EP2235167A1 - Gesteigerte produktion von acetyl-coenzym a - Google Patents

Gesteigerte produktion von acetyl-coenzym a

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Publication number
EP2235167A1
EP2235167A1 EP09703058A EP09703058A EP2235167A1 EP 2235167 A1 EP2235167 A1 EP 2235167A1 EP 09703058 A EP09703058 A EP 09703058A EP 09703058 A EP09703058 A EP 09703058A EP 2235167 A1 EP2235167 A1 EP 2235167A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
host cell
coenzyme
acetyl
pyruvate
formate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09703058A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gunter Festel
Jelena Simona Duvnjak
Eckhard Boles
Christian Weber
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Butalco GmbH
Original Assignee
Butalco GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Butalco GmbH filed Critical Butalco GmbH
Publication of EP2235167A1 publication Critical patent/EP2235167A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the present invention relates to the development of enzymatic bypass reactions of pyruvate dehydrogenase in order to produce from pyruvate, coenzyme A and NAD + the molecules acetyl coenzyme A, NADH + H + and CO 2 , without energy equivalents, such as in the form of ATP to consume.
  • This bypass reaction consists either of the activities of a pyruvate decarboxylase together with a coenzyme A-dependent aldehyde dehydrogenase or of the activities of a pyruvate formate lyase together with a formate dehydrogenase.
  • the invention relates to the expression of one or both of these bypassing reactions in the cytoplasm of living cells, preferably eukaryotic cells.
  • the invention further relates in particular to the expression in eukaryotic cells of coenzyme A-dependent aldehyde dehydrogenases, preferably coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenases [also acetaldehyde: NAD + oxidoreductase (CoA-acetylating) or acetaldehyde called dehydrogenase (acetylating)] and / or of pyruvate formate lyases together with their activating enzyme.
  • the invention further relates to host cells, in particular modified yeast strains containing the genes for
  • Coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenases together with those for pyruvate decarboxylases and / or express the genes for pyruvate formate lyases together with their activating enzyme and those for formate dehydrogenases and form the polypeptides.
  • the polypeptides may either be formed individually or as fusion polypeptides between pyruvate decarboxylase and coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase and / or between pyruvate formate lyase and formate dehydrogenase.
  • the acetyl-coenzyme A production is increased in the cytoplasm of the cells. This can lead to an increased and more efficient production of secondary products, in particular acetoacetyl-CoA,
  • Mevalonate isoprenoids, crotonic acid, 1-butanol, sterols, malonyl-CoA, fatty acids, lipids, alkanes, malonate, flavonoids, stilbenoids, malonylated secondary metabolites, and other compounds derived from or derived from the aforementioned ( Figure 1) ).
  • Figure 1 Mevalonate, isoprenoids, crotonic acid, 1-butanol, sterols, malonyl-CoA, fatty acids, lipids, alkanes, malonate, flavonoids, stilbenoids, malonylated secondary metabolites, and other compounds derived from or derived from the aforementioned ( Figure 1) ).
  • the invention is important in the context of the production of bio-based chemicals and pharmaceutical agents, e.g. 1-butanol, crotonic acid, butyl acetate, malonic acid, oils, alkanes, terpenes, isoprenoids, various antibacterial and fungicidal agents, and in particular the precursor molecule amorphadiene of the antimalarial drug artemisinin.
  • bio-based chemicals and pharmaceutical agents e.g. 1-butanol, crotonic acid, butyl acetate, malonic acid, oils, alkanes, terpenes, isoprenoids, various antibacterial and fungicidal agents, and in particular the precursor molecule amorphadiene of the antimalarial drug artemisinin.
  • Acetyl coenzyme A is a key molecule in the metabolism of almost all living things. It is used in their cells in many biochemical reactions. Chemically, it is a thioester between acetic acid (acetate) and coenzyme A.
  • Coenzyme A also coenzyme A, short CoA or CoASH
  • Coenzyme A is a coenzyme that is used for the "activation” of alkanoic acids and their derivatives and is involved in the energy metabolism.
  • Coenzyme A acetyl-CoA for short
  • Acetyl-CoA is a central intermediate metabolite that is switched between catabolic and anabolic processes.
  • acetyl CoA is formed during the oxidative degradation of fatty acids, certain amino acids and carbohydrates. It serves as a precursor for the biosynthesis of a wide variety of Metabolites and biochemicals. Since cellular membranes are impermeable to acetyl-CoA, it must be produced separately in eukaryotic cells either in each membrane-bound compartment or transported across the membranes: these include, for example, mitochondria,
  • acetyl-CoA is provided above all by the pyruvate dehydrogenase reaction from pyruvate and in the oxidation of the fatty acids and introduced into the citric acid cycle.
  • acetyl-CoA may be required for the synthesis of a variety of compounds: acetoacetyl-CoA, mevalonate, isoprenoids, sterols, sesquiterpenes, polyprenols, terpenoids, malonyl-CoA, flavonoids, stilbenoids, malonate, malonylated secondary metabolites, D-amino acids, N -Malonyl-aminocyclopropanecarboxylic acid, fatty acids, lipids, oils, waxes, cysteine, glucosinolate, xenobiotics, pesticides, bioplastics, polyhydroxybutyrate, aroma-active esters of an alcohol and a fatty acid, butanol, alkanes,
  • acetyl-CoA can be formed only by a few reactions.
  • One possibility is the synthesis of citrate by means of ATP citrate lyase (e.g.
  • Vertebrates, insects and plants another possibility is the synthesis of pyruvate by means of the reaction sequence of pyruvate decarboxylase, acetaldehyde dehydrogenase and acetyl-CoA synthetase (in yeasts). These reactions or Reaction sequences require energy, which is usually provided in the form of ATP.
  • the acetyl-CoA formed can then be carboxylated, for example, by the acetyl-CoA carboxylase and form malonyl-CoA.
  • Another possibility is the condensation of two molecules acetyl-CoA to acetoacetyl-CoA. There are many more besides
  • the resulting intermediates serve as starting materials for the synthesis of a variety of metabolites, as described above.
  • acetyl-CoA is formed, for example, during the oxidative degradation of fermentable carbon sources, in particular carbohydrates, above all by the reaction sequence of pyruvate decarboxylase, acetaldehyde dehydrogenase and acetyl-CoA synthetase or by ATP citrate lyase.
  • these two reactions have the disadvantage that they consume energy, which is mostly provided in the form of ATP hydrolysis. This can have a negative effect on the energy balance of the cells, which can, for example, cause lower biomass formation or lower product formation. This is especially true under anaerobic conditions or in certain fermentations.
  • the beer, wine and baking yeast Saccharomyces cerevisiae has been used for centuries for bread, wine and beer production due to its ability to ferment sugar to alcohol and carbon dioxide.
  • S. cerevisiae is used in addition to the production of heterologous proteins, especially in the production of bio-based chemicals such as ethanol and lactate or pharmaceutical-pharmaceutical agents such as Artemisinin use.
  • bio-based chemicals such as ethanol and lactate or pharmaceutical-pharmaceutical agents
  • a recombinant yeast strain has been described that can obviously produce 1-butanol.
  • S. cerevisiae also has no ATP citrate lyase.
  • S. cerevisiae synthesizes its cytosolic acetyl-CoA from pyruvate using pyruvate decarboxylase, acetaldehyde dehydrogenase and acetyl-CoA synthetase reactions. But in the last reaction two energy equivalents in the form of ATP are consumed. However, this means that in the oxidation of 1 molecule of glucose to 2 molecules of acetyl-CoA a total of 2 molecules of ATP must be applied. If, on the other hand, it were possible to create an energy-independent bypass reaction, then there would be a gain of 2 molecules of ATP.
  • Acetyl-CoA in eukaryotic host cells in particular yeasts and thereby preferably Saccharomyces species, overcome and lead to an increased and energy-independent provision of acetyl-CoA in the cytosol.
  • the object is achieved by providing nucleic acid molecules which in each case encode a polypeptide of a coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase or of a pyruvate formate lyase.
  • pyruvate-formate lyase must also be added
  • Nukleinsauremolekul which encodes a polypeptide of a pyruvate formate lyase activating enzyme, are provided.
  • a nucleic acid molecule according to the invention is a recombinant nucleic acid molecule.
  • nucleic acid molecules of the invention include dsDNA, ssDNA, PNA, CNA, RNA or mRNA or combinations thereof.
  • nucleic acid construct as used below is to be understood in the context of the present invention as a sequence consisting of dsDNA, ssDNA, PNA, CNA, RNA or mRNA or combinations thereof which comprises the nucleic acid molecule according to the invention or comprise a plurality of further sequences which facilitate the incorporation of the nucleic acid molecule according to the invention into a host cell, which increase the reading rate of the nucleic acid molecule according to the invention or which are known to the person skilled in the art for reasons other than those suitable for the purpose of the invention.
  • Acetyl-CoA is a central metabolic intermediate of yeast cells and can be expressed in yeast cells, and in particular in recombinant yeast cells, to be further reacted to a variety of products.
  • a pyruvate decarboxylase In the case of the heterologously expressed coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase, a pyruvate decarboxylase must be simultaneously expressed in order to form from pyruvate, coenzyme A and NAD + the molecules acetyl coenzyme A, NADH + H + and CO 2 .
  • the coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase sets the acetaldehyde formed by the pyruvate decarboxylase together with coenzyme A and NAD + to acetyl coenzyme A and NADH + H + .
  • yeast alcohol dehydrogenases can be reduced or eliminated.
