genannten Nukleinsäuremoleküle hybridisieren und
d) Nukleinsäuremoleküle, deren Nukleotidsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der Sequenz der unter b) oder c) genannten Nukleinsäuremoleküle abweicht. Eine codierte (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase besitzt die unter Sequenz-Nr. 2 und Sequenz-Nr. 4 angegebenen Aminosäuresequenzen. Darüber hinaus kann die (i?)-3- Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase, die codiert wird, sich aus einem Vielfachen dieser verschiedenen Untereinheiten gemäß Sequenz-Nr. 2 und Sequenz-Nr. 4 zusammensetzen. Dabei weisen die codierten Enzyme eine Sequenzidentität zu den in den Sequenz-Nr. 2 und 4 angegebenen Aminosäuresequenzen von mindestens 50 %, vorzugsweise von mindestens 75%, besonders bevorzugt von mindestens 95 %, bzw. von mindestens 99% auf Aminosäureebene auf. Gegenstand der Erfindung ist auch die (T?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase, die die Sequenzen Nr. 2 und 4 als Monomer hat oder eine (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase, die mindestens 50 % Homologie aufweist, vorzugsweise mindestens 75%%, besonders bevorzugt mindestens 95 %, bzw. mindestens 99% Homologie zu diesen Sequenzen. Ganz besonders sind Mutasen geeignet, die eine Homologie von mindestens 75% zu den Sequenzen 2 und 4 aufweisen.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine (7i)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase, die die Sequenzen Nr. 5 und 6 als Monomer hat. Dabei besitzt die Sequenz Nr. 5 eine 78 %ige Identität zur Sequenz 2 und die Sequenz 6 eine 77 %ige Identität zur Sequenz Nr. 4.
Weiterhin Gegenstand der Erfindung sind (T?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutasen, die Oligomere der Sequenzen Nr. 2 und 4 oder deren . Homologen sind oder aufweisen. Vorzugsweise sind es Mutasen aus Oligomeren mit je 2 Kopien der Untereinheiten (also 2 x A + 2 x B). Dazu gehören auch die (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutasen mit mindestens 50 % Homologie, vorzugsweise mit mindestens 75%, besonders bevorzugt von mindestens 95 %, bzw. von mindestens 99% Homologie zu diesen Sequenzen. Das betrifft insbesondere die Sequenzen 5 und 6.
Darüber hinaus umfasst die Erfindung Proteine, die die (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA- Mutasen als Monomer oder Oligomer wie oben beschrieben, aufweisen, die fusioniert mit zusätzlichen Proteinen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cobalamin-bindenden Proteinen, Acyl-CoA-Synthethasen, MeaB-ähnlichen Chaperonen, Adenosyl-transferierenden Enzymen und/oder Acyl-CoA-Lyasen vorliegen. Eingeschlossen sind dabei Varianten, bei denen die weiteren Proteine nur mit einer Untereinheit fusioniert sind sowie die Proteine mit mindestens 50 % Homologie, vorzugsweise mit mindestens 75%, besonders bevorzugt von mindestens 95 %, bzw. von mindestens 99% Homologie zu diesen Sequenzen.
Seq. Nr. 1 zeigt die 1692 bp umfassende Nukleotidsequenz für die Untereinheit A einer Cobalamin-abhängigen (J?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA~Mutase aus DSM 2912.
Seq. Nr. 2 zeigt die 563 AS umfassende Aminosäuresequenz für die Untereinheit A einer Cobalamin-abhängigen (T?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase aus DSM 2912.
Seq. Nr. 3 zeigt die 399 bp umfassende Nukleotidsequenz für die Untereinheit B einer Cobalamin-abhängigen (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase aus DSM 2912. Seq. Nr. 4 zeigt die 132 AS umfassende Aminosäuresequenz für die Untereinheit B einer Cobalamin-abhängigen (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase aus DSM 2912.
Seq. Nr. 5 zeigt die 569 AS umfassende Aminosäuresequenz für die Untereinheit AI einer Cobalamin-abhängigen (Ä)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase aus Stamm DSM 25957 (78 % Identität zu Mut3A aus Stamm DSM 2912). Seq. Nr. 6 zeigt die 130 AS umfassende Aminosäuresequenz für die Untereinheit Bl einer Cobalamin-abhängigen (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase aus Stamm DSM 25957 (77 % Identität zu Mut3B aus Stamm DSM 2912).
Seq. Nr. 7 zeigt eine Codon optimierte 1692 bp umfassende Nukleotidsequenz für die Untereinheit A der Cobalamin-abhängigen (T?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase der Sequenz Nr. 2.
Seq. Nr. 8 zeigt eine Codon optimierte 399 bp umfassende Nukleotidsequenz für die Untereinheit B der Cobalamin-abhängigen (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase der Sequenz Nr. 4.
Seq. Nr. 9 zeigt die 1710 bp umfassende Nukleotidsequenz für die Untereinheit A einer Cobalamin-abhängigen (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase aus DSM 25957.
Seq. Nr. 10 zeigt die 393 bp umfassende Nukleotidsequenz für die Untereinheit B einer Cobalamin-abhängigen (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase aus DSM 25957.
