CN110373440A

CN110373440A - 一锅酶法制备dl-丝氨酸的方法

Info

Publication number: CN110373440A
Application number: CN201910664186.3A
Authority: CN
Inventors: 钱敏帆; 杨卫华; 张飞龙; 葛文强; 金力; 华超; 肖延铭
Original assignee: CHANGXING PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: CHANGXING PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2019-07-23
Filing date: 2019-07-23
Publication date: 2019-10-25
Anticipated expiration: 2039-07-23
Also published as: CN110373440B

Abstract

本发明公开了一锅酶法制备DL‑丝氨酸的方法。该方法包括以下步骤：(1)以甲醛、甘氨酸为底物，在辅酶存在下，重组D‑苏氨酸醛缩酶将一分子甲醛和一分子甘氨酸催化转化为D‑丝氨酸；(2)所述D‑丝氨酸在重组丙氨酸消旋酶作用下转化为DL‑丝氨酸。本发明具有操作简单、生产周期短、生产成本低、收率高、三废排放小，适合大规模的工业化生产等优点。

Description

一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种DL-丝氨酸的生物制备方法，尤其涉及一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，属于生物技术领域。

背景技术

丝氨酸(Serine)是天然存在的20种氨基酸之一，一般是指L-丝氨酸。DL-丝氨酸(DL-Serine)包含两个等量的光学异构体，是L-丝氨酸和D-丝氨酸1:1的混合物。DL-丝氨酸是脱羧酶抑制药盐酸苄丝肼的关键中间体，同时也是合成很多有机化合物的原料，其结构式如下所示：

一般氨基酸的生产工艺无外乎四种：蛋白质水解提取法、化学合成法、生物发酵和生物酶催化法。丝氨酸虽然在某些蛋白质如丝胶蛋白中含量丰富，但以蚕茧衣水解制取丝氨酸，不但原料成本高昂，而且后续分离纯化也困难，导致总成本较高。现有DL-丝氨酸的生产工艺基本是以化学合成为主。化学合成法制备DL-丝氨酸，涉及反应步骤多，工艺复杂，反应总收率偏低；原料或中间产物具有毒性，不易分离，导致产品分离纯化困难，且对环境不友好；化学合成法制备DL-丝氨酸总成本目前还是偏高。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法。

为了实现上述的目的，本发明采取以下技术方案：

一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，该方法包括以下步骤：

(1)以甲醛、甘氨酸为底物，在辅酶存在下，重组D-苏氨酸醛缩酶将一分子甲醛和一分子甘氨酸催化转化为D-丝氨酸；

(2)所述D-丝氨酸在重组丙氨酸消旋酶作用下转化为DL-丝氨酸。

本发明的催化工艺路线如下所示：

进一步地，在上述方法中，所述的重组D-苏氨酸醛缩酶由节杆菌来源的D-苏氨酸醛缩酶、黄单胞菌来源的D-苏氨酸醛缩酶或无色杆菌来源的D-苏氨酸醛缩酶重组获得。

进一步地，在上述方法中，所述的重组丙氨酸消旋酶由假单胞菌MYb115来源的丙氨酸消旋酶、枯草芽孢杆菌来源的丙氨酸消旋酶或酵母来源的丙氨酸消旋酶重组获得。

进一步地，在上述方法中，所述步骤(1)辅酶为磷酸吡哆醛(PLP)。

进一步地，在上述方法中，所述步骤(1)催化转化的pH为6.0～9.0；优选的，pH为7.0～8.0。

进一步地，在上述方法中，所述步骤(1)催化转化温度为30℃～40℃，反应时间为10～60min，优选为30min。

进一步地，在上述方法中，所述步骤(1)中甲醛为37％的甲醛溶液，所述甘氨酸与甲醛溶液的质量比为3:0.2～0.3。

进一步地，在上述方法中，所述步骤(1)进一步添加0.01mol/L～0.03mol/L的镁盐；所述镁盐选自氯化镁、硫酸镁、硝酸镁中的任意一种或多种组合。

本发明中添加镁盐作为辅助因子，对该酶催化具体良好的促进作用。有助于酶更完全的把底物转化为产物，大大提高酶催化的速率，同时对酶的稳定性有一定的作用。

进一步地，在上述方法中，所述步骤(2)反应温度为30℃～40℃，当转化甘氨酸浓度低于2g/L，将转化温度提高至45～50℃，继续反应3～5小时。

本发明当转化甘氨酸浓度低于2g/L，将转化温度提高至45～50℃，更有利于丙氨酸消旋酶把D-丝氨酸完全消旋为DL-丝氨酸，有利于产品的比旋度在“0”。

进一步地，在上述方法中，步骤(2)之后还包括后处理步骤，所述后处理步骤包括对步骤(2)得到的DL-丝氨酸转化液经微滤膜、纳滤膜以及精密过滤器过滤浓缩，离心，洗涤，获得DL-丝氨酸晶体。