  • NADH + H + implement This formate dehydrogenase can either be a yeast enzyme of its own (Fdhl (SEQ ID.2) or Fdh2 (SEQ ID.4) or else expressed heterologously since FDH1 (SEQ ID.3) and FDH2 (SEQ ID. 5) of S. cerevisiae, expression or activity must be increased, for example, by using a promoter which is strong under the fermentation conditions, whereby the natural promoter of one or both of the formate dehydrogenase genes becomes strong Promoter (eg HXT7konst, PGKl, ADHl, ).
  • yeast pyruvate decarboxylases it may be useful to reduce or eliminate the expression or activity of the yeast pyruvate decarboxylases, to reduce or avoid the co-generation of ethanol, and to increase the availability of pyruvate for the pyruvate formate lyase.
  • nucleic acid sequences of the nucleic acid molecules according to the invention which each encode a polypeptide of a coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase, are preferably genes from prokaryotes (for example from Escherichia coli), e.g. mhpF (SEQ ID 6), a mutated allele of adhE (SEQ ID 7) with coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase activity, or a truncated version of the mutant allele of adhE (SEQ ID 8) containing only the Coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase activity of the bifunctional enzyme encodes.
  • the respective nucleic acid sequence can either code for a coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase or it is used as a nucleic acid sequence fusion with a gene that is responsible for a
  • Polypeptide coded with pyruvate decarboxylase activity wherein a polypeptide is encoded, which has both activities.
  • Nucleic acid molecules which each code for a polypeptide of a pyruvate formate lyase and a pyruvate formate lyase activating enzyme are preferably genes from prokaryotes or anaerobic chytridiomycetes or chlorophytes.
  • the nucleic acid sequence encoding a polypeptide of pyruvate formate lyase may either encode that polypeptide alone or be expressed as nucleic acid sequence fusion with a gene encoding a polypeptide having formate dehydrogenase activity a polypeptide is encoded which has both activities.
  • nucleic acid molecules of the invention preferably comprise nucleic acid sequences which are identical to the naturally occurring nucleic acid sequence, individual
  • Each amino acid is encoded at the gene level by a codon. However, there are several different codons that code for a single amino acid. The genetic code is therefore degenerate. The preferred codon choice for a corresponding amino acid differs from organism to organism. This may be the case for heterologously expressed genes
  • the present invention furthermore relates to expression cassettes comprising a nucleic acid molecule according to the invention.
  • Expression cassettes further preferably include promoter and terminator sequences.
  • promoter sequences are selected from HXT7, truncated HXT7, PFK1, FBA1, PGK1, ADH1, TDH3.
  • terminator sequences are selected from CYCl, FBA1, PGK1, PFK1, ADH1, TDH3.
  • the present invention also relates to
  • Expression vectors comprising a nucleic acid molecule according to the invention or a novel nucleic acid molecule
  • the expression vectors according to the invention furthermore preferably comprise a selection marker.
  • the selection marker is selected from a leucine marker, a uracil marker, the dominant antibiotic marker geneticin, hygromycin and nourseothricin.
  • the present invention also relates to host cells which contain a nucleic acid construct according to the invention, an expression cassette according to the invention or an expression vector according to the invention.
  • a nucleic acid molecule according to the invention, an expression cassette according to the invention or an expression vector according to the invention is stably integrated into the genome of the host cell.
  • a host cell according to the invention is preferably a fungal cell and more preferably a yeast cell, such as Saccharomyces species, Kluyveromyces sp., Hansenula sp., Pichia sp. or Yarrowia sp ..
  • the present invention further relates to a recombinant host cell containing such an isolated nucleic acid molecule.
  • the present invention relates to a recombinant host cell containing a nucleic acid construct encoding a polypeptide, which catalyzes a substrate-product conversion selected from the following two reaction:
  • At least one DNA molecule is heterologous to said host cell and wherein said host cell has increased acetyl-coenzyme A production.
  • the present invention further preferably relates to a
  • a host cell as defined above characterized in that the increased acetyl-CoA formation takes place in the cytoplasm of the host cell.
  • the present invention further preferably relates to a
  • a host cell as defined above characterized in that the polypeptide that catalyzes the conversion of acetaldehyde + coenzyme A + NAD + to acetyl coenzyme A + NADH + H + is a coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase.
  • the present invention further preferably relates to a host cell as defined above, characterized in that the polypeptide which catalyzes the conversion of pyruvate + coenzyme A to acetyl coenzyme A + formate, a pyruvate formate lyase and by the simultaneous expression of a pyruvate Formate lyase activating enzyme is activated.
  • the present invention more preferably relates to a host cell as defined above, characterized in that the coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase is expressed in a host cell which simultaneously expresses a pyruvate decarboxylase activity.
  • the present invention more preferably relates to a host cell as defined above, characterized in that the coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase and the pyruvate decarboxylase are expressed in a host cell having a reduced or no activity of an alcohol dehydrogenase.
  • the present invention more preferably relates to a host cell as defined above, characterized in that the pyruvate-formate-lyase and pyruvate-formate-lyase activating enzyme are expressed in a host cell which simultaneously expresses a polypeptide which inhibits the transformation of formate + NAD + catalyzed to CO 2 + NADH + H 4 .
  • the present invention more preferably relates to a host cell as defined above, characterized in that the protein which catalyzes the conversion of formate + NAD + to CO2 + NADH + H + is a formate dehydrogenase.
  • the present invention further preferably relates to a host cell as defined above, characterized in that the pyruvate formate lyase and pyruvate formate lyase activating enzyme and the formate dehydrogenase are expressed in a host cell having a reduced or no activity of a pyruvate Having decarboxylase.
  • the present invention more preferably relates to a host cell as defined above, characterized in that the host cell is a yeast.
  • the present invention further preferably relates to a
  • Host cell as defined above, characterized in that the host cell is selected from the following group: Pichia, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Yarrowia and Saccharomyces.
  • the present invention more preferably relates to a host cell as defined above, characterized in that the host cell is Saccharomyces cerevisiae.
  • the present invention further preferably relates to a
  • a host cell as defined above characterized in that the host cell is an optionally anaerobic host cell.
  • the present invention further relates to a method for the increased delivery of acetyl-CoA in the cytosol in a host cell.
  • the inventive method comprises the expression of a erfmdungsgeloisen Nuklemsauremolekuls, an inventive expression cassette or erfmdungsge navalen expression vector in a host cell.
  • the method of the invention comprises providing a host cell as defined above and contacting the host cell with a fermentable carbon source under conditions in which the rate of formation of acetyl-CoA is increased.
  • the present invention further preferably relates to a method as defined above, characterized in that the fermentable carbon source is a C3 - C6 carbon source.
  • the present invention more preferably relates to a method as defined above, characterized in that the carbon source belongs to the group consisting of monosaccharides, oligosaccharides or polysaccharides.
  • the present invention more preferably relates to a method as defined above, characterized in that the carbon source belongs to the group consisting of glucose, fructose, sucrose, maltose, xylose or arabinose.
  • the present invention further preferably relates to
  • a method as defined above characterized in that the host cell is contacted with the carbon source in culture medium.
  • the present invention further preferably relates to
  • the present invention further preferably relates to
  • the present invention further preferably relates to
  • a method as defined above characterized in that the secondary product to the group consisting of mevalonate, isoprenoids, sterols, sesquiterpenes, polyprenols, terpenoids, flavonoids, stilbenoids, malonate, malonylated Secondary metabolites, D-amino acids, N-malonyl-aminocyclopropanecarboxylic acid, fatty acids, lipids, oils, waxes, cysteine, glucosinolate, xenobiotics, pesticides, bioplastics, polyhydroxybutyrate, flavor-active esters, 1-butanol, alkanes, butyl acetate.
  • the present invention further preferably relates to a process as defined above, characterized in that the production of the secondary product is increased.
  • the process is preferably carried out in a host cell according to the invention.
  • the present invention furthermore relates to a nucleic acid molecule, a novel nucleic acid molecule
  • Expression cassette an expression vector according to the invention, a host cell according to the invention with an increased acetyl-CoA production rate.
  • the present invention furthermore relates to the use of a nucleic acid molecule according to the invention, an expression cassette according to the invention, an expression vector according to the invention, a host cell according to the invention for the recombinant fermentation of biomaterial.
  • an expression cassette according to the invention, an expression vector according to the invention, a host cell according to the invention By using a nucleic acid molecule according to the invention, an expression cassette according to the invention, an expression vector according to the invention, a host cell according to the invention, the rate of formation of cytosolic acetyl-CoA is increased. The result is a faster, more efficient and increased production of acetyl-CoA in the cytoplasm of the host cell according to the invention and optionally an increased production of secondary products as described above.
  • the present invention further relates to a polypeptide having in vitro and / or in vivo coenzyme A-dependent acetaldehyde dehydrogenase activity and / or a polypeptide having in vitro and / or in vivo pyruvate formate lyase activity.
  • the present invention further relates to an isolated Nukleinsauremolekul that encodes a polypeptide according to the invention.
  • polypeptide of the invention isolated Nukleinsauremolekul and the host cell of the invention are preferably used to increase the production of cytosolic acetyl-CoA.
  • polypeptide according to the invention, isolated nucleic acid molecule and the host cell according to the invention are preferably used for increasing the production of cytosolic acetyl-CoA and derived derivatives thereof in host cells, in particular yeasts, wherein the host cells also contain one or more additional modifications, such as nucleic acid molecules.