Sequenz 1 = Gensequenz mut3A
Sequenz 2 = Proteinsequenz Mut3A
Sequenz 3 = Gensequenz mut3B
Sequenz 4 = Proteinsequenz Mut3B Sequenz 5 = Proteinsequenz Mut3Al
Sequenz 6 = Proteinsequenz Mut3Bl
Sequenz 7 = Gensequenz mut3Ä - Codon optimiert für E. coli
Sequenz 8 = Gensequenz mut3B - Codon optimiert für E. coli
Sequenz 9 = Gensequenz mut3Al
Sequenz 10 = Gensequenz mut3Bl
Sequenz 1 = Gensequenz mut3A
ATGGCTGÄTCAAGAGAAGCTCTTTAATGGAGACGAGATCCGGCGAATTCGACAGGAAAAG GAACGTTGGTACCGAGAGACGGTCAAAGGAAACGACGGAGGAAACGACTATGTGACGGAT TCGGGAATTCCTGTCAACCTGATCTACGGCCCGGACGACATCGCGGATTTCGATTATTTG AAAGAAAGCGGTTTTTCCGGAGAACCGCCCTATGTTCGGGGCGTTTATCCGAATATGTAC CGGGGTCGACTCTTCACTATCCGCCAGATCGCGGGATTCGGAACTCCGGAAGACACCAAT CGGCGATTCAAATTCCTCTTGGAGAACGGTGCGACAGGCACCAGCGTGGTGTTGGACCTG CCGACGATCCGCGGCTACGACTCCGATGATCCCAAAGCCGAGGGCCATGTTGGCGCCGCC GGAGTCGCCATTGACTCCCTGGAGGACATGGAGGCGCTCTATGACGGAATCCCCATCGAT CAGGTGTCTTCGÄACATCGTCACGCATTTGCCGAGCACCACGGTGGTGTTGATGGCGATG TTTGTGGCGATGGCCGAGAAACGGGGCCTGCCCCTCGAGAAGTTGTCCGGCACCAACCAG AATGATTTCTTGATGGAGACGACCATCGGCAGCTCGCTGGAGATTCTGCCGCCGAAGGCT TCCTTCCGGCTGCAGTGCGACTCCATTGAATACGCGAGCAAACGGCTCCCGAGGTGGAAC CCTGTGAGCTACAACGGGTACAACCTTCGAGAAGCGGGAACCACAGCGGTGCAGGAGGTG GGGTGCGCCATTGCCAACGCTATCGCCACGACGGAAGAGTTGATTCGCCGGGGAAATGAC GTCGATGACTTTGCAAAACGGCTGTCCTTTTTCTGGAACTTGTTCAACGATTTCTTCGAG GAGATTGCGAAATGCCGGGCATCGCGGCTGGTCTGGTACGACGTGATGAAAAATCGATTC GGCGCCAAGAATCCTCGATCCTATCTCATGCGTTTTCACGTGCAGACCGGGGGCATCACG TTGACGAAGGTGGAACCCCTGAACAACATTGCGCGGTCTGCGATTCAGGGACTGGCCGCC GTTTTGGGCGGGGCCCAGTCTTTGCACATCGÄTTCTTACGACGAAGCCTATTCGGCGCCC ACTGAACAGGCGGCTCTGGTCTCCCTGAGGACCCAGCAGATCATTCAAGTGGAGACGGGC GTAGTCAACACCGTTGACCCCTTGGCCGGCTCCTATTACGTGGAATATTTGACCCGAGAG ATGGCCGAACACATCCGGGCCTACATCGACCAGATCGAATCCCGGGGAGGAATCATCGCT GTCGTGGAAAGTGGGTGGCTGCACCGGGAAATCGCCGAATTCGCGTATCGAACCCAGCAG GACATCGAGACCGGGAAGCGAAAAGTGGTCGGTCTGAATTACTTCCCGTCCAAAGAAGCT GAAACCAAGGTCGAGGTGTTCCGTTATCCCGAAGATGCCGAGCGCATGCAGAAGGAAAAG TTGGCCAAACTGCGGGCTCGCCGGGACCCGGTGAAGGTGGAGCAGACCCTGCGGGTTCTT CGTGAGAAATGTCACGAAGATGTGAACATCCTGCCCTACGTAAAAGATGCCGTCGAAGCG TACTGCACCTTGGGCGAGATTCAAAACGTGTTCCGGGAAGAGTTCGGGCTGTGGCAGTTC CCTTTGGTTTGA
Sequenz 2 = Proteinsequenz Mut3A
MADQEKLFNGDEIRRIRQEKER YRETVKGNDGGNDYVTDSGI PVNLIYGPDDIADFDYL KESGFSGEPPYVRGVYPNMYRGRLFTIRQIAGFGTPEDTNRRFKFLLENGATGTSVVLDL PTIRGYDSDDPKAEGHVGAAGVAIDSLEDMEALYDGIPIDQVSSNIVTHLPSTTVVLMAM FVAMAEKRGLPLEKLSGTNQNDFLMET IGSSLEILPPKAS FRLQCDSIEYASKRLPRWN PVSYNGYNLREAGTTAVQEVGCAIANAIATTEELIRRGNDVDDFAKRLSFF NLFNDFFE EIAKCRASRLVWYDVMKNRFGAKNPRSYLMRFHVQTGGITLTKVEPLNNIARSAIQGLAA VLGGAQSLHIDSYDEAYSAPTEQAALVSLRTQQIIQVETGVVNTVDPLAGSYYVEYLTRE MAEHIRAYIDQIESRGGIIAVVESG LHREIAEFAYRTQQDIETGKRKVVGLNYFPSKEA ETKVEVFRYPEDAER QKEKLAKLRARRDPVKVEQTLRVLREKCHEDVNILPYVKDAVEA YCTLGEIQNVFREEFGLWQFPLV
Sequenz 3 = Gensequenz mut3B
ATGGAGAAAAAGATCAAGGTGATCATGGTCAAATTGGGACTCGACATTCATTGGCGCGGA GCGTTGGTGGTGTCCAAGATGCTTCGCGATCGGGGCATGGAAGTGGTCTATCTCGGCAAT CTGTTCCCCGAACAGATCGTCCAAGCGGCCGTCCAAGAGGGGGCCGACGTGGTGGGCTTG AGCACCCTAGGCGGCAACCATCTGACGTTGGGTCCCAAGGTGGTGGAGTTGTTGCGGGCG AAGGGAATGGAGGAGGTTCTCGTGATCATGGGCGGCGTGATCCCCGAGGAGGACGTCCCG GCCCTCAAGGAGGCGGGAATCGCTGAAGTGTTCGGGCCGGAAACCCCCATTGACGCCATC GAATCGTTCATTCGAAGCCGGTTTCCGGATCGGGATTGA
Sequenz 4 = Proteinsequenz Mut3B
MEKKIKVIMVKLGLDIH RGALVVSKMLRDRG EVVYLGNLFPEQIVQAAVQEGADVVGL STLGGNHLTLGPKVVELLRAKGMEEVLVIMGGVI PEEDVPALKEAGIAEVFGPETPI DÄI ESFIRSRFPDRD