本发明DL-丝氨酸转化液经微滤膜主要是为了去除菌体；纳滤膜可以脱色和除杂，获得的清液经精密过滤器进入降膜浓缩，经过低温连续浓缩，当大量晶体出现时，浓缩液直接离心得到晶体，并用少量70％乙醇淋洗，待离心至无母液流出时，即可收集晶体，经检测符合成品标准。

进一步地，在上述方法中，所述浓缩时温度控制在45～50℃。

本发明在上述温度范围内能够得到小颗粒状晶体，经检测该小颗粒状晶体透光率达到99.5％以上，纯度达到99.95％以上。若温度偏高或者偏低，则得到片状或粉状晶体，透光率和纯度将远远降低。

进一步地，在上述方法中，所述步骤(1)得到D-丝氨酸可进一步经过后处理制备D-丝氨酸产品，同时得到D-丝氨酸残留母液，所述母液能够进一步经重组丙氨酸消旋酶消旋用于制备DL-丝氨酸。

本发明D-丝氨酸残留母液经过重组丙氨酸消旋酶消旋，经过微滤膜去除菌体，以及纳滤膜脱色和除杂，清液经过精密过滤器进入降膜浓缩，经过低温连续浓缩，当大量晶体出现时，浓缩液直接离心得到晶体，并用少量70％乙醇淋洗，待离心至无母液流出时，即可收集晶体，经检测符合成品标准。经检测该小颗粒状晶体透光率达到99.0％以上，纯度达到99.5％以上。本发明实现了D-丝氨酸母液的资源再利用，有效降低了D-丝氨酸生产过程中的“三废”排放。

进一步地，在上述方法中，所述重组D-苏氨酸醛缩酶和重组丙氨酸消旋酶由如下方法制备：

1)分别将来源于节杆菌的D-苏氨酸醛缩酶基因(DTA，GenBank:AB010956.1)、来源于假单胞菌MYb115的丙氨酸消旋酶基因(ALR，GenBank:PRA60187.1)构建到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a-DTA和pET28a-ALR；

2)分别将上述重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组表达菌株BL21(DE3)/pET28a-DTA和BL21(DE3)/pET28a-ALR；

3)将上述重组表达菌株单菌落接种到含有卡那霉素抗性的液体LB培养基中，37℃过夜培养；将活化后得到的培养物接种到含有卡那霉素的液体TB培养基中，37℃振荡培养至OD600为3.5，加入终浓度为0.1mM的IPTG，于25℃下诱导培养8-10h；离心，收集菌体，超声破壁后即分别获得重组D-苏氨酸醛缩酶和重组丙氨酸消旋酶的粗酶液。

进一步地，在上述方法中，具体步骤如下：

向反应体系中加入150g/L的甘氨酸和10～15g/L的37％甲醛溶液，用4M氢氧化钠溶液控制pH在7.0～8.0；再依次投加六水合氯化镁3g/L、5-磷酸吡哆醛0.1g/L，再次用4M氢氧化钠溶液将pH控制在7.0～8.0，温度控制在30℃～40℃，加入2％～4％重组D-苏氨酸醛缩酶，开始反应，反应过程中，pH会上升，流加37％甲醛溶液以维持反应pH在7.0～8.0之间；反应30min后，投加0.5％～1％重组丙氨酸消旋酶；经液相检测DL-丝氨酸消旋平衡，且甘氨酸残留低于2g/L时，将转化温度提高至45～50℃继续反应3～5小时；反应结束后，获得DL-丝氨酸转化液。

本发明一锅酶法制备DL-丝氨酸转化率≥98％，转化液中DL-丝氨酸含量可达100～140g/L。

本发明具有以下技术特点：

本发明的一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法催化路线设计新颖，具有操作简单、生产周期短、生产成本低、收率高、三废排放小，适合大规模的工业化生产等优点。

附图说明

图1本发明催化生产的DL-丝氨酸的液相图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

除非另作定义，本公开所使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内有一般技能的人士所理解的通常意义。