  • such an additional modification according to the invention is, for example, a host cell which, on account of the provision of heterologous nucleic acid molecules, produces the following secondary products: acetoacetyl-CoA, mevalonate, isoprenoids, sterols, sesquiterpenes, polyprenols, terpenoids, malonyl-CoA, flavonoids, stilbenoids, Malonate, malonylated secondary metabolites, D-amino acids, N-malonyl
  • Aminocyclopropanecarboxylic acid fatty acids, lipids, oils, waxes, cysteine, glucosinolate, xenobiotics, pesticides, bioplastics, polyhydroxybutyrate, flavor-active esters of an alcohol and a fatty acid, butanol, alkanes, butyl acetate, and all other compounds derived from those cited to let.
  • polypeptide according to the invention isolated nucleic acid molecule and the host cell according to the invention are preferably used for increasing the production of cytosolic acetyl-CoA and secondary products in the fermentation of carbon sources.
  • nucleic acids according to the invention Possible uses of the nucleic acids according to the invention, expression cassettes, expression vectors and host cells are the production of high-quality precursor products for further biochemical and chemical syntheses.
  • Expression cassettes, expression vectors and host cells are available.
  • the invention enables an increased and energy-independent provision of acetyl-CoA in the cytosol of eukaryotic host cells, in particular yeasts and preferably Saccharomyces species. Since the provision of acetyl-CoA is a limiting reaction in the biotechnological production of a variety of
  • Secondary products also makes it possible to increase the production of these secondary products, e.g. 1- butanol, crotonic acid, mevalonate, isoprenoids, fatty acids, alkanes, or flavonoids, especially in host cells containing other corresponding heterologous nucleic acids. This applies in particular to fermentations of biomaterial under anaerobic or microaerobic conditions.
  • Antibiotic resistance was added to the medium after autoclaving 40 ⁇ g / ml ampicillin.
  • Solid nutrient media additionally contained 2% agar. The cultivation took place at 37 ° C. 1 . 2 yeasts
  • Synthetic Complete Selective Medium SC 0.67% yeast nitrogen base w / o anno acids, pH 6.3,
  • Synthetic mimic selective medium SM 0.16% yeast nitrogen base w / o amino acid and ammonium sulphate, 0.5% ammonium sulphate, 20 mM potassium dihydrogen phosphate, pH 6.3, carbon source in the respectively indicated concentration
  • Synthetic Fermentation Medium (Mammalian Medium) SFM: (Verduyn et al., 1992), pH 5.5
  • Salts (NH 4 ) 2 SO 4 , 5g / l; KH 2 PO 4 , 3g / l; MgSO 4 * 7H 2 O, 0.5 g / l trace elements: EDTA, 15 mg / l, ZnSO 4 M, 5 mg / l; MnCl 2 MH 2 O, 0, lmg / l; CoCl 2 * 6H 2 0, 0.3 mg / 1; CuSO 4 , 0.192 mg / 1; Na 2 Mo0 4 * 2H 2 O, 0.4 mg / L; CaCl 2 * 2H 2 O, 4.5 mg / L; FeSO 4 * 7H 2 O, 3 mg / 1; H 3 BO 3 , 1 mg / 1; KI, 0.1 mg / l
  • Vitamins biotin, 0.05 mg / 1; p-aminobenzoic acid, 0.2 mg / l; Nicotinic acid, 1 mg / 1; Calcium pantothenate, 1 mg / 1; Pyridoxine HCL, 1 mg / 1; Thiamine HCL, 1 mg / 1; Minositol, 25 mg / 1
  • Solid solid and selective media contained 1.8% agar in addition.
  • the cultivation of the yeast cells was carried out at 30 ° C.
  • the synthetic mineral medium used for the fermentations contained salts, trace metals and vitamins in the concentrations listed above and L-arabinose as carbon source. Of the trace metals and the vitamins, a master lottery was scheduled. Both solutions were sterile-filtered. Both were stored at 4 ° C.
  • the pH value was crucial. The various trace elements had to be completely dissolved in water sequentially in the above order. After each addition, the pH had to be adjusted to 6.0 with KOH before the next trace element could be added. At the end, the pH was adjusted to 4.0 with HCL.
  • Electroporation method according to Dower et al. (1988) and Wirth (1993) using an Easyject prima device (EQUIBO).
  • the isolation of plasmid DNA from E. coli was carried out by the alkaline lysis method of Birnboim and DoIy (1979), modified according to Maniatis et al. (1982) or alternatively with the "QIAprep Spin Miniprep Kit” from Qiagen.
  • the cells of a stationary yeast culture (5 ml) were harvested by centrifugation, washed and resuspended in 400 ⁇ l of Buffer Pl (Plasmid Mini Kit, Qiagen). After the addition of 400 ul buffer P2 and 2/3 volume of glass beads (0.45 mm 0) of the cells were disrupted by shaking for 5 minutes on a Vibrax (Vibrax-VXR from Janke & Kunkel or IKA). The supernatant was mixed with 2 volumes of buffer P3, mixed and incubated on ice for 10 min. After a 10-minute Centrifugation at 13000 rpm was precipitated by adding 0.75 ml of isopropanol to the supernatant, the plasmid DNA at room temperature. The DNA pelleted by centrifugation for 30 min at 13000 rpm was washed with 70% ethanol, dried and resuspended in 20 ⁇ l water. 1 ⁇ l of the DNA was used for transformation into E. coli.
  • Phusion TM High Fidelity PCR System The polymerase chain reaction was carried out in a total volume of 50 ⁇ l using the Finnzymes "Phusion TM High Fidelity PCR System" according to the manufacturer's instructions Each batch consisted of 1-lOng DNA or 1-2 yeast colonies as the synthesis template,
  • PCR reaction was carried out in a thermocycler from Techne and the PCR conditions were selected as needed as follows:
  • Oligonucleotides or adapted to the size of the expected product.
  • the PCR products were checked by agarose gel electrophoresis and then purified.
  • the purification of the PCR products was carried out with the "QIAquick PCR Purification Kit” from Qiagen according to the manufacturer.
  • the separation of DNA fragments with a size of 0.15-20kb was carried out in 0.5-l% agarose gels with 0.5 ug / ml ethidium bromide.
  • lxTAE buffer 40 mM Tris, 40 mM acetic acid, 2 mM EDTA was used (Mamatis et al., 1982).
  • the desired DNA fragment was excised from the TAE agarose gel under long-wave UV light (366 nm) and isolated using the "QIAquick Gel Extraction Kit” from Qiagen according to the manufacturer's instructions. 4. Enzymatic modification of DNA
  • Sequence-specific cleavage of the DNA with restriction endonucleases was performed under the manufacturer's recommended incubation conditions for 1 hour with 2-5U enzyme per ⁇ g of DNA.
  • Electroporation An alternative method of transforming bacteria with plasmid DNA.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine rekombinante Wirtszelle, die mindestens ein Nukleinsäuremolekül enthält, welches ein Polypeptid kodiert, das eine Substrat-Produkt Umwandlung katalysiert, die aus den folgenden zwei Reaktion ausgewählt ist: Acetaldehyd + Coenzym A + NAD+ zu Acetyl- Coenzym A + NADHH-H+ und/oder Pyruvat + Coenzym A zu Acetyl- Coenzym A + Formiat, wobei zumindest ein DNA-Molekül heterolog zu der besagten Wirtszelle ist und wobei die besagte Wirtszelle eine gesteigerte Acetyl-Coenzym A Produktion aufweist. Des Weiteren befasst sich die Erfindung mit einem Verfahren für eine gesteigerte Bildungsrate von Acetyl-CoA in einer Wirtszelle.

Description

Gesteigerte Produktion von Acetyl-Coenzym A
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Entwicklung enzymatischer Umgehungsreaktionen der Pyruvat-Dehydrogenase, um aus Pyruvat, Coenzym A und NAD+ die Moleküle Acetyl-Coenzym A, NADH+H+ und CO2 herzustellen, ohne dabei Energieaquivalente, wie z.B. in Form von ATP zu verbrauchen. Diese Umgehungsreaktion besteht entweder aus den Aktivitäten einer Pyruvat-Decarboxylase zusammen mit einer Coenzym A-abhangigen Aldehyd-Dehydrogenase oder aus den Aktivitäten einer Pyruvat- Formiat-Lyase zusammen mit einer Formiat-Dehydrogenase . Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Expression einer oder beider dieser Umgehungsreaktionen im Cytoplasma von lebenden Zellen, dabei bevorzugt von eukaryontischen Zellen. Die Erfindung bezieht sich weiterhin insbesondere auf die Expression in eukaryotischen Zellen von Coenzym A-abhangigen Aldehyd-Dehydrogenasen, dabei bevorzugt Coenzym A-abhangige Acetaldehyd-Dehydrogenasen [auch Acetaldehyd:NAD+ Oxidoreduktase (CoA-acetylierend) oder Acetaldehyd Dehydrogenase (acetylierend) genannt] und/oder von Pyruvat- Formiat-Lyasen zusammen mit ihrem aktivierenden Enzym. Die Erfindung bezieht sich des Weiteren auf Wirtszellen, insbesondere modifizierte Hefe-Stamme, die die Gene für
Coenzym A-abhangige Acetaldehyd-Dehydrogenasen zusammen mit solchen für Pyruvat-Decarboxylasen und/oder die die Gene für Pyruvat-Formiat-Lyasen zusammen mit ihrem aktivierenden Enyzm und solchen für Formiat-Dehydrogenasen exprimieren und die Polypeptide bilden. Dabei können die Polypeptide entweder einzeln gebildet werden oder auch als Fusionspolypeptide zwischen Pyruvat-Decarboxlyase und Coenzym A-abhangiger Acetaldehyd-Dehydrogenase und/oder zwischen Pyruvat-Formiat- Lyase und Formiat-Dehydrogenase. Bei der Verwendung dieser modifizierten Wirtszellen und Inkontaktbringen mit einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle wird die Acetyl-Coenzym A- Produktion im Cytoplasma der Zellen gesteigert. Dieses kann zu einer gesteigerten und effizienteren Produktion von Folgeprodukten fuhren, insbesondere Acetoacetyl-CoA,
Mevalonat, Isoprenoiden, Crotonsaure, 1-Butanol, Sterolen, Malonyl-CoA, Fettsauren, Lipiden, Alkanen, Malonat, Flavonoiden, Stilbenoiden, malonylierten Sekundarmetaboliten, und anderen Verbindungen, die sich aus den genannten ergeben oder von diesen ableiten lassen (Abb. 1) . Die vorliegende
Erfindung ist somit unter anderem bedeutsam im Zusammenhang mit der Produktion von biobasierten Chemikalien und pharmazeutischen Wirkstoffen, wie z.B. 1-Butanol, Crotonsaure, Butylacetat, Malonsaure, Ölen, Alkanen, Terpenen, Isoprenoiden, verschiedenen antibakteriellen und fungiziden Agenzien, und im speziellen dem Vorlaufermolekul Amorphadien des Antimalaria-Wirkstoffes Artemisinin.