Sequenz 5 = Proteinsequenz Mut3Al
MTKANVNQETKLFNQEVVKEIEAQKER KKETVKGKTGDGEYFSDSGIPVNLLYTPDDMK DI DYMKDIGLSGEAPYVRGVYPNMYRGRLFTVRQIAGYGTPEDT DRFKFLLKNGATGTS VVLDLPTIRGYDSDDPEAEGHVGAAGVAI DSLEDIEALYDGI PI DEISS IVTHLPSTTV VIMAMFAAMAEKKGIPFEKLSGTNQNDFLMETAIGSSLEVLPPKASFRLQCDAIEFASKN LPRWNPVSYNGYNLREAGTDAVAEVACALANÄIATSEELIRRGNKI DDFAKRLSFF NLY NDFFEEIAKCRASRVVYQEIMKERFHAEE KSQLMRFHVQTAGITLTKVEPLNNIARSAI QGLAAVLGGAQSLHVDSYDEAYSAPTEESALISIRTQQI IQTETNVVNTVDPLAGSYFVE YLTKEMAQRIRDYISEIESRGGLVACVDSGWLHREIADFAYQTQKEIENGTRKIVGLNYF PSEDHAGQKVEVFRYPETAEAKQKEKLERLRQKRDAKKVEEKLNVIREMCHQDVNLMPYI KDAVLEYATLGEIEEVFREEFGLWQFPLA
Sequenz 6 = Proteinsequenz Mut3Bl
MQVKVVMAKLGLDIHWRGALVVSR LRDEG EVVYLGNQFPEQIVEAAIQEGADVIGLST LGGNHLTLGPKVVKIAREKGVESLVIMGGVI PEDDIPLLKESGIAEVFGPETKVESIASF IREHVGKKIG Sequenz 7 = Gensequenz mut3A_optimiert
Codon-Optimierung für Expression in E. coli, Cupriavidusnecator und
Methylobacteriumextorquens
ATG GCC GAT CAG GAG AAG CTC TTC AAC GGC GAC GAG ATC CGG CGC ATC CGC CAG
GAA AAG GAA CGC TGG TAG CGC GAG AGG GTC AAG GGC AAC GAC GGC GGC AAC GAC
TAG GTG AGG GAT TCG GGC ATC CCG GTC AAC CTG ATC TAG GGC CCG GAC GAC ATC
GCG GAT TTC GAT TAG CTC AAG GAA AGG GGC TTC TCC GGC GAA CCG CCG TAG GTC
CGG GGC GTC TAG CCG AAC ATG TAG CGG GGC CGC CTC TTC ACC ATC CGC CAG ATC
GCG GGC TTC GGC ACC CCG GAA GAC ACC AAC CGG CGC TTC AAG TTC CTC CTC GAG
AÄC GGC GCG AGG GGC ACC AGG GTG GTG CTC GAC CTG CCG AGG ATC CGC GGC TAG
GAC TCC GAT GAT CCG AAG GCC GAG GGC CAC GTC GGC GCC GCC GGC GTC GCC ATC
GAG TCC CTG GAG GAC ATG GAG GCG CTC TAG GAC GGC ATC CCG ATC GAT CAG GTG
TCG TCG AAC ATC GTC AGG CAC CTC CCG AGG ACC AGG GTG GTG CTC ATG GCG ATG TTC GTG GCG ATG GCC GAG AAG CGG GGC CTG CCG CTC GAG AAG CTC CC GGC ACC
AAC CAG AAC GAT TTC CTC ATG GAG ACG ACC ATC GGC AGG TCG CTG GAG ATC CTG
CCG CCG AAG GCC TCC TTC CGG CTC CAG TGC GAC TCC ATC GAA TAC GCG AGG AAG
CGG CTC CCG CGC TGG AAC CCG GTG AGG TAC AAC GGG TAC AAC CTC CGC GAA GCG
GGC ACC AGG GCG GTG CAG GAG GTG GGG TGC GCC ATC GCC AAC GCC ATC GCC ACG
AGG GAA GAG CTG ATC CGC CGG GGC AAC GAC GTC GAT GAC TTC GCG AAG CGG CTG
TCC TTC TTC TGG AAC CTC TTC AAC GAT TTC TTC GAG GAG ATC GCG ÄAG TGC CGG
GCG TCG CGG CTG GTC TGG TAC GAC GTG ATG ÄAG AAC CGC TTC GGC GCC AAG AAC
CCG CGC TCC TAC CTC ATG CGC TC CAC GTG CAG ACC GGG GGC ATC ACG CTC ACG
AÄG GTG GAA CCG CTG AAC AAC ATC GCG CGG TCG GCG ATC CAG GGC CTG GCC GCC
GTC CTC GGC GGG GCC CAG TCG CTC CAC ATC GAT TCG TAC GAC GAA GCC TAC TCG
GCG CCG ACC GAA CAG GCG GCC CTG GTC TCC CTG CGC ACC CAG CAG ATC ATC CAG
GTG GAG AGG GGC GTG GTC AAC ACC GTC GAC CCG CTC GCC GGC TCC TAC TAC GTG
GAÄ TAG CTC ACC CGC GAG ATG GCC GAA CAC ATC CGG GCC TAC ATC GAC CAG ATC
GAA TCC CGG GGC GGC ATC ATC GCC GTC GTG GAA AGG GGG TGG CTG CAC CGG GAA
ATC GCC GAA TTC GCG TAC CGC ACC CAG CAG GAC ATC GAG ACC GGG AAG CGC ÄAG
GTG GTC GGC CTG AAC TAC TTC CCG TCC AAG GAA GCC GAA ACC ÄAG GTC GAG GTG
TTC CGC TAC CCG GAA GAT GCC GAG CGC ATG CAG AAG GAA AAG CTC GCC AAG CTG
CGG GCC CGC CGG GAC CCG GTG AAG GTG GAG CAG ACC CTG CGG GTC CTC CGC GAG
ÄAG TGC CAC GAA GAT GTG AAC ATC CTG CCG TAC GTG AAG GAT GCC GTC GAA GCG
TAG TGC ACC CTC GGC GAG ATC CAG AAC GTG TTC CGG GAA GAG TTC GGG CTG TGG
CAG TTC CCG CTC GTC TGA
Sequenz Nr. 8 = Gensequenz mut3B_opt imiert
Codon-Optimierung für Expression in E. coli, Cupriavidusnecator und