本发明具体实施方式中使用的重组D-苏氨酸醛缩酶和重组丙氨酸消旋酶由如下方法制备：

1)根据节杆菌来源的D-苏氨酸醛缩酶基因(SEQ NO.1)、假单胞菌MYb115来源的丙氨酸消旋酶基因(SEQ NO.2)由上海捷瑞生物工程有限公司进行基因的全合成，并连接到pET28a载体上，获得重组载体pET28a-DTA和pET28a-ALR；

3)分别将上述重组表达菌株单菌落接种到含有卡那霉素抗性的液体LB培养基中，37℃过夜培养。将活化后得到的培养物接种到含有卡那霉素的液体TB培养基中，37℃振荡培养至OD600为3.5，加入终浓度为0.1mM的IPTG，于25℃下诱导培养8-10h。离心，收集菌体，超声破壁(3％-10％的湿菌体破壁)后即分别获得D-苏氨酸醛缩酶和丙氨酸消旋酶的粗酶液。

本发明具体实施方式中通过高效液相色谱(HPLC)检测过程中底物甘氨酸和产物DL-丝氨酸的浓度变化以及产品的质量控制。

HPLC分析方法为：色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6*250mm,5μm)；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：334nm；流动相2.871g/L醋酸钠溶液:甲醇＝7:3。本发明催化生产的DL-丝氨酸的液相图如图1所示。

实施例1

2.5吨体系的转化

向反应釜内依次加入1300L水，375kg甘氨酸，3kg甲醛溶液(37％)，用4M氢氧化钠溶液控制pH在7.0～8.0；再依次投加六水合氯化镁7.5kg、5-磷酸吡哆醛0.25kg，再次用4M氢氧化钠溶液将pH控制在7.0～8.0，温度控制在30℃～40℃。加入75kg重组D-苏氨酸醛缩酶，开始反应。反应过程中流加37％甲醛溶液以维持反应pH在7.0～8.0之间。反应30min后，投加12.5kg重组丙氨酸消旋酶。经液相检测DL-丝氨酸消旋平衡，且甘氨酸残留低于2g/L时，将转化温度提高至45～50℃继续反应3-5小时，终止反应，转化率约为98％。

实施例2

7.5吨体系的转化

向反应釜内依次加入水3900L，1125kg甘氨酸，9kg甲醛溶液(37％)，用4M氢氧化钠溶液控制pH在7.0～8.0；再依次投加六水合氯化镁22.5kg、5-磷酸吡哆醛0.75kg，再次用4M氢氧化钠溶液将pH控制在7.0～8.0，温度控制在30℃～40℃。加入210kg重组D-苏氨酸醛缩酶，开始反应。反应过程中流加37％甲醛溶液以维持反应pH在7.0～8.0之间。反应30min后，投加37.5kg重组丙氨酸消旋酶。经液相检测DL-丝氨酸消旋平衡，且甘氨酸残留低于2g/L时，将转化温度提高至45～50℃继续反应3-5小时，终止反应，转化率约为98.5％。

实施例3

15吨体系的转化

向反应釜内依次加入水7800L，2250kg甘氨酸，18kg甲醛溶液(37％)，用4M氢氧化钠溶液控制pH在7.0～8.0；再依次投加六水合氯化镁45kg、5-磷酸吡哆醛1.5kg，再次用4M氢氧化钠溶液将pH控制在7.0～8.0，温度控制在30℃～40℃。加入380kg重组D-苏氨酸醛缩酶，开始反应。反应过程中流加37％甲醛溶液以维持反应pH在7.0～8.0之间。反应30min后，投加75kg重组丙氨酸消旋酶。经液相检测DL-丝氨酸消旋平衡，且甘氨酸残留低于2g/L时，将转化温度提高至45～50℃继续反应3-5小时，终止反应，转化率约为98.5％。

实施例4

15吨体系转化液浓缩处理

将实施例3得到的DL-丝氨酸转化液经过微滤膜去除菌体，以及纳滤膜脱色和除杂，清液经过精密过滤器平分成A、B、C三组，分批进行降膜浓缩。A组温度控制在35～45℃之间，B组温度控制在45～55℃之间，C组温度控制在55～65℃之间。经过连续浓缩，当大量晶体出现时，A、C组浓缩液转移至浓缩结晶罐内继续浓缩，当浓缩液较浓稠时，停止浓缩，降温至15～25℃冷却结晶后经离心机离心得到晶体。B组浓缩液直接离心得到晶体。并都用少量70％乙醇淋洗，待离心至无母液流出时，即可收集晶体，B组离心得到母液经过精密过滤器过滤，返回至降膜浓缩器内继续浓缩结晶，母液循环浓缩至最后较少体积时，可停止浓缩。经检测A组得到粉状晶体，经检测该小颗粒状晶体透光率达到94.5％，纯度达到99.45％；B组得到小颗粒状晶体，经检测该小颗粒状晶体透光率达到99.5％以上，纯度达到99.95％；C组得到片状晶体，经检测该小颗粒状晶体透光率达到96.5％以上，纯度达到99.00％。