Acetyl-Coenzym A ist ein zentrales Molekül im Metabolismus fast aller Lebewesen. Es wird in deren Zellen in vielen biochemischen Reaktionen genutzt. Chemisch gesehen ist es ein Thioester zwischen Essigsaure (Acetat) und Coenzym A. Coenzym A (auch Koenzym A, kurz CoA oder CoASH) ist ein Coenzym, das zur „Aktivierung" von Alkansauren und deren Derivaten dient und am Energiestoffwechsel beteiligt ist. Acetyl-Coenzym A (kurz Acetyl-CoA) ist ein „aktivierter" Essigsaurerest (CH3CO-) . Dieser ist an die SH-Gruppe des Thioethanolamin- Anteils von Coenzym A gebunden.
Acetyl-CoA ist ein zentraler Intermediarmetabolit , der zwischen katabole und anabole Prozesse geschaltet ist. Acetyl- CoA entsteht z.B. beim oxidativen Abbau von Fettsauren, bestimmten Aminosäuren und Kohlenhydraten. Es dient als Vorstufe für die Biosynthese einer großen Vielzahl von Metaboliten und Biochemikalien. Da zelluläre Membranen undurchlässig für Acetyl-CoA sind, muss es in eukaryontischen Zellen entweder in jedem membranumgrenzten Kompartiment separat hergestellt oder über die Membranen hinweg transportiert werden: dazu zählen z.B. Mitochondrien,
Piastiden, Peroxisomen und das Cytosol . In den eukaryontischen Mitochondrien und im Cytosol prokaryontischer Zellen wird Acetyl-CoA vor allen Dingen durch die Pyruvat-Dehydrogenase Reaktion aus Pyruvat und bei der Oxidation der Fettsäuren bereitgestellt und in den Zitronensäurezyklus eingeschleust.
Im Cytosol kann Acetyl-CoA für die Synthese einer Vielzahl von Verbindungen benötigt werden: Acetoacetyl-CoA, Mevalonat, Isoprenoide, Sterole, Sesquiterpene, Polyprenole, Terpenoide, Malonyl-CoA, Flavonoide, Stilbenoide, Malonat, malonylierte Sekundärmetabolite, D-Aminosäuren, N-Malonyl- Aminocyclopropancarboxylsäure, Fettsäuren, Lipide, Öle, Wachse, Cystein, Glucosinolat, Xenobiotica, Pestizide, Biokunststoffe, Polyhydroxybutyrat, Aroma-aktive Ester aus einem Alkohol und einer Fettsäure, Butanol, Alkane,
Butylacetat, und sämtliche anderen Verbindungen, die sich aus den genannten ableiten lassen. Dieses gilt nicht nur für in den Zellen vorkommende, naturliche Prozesse, sondern ebenso für die Produktion einer Vielzahl von biobasierten Chemikalien und pharmazeutischen oder medizinischen Wirkstoffen durch rekombinante (transgene) Zellen und Organismen.
Im Cytosol von eukaryotischen Zellen kann Acetyl-CoA nur durch wenige Reaktionen gebildet werden. Eine Möglichkeit ist die Synthese aus Citrat mittels der ATP-Citrat Lyase (z.B. in
Vertebraten, Insekten und Pflanzen) , eine andere Möglichkeit die Synthese aus Pyruvat mittels der Reaktionsabfolge aus Pyruvate Decarboxylase, Acetaldehyd Dehydrogenase und Acetyl- CoA Synthetase (in Hefen). Diese Reaktionen bzw. Reaktionsabfolgen benotigen Energie, die in der Regel in Form von ATP zur Verfugung gestellt wird. Das gebildete Acetyl-CoA kann dann z.B. durch die Acetyl-CoA Carboxylase carboxyliert werden und Malonyl-CoA bilden. Eine andere Möglichkeit ist die Kondensation zweier Moleküle Acetyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA. Daneben gibt es noch eine Vielzahl weiterer
Reaktionsmoglichkeiten . Die entstehenden Intermediate dienen als Ausgangsstoffe für die Synthese einer Vielzahl von Metaboliten, wie sie oben beschrieben sind.
Im Cytosol eukaryontischer Zellen wird Acetyl-CoA z.B. beim oxidativen Abbau von fermentierbaren Kohlenstoffquellen, insbesondere Kohlenhydrate, vor allen Dingen durch die Reaktionsabfolge aus Pyruvat Decarboxylase, Acetaldehyd Dehydrogenase und Acetyl-CoA Synthetase oder durch die ATP- Citrat Lyase gebildet. Diese beiden Reaktionen haben jedoch den Nachteil, dass sie Energie verbrauchen, die zumeist in Form von ATP-Hydrolyse bereitgestellt wird. Dieses kann sich negativ auf den Energiehaushalt der Zellen auswirken, was z.B. niedrigere Biomassebildung oder niedrigere Produktbildung bewirken kann. Dieses gilt vor allen Dingen unter anaeroben Bedingungen oder bei bestimmten Fermentationen. Viele prokaryotische Zellen können dieses Problem durch den Besitz einer Pyruvat-Dehydrogenase umgehen. Diese bildet aus Pyruvat, NAD+ und CoA die Produkte Acetyl-CoA und NADH+H+. In eukaryontischen Zellen ist diese Reaktion auf die Mitochondπen beschrankt. Das in den Mitochondrien gebildete NADH sowie auch das Acetyl-CoA können nun nicht einfach über die Mitochondrienmembran ins Cytosol diffundieren, sodass das durch die Pyruvat-Dehydrogenase gebildete NADH und Acetyl-CoA für cytosolische Reaktionen nicht einfach zur Verfugung steht. Die meisten, oben genannten Folgeprodukte von Acetyl-CoA werden jedoch durch nicht-mitochondriale Reaktionsabfolgen gebildet . Die Bier-, Wein- und Backerhefe Saccharomyces cerevisiae wird aufgrund ihrer Eigenschaft, Zucker zu Alkohol und Kohlendioxid zu fermentieren, schon seit Jahrhunderten für die Brot-, Wein- und Bierherstellung genutzt. In der Biotechnologie findet S. cerevisiae neben der Produktion von heterologen Proteinen vor allem in der Produktion von biobasierten Chemikalien wie z.B. Ethanol und Lactat oder pharmazeutisch-medizinischen Wirkstoffen wie z.B. Artemisinin Verwendung. Auch wurde kurzlich ein rekombinanter Hefestamm beschrieben, der offensichtlich 1-Butanol produzieren kann.
Die Synthese einer Vielzahl von biobasierten Chemikalien und Wirkstoffen geht von Acetyl-CoA aus und beginnt im Cytosol. S. cerevisiae ist aber nicht in der Lage, das Acetyl-CoA, das bei der Pyruvat-Dehydrogenase Reaktion entsteht über die
Mitochondrienmembran ins Cytosol zu schleusen. S. cerevisiae besitzt auch keine ATP-Citrat Lyase. S. cerevisiae synthetisiert sein cytosolisches Acetyl-CoA aus Pyruvat mittels der Pyruvat-Decarboxylase, Acetaldehyd Dehydrogenase und Acetyl-CoA Synthetase Reaktionen. Dabei werden aber in der letzten Reaktion zwei Energieaquivalente in Form von ATP verbraucht. Das bedeutet aber, dass bei der Oxidation von 1 Molekül Glucose zu 2 Molekülen Acetyl-CoA insgesamt 2 Moleküle ATP aufgebracht werden müssen. Wurde man hingegen eine energieunabhangige Umgehungsreaktion schaffen können, dann ergäbe sich ein Gewinn von 2 Molekülen ATP.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Mittel und Wege zur Verfugung zu stellen, die die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile der Synthese von cytosolischem
Acetyl-CoA in eukaryotischen Wirtszellen, insbesondere Hefen und dabei bevorzugt Saccharomyces Spezies, überwinden und zu einer gesteigerten und energieunabhangigen Bereitstellung von Acetyl-CoA im Cytosol fuhren. Die Aufgabe wird erfmdungsgemaß gelost durch zur Verfugung stellen von Nukleinsauremolekulen, die jeweils für ein Polypeptid einer Coenzym A-abhangigen Acetaldehyd- Dehydrogenase oder einer Pyruvat-Formiat-Lyase kodieren. Im Falle der Pyruvat-Formiat-Lyase muss zusatzlich noch ein
Nukleinsauremolekul, welches für ein Polypeptid eines Pyruvat- Formiat-Lyase aktivierenden Enzyms kodiert, zur Verfugung gestellt werden.
