DE102014212069A1

DE102014212069A1 - Verfahren zur Herstellung organischer Verbindungen

Info

Publication number: DE102014212069A1
Application number: DE102014212069.1A
Authority: DE
Inventors: Thore Rohwerder; Falk Harnisch; Maria Teresa Weichler; Luis Filipe Morgado Rosa; Carla Gimkiewicz
Original assignee: Helmholtz Zentrum fuer Umweltforschung GmbH UFZ
Current assignee: Helmholtz Zentrum fuer Umweltforschung GmbH UFZ
Priority date: 2014-06-24
Filing date: 2014-06-24
Publication date: 2015-12-24
Anticipated expiration: 2034-06-25
Also published as: DE102014212069B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung organischer Verbindungen und Produkte aus diesen organischen Verbindungen, wobei Kohlendioxid (CO₂) elektrochemisch in reduzierte C1-Verbindungen an einer Kathode umgewandelt wird und ein die organische Verbindung produzierender methylotrophen Mikroorganismus oder ein Zell- oder Rohextrakt davon, der mindestens einen Stoffwechselweg für die Verwertung der C1-Verbindungen als Kohlenstoff- und Energiequelle aufweist, kultiviert wird. Die organischen Verbindungen werden nach Akkumulation in den Zellen des Mikroorganismus bzw. Abgabe ins Medium gewonnen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung organischer Verbindungen und Produkte aus diesen organischen Verbindungen, wobei Kohlendioxid (CO₂) elektrochemisch in reduzierte C1-Verbindungen an einer Kathode umgewandelt wird und ein die organische Verbindung produzierender methylotrophen Mikroorganismus oder ein Zell- oder Rohextrakt davon, der mindestens einen Stoffwechselweg für die Verwertung der C1-Verbindungen als Kohlenstoff- und Energiequelle aufweist, kultiviert wird. Die organischen Verbindungen werden nach Akkumulation in den Zellen des Mikroorganismus bzw. Abgabe ins Medium gewonnen.
Für die Erzeugung von Elektrizität aus Sonnenlicht, Windkraft und weiteren regenerativen Energiequellen steht heutzutage eine Vielzahl von größtenteils technisch ausgereiften Verfahren zur Verfügung. Neben der direkten Nutzung der so gewonnenen Elektrizität, kann diese Energie, insbesondere z. B. bei eventuell temporär anfallender Überschussproduktion, auch für eine elektrochemische CO₂-Reduktion und damit verknüpften nachhaltigen Produktion von reduzierten C1-Verbindungen Verwendung finden. Die elektrochemische Reduktion von CO₂ zu Ameisensäure, Formaldehyd oder Methanol ist literaturbekannt (z. B. Mikkelsen et al. 2010, "The teraton challenge. A review of fixation and transformation of carbon dioxide", Energy Environ. Sci. 3: 43–81).
In diesem Zusammenhang sind auch bereits verschiedene Verfahren bekannt gemacht worden, die die elektrochemische Reduktion von CO₂ behandeln, z. B. die Verwendung von Gasphasenelektroden, die Verwendung von Zinn-basierten Kathoden, die Verwendung von Molybdän-Kathoden zur ausschließlichen Produktion von Methanol, die CO₂-Reduktion unter erhöhten Drücken und Temperaturen und die Verwendung von nicht-wässrigen Elektrolytlösungen. Des Weiteren wurden auch schon bestimmte Teilaspekte wie z. B. die Elektrodenmaterialien und Reaktorgeometrien behandelt.
Es ist weiterhin bekannt, dass die elektrochemische Reduktion von CO₂ zu Ameisensäure mit der mikrobiellen Synthese von Alkoholen, namentlich Isobutanol und 3-Methyl-1-butanol, kombiniert werden kann (Li et al. 2012, Science 335: 1596). In einem integrierten Prozess wurde die an einer Indium-Kathode entstehende Ameisensäure unter aeroben Bedingungen direkt durch einen gentechnisch modifizierten Ralstonia eutropha H16(identisch mit Cupriavidus necator H16, DSM 428 und ATCC 17699)-Stamm als Energie- und Kohlenstoffquelle genutzt. In diesem Verfahren oxidieren die Bakterien zunächst die Ameisensäure komplett zu CO₂, um Energie- und Reduktionsäquivalente für assimilatorische Reaktionen zu gewinnen. Die Synthese von Biomasse, den genannten Alkoholen oder anderen Metaboliten/Produkten erfolgt dann ausschließlich autotroph durch CO₂-Fixierung mithilfe des in Ralstonia eutropha H16 vorhandenen Calvin-Zyklus. Dieses Verfahren unter Nutzung eines autotrophen Stoffwechsels zur Synthese von höherwertigen organischen Verbindungen aus reduzierten C1-Verbindungen, ist umständlich und ineffizient, da die elektrochemisch gebildete Ameisensäure nicht direkt durch den Mikroorganismus assimiliert werden kann, sondern über den Umweg einer kompletten Oxidation und erneuten, jetzt mikrobiellen (d. h. autotrophen), CO₂-Fixierung zu dem gewünschten Produkt konvertiert wird.
Die elektrochemische CO₂-Reduktion in einem zur mikrobiellen Kultivierung geeigneten Medium bzw. in Gegenwart von Mikroorganismen stellt eine erhebliche Herausforderung dar, da in komplexen Medien verstärkt Nebenreaktionen auftreten, welche zu einer (potentiellen) Verringerung der Produktionsraten/-ausbeuten führen können sowie zu einem „Blockieren” der Elektrodenoberfläche und damit zu deren Inaktivierung und zu einer unerwünschten, da schädlichen Interaktion mit den Mikroorganismen.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, ein effektives Verfahren zur Herstellung von organischen Verbindungen zu finden, das hohe Ausbeuten gewährleistet. Dabei bestand die Aufgabe insbesondere darin, elektrochemische und mikrobielle Teilreaktionen zu kombinieren und bevorzugt ein integriertes Verfahren bereitzustellen, d. h. die elektrochemische Reduktion von CO₂ in Gegenwart von aktiven mikrobiellen Zellen/Biomasse zu ermöglichen. Weiterhin bestand die Aufgabe in der Verbesserung der elektrochemischen CO₂-Reduktion in diesen Medien für die Bereitstellung von C1-Körpern, welche mikrobiell verwertet werden können.
Die Aufgabe kann durch ein Verfahren gelöst werden, das die elektrochemische CO₂-Reduktion mit einer mikrobiellen Verwertung der elektrochemisch reduzierten C1-Verbindungen kombiniert, wobei methylotrophe Mikroorganismen oder genetisch manipulierte Vertreter dieser Stoffwechselgruppe bzw. Zellextrakte oder Rohextrakte davon zur Produktion höherwertiger organischer Verbindungen kultiviert werden. Die methylotrophen Mikroorganismen können die elektrochemisch gewonnenen reduzierten C1-Verbindungen als Energie- und Kohlenstoffquelle nutzen. Sowohl die elektrochemische Reduktion von CO₂ als auch die mikrobielle Produktion von höherwertigen organischen Verbindungen erfolgt bevorzugt in einer wässrigen Reaktionslösung in einem Temperaturbereich von bevorzugt 4 bis 100°C. Die entsprechenden Syntheseprodukte werden ins Medium abgegeben bzw. Akkumulieren in den Mikroorganismen.
Die elektrochemische Reduktion umfasst dabei alle Verfahren, bei welchem ein mittel- oder unmittelbarer Transfer von Elektronen von einer Elektrode (d. h. einem Elektronenleiter) zu gasförmigem CO₂ bzw. gelöstem CO₂ und Carbonaten erfolgt. Da es sich um eine Reduktionsreaktion handelt, wird die Arbeitselektrode auch genauer als Kathode spezifiziert.
Reduzierte C1-Kohlenstoffquellen, hier auch reduzierte C1-Verbindungen genannt, umfassen bevorzugt die Verbindungen Methanol, Formaldehyd und Ameisensäure bzw. Salze der Ameisensäure (Formiate), die elektrochemisch aus CO₂ in gasförmiger oder gelöster Form bzw. aus den entsprechenden Salzen gewonnen werden können. Mit dem Verfahren wird insbesondere gasförmiges CO₂ und/oder gelöstes CO₂/HCO₃ ^– an der Kathode zu reduzierten C1-Verbindungen umgewandelt.
Es wurde überraschend gefunden, dass die methylotrophen Mikroorganismen auch direkt die elektrochemisch aus CO₂ bereitgestellten reduzierten C1-Verbindungen zu höherwertigen organischen Verbindungen, wie z. B. 2-Hydroxyisobuttersäure, in einem integrierten Prozess konvertieren. Elektrochemische und mikrobielle Verfahrensschritte können deshalb sowohl räumlich voneinander getrennt ablaufen (desintegriertes Verfahren), als auch in einem Reaktionsgefäß stattfinden (integriertes Verfahren).
Bei den organischen Zielverbindungen handelt es sich bevorzugt um Grund- und Feinchemikalien, die vorzugsweise eine Kettenlänge von mindestens 2 bis 20 Kohlenstoffatomen (C2 bis C20) aufweisen. zeigt zahlreiche Verbindungen, die z. B. aus reduzierten C1-Verbindungen synthetisiert werden können. Diese können dann gegebenenfalls zu Folgeprodukten umgesetzt werden.
Eine entsprechende Vorrichtung zur CO₂-Reduktion umfasst im Wesentlichen einen oder mehrere Reaktoren mit Elektrolysezellen, die mit Elektroden (Anoden und Kathoden sowie Referenzelektroden), Potentiostaten bzw. Gleichstromquellen, Abschirmungen und Ionenaustauschmembranen/Separatoren ausgestattet sind. Gegebenenfalls erfolgt in der gesamten Anlage oder Teilen der Anlage eine Durchmischung der Medien z. B. durch Rührer. Gegebenenfalls können die Gase über lokale Druckgeneratoren zugegeben werden. Zur Prozessüberwachung werden in die Vorrichtung z. B. diverse Messsonden (pH-Meter, Messsonden für Gase) installiert.
Für das integrierte Verfahren wird z. B. ein Reaktor verwendet, vorzugsweise aus Glas, Kunststoff oder Edelstahl, der mehrere Ein- und Auslässe aufweist und in einer temperierbaren Umgebung installiert ist. Der Reaktor umfasst mindestens zwei Kammern, wobei mindestens eine Kammer, die gleichzeitig zur mikrobiellen Fermentation dient, die Arbeitselektrode(n) (d. h. Kathode(n)) mit Referenzelektrode(n) aufweist und, eine davon abgeschirmte Kammer mit Gegenelektrode(n) (d. h. Anode(n)) bestückt ist. Die Kammern sind ionisch verbunden, z. B. durch Verwendung einer Membran als Separator.