Methylobacteriumextorquens
ATG GAG AAG AAG ATC AAG GTG ATC ATG GTC AAG CTC GGC CTC GAC ATC CAC TGG CGC GGC GCG CTC GTG GTG TCC AAG ATG CTC CGC GAT CGG GGC ATG GAA GTG GTC TAC CTC GGC AAC CTG TTC CCG GAA CAG ATC GTC CAG GCG GCC GTC CAG GAG GGG GCC GAC GTG GTG GGC CTC AGG ACC CTG GGC GGC AAC CAC CTG AGG CTC GGC CCG AAG GTG GTG GAG CTG CTC CGG GCG AAG GGC ATG GAG GAG GTC CTC GTG ATC ATG GGC GGC GTG ATC CCG GAG GAG GAC GTC CCG GCC CTC AAG GAG GCG GGC ATC GCC GAA GTG TTC GGG CCG GAA ACC CCG ATC GAC GCC ATC GAA TCG TTC ATC CGC AGG CGG TTC CCG GAT CGG GAT GA
Sequenz 9 = Gensequenz muß AI
ATGACTAAAGCTAACGTAÄACCÄGGAAACAAAGCTATTTAATCAAGAÄGTCGTAAAAGAGAT TGAGGCACAAAAAGAGCGCTGGAAGAAGGAAACGGTAAAAGGAAAAACAGGGGATGGCGAAT ATTTCTCAGACTCAGGAATTCCTGTAAATCTTCTCTATACTCCTGATGACATGAAAGATATT GATTATATGAAAGATATTGGCTTATCAGGGGAAGCCCCTTATGTCCGTGGAGTATATCCAÄA TATGTACAGAGGGAGATTATTTACCGTTCGTCAAATTGCAGGATATGGAACACCTGAAGACA CCAATGATAGATTTAAATTTCTCTTGAAAAATGGTGCAACTGGAACGAGCGTCGTTTTGGAT CTTCCAACAATTCGTGGTTATGATTCGGATGATCCAGAAGCAGAGGGGCATGTAGGAGCTGC AGGAGTTGCCATTGATTCCTTAGAAGATATTGAAGCGCTTTATGATGGGATCCCAATTGATG AAATTTCAAGTAATATCGTTACCCATCTTCCGAGTACCACGGTTGTTATCATGGCGATGTTT GCAGCAATGGCAGAGAAAAAAGGAATTCCTTTCGAAAAATTATCTGGAACAAATCAAAATGA CTTTTTAATGGAAACAGCAATTGGAAGTTCCTTAGAAGTCTTACCGCCTAAAGCATCTTTCC GÄCTACAATGTGATGCCATTGAATTCGCTAGTAAAAATTTACCGCGATGGAATCCAGTCAGT TATAATGGCTACAATCTTCGTGAAGCAGGGACGGATGCTGTTGCAGAAGTAGCATGTGCGTT AGCAAACGCAATTGCAACATCGGAAGAATTAATAAGAAGAGGAAATAAAATTGATGATTTTG CCAAGCGACTTTCTTTCTTCTGGAATCTATATAATGACTTTTTTGAAGAAATTGCAAAATGT CGAGCATCCCGAGTTGTTTACCAAGAAATTATGAAGGAGCGTTTTCATGCAGAAGAAATGAA ATCTCAGTTAATGAGATTCCATGTCCAAACGGCAGGTATTACGTTAACCAAAGTAGAGCCAC TTAATAATATCGCACGTTCTGCCATTCAAGGCTTAGCAGCTGTACTTGGCGGGGCACAGTCC TTACACGTTGATTCTTATGATGAAGCTTATTCTGCÄCCAACAGAAGÄATCGGCCTTAATTTC CATTAGAACACAGCAÄATTATTCAÄACAGAÄACÄAATGTCGTCAÄCACAGTTGACCCATTAG CTGGTTCCTATTTTGTTGAGTATCTAACAAAGGAAATGGCGCAGAGAATCCGTGATTACATT TCTGAAATTGAATCAAGAGGCGGTTTGGTTGCTTGTGTTGATTCTGGTTGGCTACATCGAGA GATTGCAGATTTTGCTTACCAAACACAGAAAGAGATTGAAAATGGTACTCGTAAAATTGTGG GCTTAAACTATTTTCCGAGTGAAGACCACGCCGGACAAAAGGTAGAAGTATTTCGATATCCA GAAACAGCGGAAGCGAAGCAAAAGGAGAAATTAGAGAGACTTCGTCAGAAAAGAGATGCCAA AAAAG T T G AAG AAAAAT AAAT G T G AT T C G AG AAAT G T G T C AT C AAG AT GT G AAT T AAT G C CTTATATAAAGGATGCTGTTTTGGAATATGCAACATTAGGTGAAATAGAAGAAGTTTTTAGA GAAGAATTTGGATTATGGCAATTTCCATTAGCGTGA
Sequenz 10 = Gensequenz mut3Bl
ATGCAAGTTAAAGTGGTTATGGCGAAGTTAGGTTTAGATATCCATTGGCGTGGTGCACTTGT CGTCTCTAGAATGTTAAGGGATGAAGGGATGGAAGTCGTTTATTTAGGAAATCAGTTTCCAG AACAAATTGTAGAAGCGGCAATTCAAGAAGGGGCTGATGTTATTGGATTAAGCACTCTGGGC GGAAATCATCTAACATTGGGGCCAAAAGTGGTCAAAATTGCCAGAGAAAAAGGAGTAGAATC ACTTGTTATCATGGGCGGTGTTATTCCAGAAGATGATATACCTTTGCTAAAAGAATCCGGAA TTGCTGAAGTATTTGGGCCGGAGACCAAGGTGGAATCAATCGCTTCATTTATTCGTGAGCAT GTAGGGAAAAAAATAGGGTAA
Anschließend werden Beispiele aufgeführt, die die Erfindung näher beschreiben, auf die sie jedoch nicht beschränkt werden soll. Allgemeine Methoden
Homologievergleiche von Nukleotid- und Aminosäuresequenzen wurden mit dem Programm BLAST (BLASTN bzw. BLASTP) mit den allgemeinen Grundeinstellungen (Matrix = BLOSUM62) durchgeführt (Altschul et al. 1990, Journal of Molecular Biology 215: 403- 410). Das BLAST-Programm kann erhalten werden vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) und aus anderen Quellen.