Bei einem erfindungsgemaßen Nukleinsauremolekul handelt es sich um ein rekombinantes Nukleinsauremolekul. Des Weiteren umfassen erfindungsgemaße Nuklemsauremolekule dsDNA, ssDNA, PNA, CNA, RNA oder mRNA oder Kombinationen davon.
Die Bezeichnung „Nukleinsaurekonstrukt", wie sie nachfolgend verwendet wird, ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung als eine Sequenz aus dsDNA, ssDNA, PNA, CNA, RNA oder mRNA oder Kombinationen davon zu verstehen, die das erfindungsgemaße Nukleinsauremolekul umfasst. Ferner kann das Nukleinsaurekonstrukt eine oder mehrere weitere Sequenzen umfassen, die den Einbau des erfindungsgemaßen Nukleinsauremolekuls in eine Wirtszelle erleichtern, die die Ableserate des erfindungsgemaßen Nukleinsauremolekuls erhohen oder dem Fachmann aus anderen Gründen als für den erfindungsgemaßen Zweck geeignet bekannt sind.
Bei der Fermentation von Kohlenstoffquellen, insbesondere Kohlenhydraten, entsteht durch das in der Hefezelle heterolog exprimierte Gen einer Coenzym A-abhangigen Acetaldehyd- Dehydrogenase oder einer Pyruvat-Formiat-Lyase (plus eines Pyruvat-Formiat-Lyase aktivierenden Enzyms) der Zwischenmetabolit Acetyl-CoA. Acetyl-CoA ist ein zentrales Stoffwechselintermediat der Hefezellen und kann in Hefezellen, und insbesondere in rekombinanten Hefezellen, zu einer Vielzahl von Produkten weiter umgesetzt werden.
Im Falle der heterolog exprimierten Coenzym A-abhangigen Acetaldehyd-Dehydrogenase muss dabei gleichzeitig eine Pyruvat Decarboxylase exprimiert werden, um aus Pyruvat, Coenzym A und NAD+ die Moleküle Acetyl-Coenzym A, NADH+H+ und CO2 zu bilden. Die Coenzym A-abhangigen Acetaldehyd-Dehydrogenase setzt dabei das von der Pyruvat Decarboxylase gebildete Acetaldehyd zusammen mit Coenzym A und NAD+ zu Acetyl-Coenzym A und NADH+H+ um. S. cerevisiae exprimiert unter diesen Bedingungen normalerweise eine eigene Pyruvat-Decarboxylase (Pdcl) (SEQ. ID. 1) . Um die gleichzeitige Bildung von Ethanol aus Acetaldehyd zu reduzieren oder zu vermeiden und um die Verfügbarkeit von Acetaldehyd für die Coenzym A-abhangigen Acetaldehyd- Dehydrogenase zu steigern, kann die Expression oder Aktivität der Alkohol Dehydrogenasen der Hefe reduziert oder ausgeschaltet werden.
Im Falle der heterologen Expression einer Pyruvat-Formiat- Lyase/Pyruvat-Formiat-Lyase aktivierendes Enzym, welche Pyruvat zusammen mit Coenzym A zu Acetyl-CoA und Formiat umsetzt, muss gleichzeitig die Expression oder Aktivität einer cytosolisch lokalisierten Formiat-Dehydrogenase gesteigert werden, um mittels NAD+ das gebildete Formiat zu CO2 und
NADH+H+ umzusetzen. Diese Formiat-Dehydrogenase kann entweder ein eigenes Enzym der Hefe sein (Fdhl (SEQ. ID. 2) oder Fdh2 (SEQ. ID. 4) oder aber auch heterolog exprimiert werden. Da FDHl (SEQ. ID. 3) und FDH2 (SEQ. ID. 5) von S. cerevisiae jedoch nur schwach exprimiert werden, muss die Expression oder Aktivität z. B. durch die Verwendung eines unter den Fermentationsbedingungen starken Promoters erhöht werden. Dabei wird der naturliche Promoter eines oder beider Formiat Dehydrogenase Gene gegen einen starken Promotor (z.B. HXT7konst, PGKl, ADHl, ...) ausgetauscht. Ebenfalls kann es nützlich sein, die Expression oder Aktivität der Pyruvat Decarboxylasen der Hefe zu reduzieren oder auszuschalten, um die gleichzeitige Bildung von Ethanol zu reduzieren oder zu vermeiden und um die Verfügbarkeit von Pyruvat für die Pyruvat-Formiat-Lyase zu steigern.
Bei den Nukleinsauresequenzen der erfindungsgemaßen Nukleinsauremolekule, die jeweils für ein Polypeptid einer Coenzym A-abhangigen Acetaldehyd-Dehydrogenase kodieren, handelt es sich bevorzugt um Gene aus Prokaryonten (z.B. aus Escherichia coli), nämlich z.B. mhpF (SEQ. ID. 6), ein mutiertes Allel von adhE (SEQ. ID. 7)mit Coenzym A-abhangigen Acetaldehyd-Dehydrogenase Aktivität oder eine verkürzte Version des mutierten Allels von adhE (SEQ. ID. 8), die nur die Coenzym A-abhangigen Acetaldehyd-Dehydrogenase Aktivität des bifunktionalen Enzyms kodiert. Dabei kann die jeweilige Nukleinsauresequenz entweder eine Coenzym A-abhangige Acetaldehyd-Dehydrogenase kodieren oder sie wird als Nukleinsauresequenz-Fusion mit einem Gen, das für ein
Polypeptid mit Pyruvat-Decarboxylase-Aktivitat kodiert, wobei ein Polypeptid kodiert wird, welches beide Aktivitäten aufweist .
Bei den Nukleinsauresequenzen der erfindungsgemaßen
Nukleinsauremolekule, die jeweils für ein Polypeptid einer Pyruvat-Formiat-Lyase und eines Pyruvat-Formiat-Lyase aktivierenden Enzyms kodieren, handelt es sich bevorzugt um Gene aus Prokaryonten oder anaeroben Chytridiomyceten oder Chlorophyten . Dabei kann die Nukleinsauresequenz, die für ein Polypeptid einer Pyruvat-Formiat-Lyase kodiert, entweder dieses Polypeptid alleine kodieren oder sie wird als Nukleinsauresequenzfusion mit einem Gen, das für ein Polypeptid mit Formiat-Dehydrogenase Aktivität kodiert, wobei ein Polypeptid kodiert wird, welches beide Aktivitäten aufweist .
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle umfassen bevorzugt Nukleinsäuresequenzen, die mit der natürlich vorkommenden Nukleinsäuresequenz identisch sind, einzelne
Nukleotidsubstitutionen enthalten oder für eine Verwendung in einer Wirtszelle Codon-optimiert sind.
Jede Aminosäure wird auf Genebene durch ein Codon verschlüsselt. Jedoch gibt es mehrere verschiedene Codons, die für eine einzelne Aminosäure codieren. Der genetische Code ist folglich degeneriert. Die bevorzugte Codonwahl für eine entsprechende Aminosäure ist von Organismus zu Organismus verschieden. So kann es bei heterolog exprimierten Genen zu
Problemen kommen, wenn der Wirtsorganismus bzw. die Wirtszelle einen sehr unterschiedlichen Codon-Gebrauch aufweist. Das Gen kann überhaupt nicht oder nur langsam exprimiert werden. Sogar in Genen von verschiedenen Stoffwechselwegen innerhalb eines Organismus ist ein unterschiedlicher Codon-Gebrauch festzustellen. Von den Glykolyse-Genen aus S. cerevisiae ist bekannt, dass sie stark exprimiert werden. Sie weisen einen stark restriktiven Codon-Gebrauch auf. Die Anpassung des Codon-Gebrauchs der Gene der Coenzym A-abhängigen Acetaldehyd- Dehydrogenase oder der Pyruvat-Formiat-Lyase an den Codon- Gebrauch von S. cerevisiae führt zu einer Verbesserung der Acetyl-CoA Bildungsrate in Hefe.
Die vorliegende Erfindung betrifft überdies Expressionskassetten, umfassend ein erfindungsgemäßes Nukleinsauremolekul . Die erfindungsgemaßen
Expressionskassetten umfassen weiterhin bevorzugt Promotor- und Terminatorsequenzen. Bevorzugterweise sind Promotorsequenzen ausgewählt aus HXT7, verkürzter HXT7, PFKl, FBAl, PGKl, ADHl, TDH3. Bevorzugterweise sind Terminatorsequenzen ausgewählt aus CYCl, FBAl, PGKl, PFKl, ADHl, TDH3.
Die vorliegende Erfindung betrifft überdies
Expressionsvektoren, umfassend ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekύl oder eine erfindungsgemäße
Expressionskassette. Die erfindungsgemaßen Expressionsvektoren umfassen weiterhin bevorzugt einen Selektionsmarker . Bevorzugterweise wird der Selektionsmarker ausgewählt aus einem Leucin-Marker, einem Uracil-Marker, den dominanten Antibiotika-Marker Geneticin, Hygromycin und Nourseothricin .
Die vorliegende Erfindung betrifft uberdies_Wirtszellen, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsaurekonstrukt, eine erfindungsgemaße Expressionskassette oder einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthalten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemaßes Nukleinsäuremolekül, eine erfindungsgemäße Expressionskassette oder ein erfindungsgemaßer Expressionsvektor in das Genom der Wirtszelle stabil integriert .
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle ist bevorzugt eine Pilzzelle und weiter bevorzugt eine Hefezelle, wie Saccharomyces species, Kluyveromyces sp., Hansenula sp., Pichia sp. oder Yarrowia sp..