Im desintegrierten Verfahren findet ein mikrobieller Fermentationsreaktor Verwendung, der mit der elektrochemischen Reaktionskammer verbunden ist bzw. der mit dem in der elektrochemischen Teilreaktion erzeugten reduzierten C1-Verbindungen versorgt wird. Vorzugsweise erfolgt die Substrateinspeisung in den mikrobiellen Fermenter direkt über z. B. eine Pumpe. Gegebenenfalls wird eine Aufbereitungsstufe zwischengeschaltet, z. B. zur Änderung des pH-Wertes oder zur Konzentrierung der elektrochemischen Produkte.
In beiden Fällen wird der Gaszugang (CO₂ und ggf. Inertgase und O₂) mit einer definierten Flussrate geregelt. Die Elektrolysezellen werden z. B. bei konstanter Spannung der Arbeitselektrode gegenüber der Referenzelektrode oder gepulst in reiner Elektrolytlösung oder in Gegenwart von methylotropher Biomasse betrieben.
Das gasförmige CO₂ und/oder gelöste CO₂/HCO₃ ^–, das an der Kathode reduziert wird, kommt aus verschiedenen Prozessen zur Anwendung. Die elektrische Energie kann ebenfalls aus verschiedenen Quellen zur Anwendung kommen, z. B. können die Kontakte an eine photovoltaische Energiegewinnungsanlage angeschlossen sein, so dass mit der dort in elektrische Energie umgewandelten solaren Energie die CO₂-Umwandlung möglich ist. Eine weitere bevorzugte Anwendung ist die entsprechende Kombination mit Wind- und Wasserkraftanlagen sowie der direkte Anschluss an das Stromnetz. Besonders bevorzugt ist die Kombination mit anderen Kraftwerk- und Industrieanlagen, bei denen neben der Stromerzeugung die Abscheidung und Speicherung von CO₂ eine Rolle spielt, wie in Biogasverbrennungsanlagen oder auch in Kombination mit CCS-Verfahren (Carbon Dioxide Capture and Storage).
Erfindungsgemäß wird in dem kombinierten Verfahren die elektrochemische CO₂-Reduktion hin zu reduzierten C1-Verbindungen vorzugsweise bei einem konstanten negativen Elektrodenpotential (potentiostatischer bzw. chronoamperometrischer Betrieb) oder bei einem konstanten negativen Reduktionsstrom (galvanostatischer Betrieb) durchgeführt. Galvanostatische Betriebsweisen rufen ein korrespondierendes Potential an der Elektrode hervor, während bei potentiostatischen Betriebsweisen dieses angelegt wird und ein korrespondierender Strom fließt.
Im Folgenden wird beispielhaft die potentiostatische Betriebsweise genauer beschrieben, jedoch sind beide Betriebsweisen im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft anwendbar.
Die elektrochemische CO₂-Reduktion wird gemäß vorliegender Erfindung vorzugsweise bei einem konstanten negativen Elektrodenpotential an der Kathode (als „Arbeitspotential” bezeichnet) durchgeführt, wobei der Potentialbereich vorteilhafter weise auf einen Wert von 0 V vs. SHE (standard hydrogen electrode = Standardwasserstoffelektrode) bis –5,0 V vs. SHE eingestellt wird. Dies wird als „Potentialfenster” des Arbeitspotentials bezeichnet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante des elektrochemischen Verfahrensschrittes erfolgt die elektrochemische CO₂-Reduktion bei einem variierenden Elektrodenpotential bzw. Stromfluss, im Folgenden als „Pulsverfahren” bezeichnet. Es kann eine gepulste Stromversorgung eingesetzt werden, bei der der Strom zwischen zwei Werten, von denen der eine kleiner als der andere, Null oder sogar umgepolt sein kann. Im Pulsverfahren wird in konstanten oder alternierenden Zeitabschnitten das Potential der Kathode (Arbeitspotential bzw. Arbeitsstromfluss) hin zu einem anderen Potential bzw. Stromfluss („Pulspotential”) verändert. Das hat den Vorteil, dass eine Deaktivierung bzw. Verblockung der Kathode verhindert wird. Dabei kann das Pulspotential kurzzeitig auch außerhalb des o. g. Potentialfensters liegen, jedoch liegt es vorzugsweise zwischen –10,0 V vs. SHE und +1,5 V vs. SHE. Zur Erzielung eines effizienten Wirkungsgrades liegt das „Potentialfenster” des Arbeitspotentials besonders bevorzugt zwischen 0 V und –3 V vs. SHE.
Eine besonders vorteilhafte Verfahrensvariante des Pulsverfahrens besteht darin, dass die Kathode periodisch einer Offenzellspannung (OCP) oder einer Unterbrechung des Stromkreises unterworfen wird und sich so Phasen von Stromfluss (Produktion von reduzierten C1-Verbindungen) und keinem Stromfluss (keine Produktion von reduzierten C1-Verbindungen) abwechseln. Die Pulsdauer kann dabei zwischen 1 Sekunde und 2 Tagen variieren, ist jedoch stets kürzer als die Dauer des Anlegens des Arbeitspotentials. Es können unterschiedliche Intervalle eingestellt werden, die in der Regel zwischen 5 und 30 Minuten liegen können, wobei sich ein Pulsregime mit einem Intervall von 15 min als besonders effektiv erwiesen hat. Die Pulsdauer kann dann zwischen 2 und 10 Minuten liegen.
Des Weiteren können in dem Reaktor mehrere Kathoden eines oder unterschiedlicher Typen vorhanden sein, welche entweder synchron oder räumlich oder zeitlich versetzt betrieben werden, dies schließt insbesondere den Betrieb bei verschiedenen Arbeitspotentialen sowie den Betrieb von unterschiedlichen bzw. zeitlich versetzten Pulsverfahren mit ein.
Beim desintegrierten Verfahren gibt es hinsichtlich der Temperaturen und Drücke im Rahmen der technischen Umsetzbarkeit keine Einschränkungen für die elektrochemische Reaktionsführung.
Die Gesamtreaktion des integrierten Verfahrens und die mikrobielle Teilreaktion des desintegrierten Verfahren verlaufen unter Bedingungen, welche auch die mikrobielle Kultivierung erlauben, insbesondere im Temperaturbereich von 4°C bis 100°C, so dass die Stammkultivierung, elektrochemische CO₂-Reduktion sowie Produktbildung ablaufen können. Das Gesamtverfahren bzw. die mikrobielle Teilreaktion kann hierbei bei einem Druck der Gase/Gasmischungen von etwa 1 (= normaler Atmosphärendruck) bis zu 1000 bar (als reines Gas oder in Mischungen mit Inertgasen und gegebenenfalls Sauerstoff bei Verwendung aerober methylotropher Mikroorganismen) erfolgreich durchgeführt werden.
Weiterhin kann die elektrochemische Reaktion in wässrigen Medien durchgeführt werden, welche bereits die für die Mikrobiologie benötigten Nährstoffe und Puffer enthalten. Insbesondere durch die bevorzugte Anwendung des Pulsverfahrens konnte eine überraschende Kompatibilität von Elektrochemie und Mikrobiologie erzielt werden (wie in den Beispielen ausführlicher beschrieben).
Wie bereits ausgeführt, verläuft die elektrochemische Umwandlung von CO₂ an der Kathode. Als Elektrodenmaterial können verschiedene Metalle und Nichtmetalle zum Einsatz kommen. Als Metalle werden z. B. Indium, Zinn, Blei, Thallium, Cadmium, Wismut, Gold, Silber, Zink, Gallium, Kupfer, Nickel, Eisen, Platin, Titan u. a. und deren bi-, trinäre und höhere Legierungen verwendet. Des Weiteren schließt dies Elektrodenmaterialien ein, welche auf einer funktionalen Oberflächenbeschichtung der genannten Materialien auf einem Trägermaterial beruhen, dazu gehören auch leitfähige Trägermaterialien wie Edelstähle oder Graphite. Als Nichtmetalle können beispielsweise Graphit und Graphitmodifikationen (u. a. Kohlenstoffnanoröhrchen oder Kohlenstoffnanopartikel) sowie alle entsprechenden Verbundmaterialien verwendet werden. Die Elektrodenspezifikation kann alle geometrischen Formen und Modifikationen der genannten Metalle und Nichtmetalle aufweisen, insbesondere Bleche, Platten, Folien, Rundlinge, Röhren, Schwämme, Gelege, Gewebe, Bürsten, Zylinder. Besonders bevorzugte Kathodenmaterialien sind Folien aus Indium-, Platin-, Kupfer-, Edelstahl- und Kohlenstoff-basierten Materialien.
Als Medien können alle möglichen Elektrolytlösungen z. B. wässrige Salzlösungen/Elektrolytlösungen und mikrobielle Nährlösungen sowie ionische Flüssigkeiten eingesetzt werden. Bevorzugt finden mineralische Medien Verwendung, die mikrobielles Leben ermöglichen. Die Salze enthalten z. B. Kationen und Anionen, die ausgewählt sind aus den folgenden Gruppen:
Kationen: H⁺, NH₄ ⁺; K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺, Na⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Co²⁺;
Anionen: OH^–, Cl^–, BO₃ ^3–, PO₄ ^3–, HPO₄ ^2–, H₂PO₄ ^–, SO₄ ^2–, MoO₄ ^2–, NO₃ ^–.
Weiterhin können Mikronährstoffe und Vitamine vorhanden sein, vorzugsweise Biotin, Folsäure, Pyridoxin-HCl, Thiamin-HCL, Riboflavin, Nicotinsäure, DL-Ca-Pantothenat, Vitamin B12, p-Aminobenzoesäure, Liponsäure.
Vorzugsweise wird mindestens eine Anode eingesetzt, die sowohl im die Kathode umgebenden wässrigen Medium als auch von dieser Reaktionslösung durch eine Membran getrennt ist.
Eine weitere bevorzugte Variante ist der Einsatz einer zusätzlichen Anode oder sogar mehrerer Anoden, welche eine bioelektrochemische Kultivierung der methylotrophen Mikroorganismen erlauben. Diese haben insbesondere im integrierten Verfahren die Funktion, dass sie bei Verwendung von aeroben Mikroorganismen partiell oder komplett die Elektronen des mikrobiellen Elektronentransportsystems/Atmungskette abgreifen, die sonst auf Sauerstoff übertragen werden. Damit können die Ausbeuten (electron conversion efficiency = ECE) gesteigert werden, d. h. es geht weniger Energie „verloren” als bei dem Prozess ohne Anode. Des Weiteren lässt sich der mikrobielle Stoffwechsel, insbesondere die Biomassebildung, so kontrollieren.
Die erfindungsgemäße elektrochemische CO₂-Reduktion an der Kathode mit Pulsverfahren hat die folgenden Vorteile:

– Es können Bedingungen gewählt werden, welche „physiologisch” sind und extreme pH-Bedingungen, bzw. hohe Salzkonzentrationen, oder die Verwendung von org. Lösungsmitteln oder ionischen Flüssigkeiten vermeiden.
– Die CO₂-Reduktion kann auch in Anwesenheit geringer Mengen von Sauerstoff – trotz Konkurrenz durch die Sauerstoffreduktionsreaktion (ORR – oxygen reduction reaction) – effizient erfolgen (was für eine Kopplung mit einer aeroben mikrobiellen Kultivierung vorteilhaft ist), in Gegenwart von (Luft)Sauerstoff werden gute Produktionsraten erzielt.
– Es kann bei niedrigen Zellpotentialen und geringen Kathodenspannungen gearbeitet werden, wobei mit hohen Effizienzen unter den genannten Bedingungen insbesondere gute Formiatproduktionsraten erreicht werden.

Wie bereits ausgeführt, können die elektrochemischen und mikrobiellen Teilreaktionen dabei in aufeinander folgenden Verfahrensschritten (desintegrierter Ansatz) oder in einem Reaktionsgefäß (integrierter Ansatz) stattfinden.
Erfindungsgemäß kommen methylotrophe Mikroorganismen oder Zell- oder Rohextrakte davon zur Produktion von höheren organischen Verbindungen zum Einsatz, die mindestens einen Stoffwechselweg für die Verwertung der C1-Verbindungen als Kohlenstoff- und Energiequelle aufweisen. Da im integrierten Verfahren die Bedingungen zur Durchführung der Elektrolyse mikrobielles Wachstum bzw. zumindest mikrobielles Leben erlauben, ist stets die unmittelbare Produktion der gewünschten organischen Verbindungen mit den elektrochemisch erzeugten C1-Verbindungen möglich. Auch die Anzucht der für die gewünschte Syntheseleistung benötigten Biomasse kann bereits in der Elektrolysezelle, bevorzugt mittels der elektrochemisch erzeugten reduzierten C1-Verbindungen, erfolgen. Schon während des Wachstums können dann die gewünschten organischen Verbindungen produziert werden.
Die für die biotechnologische Produktion der gewünschten organischen Verbindungen benötigte mikrobielle Biomasse kann auch unabhängig von der elektrochemischen Erzeugung der C1-Verbindungen auf geeigneten Substraten und unter geeigneten Inkubationsbedingungen angezogen werden. Das heißt Biotransformation (= Produktion) und Wachstum/Aufrechterhaltung der Biomasse können voneinander getrennt stattfinden.
Organische Verbindungen produzierende methylotrophe Mikroorganismen können Bakterien, Archaeen, Hefen oder Pilze sein. Der Begriff methylotrophe Mikroorganismen umfasst erfindungsgemäß sowohl aerob als auch anaerob lebende prokaryotische und eukaryotische Mikroorganismen, die die genannten reduzierten C1-Kohlenstoffverbindungen mithilfe des bei diesen Organismen natürlich vorkommenden methylotrophen Stoffwechsels fakultativ oder obligat als alleinige Energie- und Kohlenstoffquelle für den Erhaltungsstoffwechsel und zum Wachstum sowie insbesondere zur Synthese von gewünschten Metaboliten, welche Zwischen- oder Endprodukte des Verfahren darstellen, nutzen können. Der Begriff methylotropher Stoffwechsel umfasst alle bekannten Stoffwechselwege, die für die assimilatorische und dissimilatorische Verwertung der reduzierten C1-Verbindungen natürlich in aeroben und anaeroben methylotrophen Mikroorganismen vorkommen.
Methylotrophe Stoffwechselwege wie sie in aeroben bzw. falkultativ denitrifizierenden Mikroorganismen vorkommen, sind z. B. bei Chistoserdova et al. 2009 (Chistoserdova et al. 2009, Annu. Rev. Microbiol. 63: 477–499) und Anthony 1982 (Anthony 1982, "The Biochemistry of Methylotrophs", Academic Press, London) beschrieben. Die am weitesten in aeroben bzw. falkultativ denitrifizierenden Mikroorganismen verbreiteten assimilatorischen methylotrophen Stoffwechselwege sind der Ribulosemonophosphat-Weg und der Serin-Weg. Methylotrophe Stoffwechselwege wie sie in obligat anaeroben Mikroorganismen vorkommen sind z. B. der so genannte Wood-Ljungdahl-Weg in acetogenen Mikroorganismen (Ragsdaleand Pierce 2008, "Acetogenesis and the Wood-Ljungdahl Pathway of CO2 Fixation", Biochim. Biophys. Acta 1784: 1873–1898) und der Methanogenese-Stoffwechsel in methanogenen Mikroorganismen (Thauer 1998, „Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson", Microbiology 144: 2377–2406). In dem aeroben Bakterienstamm Methylobacterlum extorquens AM1 ist beispielsweise der Serin-Weg in Kombination mit dem so genannten Ethylmalonyl-CoA-Weg für die Assimilation von reduzierten C1-Verbindungen verantwortlich (Chistoserdova et al. 2009, Annu. Rev. Microbiol. 63: 477–499, Abbildung 1).
Erfindungsgemäß können somit durch Wildtyp-Stämme, die vorzugsweise mit zusätzlichen Stoffwechselwegen versehen sind (z. B. durch genetische Manipulation), zahlreiche organische Verbindungen hergestellt werden bzw. als Edukte für nachfolgende mikrobielle und/oder chemische Synthesewege eingesetzt werden. Sämtliche methylotrophe Organismen, die in der Lage sind aus reduzierten C1-Verbindungen gewünschte organische Verbindungen oder Vorstufen dieser Verbindungen herzustellen, können erfindungsgemäß eingesetzt werden.
Das heißt, die eingesetzten Mikroorganismen enthalten neben dem für den methylotrophen Stoffwechsel zur Assimilation und Dissimilation der reduzierten C1-Verbindungen notwendigen genetischen Material in der Regel zusätzlich genetisches Material kodierend enzymatische Aktivitäten, die für die Synthese einer gewünschten organischen Verbindung notwendig sind. Für die Synthese von 3-Hydroxycarbonyl-CoA-Ester aus Acetyl-CoA und die Isomerisierung der 3-Hydroxycarbonyl-CoA-Ester zu den entsprechenden 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA-Ester ist es z. B. eine entsprechende metabolische Sequenz umfassend mindestens eine Acyl-COA-Mutase sowie eine Beta-Ketothiolase und eine Acetoacetyl-CoA-Reduktase. Die genetischen Materialien können in den Mikroorganismus nach an sich bekannten Techniken transfiziert werden. Alternativ können Mikroorganismen Verwendung finden, die die benötigten enzymatischen Aktivitäten bereits aufweisen. Unter enzymatischen Aktivitäten werden im Sinne der Erfindung Enzyme bzw. Proteine oder sie enthaltende Mikroorganismen verstanden, die ein definiertes Substrat in einem bestimmten Zeitraum umsetzen können.
Vorzugsweise werden methylotrophe Mikroorganismen oder eines Zell- oder Rohextraktes davon im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt, die neben der Möglichkeit der Verwertung von reduzierten C1-Verbindungen als Kohlenstoff- und Energiequelle mindestens ein Polynukleotid aufweisen, das für ein Enzym mit Acyl-COA-Mutase-Aktivität kodiert bzw. die mit mindestens einem Enzym mit Acyl-CoA-Mutase-Aktivität transfiziert sind.
Geeignete Mikroorganismen können z. B. sein:
Bacillus spp., Bacillus methanolicus, Methylosinus spp., Methylosinus acidophilus, Methylosinus pucelana, Methylosinus sporium, Methylosinus trichosporium, Methylocystis spp., Methylocystis bryophila, Methylocystis echinoides, Methylocystis heyeri, Methylocystis hirsute, Methylocystis methanolicus, Methylocystis minimus, Methylocystis parvus, Methylocystis pyriformis, Methylocystis rosea, Methylobacter spp., Methylobacter bovis, Methylobacter capsulatus, Methylobacter chroococcum, Methylobacter luteus, Methylobacter marinus, Methylobacter psychrophilus, Methylobacter tundripaludum, Methylobacter vinelandii, Methylobacter whittenburyi, Methylobacterium spp., Methylobacterium adhaesivum, Methylobacterium aerolatum, Methylobacterium aminovorans, Methylobacterium aquaticum, Methylobacterium brachiatum, Methylobacterium brachythecii, Methylobacterium bullatum, Methylobacterium cerastii, Methylobacterium dankookense, Methylobacterium extorquens, Methylobacterium fujisawaense, Methylobacterium gnaphalii, Methylobacterium goesingense, Methylobacterium gossipiicola, Methylobacterium gregans, Methylobacterium haplocladii, Methylobacterium hispanicum, Methylobacterium iners, Methylobacterium isbiliense, Methylobacterium jeotgali, Methylobacterium komagatae, Methylobacterium longum, Methylobacterium marchantiae, Methylobacterium mesophilicum, Methylobacterium nodulans, Methylobacterium organophilum, Methylobacterium oryzae, Methylobacterium oxalidis, Methylobacterium persicinum, Methylobacterium phyllosphaerae, Methylobacterium platani, Methylobacterium podarium, Methylobacterium populi, Methylobacterium radiotolerans, Methylobacterium rhodesianum, Methylobacterium lusitanum, Methylobacterium rhodinum, Methylobacterium salsuginis, Methylobacterium soli, Methylobacterium specialis, Methylobacterium suomiense, Methylobacterium tardum, Methylobacterium tarhaniae, Methylobacterium thiocyanatum, Methylobacterium thuringiense, Methylobacterium trifolii, Methylobacterium variabile, Methyloba cterium zatmanii, Methylocapsa spp., Methylocapsa acidiphila, Methylocapsa aurea, Methylomonas spp., Methylomonas methanica Methylomonas aminofaciens, Methylomonas aurantiaca, Methylomonas fodinarum, Methylomonas koyamae, Methylomonas paludis, Methylomonas rubra, Methylomonas scandinavica, Methylopila spp., Methylopila capsulata, Methylopila helvetica, Methylopila musalis, Methylopila jiangsuensis, Methyloversatilis spp., Methyloversatilis universalis, Methyloversatilis thermotolerans, Methylococcus spp., Methylococcus capsulatus, Methylococcus mobilis, Methylococcus thermophilus, Methylovorus spp., Methylovorus glucosotrophus, Methylovorus mays, Methylovorus menthalis, Methylovulum spp., Methylovulum miyakonense, Methylosoma spp., Methylosoma difficile, Methylogaea spp., Methylogaea oryzae, Methylocella spp., Methylocella silvestris, Methylibium spp., Methylibium petroleiphilum, Methyloferula spp., Methyloferula stellata, Hyphomicrobium spp., Hyphomicrobium nitrativorans, Hyphomicrobium denitrificans, Hyphomicrobium aestuarii, Hyphomicrobium chloromethanicum, Hyphomicrobium facile, Hyphomicrobium hollandicum, Hyphomicrobium methylovorum, Hyphomicrobium sulfonivorans, Hyphomicrobium vulgare, Hyphomicrobium zavarzinii, Bradyrhizobium spp., Bradyrhizobium oligotrophicum, Bradyrhizobium japonicum, Starkeya spp., Starkeya novella, Rhizobium spp., Thermoanaerobacter spp., Thermoanaerobacter kivui, Moorella spp., Moorella the thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Moorella glycerini, Moorella humiferrea, Moorella mulderi, Moorella perchloratireducens, Moorella stamsii, Sporomusa acidovorans, Acetobacterium spp., Acetobacterium woodii, Candida spp., Candida boidini Pichia spp., Pichia pastoris, Pichia methanolica, Hansenula spp., Hansenula polymorpha, Paecilomyces spp., Paecilomyces variotii, Penicillium spp., Penicillium chiysogenum u. a.
In einer weiteren Variante werden z. B. durch Erzeugung von Deletions-Mutanten oder durch ähnliche Techniken Stammvarianten geschaffen, bei denen unerwünschte Nebenreaktionen z. B. des (R)-3-Hydroxybutyryl-CoA-Stoffwechsels, wie die Rückoxidation zu Acetyl-CoA oder die Bildung von Poly-3-hydroxybuttersäure, reduziert oder ganz gestoppt sind.
In einer bevorzugten Variante liegt im verwendeten methylotrophen Mikroorganismus oder eines Zell- oder Rohextraktes davon mindestens ein Polynukleotid vor, das eine Cobalamin-abhängige (R)- und/oder (S)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase kodiert oder mit dieser(en) Mutase(n) transfiziert ist. Vorzugsweise wird eine Cobalamin-abhängige (R)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase aus einem gemäßigt acidophilen Gram-positiven Bakterienstamm eingesetzt, der zur Gattung Kyrpidia gehört. Besonders bevorzugt kann im erfindungsgemäßen Verfahren eine Mutase aus dem Stamm Kyrpidia tusciae eingesetzt werden, der z. B. unter DSM 2912, IFO 15312 und NBRC 15312 kommerziell verfügbar ist und die z. B. in WO 2014044674 A2 beschrieben ist.
Ganz besonders bevorzugt wird als methylotropher Mikroorganismus ein mit mindestens einer Acyl-CoA-Mutase-Aktivität transfizierter Stamm der Bakterienart Methylobacterium extorquens eingesetzt, in der Regel Methylobacterium extorquens AM1. Weiterhin können andere methylotrophe Mikroorganismen, die die reduzierten C1-Verbindungen wie der Stamm Methylobacterium extorquens AM1 über den Serin-Weg assimilieren und somit direkt Acetyl-CoA bilden, eingesetzt werden.
Beispielhaft ist dargestellt, wie reduzierte C1-Verbindungen in Methylobacterium extorquens AM1 u. a. direkt als Acetyl-CoA assimiliert ( ) werden. Dieser Metabolit kann als unmittelbare Vorstufe beispielsweise für die Synthese von (R)-3-Hydroxybutyryl-CoA und anderen (R)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Estern angesehen werden, da diese aus Acetyl-CoA durch enzymatische Kondensation und nachfolgende Reduktion leicht gebildet werden können. Katalysiert wird z. B. die Synthese von (R)-3-Hydroxybutyryl-CoA aus Acetyl-CoA durch die Beta-Ketothiolase PhaA (z. B. MexAM1_META1p3700) und die Acetoacetyl-CoA-Reduktase PhaB (z. B. MexAM1_META1p3701), die beide bereits im natürlichen methylotrophen Stoffwechsel des Stammes AM1 aktiv sind (Chistoserdova et al. 2009, Annu. Rev. Microbiol. 63: 477–499).