由于不不同温度下结晶，以及在不同设备以及浓缩方法得到的产品性状及品质差别很大，本专利采用降膜浓缩连续浓缩结晶的方式以及对温度的严格控制，不仅提高了效率，提高的产品的品质，而且降低了产品的生产成本。

实施例5

向反应釜内依次加入水7800L，2250kg甘氨酸，18kg甲醛溶液(37％)，用4M氢氧化钠溶液控制pH在7.0～8.0；再依次投加六水合氯化镁45kg、5-磷酸吡哆醛1.5kg，再次用4M氢氧化钠溶液将pH控制在7.0～8.0，温度控制在30℃～40℃，加入重组D-苏氨酸醛缩酶开始反应。反应过程中流加37％甲醛溶液以维持反应pH在7.0～8.0之间。经液相检测甘氨酸残留低于2g/L时，终止反应。转化液经过微滤膜去除菌体，以及纳滤膜脱色和除杂，清液经过精密过滤器进入降膜浓缩，经过连续浓缩，当大量晶体出现时，浓缩液降温至15～25℃冷却结晶后经离心得到晶体，并用少量70％乙醇淋洗，待离心至无母液流出时，收集晶体，并得到D-丝氨酸氨酸母液。向该母液中投加37.5kg丙氨酸消旋酶进行转化，温度控制在30℃～40℃。经液相检测DL-丝氨酸消旋平衡，终止反应。该转化液再经过微滤膜去除菌体，以及纳滤膜脱色和除杂，清液经过精密过滤器进入降膜浓缩，经过低温连续浓缩(温度严格控制在45～50℃之间)，当大量晶体出现时，浓缩液直接离心得到晶体，并用少量70％乙醇淋洗，待离心至无母液流出时，即可收集晶体。得到的小颗粒状晶体，经检测该小颗粒状晶体透光率达到99.0％以上，纯度达到99.7％。

该方法能够有效利用无法进行回收D-丝氨酸氨酸的母液，经过酶催化以及有效的提取方法，得到高品质的DL-丝氨酸氨酸，变废为宝。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。