Für das Screening nach Mikroorganismen mit (T?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase-Aktivität und für die Anzucht von Mikroorganismen auf 2-Hydroxyisobuttersäure wurde ein Basalmedium (Tab. 1) verwendet. Inkubiert wurde unter Schütteln oder Rühren im Dunkeln bei den in den Beispielen genannten Temperaturen, pH- Werten und Substratkonzentrationen. Zur Überprüfung der Vitamin B12-Abhängigkeit des Wachstums auf 2- Hydroxyisobuttersäure wurde jeweils ein Ansatz mit Basalmedium ohne Vitamin B12 und ein Ansatz mit Vitamin B12 (0,05 mg/L) inkubiert. Tabelle 1
Basalmedium (mg/L)
NH4C1 761 ,4 Biotin 0,02
KH2P04 340,3 Folsäure 0,02
K2HP04 435,5 Pyridoxin-HCl 0,1
CaC12 X 6 H20 5,5 Thiamin 0,05
MgS04 x 7 H20 71 ,2 Riboflavin 0,05
ZnS04 x 7 H20 0,44 Nicotinsäure 0,05
MnS04 x H20 0,615 DL-Ca-Panthothenat 0,05
CuS04 x 5 H20 0,785 p-Aminobenzoesäure 0,05
Na2Mo04 x 2 H20 0,252 Liponsäure 0,05
FeS04 X 7 H20 14,96
Für den Enzymassay zur Bestimmung der (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase- Aktivität in Protein-Rohextrakten oder Enzympräparaten wurden Reaktionsansätze (Tab. 2) mit den in den Beispielen genannten CoA-Estern als Substrate mit Protein aus Rohextrakten oder mit aufgereinigten Enzymuntereinheiten bei den in den Beispielen angegebenen Temperaturen und S ubstratkonzentrati onen inkubiert.
Tabelle 2
MgCl 10 mM
Kaliumphosphat 50 mM
Glycerin 10 %
Coenzym B12 0,833 mM
pH-Wert 6,6
Die CoA-Ester, die als Substrate im Enzymassay zur Bestimmung der ( ?)-3- Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase-Aktivität eingesetzt wurden, wurden aus den freien Säuren nach der einschlägigen Methode über Aktivierung mit Thiophenol und anschließender Umesterung mit Coenzym A (CoA) hergestellt, wie sie z. B. bei Padmakumar et al. 1993 (Padmakumar et al. 1993, A rapid method for the synthesis of methylamlonyl-coenzyme A and other CoA-esters. Anal. Biochem. 214: 318-320) beschrieben ist.
Die im Enzymassay eingesetzten CoA-Ester-Substrate und die entstandenen Produkte wurden mittels HPLC bestimmt. Als mobile Phase diente ein Laufmittel bestehend aus 14,5 Vol-% Acetonitril, 10 niM Tetrabutylammoniumhydrogensulfat und 100 mM Natriumphosphat mit einem pH-Wert von 4,5. Damit wurden die CoA-Ester auf der Säule Nucleosil 100-5 C18 (Machcrey-Nagel) aufgetrennt. Die Detektion erfolgte bei 260 nm mithilfe eines photometrischen Detektors.
Nicht-veresterte organische Säuren, die bei der Inkubation mit ganzen Zellen als Substrat dienten oder gebildet wurden, wurden ebenfalls mittels HPLC bestimmt. Als mobile Phase diente ein Laufmittel bestehend aus 10 mN Schwefelsäure in Wasser. Damit wurden die Säuren auf der Säule Nucleogel Ion 300 OA (Macherey-Nagel) aufgetrennt. Die Detektion erfolgte mithilfe eines Brechungsindex-Detektors. Die Proteinkonzentration der Protein-Rohextrakte und der Enzympräparate wurde mithilfe der Bradfordreagenz (Merck) nach Protokoll des Herstellers bestimmt. Als Standard diente Rinderserumalbumin.
Beispiel 1:
Screening nach mesophilen und thermophilen Mikroorganismen mit 3-Hydroxycarbonyl- CoA-Mutase-Aktivität
Verschiedene Anreicherungskulturen sowie mesophile und thermophile Stämme aus den Gattungen Bacillus und Geobacillus sowie aus anderen mikrobiellen Gattungen wurden daraufhin getestet, ob sie in Flüssigkultur (Basalmedium, pH 6,8) auf 2- Hydroxyisobuttersäure (Startkonzentration 1 g L) als einzige Energie- und organische Kohlenstoffquelle wachsen können. Die Inkubationstemperatur betrug für dieses Screening 30 oder 50 °C. Der Bakterienstamm DSM 2912 zeigte überraschend die gesuchte Fähigkeit.
Das Wachstum von DSM 2912 auf 2-Hydroxyisobuttersäure war zudem Vitamin B12- abhängig, was auf einen Cobalamin-abhängigen Schritt im zugrunde liegenden dissimilatorischen Stoffwechsel hindeutet. Für die Bestimmung der Generationszeiten von Stamm DSM 2912 auf 2- Hydroxyisobuttersäure wurde der Stamm in einem 1-L-Fermenter mit pH- und Temperaturkontrolle inkubiert. Der pH-Wert wurde durch automatische Titration mit 0,2 M Lösungen von Natronlauge und Salzsäure konstant gehalten. Das Wachstum wurde durch Messung der optischen Dichte bei 700 nm mittels Photometer verfolgt. Wachstum auf 2-Hydroxyisobuttersäure (Startkonzentration 2 g/L) mit Generationszeiten unter 60 Stunden wurde mit dem Stamm DSM 2912 in einem pH-Bereich von 5,5 bis 8,0 bei einer optimalen Inkubationstemperatur von 55 °C beobachtet (Abb. 1). Das pH-Optimum lag im schwach sauren Bereich bei pH 6,7. Bei diesem pH-Wert und bei Inkubationstemperaturen von 55, 60 und 62 °C betrugen die Generationszeiten 9, 10 und 12 Stunden (Abb. 1).