Die vorliegende Erfindung betrifft überdies eine rekombinante Wirtszelle, die ein solches isoliertes Nukleinsäuremolekül enthält. Dabei betrifft die vorliegenden Erfindung insbesondere eine rekombinante Wirtszelle, die ein Nukleinsaurekonstrukt enthält, welches ein Polypeptid kodiert, das eine Substrat-Produkt Umwandlung katalysiert, die aus den folgenden zwei Reaktion ausgewählt ist:
a) Acetaldehyd + Coenzym A + NAD+ zu Acetyl-Coenzym A + NADH+H4
und/oder
b) Pyruvat + Coenzym A zu Acetyl-Coenzym A + Formiat,
wobei zumindest ein DNA-Molekül heterolog zu der besagten Wirtszelle ist und wobei die besagte Wirtszelle eine gesteigerter Acetyl-Coenzym A Produktion aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt eine
Wirtszelle wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die gesteigerte Acetyl-CoA Bildung im Cytoplasma der Wirtszelle stattfindet.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt eine
Wirtszelle wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid, das die Umwandlung von Acetaldehyd + Coenzym A + NAD+ zu Acetyl-Coenzym A + NADH+H+ katalysiert eine Coenzym A-abhängige Acetaldehyd-Dehydrogenase ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt eine Wirtszelle wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid, das die Umwandlung von Pyruvat + Coenzym A zu Acetyl-Coenzym A + Formiat katalysiert, eine Pyruvat- Formiat-Lyase und durch die gleichzeitige Expression eines Pyruvat-Formiat-Lyase aktivierenden Enzyms aktiviert wird. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt eine Wirtszelle wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Coenzym A-abhängige Acetaldehyd-Dehydrogenase in einer Wirtszelle exprimiert wird, die gleichzeitig eine Pyruvat-Decarboxylase Aktivität exprimiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt eine Wirtszelle wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Coenzym A-abhängige Acetaldehyd-Dehydrogenase und die Pyruvat-Decarboxylase in einer Wirtszelle exprimiert werden, die eine reduzierte oder keine Aktivität einer Alkohol- Dehydrogenase aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt eine Wirtszelle wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Pyruvat-Formiat-Lyase und Pyruvat-Formiat-Lyase aktivierendes Enzym in einer Wirtszelle exprimiert werden, die gleichzeitig ein Polypeptid exprimiert, das die Umwandlung von Formiat + NAD+ zu CO2 + NADH+H4 katalysiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt eine Wirtszelle wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein, welches die Umwandlung von Formiat + NAD+ zu CO2 + NADH+H+ katalysiert, eine Formiat-Dehydrogenase ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt eine Wirtszelle wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Pyruvat-Formiat-Lyase und Pyruvat-Formiat-Lyase aktivierendes Enzym und die Formiat-Dehydrogenase in einer Wirtszelle exprimiert werden, die eine reduzierte oder keine Aktivität einer Pyruvat-Decarboxylase aufweist. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt eine Wirtszelle wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle eine Hefe ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt eine
Wirtszelle wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle ausgewählt ist aus folgender Gruppe: Pichia, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Yarrowia und Saccharomyces .
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt eine Wirtszelle wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle Saccharomyces cerevisiae ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt eine
Wirtszelle wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle eine fakultativ anaerobe Wirtszelle ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft überdies ein Verfahren zur gesteigerten Bereitstellung von Acetyl-CoA im Cytosol in einer Wirtszelle. Das erfindungsgemaße Verfahren umfasst die Expression eines erfmdungsgemaßen Nuklemsauremolekuls, einer erfindungsgemaßen Expressionskassette oder eines erfmdungsgemaßen Expressionsvektors in einer Wirtszelle.
Insbesondere umfasst das erfindungsgemaße Verfahren die Bereitstellung einer Wirtszelle wie vorstehend definiert sowie das Inkontaktbringen der Wirtszelle mit einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle unter Bedingungen, unter denen die Bildungsrate von Acetyl-CoA gesteigert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt ein Verfahren wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die fermentierbare Kohlenstoffquelle eine C3 - C6 Kohlenstoffquelle ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt ein Verfahren wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoffquelle zu der Gruppe bestehend aus Monosacchariden, Oligosacchariden oder Polysacchariden gehört.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt ein Verfahren wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoffquelle zu der Gruppe bestehend aus Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose, Xylose oder Arabinose gehört .
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt ein
Verfahren wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle mit der Kohlenstoffquelle in Kulturmedium in Kontakt gebracht wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt ein
Verfahren wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle weitere heterologe Nukleinsauremolekule enthalt, welche für Polypeptide kodieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt ein
Verfahren wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle ausgehend von Acetyl-CoA ein Folgeprodukt bildet.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt ein
Verfahren wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Folgeprodukt zu der Gruppe bestehend aus Mevalonat, Isoprenoiden, Sterolen, Sesquiterpenen, Polyprenolen, Terpenoiden, Flavonoiden, Stilbenoiden, Malonat, malonylierten Sekundärmetaboliten, D-Aminosäuren, N-Malonyl- Aminocyclopropancarboxylsäure, Fettsäuren, Lipiden, Ölen, Wachsen, Cystein, Glucosinolat, Xenobiotica, Pestiziden, Biokunststoffen, Polyhydroxybutyrat, Aroma-aktiven Estern, 1- Butanol, Alkanen, Butylacetat gehört.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter bevorzugt ein Verfahren wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Produktion des Folgeproduktes gesteigert ist.
Dabei wird das Verfahren bevorzugt in einer erfindungsgemäßen Wirtszelle durchgeführt.
Die vorliegende Erfindung betrifft überdies ein Nukleinsäuremolekül, eine erfindungsgemäße
Expressionskassette, einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor, eine erfindungsgemäße Wirtszelle mit gesteigerter Acetyl-CoA Produktionsrate.
Die vorliegende Erfindung betrifft überdies die Verwendung eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors, einer erfindungsgemäßen Wirtszelle zur rekombinanten Fermentation von Biomaterial.
Durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, eines erfindungsgemaßen Expressionsvektors, einer erfindungsgemäßen Wirtszelle wird die Bildungsrate von cytosolischem Acetyl-CoA gesteigert. Das Resultat ist eine schnellere, effizientere und gesteigerte Produktion von Acetyl-CoA im Cytoplasma der erfindungsgemaßen Wirtszelle sowie gegebenenfalls eine gesteigerte Produktion von Folgeprodukten wie sie oben beschrieben wurden. Die vorliegende Erfindung betrifft überdies ein Polypeptid, das eine in vitro und/oder in vivo Coenzym A-abhangige Acetaldehyd-Dehydrogenase Aktivität aufweist und/oder ein Polypeptid, das eine in vitro und/oder in vivo Pyruvat- Formiat-Lyase Aktivität aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft überdies ein isoliertes Nukleinsauremolekul, das für ein erfindungsgemaßes Polypeptid kodiert.
Für bevorzugte Ausfuhrungsformen des isolierten Nukleinsauremolekuls und der Wirtszellen wird hiermit Bezug genommen auf die oben aufgeführten Ausfuhrungsformen.
Das erfindungsgemaße Polypeptid, isolierte Nukleinsauremolekul und die erfindungsgemaße Wirtszelle werden bevorzugt verwendet zur Steigerung der Produktion von cytosolischen Acetyl-CoA.
Das erfindungsgemaße Polypeptid, isolierte Nukleinsauremolekul und die erfindungsgemaße Wirtszelle werden bevorzugt verwendet zur Steigerung der Produktion von cytosolischen Acetyl-CoA und davon abstammenden Folgeprodukten in Wirtszellen, insbesondere Hefen, wobei die Wirtszellen auch eine oder mehrere zusätzliche Modifikationen, wie Nukleinsauremolekule enthalten .
Bei einer solchen zusatzlichen Modifikation handelt es sich erfindungsgemaß beispielsweise um eine Wirtszelle, die aufgrund der Zurverfügungstellung von heterologen
Nukleinsauremolekulen Butanol produziert, wie von den Erfindern in der (WO 2007/041269 A2) beschrieben. Weiterhin handelt es sich bei einer solchen zusatzlichen Modifikation erfindungsgemäß beispielsweise um eine Wirtszelle, die aufgrund der Zurverfügungstellung von heterologen Nukleinsauremolekulen Isoprenoidverbindungen produziert, wie von den Erfindern in der (WO 2007/024718 A2) beschrieben .
Weiterhin handelt es sich bei einer solchen zusatzlichen Modifikation erfindungsgemäß beispielsweise um eine Wirtszelle, die aufgrund der Zurverfügungstellung von heterologen Nukleinsauremolekulen folgende Folgeprodukte produziert: Acetoacetyl-CoA, Mevalonat, Isoprenoide, Sterole, Sesquiterpene, Polyprenole, Terpenoide, Malonyl-CoA, Flavonoide, Stilbenoide, Malonat, malonylierte Sekundärmetabolite, D-Aminosäuren, N-Malonyl-
Aminocyclopropancarboxylsäure, Fettsäuren, Lipide, Öle, Wachse, Cystein, Glucosinolat, Xenobiotica, Pestizide, Biokunststoffe, Polyhydroxybutyrat , Aroma-aktive Ester aus einem Alkohol und einer Fettsaure, Butanol, Alkane, Butylacetat, und sämtliche anderen Verbindungen, die sich aus den genannten ableiten lassen.
Das erfmdungsgemaße Polypeptid, isolierte Nukleinsauremolekul und die erfindungsgemäße Wirtszelle werden bevorzugt verwendet zur Steigerung der Produktion von cytosolischen Acetyl-CoA und Folgeprodukten bei der Fermentation von Kohlenstoffquellen.
Nutzungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Expressionskassetten, Expressionsvektoren und Wirtszellen sind die Herstellung von hochwertigen Vorläufer-Produkten für weitere biochemische und chemische Synthesen.
Sobald diese Chemikalien aus Biomaterial durch Biokonversion (z.B. Fermentationen mit Hefen) hergestellt werden, ist es wichtig, die erfmdungsgemaßen Nukleinsäuren,
Expressionskassetten, Expressionsvektoren und Wirtszellen zur Verfugung zu haben.
Die Erfindung ermöglicht eine gesteigerte und energieunabhangige Bereitstellung von Acetyl-CoA im Cytosol eukaryotischer Wirtszellen, insbesondere Hefen und dabei bevorzugt Saccharomyces Spezies. Da die Bereitstellung von Acetyl-CoA eine limitierende Reaktion bei der biotechnologischen Produktion einer Vielzahl von
Folgeprodukten ist, ermöglicht die Erfindung auch die Steigerung der Produktion dieser Folgeprodukte, wie z.B. 1- Butanol, Crotonsaure, Mevalonat, Isoprenoide, Fettsauren, Alkane, oder Flavonoide, insbesondere in Wirtszellen, die weitere entsprechende heterologe Nukleinsäuren enthalten. Dies gilt insbesondere bei Fermentationen von Biomaterial unter anaeroben oder microaeroben Bedingungen.
Methoden
1. Stamme und Medien
1.1 Bakterien
- E. coli SURE (Stratagene) - E. coli DH5α (Stratagene)
Vollmedium LB 1% Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5% NaCl, pH 7,5 (siehe Maniatis, 1982) .
Für die Selektion auf eine plasmidkodierte
Antibiotikaresistenz wurde dem Medium nach dem Autoklavieren 40μg/ml Ampicillin zugesetzt. Feste Nahrmedien enthielten zusätzlich 2% Agar. Die Anzucht erfolgte bei 37°C. 1 . 2 Hefen
Stamme aus der Serie CEN. PK, Industriehefen
-synthetisches Komplettselektivmedium SC: 0,67% Yeast nitrogen base w/o anno acids, pH6,3,
Aminosaure/Nukleobase-Losung, Kohlenstoffquelle in der jeweils angegeben Konzentration
-synthetisches Mmimalselektivmedium SM: 0,16% Yeast nitrogen base w/o amino acid and ammonium sulphate, 0,5% Ammoniumsulfat ,2OmM Kalium- dihydrogenphosphat, pH6,3, Kohlenstoffquelle in der jeweils angegeben Konzentration
-synthetisches Fermentationsmedium (Mmeralmedium) SFM: (Verduyn et al., 1992), pH 5,5
Salze: (NH4)2SO4, 5g/l; KH2PO4, 3g/l; MgSO4*7H2O, 0,5g/l Spurenelemente: EDTA, 15mg/l, ZnSO4M, 5mg/l; MnCl2MH2O, 0,lmg/l; CoCl2*6H20, 0,3 mg/1; CuSO4, 0,192 mg/1; Na2Mo04*2H20, 0,4 mg/l;CaCl2*2H2O, 4,5 mg/1; FeSO4*7H2O, 3 mg/1; H3BO3, 1 mg/1; KI, 0, 1 mg/1
Vitamine: Biotin, 0,05 mg/1; p-Aminobenzoesaure, 0,2 mg/1; Nicotinsaure, 1 mg/1; Calciumpantothenat, 1 mg/1; Pyridoxin- HCL, 1 mg/1; Thiamin-HCL, 1 mg/1; Minositol, 25 mg/1
Konzentration der Aminosäuren und Nukleobasen im synthetischen Komplettmedium (nach Zimmermann, 1975) : Adenin (0,08mM), Arginin (0,22mM), Histidin (0,25mM), Isoleucin (0,44mM), Leucin (0,44mM), Lysin (0,35mM), Methionm (0,26mM), Phenylalanin (0,29mM), Tryptophan (0,19mM), Threonin (0,48mM), Tyrosin (0,34mM), Uracil (0,44mM), Valin (0,49mM). Als Kohlenstoffquelle wurden L-Arabinose und D- Glucose eingesetzt. Feste Voll- und Selektivmedien enthielten zusaztlich 1,8 % Agar. Die Anzucht der Hefezellen erfolgte bei 30°C. Das für die Fermentationen eingesetzte synthetische Mineralmedium enthielt Salze, Spurenmetalle und Vitamine in den oben aufgelisteten Konzentrationen und L-Arabinose als Kohlenstoffquelle . Von den Spurenmetallen und den Vitaminen wurde eine Stammlosung angesetzt. Beide Losungen wurden sterilflltriert . Beide wurden bei 4 °C gelagert. Für die Herstellung der Spurenmetalllosung war der pH-Wert von entscheidender Rolle. Die verschiedenen Spurenelemente mussten in der obigen Reihenfolge nacheinander in Wasser vollständig gelost werden. Nach jeder Zugabe musste der pH- Wert mit KOH auf 6, 0 eingestellt werden bevor das nächste Spurenelement zugegeben werden konnte. Am Ende wurde der pH- Wert mit HCL auf 4,0 justiert. Um Schaumbildung zu vermeide, wurde dem Medium 200μl Antischaum (Antifoam2004, Sigma) zugegeben. Da die Versuche unter anaeroben Bedingungen durchgeführt wurden, musste dem Medium nach dem Autoklaviern noch 2,5 ml/1 einer Tween80-Ergosterol-Losung zugegeben werden. Diese besteht aus 16,8 g Tween80 und 0,4 g Ergosterol, welche mit Ethanol auf 50 ml aufgefüllt und darin gelost wurden. Die Losung wurde sterilflltriert . Die Salze und der Antischaum wurden gemeinsam mit dem kompletten Fermenter autoklaviert . Die Arabmose wurde getrennt vom restlichen Medium autoklaviert. Nach Abkühlen des Mediums wurden die Spurenelemente sowie die Vitamine hinzugegeben. 2. Transformation
2.1 Transformation von E. coli Die Transformation der E. coli Zellen erfolgte durch die
Elektroporationsmethode nach Dower et al. (1988) und Wirth (1993) mittels eines Easyject prima Geräts (EQUIBO).
2.2 Transformation von S. cerevisiae Die Transformation von S. cerevisiae Stammen mit Plasmid-DNA bzw. DNA-Fragmenten erfolgte nach der Lithiumacetat-Methode von Gietz und Woods (1994) .
3. Praparation von DNA
3.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli erfolgte nach der Methode der alkalischen Lyse von Birnboim und DoIy (1979), modifiziert nach Maniatis et al. (1982) oder alternativ mit dem „QIAprep Spin Miniprep Kit" der Firma Qiagen.
Hochreine Plasmid-DNA für Sequenzierungen wurde mit dem „Plasmid Mini Kit" der Firma Qiagen nach Angaben des Herstellers präpariert.
3.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus S. cerevisiae
Die Zellen einer stationären Hefekultur (5ml) wurden durch Zentrifugation geerntet, gewaschen und in 400μl Puffer Pl (Plasmid Mini Kit, Firma Qiagen) resuspendiert. Nach Zugabe von 400μl Puffer P2 und 2/3 Volumen Glasperlen (0 0,45mm) erfolgte der ZellaufSchluss durch 5-minütiges Schuttein auf einem Vibrax (Vibrax-VXR von Janke & Kunkel oder IKA) . Der Überstand wurde mit 2 Volumen Puffer P3 versetzt, gemischt und für 10min auf Eis inkubiert. Nach einer 10-minutigen Zentrifugation bei 13000rpm wurde durch Zugabe von 0,75ml Isopropanol zum Überstand die Plasmid-DNA bei Raumtemperatur gefällt. Die durch Zentrifugation für 30min bei 13000rpm pelletierte DNA wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20μl Wasser resuspendiert . lμl der DNA wurde für die Transformation in E. coli eingesetzt.
3.3 Bestimmung der DNA-Konzentration
Die DNA-Konzentration wurde spektralphotometrisch in einem Wellenlängenbereich von 240-300nm gemessen. Liegt die Reinheit der DNA, bestimmt durch den Quotient E260nm/E280nm, bei 1,8, so entspricht die Extinktion E260nm=l,0 einer DNA-Konzentration von 50μg dsDNA/ml (Maniatis et al . , 1982).
3.4 DNA-Amplifikation mittels PCR
Verwendung des Phusion™ High Fidelity Systems Die Polymerasekettenreaktion erfolgte in einem Gesamtvolumen von 50μl mit dem „Phusion™ High Fidelity PCR System" der Firma Finnzymes nach Angaben des Herstellers. Jeder Ansatz bestand aus 1-lOng DNA oder 1-2 Hefekolonien als Synthesevorlage,
0,2mM dNTP-Mix, lxPuffer 2 (enthält 1,5mM MgCl2), IU Polymerase und je lOOpmol der entsprechenden Oligonukleotidprimer . Die PCR-Reaktion wurde in einem Thermocycler der Firma Techne durchgeführt und die PCR-Bedingungen nach Bedarf wie folgt gewählt:
1 Ix 30sec, 98°C Denaturierung der DNA
2 3Ox lOsec, 98°C Denaturierung der DNA
30sec, 56- Annealing/Bindung der
62°C Oligonukleotide an die DNA
0, 5-lmin, DNA-Synthese/Elongation 72°C
3 Ix 7min, 72°C DNA-Synthese/Elongation Nach dem ersten Denaturierungsschritt wurde die Polymerase zugegeben („not start PCR"). Die Anzahl der Syntheseschritte, die Annealingtemperatur und die Elongationszeit wurden an die spezifischen Schmelztemperaturen der verwendeten
Oligonukleotide bzw. an die Große des zu erwarteten Produkts angepasst. Die PCR-Produkte wurden durch eine Agarosegelelektrophorese überprüft und anschließend aufgereinigt .
