KR20150117853A - 미생물 변이체를 이용하여 팜슬러지 오일로부터 아디프산을 제조하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 지방산을 아세틸-CoA로 전환시키는 효소인 acyl-CoA oxidase를 코딩하는 유전자가 결실된 미생물 변이체를 이용하여 아디프산을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 acyl-CoA oxidase를 코딩하는 유전자(AOX5)가 결실 된 미생물 변이체를 이용하여 팜슬러지 오일로부터 아디프산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른, 미생물의 변이체를 이용할 경우 팜슬러지 오일을 비롯한 저가의 다양한 바이오오일로부터 아디프산을 효과적으로 생산할 수 있다.

Description

미생물 변이체를 이용하여 팜슬러지 오일로부터 아디프산을 제조하는 방법{Methods for Preparing Adipic Acid from Palm-sludge Oil Using Variant of Microorganisam}
본 발명은 지방산을 아세틸-CoA로 전환시키는 효소인 acyl-CoA oxidase를 코딩하는 유전자가 결실된 미생물 변이체를 이용하여 아디프산을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 acyl-CoA oxidase를 코딩하는 유전자(AOX5)가 결실된 미생물 변이체를 이용하여 팜슬러지 오일로부터 아디프산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
아디프산(Adipic acid)은 열가소성 수지와 코팅, 나일론6.6을 만들 수 있는 재생가능한 핵심 성분으로, 산업적 관측에서 보면 가장 중요한 다이카르복시산이다. 지방을 가수분해하여 얻은 유기산의 하나이며 기둥모양의 결정으로 무색이다. 매년 25억 kg이 제조되고 있으며, 주로 나일론을 만들기 위한 전구체로 이용되며 플라스틱 가소제, 염료·의약품 등의 원료로도 널리 사용되고 있다. 또한 베이킹파우더의 산제, 치즈, 캔디, 젤리의 산미료, 알코올 음료의 향미증진제, 잼, 젤리의 겔 형성을 위한 pH조절제로 사용된다.
아디프산은 화학적으로는 시클로헥산을 산화시켜 합성하며, 생물학적으로는 미생물 발효에 의해 포도당으로부터 cis, cis-뮤콘산 생산 후, 이의 수소화를 거쳐 생산할 수도 있다.
아디프산(Adipic acid)을 생성하는 효모들의 개발이 활발하게 이루어지고 있다. Picataggio 연구그룹에 의해 처음으로 지방산으로부터 아세틸-CoA를 생성시키는 acyl-CoA oxidase를 코딩하는 유전자 POX4 결손 및 POX5가 증폭된 재조합 효모 (Candida tropicalis)균주를 이용하여 아디프산 생성 균주가 개발되었으며 (Picataggio et al ., Nature Biotechnology, 10(8):894-898, 1992, 미국특허 제 8,343,752호), 이후 다양한 연구 그룹에서 아디프산 생성 균주의 개발이 이루어지고 있다.
최근 Verdezyne은 비식용 식물성 오일 같은 재생가능한 원료로부터 아디프산을 생산하는 발효공정을 개발하였다 (미국특허 제 8,343,752호). 세계적으로 친환경적 산업 개발 흐름에 따라 아디프산 제조사들을 중심으로 비 석유계 원료를 이용해서 바이오매스 유래 아디프산을 대량 생산 및 산업화하는 연구가 진행되고 있다. 또한 미래 에너지 가격의 폭등으로 인한 생산 비용의 충격에 대비하여 다양한 생물자원의 당, 식물성 오일, 알칸 등을 미생물들을 활용할 수 있도록 하기위한 다양한 연구가 이루어지고 있다.
미생물로부터 발효를 통해 바이오화학 원료를 생산하는 원가에서 탄소원의 원료가격이 차지하는 비중이 약 50%이상으로 알려져 있어, 바이오화학 원료의 경제적 생산을 위해서는 저가의 탄소원 활용의 중요성이 증가하고 있다. 동남아시아를 중심으로 말레이시아, 인도네시아에서 연간 crude palm oil(CPO)의 생산량은 약 6천만 톤이며 이로 인해 발생하는 폐기물 POME(palm oil mill effluent)는 2억톤에 이른다. 이들로부터 약 200만톤의 팜슬러지 오일(PSO, palm sludge oil) 회수가 가능하며, 팜슬러지오일의 경우 약 60%의 지방산(Bioresource Technology. 2014 155-161)을 함유하고 있다. 또한 가격은 $375-380/ton (인도네시아 산, 지방산 50%이상 함량)으로 매우 저렴하기 때문에 경제적으로 아디프산 생산이 가능할 것으로 보인다.