Für die Bestimmung einer 3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase-Aktivität im Protein-Rohextrakt von auf 2-Hydroxyisobuttersäure gewachsenen Zellen wurden diese durch Zentrifugation geerntet (10 min, 4 °C, 13000 x g) und nach Suspendieren in Aufschlusspuffer (100 mM Tris/HCl, pH 7) durch Inkubation in einer Kugelmühle aufgeschlossen. Durch eine erneute Zentrifugation (10 min, 4 °C, 13000 x g) wurden Zellreste und noch intakte Zellen abgetrennt und der Überstand für den Enzym assay verwendet. In diesen Protein-Rohextrakten konnte eine thermophile 3 -Hydroxycarbonyl-Co A-Mutase- Aktivität nachgewiesen werden. So wurde mit 2-Hydroxyisobutyryl-CoA als Substrat (Startkonzentration 300 μΜ) bei einer Inkubationstemperatur von 55 °C eine sehr hohe spezifische Enzym-Aktivität von 1 1 ,1 nmol/min/mg Gesamtprotein erzielt. Auch bei einer höheren Temperatur von 65 °C und mit 2-Hydroxyisobutyryl-CoA als Substrat wurde noch eine hohe Enzym-Aktivität von 5,6 nmol/min/mg Gesamtprotein gemessen.
Beispiel 2
Heterologe Expression des 3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase-Enzyms Mut3AB aus Stamm DSM 2912 in E. coli TOP 10
Da sich Vertreter der Enzymfamilie der Cobalamin-abhängigen Mutasen bezüglich ihrer Aminosäuresequenz relativ ähnlich sind, wurde versucht, durch Homologievergleich (BLASTP-Programm) mithilfe der Sequenz der Methylmalonyl-CoA-Mutase aus Propionibacterium freudenreichü subsp. shermann NCIB 9885 (Accession-Nr. CAA33090) mögliche Kandidaten für eine 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA-Mutase im Stamm DSM 2912 zu identifizieren. Die Suche im bereits veröffentlichten Genom des Stammes DSM 2912 (Klenk et al. 201 1 , Standards in Genomic Sciences 201 1 , 5: 121-134; Accession-Nr. NC_014098) ergab 3 Genregionen mit Mutase-codierenden Genen. Die erste Region mit dem Locus-Tag Btus 1313 codiert wahrscheinlich für eine Methylmalonyl-CoA-Mutase, da die Sequenz des korrespondierenden Genprodukts große Ähnlichkeit zu dem Enzym aus Propionibacterium freudenreich» subsp. shermanü NCIB 9885 zeigt. Die zweite Region mit dem Locus-Tag Btus_1053 codiert wahrscheinlich für eine Isobutyryl-CoA-Mutase, die mit dem MeaB-ähnlichen Chaperon Meal fusioniert ist, wie es kürzlich für andere Bakterienstämme beschrieben worden ist (Cracan et al. 2010, J. Biol. Chem. 285:655-666). Die dritte Genregion mit den Locus-Tags Btus_0469 und Btus_0470 zeigt keine größere Ähnlichkeit zu bekannten Mutasen, so dass eine Zuordnung nicht vorgenommen werden konnte. Deshalb wurden die zwei Gene, die für die Untereinheiten A (Btus_0469) und B (Btus_0470) codieren und im Weiteren mutSA und mut3B genannt werden, in zwei E. coli TOPlO-Stämme kloniert und exprimiert.
Für die Klonierung wurde zunächst genomische DNA aus Stamm DSM 2912 mithilfe des DNA Extraction Kit (Macherey-Nagel) gewonnen. Danach wurden mit dieser DNA die für die Untereinheiten A und B der Mutase codierenden Gene mut3A und muÜB mittels PCR amplifiziert. Dabei wurde die PCR mit der proof-reading OneTaq DNA-Polymerase (NEB) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen durchgeführt.
Primerpaare waren für mutSA: 5'-AGC GGC TCT TCA ATG GCT GAT CAA GAG AAG CTC TTT A-3' (forward primer - Sequenz Nr. 1 1) und 5'-AGC GGC TCT TCT CCC AAC CAA AGG GAA CTG CCA CA-3' (reverse primer - Sequenz Nr. 12); und für mut3B: 5'-AGC GGC TCT TCA ATG GAG AAA AAG ATC AAG GTG A-3' (forward primer - Sequenz Nr. 13) und 5'-AGC GGC TCT TCT CCC ATC CCG ATC CGG AAA CCG G-3' (reverse primer - Sequenz Nr. 14). Die PCR-Reaktionsansätze wurden 30 Zyklen mit jeweils 20 s bei 94 °C, 30 s bei 57 °C und 3 min bei 68 °C für muÜA bzw. 1,5 min bei 68 °C für mutSB inkubiert. Die so erhaltenen PCR- Produkte wurden jeweils in den Vektor pASG-IBA43 (IBA Göttingen) nach Protokoll des Herstellers kloniert. Die Transformation von E. coli TOP 10 erfolgte ebenfalls nach dem Protokoll von IBA Göttingen.
Die so erhaltenen Stämme E. coli TOP 10 pASG-IBA43::/«w/J.4 und E. coli TOP 10 pASG- IBA43 :mut3B wurden auf LB-Medium in Gegenwart von Ampicillin (100 mg/L) angezogen. Die Induktion der Mutase-Gene erfolgte mit Anhydrotetracyclin (200 ^ig/L) für 3 Stunden bei 30 °C. Die Bakterienzellen wurden wie oben im Beispiel 1 für die Zellen des Stammes DSM 2912 beschrieben durch Zentrifugation geerntet und aufgeschlossen.
Nach Induktion konnte bereits durch Kombination der Protein-Rohextrakte der Stämme E. coli TOP 10 pASG-IB A43 : :mut3A und E. coli TOP 10
Figure imgf000022_0001
2-Hydroxy- 2-methylcarbonyl-CoA-Mutase- Aktivität bei 30, 40 und 50 °C erhalten werden (mit 2- Hydroxyisobutyryl-CoA als Substrat bei einer Startkonzentration von 120 μΜ), wobei die bei 50 °C gemessene Aktivität deutlich über den bei 30 und 40 °C gemessenen Umsatzraten lag (Abb. 2). Damit wurde das Genprodukt aus mut3A und mut3B als thermophile 3- Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase identifiziert. Durch Affinitätschromatographie wurden die beiden Untereinheiten aufgereinigt und die Enzymaktivität weiter charakterisiert (s. Beispiel 3)·
Beispiel 3
Aktivität der 3 -Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase Mut3AB aus Stamm DSM 2912 nach heterologer Expression in E. coli TOP 10 und Aufreinigung durch Affinitätschromatographie
Die Aufreinigung der Enzymuntereinheiten der 3 -Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase aus Stamm DSM 2912 aus den in Beispiel 2 gewonnenen Protein-Rohextrakten erfolgte mittels Affinitätschromatographie mithilfe einer Strep-Tactin-Superflow- 10-mL-Säule (IBA Göttingen) nach dem Protokoll des Herstellers.