Durch angepasste Inkubationsbedingungen (z. B. N-Mangel durch Unterbrechung der Ammonium-Dosierung) kann die Bildung von (R)-3-Hydroxybutyryl-CoA oder anderen (R)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Estern aus Acetyl-CoA und damit die natürliche Bildung von (R)-3-Hydroxybutyryl-CoA im methylotrophen Stoffwechsel durch Induktion des Stoffwechsels für die Synthese des Speicherstoffes Poly-(R)-3-hydroxybuttersäure (PHB) deutlich gesteigert werden. Die Induktion erfolgt fachgemäß beispielsweise unter Bedingungen, bei denen im Kulturmedium für den Organismus leicht zugängliche Quellen für die Assimilation von Stickstoff, wie z. B. Ammonium, Nitrat oder Aminosäuren, verbraucht sind bzw. gezielt entfernt werden (z. B. Madison und Huisman 1999, "Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates): from DNA to plastic",. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63: 21–53; Steinbüchel und Hein 2001, "Biochemical and molecular basis of microbial synthesis of polyhydroxyalkanoates in microorganisms", Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 71: 81–123).
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können elektrochemisch gewonnene reduzierte C1-Verbindungen (vorzugsweise Ameisensäure) mit hoher Ausbeute z. B. in (R)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Ester, insbesondere (R)-3-Hydroxybutyryl-CoA, umgewandelt werden, die dann z. B. als Substrate für die Isomerisierung durch eine (R)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase zu den entsprechenden 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl-Estern, insbesondere zu 2-Hydroxyisobutyryl-CoA, dienen.
In einer ganz bevorzugten Verfahrensvariante wird 2-Hydroxyisobuttersäure mikrobiell synthetisiert, wobei direkt die aus der elektrochemischen Reduktion von CO₂ gewonnenen Reduktionsprodukte als Kohlenstoffquelle verwendet werden. Insbesondere dient Ameisensäure direkt als elektrochemisch generierte Kohlenstoffquelle. Die weiteren bevorzugten „Nebenprodukte” der elektrochemischen Reaktion (Formaldehyd und Methanol) können sowohl als Reinsubstanzen als auch in Mischungen vorzugsweise ebenfalls mikrobiell für die Synthese von gewünschten höherwertigen organischen Verbindungen direkt umgesetzt werden.
Weiterhin können auch andere methylotrophe Mikroorganismus, die die reduzierten C1-Verbindungen nicht über den Serin-Weg assimilieren, erfindungsgemäß eingesetzt werden. Für die bevorzugte Verfahrensvariante zur Produktion von 2-Hydroxyisobuttersäure oder allgemein von 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren wird dann z. B. ein Mikroorganismus eingesetzt, der die enzymatischen Aktivitäten enthält, die zum einen intrazellulär vorrangig (R)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Ester aus reduzierten C1-Verbindungen synthetisieren und zum anderen mittels (R)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase-Aktivität die (R)-3-Hydroxycarbonsäuren über die (R)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Ester zu den korrespondierenden 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA-Estern und 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren umwandeln.
Mit den Enzymen bzw. mit Mikroorganismen, die solche Enyzme enthalten, können z. B. 3-Hydroxycarbonsäure zu entsprechenden 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren umgewandelt werden. In einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante kann die enzymatische Umsetzung der reduzierten C1-Kohlenstoffquellen zu einer 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäure in einem einzigen Verfahrensschritt erfolgen.
Von dem mikrobiellen System wird dann das gewünschte Produkt, z. B. 2-Hydroxyisobuttersäure, in das Medium abgegeben oder akkumuliert in der Mikroorganismenzelle, so dass es durch übliche Zellaufschluss- und Extraktionsverfahren gewonnen werden kann.
Insbesondere werden so bevorzugt organische C2 bis C20-Verbindungen hergestellt, die zu Folgeprodukten umgesetzt werden können. Diese Folgeprodukte werden z. B. durch die Reaktionsschritte der Veresterung, Veretherung, Decarboxylierung, Dimerisierung und Reduktion erhalten.
In einer Verfahrensvariante werden z. B. produzierte Alkohole und Carbonsäuren wie z. B. 2-Hydroxyisobuttersäure durch nachfolgende enzymatische oder chemische Veresterung, Veretherung oder anderen Modifikationen mit z. B. Methanol in entsprechende Derivate z. B. Methylester überführt, die dann leicht durch übliche Verfahren von der wässrigen Reaktionslösung abgetrennt werden können. In einer ganz bevorzugten Variante wird das dazu benötigte Methanol ebenfalls bereits elektrochemisch aus CO₂ gewonnen.
Im Falle der Herstellung von höheren Carbonsäuren (ab C5) wird in einer weiteren bevorzugten Verfahrensvariante die Carboxylgruppe elektrochemisch (z. B. Schäfer 1990, Top. Curr. Chem., 152, 91–151) oder enzymatisch (z. B: Choi & Lee 2013, „Microbial production of short-chain alkanes", Nature 502: 571–574) abgespalten, so dass daraus entsprechende Alkane bzw. Alkene entstehen.
Dabei kann in beiden Prozesstypen eine integrierte Prozesssteuerung, durch Abstimmung der elektrochemischen Reaktion auf die „Bedürfnisse” der mikrobiellen Reaktion erfolgen, um die Ausbeuten etc. des Gesamtprozesses (aus elektrochemischer CO₂-Reduktion und mikrobieller Biotransformation) zu optimieren.
Dies schließt insbesondere die Messung von mikrobiellen Prozessparametern wie optischer Dichte, Edukt-/Produktkonzentration, pH-Wert, Leitfähigkeit, usw. und deren Rückkopplung/Anpassung auf die elektrochemischen Parameter ein.
Überraschend ist, dass das integrierte Verfahren durch Langzeitstabilität und Langzeitproduktivität der elektrochemischen CO₂-Reduktion in Gegenwart von Biomasse/Mikroorganismen gekennzeichnet ist. Dabei war insbesondere überraschend, dass die Elektronenausbeuten (CE = coulomb'sche Effizienz) der elektrochemischen Reaktion durch das Pulsverfahren – bei konstanten oder gesteigerten Produktionsraten [in ppm Produkt pro Elektrodenfläche und Minute] in Gegenwart von Mikroorganismen/Biomasse konstant gehalten werden können, und im Vergleich zum nicht gepulsten Verfahren sogar höhere Produktionsraten zeigen. Die „Verblockung” der Elektrodenoberfläche durch Nebenreaktionen, mikrobielle Stoffwechselprodukte u. a. kann unterdrückt werden mit dem Vorteil, dass eine „in situ”-Elektrodenreinigung stattfindet. Dies hat den Vorteil längerer Standzeiten von Elektroden.
Die für den mikrobiellen Teilprozess auf der Basis der Stöchiometrien des methylotrophen Stoffwechsels gefundenen maximal erreichbaren Ausbeuten sind dabei deutlich höher als bei einem autotrophen Prozess.
Anschließend werden Beispiele aufgeführt, die die Erfindung näher beschreiben.
Allgemeine Methoden
Medien und Elektrolytlösungen
Alle Chemikalien sind von hoher Reinheit (p. a. und höher) und werden wie vom Hersteller erhalten verwendet. Als Lösungsmittel wird deionsiertes Wasser (bidest) verwendet.
CO₂: Air products, Germany, industrielle Reinheit (2.5), künstliche Luft mit 21% O₂ und 79% N₂.