이에, 본 발명자들은 저가의 팜슬러지오일로부터 아디프산을 효율적으로 생산하고자 예의 노력한 결과, 지방산 대사가 활발한 Candida tropicalis의 변이체가 팜슬러지 오일로부터 아디프산을 효율적으로 생산하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 미생물 변이체를 이용하여 팜슬러지 오일로부터 아디프산을 생산하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지방산을 아세틸-CoA로 전환시키는 효소인 Acyl-CoA oxidase를 코딩하는 유전자(AOX5) 결실되어 있는 유지성 미생물 변이체를 팜슬러지오일 함유 배지에서 배양하여 아디프산(Adipic Acid) 및 회수하는 단계를 포함하는 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 지방산을 아세틸-CoA로 전환시키는 효소인 Acyl-CoA oxidase를 코딩하는 유전자(AOX4) 결실 및 Acyl-CoA oxidase 5(AOX5) 유전자 과발현되어 있는 유지성 미생물 변이체를 팜슬러지오일 함유 배지에서 배양하여 아디프산(Adipic Acid) 및 회수하는 단계를 포함하는 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른, 미생물의 변이체를 이용할 경우 팜슬러지 오일을 비롯한 저가의 다양한 바이오오일로부터 아디프산을 효과적으로 생산할 수 있다.
도 1. Acyl-CoA oxidase 유전자가 결실된 Candida tropicalis (KCTC 7212) 미생물 변이체들의 제작 과정을 나타낸 것이다.
도 2. Candida tropicalis (KCTC 7212) 미생물 변이체의 Acyl-CoA oxidase 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 지방산을 아세틸-CoA로 전환시키는 효소인 Acyl-CoA oxidase를 코딩하는 유전자(AOX5)가 결실되어 있는 유지성 미생물 변이체를 팜슬러지오일 함유 배지에서 배양하여 아디프산(Adipic Acid)을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 아디프산을 회수하는 단계를 포함하는 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 유전자의 ‘결실’이란 상기 유전자가 염색체상 또는 플라스미드 상에서 삭제되어 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 생산 할 수 없게 된 상태를 의미한다.
본 발명에 있어서 유지성 미생물은 자신의 무수 세포 중량의 25% 이상을 오일로서 축적할 수 있는 효모로서 분류된 미생물을 지칭하며, 야로위아 (Yarrowia), 칸디다 (Candida), 로도토룰라 (Rhodotorula), 로도스포리듐 (Rhodosporidium), 크립토코쿠스 (Cryptococcus), 트리코스포론 (Trichosporon) 및 리포마이세스 (Lipomyces) 속이 포함된다. 그 중 야로위아, 칸디다, 로도토룰라를 사용하는 것이 바람직하고, 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)(KCTC 7212)를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 있어서 아디프산을 생산하기 위한 유일한 탄소원으로 지방산 및 팜슬러지 오일을 비롯한 다양한 바이오 오일중 저가의 팜슬러지 오일을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 지방산을 아세틸-CoA로 전환시키는 효소인 Acyl-CoA oxidase를 코딩하는 유전자(AOX4)가 결실되어 있는 유지성 미생물 변이체를 팜슬러지오일 함유 배지에서 배양하여 아디프산(Adipic Acid)을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 아디프산을 회수하는 단계를 포함하는 제조방법에 관한 것이다.
또한 유지성 미생물 변이체는 추가적으로 Acyl-CoA oxidase 5(AOX5) 유전자가 과발현되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 유지성 효모인 Candida tropicalis (KCTC 7212)에서 beta-oxidation 대사경로를 재설계하기 위해 염색체 상에 존재하는 Acyl-CoA oxidase 4 (AOX4), Acyl-CoA oxidase 5 (AOX5) 유전자를 항생제 Hygromycin 내성 유전자를 내부로 삽입하여, 각각의 Acyl-CoA oxidase 4 (AOX4), Acyl-CoA oxidase 5 (AOX5) 유전자가 활성억제된 아디프산 생산 변이균주 Candida tropicalis ΔAOX4, Candida tropicalis ΔAOX5를 제작하였다(도 1).