Die nach heterologer Expression durch Affinitätschromatographie aufgereinigte und aus den Untereinheiten A und B bestehende 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA-Mutase aus dem Stamm DSM 2912 zeigte eine hohe Enzymaktivität mit den Substraten 2-Hydroxyisobutyryl- CoA und 3-Hydroxybutyryl-CoA. Mit 2-Hydroxyisobutyryl-CoA als Substrat (Startkonzentration 150 μΜ) wurden bei 30 bis 70 °C hohe spezifische Aktivitäten erzielt (Abb. 3), wobei das Optimum bei 50 °C lag. Mit 3-Hydroxybutyryl-CoA als Substrat (Startkonzentration 200 μΜ) wurde bei 50 °C auch eine hohe Aktivität erreicht. Dabei wurde mit dem (j?)-Enantiomer des 3-Hydroxybutyryl-CoA-Esters die höchste Aktivität erzielt, die damit 2-fach über der bei 50 °C gemessenen Umsatzrate mit dem 2-Hydroxyisobutyryl-CoA- Ester und sogar 10-fach über der Rate mit dem (5 -3-Hydroxybutyryl-CoA-Ester lag (Abb. 4). Beispiel 4
Produktion von 2-Hydroxyisobuttersäure durch eine N-limitierte Kultur des Stammes DSM 2912
Um eine Induktion der (J?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase- Aktivität zu erreichen, wurden Zellen des Stammes DSM 2912 bei 55 °C in Basalmedium (pH 6,8) mit Vitamin B 12 auf Acetat (1 g/L) plus 2-Hydroxyisobuttersäure (1 g/L) angezogen. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet und in N-freiem Basalmedium suspendiert, eine Zellkonzentration von 0,52 g/L (bezogen auf das Trockengewicht) eingestellt und mit Acetat (1 ,2 g/L) bei 55 °C in Gegenwart des Translationsinhibitors Chloramphenicol (1 mM) weiter inkubiert, wodurch der Overflow-Stoffwechsel über Acetyl-CoA in Richtung (R)-3- Hydroxybutyryl-CoA stimuliert wurde. Es wurde erwartet, dass durch die vorangegangene Induktion der (i?)-3 -Hydro xycarbonyl -Co A-Mutase- Aktivität jetzt 2-Hydroxyisobuttersäure aus Acetat über 3 -Hydroxybutyryl-Co A synthetisiert wird. Tatsächlich konnte im Kulturüberstand eine kontinuierliche Bildung von 2-Hydroxyisobuttersäure bei gleichzeitigem Verbrauch des zugegebenen Acetats beobachtet werden (Abb. 5). Die Ausbeute betrug 0,012 g 2-Hydroxyisobuttersäure/g Acetat. Beispiel 5
Bestimmung der kinetischen Kenndaten für die Aktivität der 3-Hydroxycarbonyl-CoA- Mutase Mut3AB aus Stamm DSM 2912 Für die Bestimmung der kinetischen Kenndaten wurden zunächst die pH- und Temperatur- Optima für das wie in den Beispielen 2 und 3 heterolog exprimierte und durch Affinitätschromatographie aufgereinigte Enzym ermittelt. Dafür wurden die spezifischen Aktivitäten für die Isomerisierung von 2-Hydroxyisobutyryl-CoA (Startkonzentration 400 μΜ) bei verschiedenen pH-Werten und Temperaturen gemessen. Für die Bestimmung des pH-Optimums wurde der Enzymassay bei 50 °C mit zwei verschiedenen Puffern durchgeführt (Abb. 6). Abweichend von Tabelle 2 wurden bei dem Acetat/Phosphat-Puffer nicht 50 mM Kaliumphosphat, sondern 50 mM Kaliumphosphat plus 50 mM Natriumacetat bei den in Abb. 6 angegebenen pH-Werten eingesetzt. Bei dem Tris/Phosphat-Puffer wurde die Pufferwirkung des 50 mM Kaliumphosphates durch Zugabe von 50 mM Tris bei den in Abb. 6 angegebenen pH- Werten erhöht. Die höchste Aktivität wurde unabhängig vom verwendeten Puffer bei einem pH- Wert von 7.8 (Abb. 6) erhalten. Bei diesem pH- Wert wurde dann unter Verwendung des Tris/Phosphat-Puffers das Temperaturoptimum bestimmt. Die höchste Aktivität wurde bei einer Temperatur von 55 °C (Abb. 7) erhalten. Bei 30 °C ist die Aktivität des Enzyms 4,0-mal und bei 75 °C 1 ,8 -mal geringer als beim Temperaturoptimum von 55 °C.
Bei den ermittelten optimalen Inkubationsbedingungen (Tris/Phosphat-Puffer, pH 7,8, 55 °C) wurden dann die Michaelis-Menten-Konstante Km und die maximale spezifische Aktivität Vmax für die Substrate (7?)-3-Hydroxybutyryl-CoA, (5)-3-Hydroxybutyryl-CoA und 2- Hydroxyisobutyryl-CoA für einen Konzentrationsbereich bis 10 mM bestimmt (Abb. 8). Die Werte für Km und Vmax wurden dabei durch Nicht-Lineare-Regressionsanalyse auf der Basis der Hill-Funktion berechnet (mithilfe des Programms OriginPro 8G in den allgemeinen Grundeinstellungen). Diese Werte und daraus ableitbare Größen wie die Wechselzahl kcat und die katalytische Effizienz kcat/Km sind in Tabelle 3 aufgeführt. Bezogen auf Vmax wird (i?)-3- Hydroxybutyryl-CoA von dem Enzym 3,12-mal schneller umgesetzt als (<S)-3- Hydroxybutyryl-CoA. Bezogen auf die katalytische Effizienz beträgt das Verhältnis von (i?)~ zu (5)-Enantiomer sogar 1 1 ,3 : 1 , da sich auch die Affinitäten (Km- Werte) des Enzyms zu den Substraten deutlich unterscheiden. Tabelle 3 :
Kinetische Kenndaten der 3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase Mut3AB aus Stamm DSM 2912 für die Isomerisierung der angegebenen Substrate bei pH 7.8 und 55 °C. Die Aktivität Vmax ist auf die eingesetzte Proteinmenge bezogen.