Kultivierung des Stammes AM1 erfolgt auf Methanol oder Ameisensäure in Medium nach Choi (Tabelle 1; Choi et al. 1989, Optimization of growth medium and poly-beta-hydroxybutyricacid production from methanol in Methylobacterium organophilium, Korean J. Appl. Microbiol. Bioeng. 17: 392–396) unter aeroben Bedingungen bei 30°C. Transformanten werden in modifiziertem Choi-Medium kultiviert, das zusätzlich 0,05 mg/l Vitamin B12 enthält. Tabelle 1:

Medium nach Choi (Choi et al. 1989, Korean J. Appl. Microbiol. Bioeng. 17: 392–396); alle Angaben in mg/l
(NH₄)₂SO₄	1000	MnSO₄ × H₂O	0,1
KH₂PO₄	1305	ZnSO₄ × 7H₂O	0,13
Na₂HPO₄ × 7H₂O	4020	CuSO₄ × 5H₂O	0,04
MgSO₄ × 7H₂O	450	Na₂MoO₄ × 2H₂O	0,04
CaCl₂ × 2H₂O	3,3	CoCl₂ + 6H₂O	0,04
FeSO₄ × 7H₂O	1,3	H₃BO₃	0,03
pH	7,0

Für die elektrochemische Reduktion von CO₂ wird ein elektrochemisches Medium verwendet (Tabelle 2), dem noch 10 ml/l einer Vitaminlösung zugegeben werden (Tabelle 3). Tabelle 2:

Elektrochemisches Medium; alle Angaben in mg/l
KH₂PO₄	34,0	Na₂SO₄	10000
K₂HPO₄	43,5	NaHCO₃	1600
MgSO₄ × 7H₂O	71,2	Fe-NH₄-Citrate	1,2
CaCl₂ × 6H₂O	5,5	CoCl₂ × 6H₂O	0,04
pH	7,0

Tabelle 3:

Vitaminlösung für elektrochemisches Medium; alle Angaben in mg/l
Biotin	2	Vitamin B12	5
Folsäure	2	p-Aminobenzoesäure	5
Pyridoxin-HCl	10	Liponsäure	5
Thiamin-HCl	5	Nicotinsäure	5
Riboflavin	5	Ca-Pantothenat	5

Elektrodenmaterialien, elektrochemische Reaktoren & elektrochemische Parameter
Reaktoraufbau:
Bezugszeichenliste
Abb. 2 und Abb. 3

A: Elektrochemische CO₂ Reduktion
B: Mikrobielle Synthese (Bioreaktor)
: Legende/Systemkomponenten:
1: Anode;
2: Ionenaustauschmenbran/Separator;
3: Kathode;
4: Potentiostat/Galvanostat bzw. Gleichstrom-/Gleichspannungsquelle;
5, 6: Referenzelektrode(n) sowie andere Messsonden;
7: Rührer

a) Integriertes System: Ein maßgeschneiderter Glasreaktor mit 4 Einlässen bzw. Auslässen wird als (Bio)elektrochemischer Reaktor in einer temperierten Umgebung verwendet. Zwei der Einlässe/Auslässe dienen zur Installation der Arbeitselektrode (Kathode) und der Referenzelektrode ((Ag/AgCl (sat. KCl 197 mV vs. SHE), hier SE 11 von Sensortechnik Meinsberg), welche durch Butyl-Stopfen dicht in die Zelle eingeführt werden. Ein dritter (größerer) Einlass/Auslass wird zur Einführung der (maßgeschneiderten) Abschirmkammer für die Gegenelektrode verwendet. Beide Kammern sind dabei durch eine ionenselektive Membran (Fumasep FAD, FumatechGmbH) ionisch verbunden. Der vierte Eingang/Ausgang dient als Gaszugang (mittels einer Kanüle in das Reaktionsmedium), Gasausgang (aus der Gasphase über dem Medium) sowie zur Installation einer verschließbaren Probenöffnung für Flüssigproben (Skizze )
b) Desintegriertes System: Es werden an o. g. System zwei weitere Ein-/Auslässe installiert, um eine Zugabe der Reaktionslösung in den mikrobiellen Fermentationsraum zu ermöglichen (Skizze )

In beiden Fällen wird der Gaszugang (O₂/CO₂) mittels eines Gasdurchflussreglers (MKS, Deutschland) mit einer konstanten Flussrate, im Beispiel 15 L h^–1 für CO₂ und 10 L h^–1 für künstliche Luft geregelt.
Als Anoden (Gegenelektrodenmaterialien) werden Graphit (Rundlinge von 60 mm Länge und 10 mm Durchmesser, OP CP-Handels-GmbH, Wachtberg, Deutschland) sowie Platinfolie (Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Deutschland) verwendet.
Als Kathodenmaterial wird Indiumfolie oder Platinfolie (von 0,01 mm Dicke, Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Deutschland) verwendet.
Die Zellen werden bei konstanter Spannung der Arbeitselektrode gegenüber der Referenzelektrode oder gepulst in reiner Elektrolytlösung oder in Gegenwart von Biomasse betrieben – Details siehe Beispiele.
Analytik
Wasserlösliche Alkohole, Alkohole und organische Säuren, die bei der elektrochemischen Reduktion von CO₂ gebildet werden oder bei der Inkubation mit Bakterienzellen als Substrat dienen oder gebildet werden, werden routinemäßig mittels HPLC (Shimadzu Corporation) quantifiziert. Als Trennsäule wird eine Nucleogel Ion 300 OA (Macherey-Nagel) bei einer Ofentemperatur von 50°C verwendet. Als mobile Phase mit einem Fluss von 0,5 mL/min dient ein Laufmittel bestehend aus 5 mM Schwefelsäure in Wasser. Die Detektion erfolgt mithilfe eines Brechungsindex-Detektors (RID-10A).
Organische Säuren wie 2-Hydroxyisobuttersäure werden zusätzlich als Methylester mittels Gaschromatographie und Massenspektrum-Detektion (Agilent Technologies) identifiziert und quantifiziert. Kulturproben werden mit schwefelsaurem Methanol 2 Stunden bei 95°C inkubiert und anschließend mit Chloroform extrahiert. Die Identifizierung und Quantifizierung erfolgt an einem HP 6890-System ausgestattet mit einem HP 5973-MSD-Detektor. Für die Quantifizierung dient Benzoesäuremethylester als interner Standard.
Für die Bestimmung von geringen Konzentrationen von 2-Hydroxyisobuttersäure werden die Proben durch Gefriertrocknung 15-fach aufkonzentriert.
Der Poly-3-hydroxybuttersäure-Gehalt in den Bakterienzellen wird nach Riis & Mai 1988 durch saure Propanolyse und anschließender Extraktion mit 1,2-Dichlorethan ebenfalls mittels Gaschromatographie bestimmt (Riis & Mai 1988, J. Chromatography A 445: 285–289).
Bakterielles Wachstum wird durch Messen der optischen Dichte bei 700 nm verfolgt. Trockengewichte der Biomasse werden gravimetrisch durch Inkubation von Kulturproben bei 105°C bis zur Gewichtskonstanz bestimmt.
Beispiel 1
Die elektrochemische CO₂-Reduktion in Biomasse-freien wässrigen Elektrolytlösungen/Medien

Unter Verwendung einer Indiumfolie als Kathode wird die Reaktion gepulst und ungepulst in Elektrochemisches Medium mit Vitaminlösung für elektrochemisches Medium durchgeführt. Tabelle 4 zeigt die Produktionsraten für das Hauptprodukt Ameisensäure bei einer Versuchsdauer von 3 Stunden. (Methanol und Formaldehyd entstehen als Nebenprodukt mit < 2%) Tabelle 4: Reduktion von CO₂ zu Ameisensäure, ungepulst und gepulst an verschiedenen Potentialen

Arbeitspotential/V vs. Ag/AgCl	Pulsregime^*1	Effektive ^*2Formiatproduktion/mg/(L·h·cm²)	Coulomb'sche Effizienz/%
–1,8	Kein Puls	9,94	46,2
–1,8	30, OCP (10)	12,7	54,5
–1,8	15, OCP (10)	11,1	54,1
–1,8	6, OCP (2)	9,1	43,1
–1,6	Kein Puls	4,4	41,6
–1,6	30, OCP (10)	4,6	40,3
–1,6	15, OCP (10)	7,6	40,3

*1: Angabe in Intervall der Arbeitspotentialunterbrechung, Art der Unterbrechung und Pulsdauer (in Klammern) alle Zeitangaben in Minuten;
*2: Dies heißt bezogen auf die Dauer des Anlegens des Arbeitspotentials