또한 Acyl-CoA oxidase 5 (AOX5) 유전자에 강력한 GAPDH promoter 에 연결하고 terminator 인 Taox를 붙여 Acyl-CoA oxidase 5 (AOX5) 유전자 과발현 카세트를 제작하였다. 제작된 DNA 카세트를 Candida tropicalis (KCTC 7212) ΔAOX4 균주의 염색체상으로 삽입된 아디프산 생산 변이균주 Candida tropicalis ΔAOX4-5를 제작하였다(도 1).
본 발명의 다른 실시예에서는 Candida tropicalis ΔAOX4, ΔAOX5 및 ΔAOX4-5 변이균주의 Acyl-CoA oxidase 활성을 분석한 결과, Candida tropicalis (KCTC 7212) 변이체들에서 모균주보다 Short-chain acyl CoA oxidase 활성이 감소한 것으로 나타난 반면, Long-chain acyl CoA oxidase 활성은 Candida tropicalis ΔAOX4 변이균주에서만 감소한 것으로 타나났다(도 2).
본 발명의 또 다른 실시예에서, 아디프산 생성에 대한 지방산 종류의 영향을 분석하기 위하여 지방산 종류에 따른 Candida tropicalis ΔAOX4 변이균주의 아디프산 생산을 비교한 결과, Methyl laurate로부터 가장 높은 아디프산 생성을 보이는 것으로 나타났다(표 1).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기의 실시예에서 최적의 아디프산 생산성을 보인 Methyl laurate을 기질로하여 Candida tropicalis ΔAOX4, ΔAOX5, ΔAOX4-5 변이균주들에 따른 아디프산 생성을 비교하였다. 표 2에 나타난 바와 같이, Candida tropicalis (KCTC 7212) ΔAOX4-5 변이균주에서 가장 높은 아디프산의 생성이 확인되었으며, ΔAOX4에 비해 ΔAOX5 변이균주 조건에서 아디프산 생산성이 27% 향상된 것이 확인되었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, Candida tropicalis 변이균주들에 의한 팜오일 산업의 부산물인 팜슬러지오일로부터 아디프산의 생성을 분석한 결과, Candida tropicalis (KCTC 7212) ΔAOX4-5 변이균주에서 가장 높은 아디프산의 생성이 확인되었으며, ΔAOX4에 비해 ΔAOX5 변이균주 조건에서 아디프산 생산성이 11% 향상된 것이 확인되었다(표 3).
종래에 acyl-CoA oxidase를 코딩하는 유전자 POX4 결실 및 POX5가 증폭된 재조합 효모 (Candida tropicalis)균주를 이용하여 아디프산 생성 균주가 개발되었으나(미국 특허 제 8,343,752호), 본 발명에서는 놀랍게도 acyl-CoA oxidase를 코딩하는 유전자 POX5가 결실된 미생물 변이체에서 아디프산의 생산성이 증가되는 것을 확인 하였다.
본 발명에 따른 변이체의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있으며, 배양 온도 및 시간, 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 상기 변이체의 배양액으로부터의 아디프산의 회수는 통상적인 분리 기술, 예를 들어 증류, 전기투석, 투과증발, 크로마토그라피, 용매추출, 반응추출 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 물질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. Acyl - CoA oxidase 유전자가 결실된 Candida tropicalis 미생물 변이체의 제작
(1) AOX4 결실 변이균주 제작
유지성효모인 Candida tropicalis (KCTC 7212)에서 beta-oxidation 대사경로를 재설계하여 아디프산 생산 변이균주를 제작하고자 하였다. 탄소수가 6개인 아디프산 생산균주 제작을 위해 Short-chain acyl CoA oxidase 활성 억제가 필수적이므로 이를 위해 Acyl-CoA oxidase 4 (AOX4) 유전자 결실 유도를 위해 염색체 상에 존재하는 Acyl-CoA oxidase 4 (AOX4) 유전자를 항생제 Hygromycin 내성 유전자를 내부로 삽입하여 Acyl-CoA oxidase 4 (AOX4) 유전자 활성억제를 유도하였다 (도 1). 먼저 Candida tropicalis (KCTC 7212) 염색체상에 존재하는 Acyl-CoA oxidase 4 (AOX4) 유전자 클로닝을 위해 프라이머 AOX4-L1과 AOX4-L4를 사용하여 PCR하여 pGEM-T 벡터에 T-cloning하여 시퀀스를 실시하여 Acyl-CoA oxidase 4 (AOX4) 유전자를 확보하였다. 확보한 Acyl-CoA oxidase 4 (AOX4) 유전자의 중앙부를 제한효소 ClaI 처리하여 AOX4 유전자 ORF의 약 400bp 를 제거한 후, Acyl-CoA oxidase 4 (AOX4) 유전자의 상류와 하류부위 사이에 Hygromycin 내성유전자를 삽입하였다. 제작된 DNA 카세트를 Candida tropicalis (KCTC 7212) ΔAOX4 균주의 염색체상으로 삽입된 아디프산 생산 변이균주 Candida tropicalis ΔAOX4를 제작하였다.