3.5 DNA-Aufreinigung von PCR-Produkten
Die Aufreinigung der PCR-Produkte erfolgte mit dem „QIAquick PCR Purification Kit" der Firma Qiagen nach Herstellerangaben.
3.6 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten
Die Auftrennung von DNA-Fragmenten mit einer Große von 0,15- 20kb erfolgte in 0,5-l%igen Agarosegelen mit 0,5μg/ml Ethidiumbromid. Als Gel- und Laufpuffer wurde lxTAE-Puffer (4OmM Tris, 4OmM Essigsaure, 2mMEDTA) verwendet (Mamatis et al., 1982) . Als Großenstandard diente eine mit den
Restriktionsendonukleasen EcoRI und HindiII geschnittene Lambda-Phagen-DNA. Die DNA-Proben wurden vor dem Auftragen mit Vio Volumen Blaumarker (lxTAE-Puffer, 10% Glycerin, 0,004% Bromphenolblau) versetzt und nach der Auftrennung durch Bestrahlung mit UV-Licht (254nm) sichtbar gemacht.
3.7 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Das gewünschte DNA-Fragment wurde aus dem TAE-Agarosegel unter langwelligem UV-Licht (366nm) ausgeschnitten und mit dem „QIAquick Gel Extraction Kit" der Firma Qiagen nach Angaben des Herstellers isoliert. 4. Enzymatische Modifikation von DNA
4.1 DNA-Restriktion
Sequenz-spezifische Spaltung der DNA mit Restriktionsendonukleasen wurden unter den vom Hersteller empfohlenen Inkubationsbedingungen für 1 Stunde mit 2-5U Enzym pro μg DNA durchgeführt.
Weitere mögliche Expressionsvektoren sind aus der Serie pRS303X, p3RS305X und p3RS306X. Hierbei handelt es sich um integrative Vectoren, die einen dominanten Antibiotika-Marker besitzen. Nähere Angaben zu diesen Vektoren finden sich bei Taxis und Knop (2006) .
Referenzen
Bailey, J.E. (1993) Host-vector interactions in Escherichia coli. Adv. Biochem Eng. 48.29-52
Birnboim, H. C. und J. DoIy (1979)
A rapid alkaline extraction procedure for Screening recombinant plasmid DNA.
Nucl. Acids Res. 7: 1513-1523
Dower, W. J., Miller, J. F. und Ragsdale, C.W. (1988)
High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.
Nucl. Acids Res. 16: 6127-6145
Gietz, R.D. und Woods, R.A. (1994)
High efficiency transformation in yeast . In: Molecular Genetics of Yeast: Practical Approaches, J. A. Johnston (Ed .) .
Oxford University Press pp. 121-134
Maniatis T, Fritsch, E. F und Sambrook, J. (1982) Molecular cloning. A laboratory manual. CoId Spring Harbor Laboratory, New York.
Taxis, C. und Knop, M. (2006)
System of centromeric, episomal, and mtegrative vectors based on drug resistance markers for Saccharomyces cerevisiae. BioTechniques 40, No. 1 Verduyn, C, Postma, E., Schθffers, W.A. und Van Dijken, J. P. (1992)
Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts : a continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholic fermentation. Yeast 8 (7) , 501-17
Wirth;R. (1993)
Elektroporation : Eine alternative Methode zur Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA.
Forum Mikrobiologie 11 (507-515).
Zimmermann, F. K. (1975)
Procedures used in the induction of mitotic recombination and mutation in the yeast Saccharomyces cerevisiae . Mutation Res. 31:71-81

Claims

Patentansprüche
1. Eine rekombinante Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt enthalt, welches ein Polypeptid kodiert, das eine Substrat-Produkt Umwandlung katalysiert, die aus den folgenden zwei Reaktion ausgewählt ist: a) Acetaldehyd + Coenzym A + NAD+ zu Acetyl-Coenzym A + NADH+H+ und/oder b) Pyruvat + Coenzym A zu Acetyl-Coenzym A + Formiat, wobei zumindest ein DNA-Molekul heterolog zu der besagten Wirtszelle ist und wobei die besagte Wirtszelle eine gesteigerte Acetyl-Coenzym A Produktion aufweist.
2. Eine Wirtszelle entsprechend Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die gesteigerte Acetyl-CoA Bildung im Cytoplasma der Wirtszelle stattfindet.
3. Eine Wirtszelle entsprechend Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid, das die Umwandlung von Acetaldehyd + Coenzym A + NAD+ zu Acetyl-Coenzym A + NADH+H+ katalysiert eine Coenzym A-abhängige Acetaldehyd- Dehydrogenase ist.
4. Eine Wirtszelle entsprechend Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid, das die Umwandlung von Pyruvat + Coenzym A zu Acetyl-Coenzym A + Formiat katalysiert, eine Pyruvat-Formiat-Lyase und durch die gleichzeitige Expression eines Pyruvat-Formiat-Lyase aktivierenden Enzyms aktiviert wird.
5. Eine Wirtszelle entsprechend Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Coenzym A-abhängige Acetaldehyd- Dehydrogenase in einer Wirtszelle exprimiert wird, die gleichzeitig eine Pyruvat-Decarboxylase Aktivität exprimiert.
6. Eine Wirtszelle entsprechend Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Coenzym A-abhangige Acetaldehyd- Dehydrogenase und die Pyruvat-Decarboxylase in einer Wirtszelle exprimiert werden, die eine reduzierte oder keine Aktivität einer Alkohol-Dehydrogenase aufweist.
7. Eine Wirtszelle entsprechend Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Pyruvat-Formiat-Lyase und Pyruvat-Formiat-Lyase aktivierendes Enzym in einer Wirtszelle exprimiert werden, die gleichzeitig ein Polypeptid exprimiert, das dieUmwandlung von Formiat + NAD+ zu CO2 + NADHH-H+ katalysiert.
8. Eine Wirtszelle entsprechend Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein, welches die Umwandlung von Formiat + NAD+ zu CO2 + NADH+H+ katalysiert, eine Formiat-Dehydrogenase ist.
9. Eine Wirtszelle entsprechend Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Pyruvat-Formiat-Lyase und Pyruvat-Formiat-Lyase aktivierendes Enzym und die Formiat- Dehydrogenase in einer Wirtszelle exprimiert werden, die eine reduzierte oder keine Aktivität einer Pyruvat- Decarboxylase aufweist.
10. Eine Wirtszelle entsprechend Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle eine Hefe ist.
11. Eine Wirtszelle entsprechend Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle ausgewählt ist aus folgender Gruppe: Pichia, Candida, Hansenula, Kluyveromyceε, Yarrowia und Saccharomyces .
12. Eine Wirtszelle entsprechend Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle Saccharomyces cerevisiae ist.
13. Eine Wirtszelle entsprechend Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle eine fakultativ anaerobe Wirtszelle ist.
14. Verfahren für eine gesteigerte Bildungsrate von Acetyl-CoA in einer Wirtszelle, umfassend die Bereitstellung einer
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 13 sowie das Inkontaktbringen der Wirtszelle mit einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle unter Bedingungen, unter denen die Bildungsrate von Acetyl-CoA gesteigert ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die fermentierbare Kohlenstoffquelle eine C3 - C6 Kohlenstoffquelle ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoffquelle zu der Gruppe bestehend aus Monosacchariden, Oligosacchariden oder Polysacchariden gehört .
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoffquelle zu der Gruppe bestehend aus Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose, Xylose oder Arabinose gehört .
18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle mit der Kohlenstoffquelle in Kulturmedium in Kontakt gebracht wird.
19. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle weitere heterologe Nukleinsaurekonstrukte enthalt, welche Polypeptide bilden.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle ausgehend von Acetyl-CoA ein Folgeprodukt bildet.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Folgeprodukt zu der Gruppe bestehend aus Mevalonat, Isoprenoiden, Sterolen, Sesquiterpenen, Polyprenolen, Terpenoiden, Flavonoiden, Stilbenoiden, Malonat, malonylierten Sekundarmetaboliten, D-Aminosauren, N- Malonyl-Aminocyclopropancarboxylsaure, Fettsauren, Lipiden, Ölen, Wachsen, Cystein, Glucosinolat, Xenobiotica, Pestiziden, Biokunststoffen,
Polyhydroxybutyrat, Aroma-aktiven Estern, 1-Butanol, Alkanen, Butylacetat gehört.
22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Produktion des Folgeproduktes gesteigert ist.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2011149353A1 (en) * 2010-05-27 2011-12-01 C5 Yeast Company B.V. Yeast strains engineered to produce ethanol from acetic acid and glycerol

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5855881A (en) * 1996-02-22 1999-01-05 Loike; John D. Mammalian alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase production in plants
US20090053797A1 (en) 2005-08-19 2009-02-26 Yoichiro Shiba Genetically modified host cells and use of same for producing isoprenoid compounds
US9297028B2 (en) 2005-09-29 2016-03-29 Butamax Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
WO2008052991A2 (en) * 2006-10-31 2008-05-08 Dsm Ip Assets B.V. Butanol production in a eukaryotic cell
US20100159546A1 (en) * 2007-03-30 2010-06-24 Aristos Aristidou Metabolic engineering of yeasts for the production of 1-butanol
EP2171075A2 (de) * 2007-07-23 2010-04-07 DSM IP Assets B.V. Butanolherstellung in einer eukaryotischen zelle

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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