Beispiel 2:
Elektrochemische Herstellung von Formiat in mikrobiologisch-geeigneten Medien
Die elektrochemische CO₂-Reduktion wird in Biomasse-freiem Medium nach Choi bei konstantem Arbeitspotential unter Verwendung von Indiumfolien als Kathode durchgeführt. zeigt die Produktionsraten an unbehandelten Elektroden bei einer Versuchsdauer von 3 Stunden.
Beispiel 3
Berechnung der maximal erreichbaren Ausbeuten an 2-Hydroxyisobuttersäure unter Verwendung des Stammes Methylobacteriumextorquens AM1
zeigt den methylotrophen Stoffwechsel für die Synthese von 2-Hydroxyisobuttersäure aus reduzierten C1-Verbindungen am Beispiel des Stammes Methylobacterium extorquens AM1 nach Expression der (R)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase aus dem Stamm Kyrpidia tusciae DSM 2912.
Auf der Basis der Stoffwechsel-Stöchiometrien lässt sich eine maximal erreichbare Ausbeute berechnen. Im Falle des Stammes Methylobacterium extorquens AM1 werden im assimilatorischen Stoffwechsel reduzierte C1-Verbindungen auf der Stufe des Formaldehyds in den Serin-Weg eingeschleust (Chistoserdova et al. 2009, Annu. Rev. Microbiol. 63: 477–499). Das dabei entstehende (R)-3-Hydroxybutyryl-CoA kann z. B. durch die heterolog exprimierte (R)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase aus Stamm Kyrpidia tusciae DSM 2912 zu 2-Hydroxyisobutyryl-CoA isomerisiert werden, welches dann hydrolysiert werden kann und somit das gewünschte Produkt 2-Hydroxyisobuttersäure freigesetzt wird ( ). Es ergibt sich für die Assimilation von Ameisensäure folgende Stöchiometrie: 2 Moleküle Ameisensäure (CH₂O₂) + 2CO₂ + 6[P] + 7[N] → 1 Molekül 2-Hydroxyisobuttersäure (C₄H₈O₃) + 5H₂O
Für die Assimilation von 2 Molekülen Ameisensäure werden im methylotrophen Stoffwechsel also insgesamt mindestens 6 Energieäquivalente [P] (Energieinhalt entsprechend der Hydrolyse von ATP zu ADP plus 1 freien Phosphat-Molekül) und 7 Reduktionsäquivalente [N] (Reduktionskraft entsprechend der Oxidation von NAD(P)H + H⁺ zu NAD(P)⁺ plus 2H⁺ und 2 Elektronen) benötigt. Energieäquivalente [P] werden in der Atmungskette durch die Oxidation von [N] bereitgestellt, wobei von folgender Effizienz ausgegangen wird: 3[N] + 1,5O₂ → 6[P] + 3H₂O
Somit werden insgesamt mindestens 10 Reduktionsäquivalente [N] benötigt, die durch die dissimilatorische Oxidation von Ameisensäure zu CO₂ mit folgender Stöchiometrie bereitgestellt werden: 10 Moleküle Ameisensäure (CH₂O₂) → 10CO₂ + 10[N]
Für die mikrobielle Teilreaktion ergibt sich entsprechend ein maximaler Ertrag von: 12 Moleküle Ameisensäure (CH₂O₂) + 1,5CO₂ → 8CO₂ + 1 Molekül 2-Hydroxyisobuttersäure (C₄H₈O₃) + 8H₂O
Für die elektrochemische Produktion von 12 Molekülen Ameisensäure aus CO₂ werden mindestens 24 Elektronen benötigt. Damit ergibt sich folgende Gesamtreaktion: 4CO₂ + 24 Elektronen + 24H⁺ + 1,5O₂ → 1 Molekül 2-Hydroxyisobuttersäure (C₄H₈O₃) + 8H₂O
Von den eingesetzten 24 Elektronen werden maximal 18 in das gewünschte Produkt 2-Hydroxyisobuttersäure eingebaut. Somit können durch den Stamm Methylobacterium extorquens AM1 maximal 75% der zuvor für die elektrochemische Reduktion von CO₂ zu Ameisensäure aufgebrachten Elektronen in das Produkt 2-Hydroxyisobuttersäure eingebaut werden. Damit ist der Prozess wesentlich effizienter als eine autotrophe Teilreaktion, die auf den Calvin-Zyklus basiert.
Beispiel 4:
Herstellung der Expressionsvektoren pCM80::Mut_Kt und pBBR1 MCS-3::Mut_Kt
Für die Herstellung von Expressionsvektoren wird zunächst genomische DNA aus Stamm DSM 2912 mithilfe des Master Pure DNA Purification Kit (Biozym) gewonnen. Danach wird mit dieser DNA ein Fragment umfassend die Gene meaH (Btus_0468), hcmA (Btus_0469) und hcmB (Btus_0470) mittels PCR amplifiziert. Dabei wird die PCR mit der Q5 High Fidelity DNA Polymerase (NEB) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen durchgeführt.
Primerpaare sind XbaI_Btus_meaH for: 5'-ATA TTC TAG AAA TGC AAG AGC TTC TOT CGC GAT TC-3' (forward primer – SEQ ID NO 1) und Btus_hcmB_SacI_rev: 5'-ATA TGA GCT CTC AAT CCC GAT CCG GAA ACC GG-3' (reverse primer – SEQ ID NO 2).
Nach 3 min bei 95°C wird der PCR-Reaktionsansatz 35 Zyklen mit jeweils 45 s bei 95°C, 45 s bei 67°C und 3 min 30 s bei 72°C inkubiert. Abschließend wird 5 min bei 72°C inkubiert. Der Ansatz wird mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und das gewünschte DNA-Fragment aus dem Gel isoliert (Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System, Promega).
Das so erhaltene DNA-Fragment und der Vektor pCM80 (Marx & Lidstrom 2001, Microbiology 147: 2065–2075) bzw. der Vektor pBBR1 MCS-3 (Kovach et al. 1995, „Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes", Gene 166: 175–176) werden mit Xbal und SacI-HF (NEB) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen inkubiert (4 h bei 37°C). Nach erfolgreichem Verdau werden Vektor- und Insert-Ansätze mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und die gewünschten DNA-Fragmente aus dem Gel isoliert (Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System, Promega). Für die Ligation werden dann jeweils der Vektor und das im Folgenden Mut_Kt genannte Insert im Verhältnis von 1:5 in Gegenwart von T4 DNA-Ligase (NEB) über Nacht bei 16°C inkubiert.
Mit den Ligationsprodukten pCM80::Mut_Kt (Seq ID NO 3, ) und pBBR1 MCS-3::Mut_Kt (SEQ ID NO4, ) werden jeweils kompetente Zellen von E. coli DH5-α (NEB) nach den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen transformiert und Plasmid-tragende Transformanten mittels Tetracyclin-Selektion detektiert.
Die Plasmide werden durch PCR, Testverdau mit SmaI (NEB) nach Plasmidisolation (nach Birnboim & Doly, 1979, A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA, NucleicAcids Res. 7: 1513–1523.) und Sequenzierung überprüft.
Die isolierten Plasmide pCM80::Mut_Kt (200 ng) und pBBR1 MCS-3::Mut_Kt (200 ng) werden jeweils mittels Elektroporation (2,5 kV, 25 μF, 600 Ω) in Methylobacterium extorquens AM1 eingebracht. Plasmid-tragende Transformanten werden mittels Tetracyclin-Selektion auf Mineralagar (nach Choi et al. 1989, Optimization of growth medium and poly-beta-hydroxybutyric acid production from methanol in Methylobacterium organophilium, Korean J. Appl. Microbiol. Bioeng. 17: 392–396; mit 15 g/l Agar-Agar, 10 g/l Methanol und 10 mg/l Tetracyclin) detektiert.
Beispiel 5:
Produktion von 2-Hydroxyisobuttersäure aus Methanol und Ameisensäure in transformierten Zellen von Methylobacterium extorquens AM1
A) Synthese von 2-Hydroxyisobuttersäure und Poly-3-hydroxybuttersäure aus Methanol durch mit pCM80:Mut_Kt transformierten Zellen von Methylobacterium extorquens AM1.
In sind der kumulative Methanolverbrauch, die Konzentration der Biomasse (Trockengewicht), der Gehalt an Poly-3-hydroxybuttersäure in den Zellen („PHB”, bezogen auf das Trockengewicht) und die Konzentration von 2-Hydroxyisobuttersäure („2-HIBA”) dargestellt.
Mit pCM80::Mut_Kt transformierte Zellen von Methylobacterium extorquens AM1 (Beispiel 4) werden in modifiziertem Choi-Medium (Tabelle 1) mit Methanol in Gegenwart von 10 mg/l Tetracyclin in einem Bioreaktor (Biostat MD, Braun Biotech international) mit 5 l Arbeitsvolumen unter Begasung mit Druckluft bei 30,6°C inkubiert. Der pH-Wert der Kultur wird durch Autotitration mit NaOH-Lösung zwischen 6,5 und 7,0 gehalten. Die Methanolkonzentration wird durch manuelle Zugabe zwischen 1 und 4 g/l gehalten. In den ersten 30 Stunden wachsen die Bakterien exponentiell mit einer spezifischen Wachstumsrate von 0,15 h^–1. Danach folgt aufgrund von zunehmender N-Limitierung (das Medium enthält nur 210 mg/l N als (NH₄)₂SO₄)) eine lineare Wachstumsphase von etwa 25 Stunden. Insgesamt werden aus 13 g/l Methanol 4 g/l Biomasse mit einem Poly-3-hydroxybuttersäure-Gehalt von etwa 20% gebildet. Zusätzlich werden durch die transformierten Zellen aus Methanol etwa 28 mg/l (= ppm) 2-Hydroxyisobuttersäure synthetisiert.
B) Synthese von 2-Hydroxyisobuttersäure aus Ameisensäure (Formiat) durch mit pBBR1 MCS-3::Mut_Kt transformierten Zellen von Methylobacterium extorquens AM1.
In sind der kumulative Formiatverbrauch und die Zunahme der Biomasse (Trockengewicht) sowie die Bildung der 2-Hydroxyisobuttersäure („2-HIBA”) dargestellt.