AOX4 변이균주의 제작에 사용된 프라이머
서열번호 1 AOX4-L1: tcacaaggtccagacccaagaaactcc
서열번호 2 AOX4-L4: atctttctctttcatccaaggat
(2) AOX5 결실 변이균주 제작
Acyl-CoA oxidase 5 (AOX5) 유전자 결실 유도를 위해 염색체 상에 존재하는 Acyl-CoA oxidase 5 (AOX5) 유전자를 항생제 Hygromycin 내성 유전자를 내부로 삽입하여 Acyl-CoA oxidase 5 (AOX5) 유전자 활성억제를 유도하였다. 먼저 Candida tropicalis (KCTC 7212) 염색체상에 존재하는 Acyl-CoA oxidase 5 (AOX5) 유전자 클로닝을 위해 프라이머 AOX5-F과 AOX5-R를 사용하여 PCR하여 pGEM-T 벡터에 T-cloning하여 시퀀스를 실시하여 Acyl-CoA oxidase 5 (AOX5) 유전자를 확보하였다. 확보한 Acyl-CoA oxidase 5 (AOX5) 유전자의 중앙부를 제한효소 MunI/ Klenow+dNTP 처리하여 AOX5 유전자 ORF sequence가 깨진 blut ended AOX5 유전자내로 즉, Acyl-CoA oxidase 5 (AOX5) 유전자의 상류와 하류부위 사이에 Hygromycin 내성유전자를 삽입하였다(도 1). 제작된 DNA 카세트를 Candida tropicalis (KCTC 7212) ΔAOX5 균주의 염색체상으로 삽입된 아디프산 생산 변이균주 Candida tropicalis ΔAOX5를 제작하였다.
AOX5 변이균주의 제작에 사용된 프라이머
서열번호 3 AOX5-F: atgcctaccgaacttcaaaaaga
서열번호 4 AOX5-R: ttaactggacaagatttcagcag
(3) AOX4 -5 변이균주 제작
Acyl-CoA oxidase 5 (AOX5) 유전자 과발현 유도를 위해 염색체 상에 존재하는 Acyl-CoA oxidase 5 (AOX5) 유전자에 강력한 GAPDH promoter 에 연결하고 terminator 인 Taox를 붙여 Acyl-CoA oxidase 5 (AOX5) 유전자 과발현 카세트를 제작하였다. 제작된 acyl-CoA oxidase 5 (AOX5) 유전자 과발현 카세트에 선별마커를 위한 항생제 Hygromycin 내성 유전자를 연결한 뒤, Short-chain acyl CoA oxidase 활성 억제를 위해 두 개의 발현카세트를 Acyl-CoA oxidase 4 (AOX4) 유전자내 즉, Acyl-CoA oxidase 4 (AOX4) 유전자의 상류와 하류부위 사이에 acyl-CoA oxidase 5 (AOX5) 유전자 과발현 카세트 및 Hygromycin 내성 유전자가 연결된 두 개의 발현카세트를 삽입하였다(도 1). 제작된 DNA 카세트를 Candida tropicalis (KCTC 7212) ΔAOX4 균주의 염색체상으로 삽입된 아디프산 생산 변이균주 Candida tropicalis ΔAOX4-5를 제작하였다.