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Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Isomerisierung von (i?)-3 -Hydroxycarbonsäuren zu entsprechenden 2- Hydroxy-2-methylcarbonsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass Mikroorganismen oder ein Rohextrakt davon, die die Aktivität einer Cobalamin-abhängi gen (R)-3 -Hydroxycarbonyl- CoA-Mutase zur Isomerisierung von (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA- und 2-Hydroxy-2- methylcarbonyl-CoA-Estern aufweisen oder die mit der genannten Cobalamin-abhängigen Mutase transfiziert sind, in einer wässrigen Reaktionslösung bei 20 bis 80°C kultiviert werden, wodurch die entsprechende 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäure ins Medium abgegeben und als Säure oder in Form ihrer Salze gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus oder ein Rohextrakt davon verwendet wird, der Enzymaktivitäten aufweist, die intrazellulär einen (R)- 3-Hydroxycarbonyl-CoA-Ester synthetisieren und diesen (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Ester zu den korrespondierenden 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren umwandeln.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ein thermo-acidophiler Gram-positiver Bakterienstamm oder ein thermophiler Gram-negativer Bakterienstamm ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend die Gattungen Kyrpidia, Hydrogenophilus, Ferrimicrobium, Sulfobacillus und A l icyclobacill us, vorzugsweise Kyrpidia.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionslösung bei Temperaturen von 45 bis 70 °C inkubiert wird, vorzugsweise bei 45 bis 55°C.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Zellextrakte und/oder die Cobalamin-abhängige (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase in angereicherter, isolierter oder synthetisch hergestellter Form eingesetzt werden, wobei 3- Hydroxycarbonsäuren, für die eine Isomerisierung angestrebt wird, unverestcrt als freie Säuren oder als CoA-Ester zugegeben werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine anorganische Kohlenstoffquelle, vorzugsweise Kohlenmonoxid oder Kohlendioxid in Kombination mit Sauerstoff und Wasserstoff, als Substrat zur Synthese eines (R)-3- Hydroxycarbonyl-CoA-Esters eingesetzt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine organische Kohlenstoffquelle als Substrat zur Synthese eines (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA- Esters eingesetzt wird, vorzugsweise Methan.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion unter Zugabe externer 3-Hydroxycarbonsäuren erfolgt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Cobalamin-abhängige (T?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase die unter Sequenz-Nr. 2 und
Sequenz-Nr. 4 angegebenen Aminosäuresequenzen umfasst oder die Sequenzen Nr. 2 und 4 besitzt oder ein Protein ist, das eine Homologie von mindestens 50 % zu den Sequenzen 2 und 4 besitzt.
1 1. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in Kombination mit weiteren Cobalamin-bindenden Proteinen, Acyl-CoA-Synthethasen, MeaB-ähnlichen Chaperonen, Adenosyl-transferierenden Enzymen und/oder Acyl-CoA- Lyasen, in angereicherter, isolierter oder synthetisch hergestellter Form erfolgt, wobei die 3- Hydroxycarbonsäuren, für die eine Isomerisierung angestrebt wird, unverestert als freie Säuren oder als CoA-Ester zugegeben werden.
12. Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, dass es eine (7?)-3 -Hydroxycarbony 1- CoA-Mutase mit den Sequenzen Nr. 2 und 4 oder eine (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase mit den Sequenzen Nr. 5 und 6 codiert.
13. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es die Sequenzen Nr. 1 und Nr. 3, Nr. 7 und Nr. 8 oder Nr. 9 und Nr. 10 aufweist.
14. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die codierte (R)-3 -Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase sich aus einem Vielfachen der Sequenz Nr. 2 und Sequenz Nr. 4 oder der Sequenz Nr. 5 und Sequenz Nr. 6 zusammensetzt.
15. (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase als Monomer mit der Sequenz Nr. 2 und Sequenz Nr. 4 und seine zu mindestens 50 % Homologen, vorzugsweise seine zu mindestens 75 % Homologen .
16. (i?)~3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase gemäß Anspruch 14 als Monomer mit der Sequenz Nr. 5 und Sequenz Nr. 6.
17. (Ä)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase mit einem Vielfachen der Sequenz Nr. 2 und Sequenz Nr. 4 in Form eines Oligomeren und seine zu mindestens 50 % Homologen, vorzugsweise seine zu 75 % Homologen.
18. (i?)-3 -Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase gemäß Anspruch 17 mit einem Vielfachen der Sequenz Nr. 5 und Sequenz Nr.6 in Form eines Oligomeren.
19. Protein umfassend eine (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18 fusioniert mit zusätzlichen Proteinen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cobalamin-bindenden Proteinen, Acyl-CoA-Synthetasen, MeaB-ähnlichen Chaperonen, Adenosyl-transferierenden Enzymen und/oder Acyl-CoA-Lyasen.
20. Verfahren zur Herstellung von 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass eine (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase, die 3-Hydroxycarbonyl-
CoA- in 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA-Ester umwandelt, gemäß einem der Ansprüche 14 bis 18 verwendet wird, wobei ein Mikroorganismus oder ein Rohextrakt, der die Mutase aufweist, in einer wässrigen Reaktionslösung bei 20 bis 80°C kultiviert wird, wodurch die entsprechende 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäure ins Medium abgegeben und als Säure oder in Form ihrer Salze gewonnen wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete ( ?)-3- Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase den (i?)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Ester im Verhältnis zum (5)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Ester von mindestens 2: 1 , bevorzugt mindestens 10: 1 umsetzt. 22, Verfahren nach Anspruch 20 oder 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionslösung bei Temperaturen von 45 bis 70 °C inkubiert wird, vorzugsweise bei 45 bis 55°C.
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