Mit pBBR1 MCS-3::Mut_Kt transformierte Zellen von Methylobacterium extorquens AM1 (Beispiel 4) werden zunächst mit 6,6 g/l Methanol in modifiziertem Choi-Medium (Tabelle 1) in Gegenwart von 10 mg/l Tetracyclin in einem Bioreaktor (Biostat B-DCU II, Sartorius) mit 1,8 l Arbeitsvolumen unter Begasung mit Druckluft bei 30,0°C inkubiert. Der pH-Wert der Kultur wird durch Autotitration mit NaOH-Lösung zwischen 6,5 und 7,0 gehalten. Durch Wachstum bis zu einer Biomasse von 2,6 g/l Biomasse wird das Methanol vollständig verbraucht. Danach wird angepasst an den Verbrauch durch eine Pumpe Ameisensäure mit Raten zwischen 0,5 und 1,0 g/l/h zugegeben, so dass die Konzentration des Substrates in der Kultur > 400 mg/l lag. Innerhalb von 24 Stunden wachsen die Bakterien unter Bildung von 1,5 g/l Biomasse ( ) weiter. Danach erhöht sich die Biomasse aufgrund von N-Limitierung nicht weiter. Insgesamt werden 69 g/l Ameisensäure verbraucht, was mit einer Synthese von 37 mg/l 2-Hydroxyisobuttersäure durch die transformierten Zellen einherging.
Beispiel 6:
Elektrochemische Herstellung von Ameisensäure aus CO₂ und Nutzung dieser C1-Verbindung zur Produktion von 2-Hydroxyisobuttersäure durch mit pCM80:Mut_Kt transformierte Zellen von Methylobacterium extorquens AM1 (integriertes Verfahren) Die elektrochemische CO₂-Reduktion wird ohne und mit auf Methanol angezogenen Zellen des mit pCM80:Mut_Kt transformierten Bakterienstammes Methylobacterium extorquens AM1 in wässrigen Elektrolytlösungen nach Tabelle 2 und 3 durchgeführt.
zeigt den Konzentrationsverlauf von durch elektrochemische Reduktion von CO₂ gebildeter Ameisensäure/Formiat und biotechnologisch synthetisierter 2-Hydroxyisobuttersäure (2-HIBA) im Reaktionsgefäß ohne („abiotisch”) und mit („biotisch) Zellen des mit pCM80:Mut_Kt transformierten Stammes Methylobacterium extorquens AM1 unter Verwendung einer 24,8 cm Indiumfolienelektrode als Kathode bei –1,6 V vs. Ag/AgCl in 100 ml Reaktionsvolumen. Ohne Zellen des methylotrophen Mikroorganismus werden innerhalb der Versuchsdauer von 80 Stunden aus CO₂ etwa 2000 ppm Ameisensäure gebildet. Im direkten Vergleich ist deutlich zu erkennen, dass bei Anwesenheit des methylotrophen Mikroorganismus diese Ameisensäure nahezu vollständig verstoffwechselt werden. Bis zum Versuchsende werden daraus durch den transformierten Bakterienstamm etwa 260 μg/l (= ppb) 2-Hydroxyisobuttersäure gebildet.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur Herstellung organischer Verbindungen und Produkte aus diesen organischen Verbindungen umfassend die Schritte: a) elektrochemische Umwandlung von Kohlendioxid (CO₂) in reduzierte C1-Verbindungen an einer Kathode, b) Kultivierung eines die organische Verbindung produzierenden methylotrophen Mikroorganismus oder eines Zell- oder Rohextraktes davon, der mindestens einen Stoffwechselweg für die Verwertung der C1-Verbindungen aus Schritt a) als Kohlenstoff- und Energiequelle aufweist, c) Akkumulation der organischen Verbindung in den Zellen des Mikroorganismus bzw. Abgabe ins Medium.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrochemische Umwandlung von CO₂ in reduzierte C1-Verbindungen in einer wässrigen Reaktionslösung bei Temperaturen von 4 bis 100°C erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung des die organische Verbindung produzierenden methylotrophen Mikroorganismus bzw. der Einsatz des Zell- oder Rohextraktes entweder räumlich getrennt (desintegriert) oder als integriertes Verfahren ohne räumliche Trennung in einer wässerigen Reaktionslösung stattfindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrochemische Umwandlung von CO₂ in reduzierte C1-Verbindungen bei einem konstanten negativen Elektrodenpotential bzw. konstantem reduktiven Stromfluss an der Kathode erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrochemische Umwandlung von CO₂ in reduzierte C1-Verbindungen bei einem variierenden Elektrodenpotential bzw. Stromfluss erfolgt, wobei in konstanten oder alternierenden Zeitabschnitten das Potential bzw. der Stromfluss an der Kathode, das Arbeitspotential bzw. Arbeitsstromfluss, hin zu einem anderen Potential bzw. Stromfluss, einem so genannten Pulspotential bzw. Pulsstrom, verändert wird (Pulsverfahren).
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kathode periodisch einer Offenzellspannung (OCP) bzw. einer Unterbrechung des Stromkreises unterworfen wird, wodurch sich Phasen von Stromfluss (Produktion) und keinem Stromfluss (keine Produktion) abwechseln, wobei die Pulsdauer zwischen 1 Sekunde und 2 Tagen variiert, jedoch stets kürzer als die Dauer des Anlegens des Arbeitspotentials ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Kathode aus verschiedenen Metallen und Nichtmetallen besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Anode eingesetzt wird, die sowohl im die Kathode umgebenden wässrigen Reaktionsmedium als auch von dieser Reaktionslösung durch eine Membran getrennt sein kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die aus CO₂ gewonnenen reduzierten C1-Verbindungen Ameisensäure, deren Salze (Formiate) oder Formaldehyd oder Methanol sowie Gemische davon sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem die organische Verbindung produzierenden methylotrophen Mikroorganismus um Bakterien, Archaeen, Hefen oder Pilze handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass in dem die organische Verbindung produzierenden methylotrophen Mikroorganismus weiterhin mindestens ein Polynukleotid vorliegt, das für ein Enzym mit Acyl-CoA-Mutase-Aktivität kodiert bzw. dass der Mikroorganismus mit mindestens einem Enzym mit Acyl-CoA-Mutase-Aktivität transfiziert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass in dem die organische Verbindung produzierenden methylotrophen Mikroorganismus mindestens ein Polynukleotid vorliegt, das eine Cobalamin-abhängige (R)- und/oder (S)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase kodiert oder mit dieser(en) Mutase(n) transfiziert ist, vorzugsweise eine Cobalamin-abhängige (R)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass als methylotropher Mikroorganismus ein mit mindestens einer Acyl-CoA-Mutase-Aktivität transfizierter Stamm der Bakterienart Methylobacterium extorquens eingesetzt wird, bevorzugt Methylobacteriumextorquens AM1.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass organische C2 bis C20-Verbindungen hergestellt werden, die gegebenenfalls zu Folgeprodukten umgesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren hergestellt werden, vorzugsweise 2-Hydroxyisobuttersäure.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Isomerisierung von (R)- und/oder (S)-3-Hydroxycarbonsäuren zu entsprechenden 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass methylotrophe Mikroorganismen, Zell- oder Rohextrakte davon kultiviert werden, die einen Stoffwechsel für die Synthese von (R)- und/oder (S)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Estern aus reduzierten C1-Verbindungen besitzen und die zusätzlich eine Cobalamin-abhängige (R)- und/oder (S)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase zur Isomerisierung von (R)- und/oder (S)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Estern zu 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA-Estern aufweisen oder die mit einer der genannten Mutasen oder beiden transfiziert sind.
Verfahren zur Isomerisierung von (R)- und/oder (S)-3-Hydroxycarbonsäuren zu entsprechenden 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass methylotrophe Mikroorganismen, Zell- oder Rohextrakte davon, die einen Stoffwechsel für die Synthese von (R)- und/oder (S)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Estern aus reduzierten C1-Verbindungen besitzen und die zusätzlich eine Cobalamin-abhängige (R)- und/oder (S)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Mutase zur Isomerisierung von (R)- und/oder (S)-3-Hydroxycarbonyl-CoA-Estern zu 2-Hydroxy-2-methylcarbonyl-CoA-Estern aufweisen oder die mit einer der genannten Mutasen oder beiden transfiziert sind in einer wässrigen Reaktionslösung bei 20 bis 80°C mit reduzierten C1-Verbindungen kultiviert werden, wodurch die entsprechende 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäure ins Medium abgegeben und als Säure oder in Form ihrer Salze gewonnen wird.