실시예 2. Candida tropicalis ( KCTC 7212) 미생물 변이체의 Acyl - CoA oxidase 활성 분석
Candida tropicalis ΔAOX4, ΔAOX5 및 ΔAOX4-5 변이균주의 Acyl-CoA oxidase 활성 분석을 실시하였다. 배양은 배양과 생산배양으로 구분하며 실시하였다. 다음의 배지에서 (6.7 g/l yeast nitrogen base, 3.0 g/l yeast extract, 3.0 g/l ammonium sulfate, 1.0 g/l potassium phosphate monobasic, 1.0 g/l potassium phosphate dibasic, 75 g/l glucose) 50 ml을 포함하는 250 ml 플라스크에 균체를 5 g/L로 접종하여 배양온도 30°C, 교반속도 200 rpm으로 배양하여, 배양액 1 ㎖을 취하여 13,000rpm에서 1분 동안 원심분리하여 균체를 회수하였다. 20 mM Tric-Cl (pH 7.5) 250 ㎕를 첨가하였고, 여기에 acid-washed 0.45 mm 글라스 비드 (glass bead)를 첨가하여 상기 균체를 5분씩 두 번 총 10분 동안 재현탁 시켰다. 이렇게 얻은 균체 파쇄액의 Acyl-CoA oxidase 활성을 Shimizu, S. et al., (Anal. Biochem., 107, 193-198, 1980), Kawaguchi, A., (J. Biochem., 88, 1481-1486, 1980), Hosaka, K. et al., (J. Biochem., 89, 1977-1803, 1981)에 따라 실시하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이,Candida tropicalis (KCTC 7212) 변이체들에서 모균주보다 Short-chain acyl CoA oxidase 활성이 감소한 것으로 나타났다. 반면, Long-chain acyl CoA oxidase 활성은 Candida tropicalis ΔAOX4 변이균주에서만 감소한 것으로 타나났다.
실시예 3. 아디프산 생성에 대한 지방산 종류의 영향
아디프산 생성에 대한 지방산 종류의 영향을 분석하기 위하여 지방산 종류별에 따른 Candida tropicalis ΔAOX4 변이균주의 아디프산 생산을 비교하였다.
Candida tropicalis ΔAOX4 변이균주를 다음의 배지 (6.7 g/l yeast nitrogen base, 3.0 g/l yeast extract, 3.0 g/l ammonium sulfate, 1.0 g/l potassium phosphate monobasic, 1.0 g/l potassium phosphate dibasic, 75 g/l glucose) 50 ml을 포함하는 250 ml 플라스크에서 배양온도 30°C, 교반속도 200 rpm으로 배양한 후 지방산을 함유하는 배지 (6.7 g/l yeast nitrogen base, 3.0 g/l yeast extract, 3.0 g/l ammonium sulfate, 1.0 g/l potassium phosphate monobasic, 1.0 g/l potassium phosphate dibasic, 1 g/l glucose, 2% fatty acid (Methyl laurate, Methyl mystrate, Methyl oleate))로 옮겨 아디프산의 생성을 분석하였다.
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, Candida tropicalis (KCTC 7212) 변이균주는 Methyl laurate로부터 가장 높은 아디프산 생성을 보이는 것으로 나타났다.
지방산 종류에 따른 Candida tropicalis (KCTC 7212) 변이균주에 의한 아디프산 생성
기질 AOX4 변이체
(mg/l)
Methyl laurate (C12) 218.4
Methyl mystrate (C14) 170.5
Methyl oleate (C18) 25.0
실시예 4. Candida tropicalis ( KCTC 7212) 미생물 변이균주들의 아디프산 생성 비교
Candida tropicalis ΔAOX4, ΔAOX5, ΔAOX4-5 변이균주들에 따른 아디프산 생성을 비교하였다.
Candida tropicalis 변이균주들을 다음의 배지 (6.7 g/l yeast nitrogen base, 3.0 g/l yeast extract, 3.0 g/l ammonium sulfate, 1.0 g/l potassium phosphate monobasic, 1.0 g/l potassium phosphate dibasic, 75 g/l glucose) 50 ml을 포함하는 250 ml 플라스크에서 배양온도 30°C, 교반속도 200 rpm으로 배양한 후 지방산을 함유하는 배지 (6.7 g/l yeast nitrogen base, 3.0 g/l yeast extract, 3.0 g/l ammonium sulfate, 1.0 g/l potassium phosphate monobasic, 1.0 g/l potassium phosphate dibasic, 1 g/l glucose, 2% Methyl laurate)로 옮겨 아디프산의 생성을 분석하였다.