序列表

<110> 长兴制药股份有限公司

<120> 一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1140

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 1

atgtcccagg aagtcatacg cggcatagcg ctgcccccgc cggcacagcc cggcgatccg 60

ctggcccgtg tcgacacgcc cagcctggtg ctggacctgg cgcccttcga agccaatctg 120

cgcgcgatgc aggcctgggc cgaccgccac gatgtcgcgc tgcgcccgca cgccaaggcg 180

cataaatgcc ctgaaatcgc cttgcggcag ctggcgctgg gcgcgcgcgg catctgctgc 240

cagaaggtca gcgaggccct gcccttcgtg gccgccggca tccaggacat ccacatcagc 300

aacgaagtcg tcggtccggc caagctggcg ctgctgggtc agctggcgcg cgtggcaaag 360

atcagcgtct gcgtggacaa cgcgcacaac ctgtcgcagg tctcgcaggc catggtgcag 420

gcgggtgcgc agattgacgt gctggtggaa gtggatgtcg gccagggccg ctgcggggtg 480

tcggacgacg ccctcgtgct ggcgctggcg cagcaggcgc gcgacctgcc cggcgtgaat 540

tttgccggcc tgcaggccta tcacgggtcg gtgcagcatt accgcacccg cgaggagcgc 600

gccgaggtct gccgccaggc ggcgcgcatc gcggcgtcct acgcgcaatt gctgcgcgaa 660

agcggcatcg cctgcgacac catcaccggc ggcggcacgg gcagcgccga gttcgatgcg 720

gccagcggcg tctataccga attgcaggct ggttcctacg ccttcatgga cggcgactat 780

ggcgccaacg agtgggacgg ccccctggcg ttcgaaaaca gcctcttcgt gctggccacg 840

gtcatgagca aaccggcgcc cgaccgggtg atcctggacg cgggcctcaa gtccaccacg 900

gccgaatgcg gcccgcccgc catcttcggc gaaccgggtc tgacgtacac cgccatcaat 960

gatgagcacg gcgtcgtgcg cgtggaaccc ggggcgcagg cgcccgacct gggcgcggtg 1020

ctgcgcttgg tgccgtcgca cgtggacccc acgttcaacc tgcatgatgg gctggtggtg 1080

gtgcgcgacg gggtggtgga agatatctgg gaaatctcgg cgcggggttt ctcgcgctga 1140

<210> 2

<211> 1230

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 2

atgcccttca ctcgcaccct tctcgcactc tctctgggca tggctctgct gcaaaatcca 60

gccttcgccg ccccgccgct atcgatgacc gacggcgtgg cgcaggtcag tacacaggac 120

agcaacgcct gggtggaaat caacaaacag gcttttgaaa acaacattcg cgccctgcag 180

gtcacgctgg ccggcaagtc taaaatctgc gcggtgctca aggccgacgc ctacggccac 240

ggcattggcc tgttgatgcc ctcggtgatc gccatgggcg tgccctgcgt cggtgtggcc 300

agcaacgaag agatccgcgt agtccgtgaa agcggcttca agggtcaatt gatccgcgta 360

cgtaccgccg ccctcagtga gctggaagcg gcattgccgt acaacgtcga agaactggtg 420

ggcaacctcg acttcgccgt caaggccagc ctgatcgccg aaaaccacgg ccggccactg 480

gtggtgcaca ttggcctgaa ctccagcggc atgagccgca acggcgtgga aatgaccacc 540

gccgagggtc gtcgtgacgc ggtcgccatg accaaagtgc cgaacctcga agtgcgggcg 600

atcatgaccc acttcgcggt cgaggatgcc gccgatgtgc gcgccggcct caaggcattc 660

aaccagcagg ccgactggct gatcaaggtc gcacaactgg accgcagcaa aatcaccctg 720

cacgcggcca actccttcgc caccctggaa gtgcccgagt cgcacctgga catggtccgt 780

cccggcggcg cactgttcgg tgacaccgtg ccgtcccata ccgaatacac ccgggtcatg 840

cagttcaaat cccacgtcgc gtcagtcaac agctacccca agggcaacac cgtcggctac 900

gaccgcacct tcaccctggc gcgtgactcg aaactggcca acatcaccgt cggctactcc 960

gacggctacc gccgcgcctt caccaacaaa ggcatcgtgc tgatcaacgg ccaccgcgtg 1020

ccggtggtgg gcaaggtctc gatgaacacc ctgatggtcg acgttaccga cgtaccgagt 1080

gtgaaaggcg gcgatgaggt ggtgctgttc ggcaagcagg gcaacgccga gattgcccag 1140

gcagaagtcg aagacattaa cggcgcgctg ctggccgacc tgtatacggt gtggggcaat 1200

tccaacccga aactgctggt cgacaaataa 1230

Claims

1.一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，其特征在于，所述的重组D-苏氨酸醛缩酶由节杆菌来源的D-苏氨酸醛缩酶、黄单胞菌来源的D-苏氨酸醛缩酶或无色杆菌来源的D-苏氨酸醛缩酶重组获得。

3.根据权利要求1所述的一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，其特征在于，所述的重组丙氨酸消旋酶由假单胞菌MYb115来源的丙氨酸消旋酶、枯草芽孢杆菌来源的丙氨酸消旋酶或酵母来源的丙氨酸消旋酶重组获得。

4.根据权利要求1所述的一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)辅酶为磷酸吡哆醛(PLP)。

5.根据权利要求1所述的一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)催化转化的pH为6.0～9.0。

6.根据权利要求1所述的一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)催化转化温度为30℃～40℃，反应时间为10～60min。

7.根据权利要求1所述的一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)进一步添加0.01mol/L～0.03mol/L的镁盐；所述镁盐选自氯化镁、硫酸镁、硝酸镁中的任意一种或多种组合。

8.根据权利要求1所述的一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)反应温度为30℃～40℃，当转化甘氨酸浓度低于2g/L，将转化温度提高至45～50℃，继续反应3～5小时。

9.根据权利要求1所述的一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)之后还包括后处理步骤，所述后处理步骤包括对步骤(2)得到的DL-丝氨酸转化液经微滤膜、纳滤膜以及精密过滤器过滤浓缩，离心，洗涤，获得DL-丝氨酸晶体。

10.根据权利要求9所述的一锅酶法制备DL-丝氨酸的方法，其特征在于，所述浓缩时温度控制在45～50℃。