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, Candida tropicalis (KCTC 7212) ΔAOX4-5 변이균주의 경우, Candida tropicalis (KCTC 7212) ΔAOX4, Candida tropicalis (KCTC 7212) ΔAOX5 변이균주에 비해 각각 약 1.45배, 1.14배 높은 아디프산 생산성을 확인 할 수 있었다.
Candida tropicalis (KCTC 7212) 변이균주들의 아디프산의 생성 비교
Candida tropicalis (KCTC 7212) 변이균주 아디프산
(mg/l)
ΔAOX4 234.0
ΔAOX5 298.9
ΔAOX4-5 339.8
실시예 5. Candida tropicalis ( KCTC 7212) 미생물 변이균주에 의한 팜슬러지오일로부터 아디프산의 생성
Candida tropicalis 변이균주에 의한 팜오일 산업의 부산물인 팜슬러지오일로부터 아디프산의 생성을 분석하였다.
Candida tropicalis 변이균주를 다음의 배지 (6.7 g/l yeast nitrogen base, 3.0 g/l yeast extract, 3.0 g/l ammonium sulfate, 1.0 g/l potassium phosphate monobasic, 1.0 g/l potassium phosphate dibasic, 75 g/l glucose) 50 ml을 포함하는 250 ml 플라스크에서 배양온도 30°C, 교반속도 200 rpm으로 배양한 후 지방산을 함유하는 배지 (6.7 g/l yeast nitrogen base, 3.0 g/l yeast extract, 3.0 g/l ammonium sulfate, 1.0 g/l potassium phosphate monobasic, 1.0 g/l potassium phosphate dibasic, 1 g/l glucose, 2% 팜슬러지오일)로 옮겨 아디프산의 생성을 분석하였다.
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, Candida tropicalis (KCTC 7212) 변이균주들에 의해 팜슬러지 오일로부터 아디프산의 생성이 확인되었다.
Candida tropicalis (KCTC 7212) 변이균주에 의한 팜슬러지 오일로 부터 아디프산의 생성
Candida tropicalis (KCTC 7212) 변이균주 아디프산
(mg/l)
ΔAOX4 220.5
ΔAOX5 245.1
ΔAOX4-5 289.2
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Methods for Preparing Adipic Acid from Palm-sludge Oil Using Variant of Microorganisam <130> P14-B088 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tcacaaggtc cagacccaag aaactcc 27 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 atctttctct ttcatccaag gat 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atgcctaccg aacttcaaaa aga 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttaactggac aagatttcag cag 23

Claims (6)

  1. 다음 단계를 포함하는 아디프산(Adipic Acid)의 제조방법:
    (a) 지방산을 아세틸-CoA로 전환시키는 효소인 Acyl-CoA oxidase를 코딩하는 유전자(AOX5)가 결실되어 있는 유지성 미생물 변이체를 팜슬러지오일 함유 배지에서 배양하여 아디프산(Adipic Acid)을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 아디프산(Adipic Acid)를 수득하는 단계.
  2. 다음 단계를 포함하는 아디프산(Adipic Acid)의 제조방법:
    (a) 지방산을 아세틸-CoA로 전환시키는 효소인 Acyl-CoA oxidase를 코딩하는 유전자(AOX4)가 결실되어 있는 유지성 미생물 변이체를 팜슬러지오일 함유 배지에서 배양하여 아디프산(Adipic Acid)을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 아디프산(Adipic Acid)를 수득하는 단계.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유지성 미생물은 야로위아 (Yarrowia), 칸디다 (Candida), 로도토룰라 (Rhodotorula) 속으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 미생물 변이체는 추가적으로 Acyl-CoA oxidase 5(AOX5) 유전자가 과발현되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, Acyl-CoA oxidase 5(AOX5) 유전자는 Candida tropicalis MYA3404 균주 유래인 AOX5인 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 유지성 미생물은 Candida tropicalis 인 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020140043490A 2014-04-11 2014-04-11 미생물 변이체를 이용하여 팜슬러지 오일로부터 아디프산을 제조하는 방법 KR20150117853A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106520713A (zh) * 2016-11-07 2017-03-22 北京利德曼生化股份有限公司 一株热稳定性好的产乙酰辅酶a氧化酶基因工程菌株及其构建方法和应用

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