CN107586797A - 一锅酶法制备左旋多巴的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一锅酶法制备左旋多巴的方法，其特征在于，以甲醛、甘氨酸和邻苯二酚为底物；甲醛和甘氨酸在醛缩酶和其辅酶存在下发生催化反应转化为丝氨酸，然后丝氨酸在脱水酶作用下转化为丙酮酸和氨，最后在酪氨酸酚裂解酶作用下，丙酮酸与邻苯二酚生成左旋多巴。本发明催化路线设计新颖，具有操作简单、生产周期短、生产成本低、收率高、环保压力小、适合大规模的工业化生产等优点。

Description

一锅酶法制备左旋多巴的方法

技术领域

本发明涉及一种左旋多巴的生物制备方法，尤其涉及一锅酶法制备左旋多巴的方法，属于生物工程领域。

背景技术

左旋多巴(3,4-dihydroxylphenylalanine，Levodopa)，又称L-多巴，化学名称为3,4-二羟基苯基丙氨酸，CAS：59-92-7，为白色结晶性粉末，无臭无味；是生物体内一种重要的生物活性物质，是L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。其结构式如下：

左旋多巴是治疗帕金森病的一线药物，虽然在长时间的使用以后会有一些副作用，但四十余年过去了，目前仍然没有新的替代药物出现。目前市面上的药物大部分都是化学合成的，合成的过程需要大量的金属催化物，合成步骤较多，过程较复杂，难度大，产物的转化效率和旋光活性均较低，同时存在生产成本高、环境污染严重等问题。随着分子生物学以及生物技术的迅速发展，利用生物合成生产左旋多巴原料药已经占据了少量的市场份额。生物法制备左旋多巴成本低，环境污染小，将是很有竞争力，前景光明的方法。

国内外科学家正在不断努力提高左旋多巴的生产产量。据报道，左旋多巴原料药的生产方法有天然植物提取法、化学合成法和微生物酶转化法。

传统的制取方法是从植物猫豆中经科学提取的，中国专利CN 103641730 A和CN103664669 A公布了一种左旋多巴的制备方法，以猫豆为原料，用酸水提取左旋多巴。该植物提取法由于受到原料来源的限制，产量小，远不能满足市场需求。

左旋多巴的化学合成较多。上世纪70年代初，国外化学合成多巴的产量已达150吨，但遇到一个主要的困难是合成出来的产品是D-型和L-型的混合物，将二者分开的过程较复杂，且难度大，同时存在生产成本高、环境污染严重等问题。

利用微生物生产左旋多巴，就是利用了代谢途径中的某些酶，如酪氨酸酶、酪氨酸分解酶、转移酶将不同的底物转变成左旋多巴，可获得大量的左旋多巴，许多国家对其生产进行了大量的研究，采取了许多不同的合成方法。上世纪60年代末，国外一些学者开始致力于微生物酶法合成左旋多巴的研究。70年代初，日本学者Yamada等对微生物酶法合成左旋多巴进行了深入的研究，通过菌种选育和发酵条件的优化于1993年在味之素公司投入工业化生产。中国专利CN 103122361 A公布了通过构建重组工程菌株，提供一种以L-酪氨酸为底物合成左旋多巴的方法。中国专利CN 104726513 A公布了一种酶法制备左旋多巴的方法，以嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)生产酪氨酸酶，以L-酪氨酸为原料转化制备左旋多巴。

目前生物法生产左旋多巴的产业化中，基本以丙酮酸和邻苯二酚为起始原料，也有少量企业以L-酪氨酸和邻苯二酚为起始原料。但市售丙酮酸或者L-酪氨酸基本以化学合成为主，生产成本较高，环境污染特别严重。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一锅酶法制备左旋多巴的方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一锅酶法制备左旋多巴的方法，其特征在于，以甲醛、甘氨酸和邻苯二酚为底物；甲醛和甘氨酸在醛缩酶和辅酶存在下发生催化反应转化为丝氨酸，然后丝氨酸在脱水酶作用下转化为丙酮酸和氨，最后在酪氨酸酚裂解酶作用下，丙酮酸与邻苯二酚生成左旋多巴。

进一步地，所述的醛缩酶选自D-苏氨酸醛缩酶、L-苏氨酸醛缩酶或丝氨酸羟甲基转移酶中的一种或多种。

所述的D-苏氨酸醛缩酶选自节杆菌来源的D-苏氨酸醛缩酶、黄单胞菌来源的D-苏氨酸醛缩酶或无色杆菌来源的D-苏氨酸醛缩酶中的一种或多种。

所述的D-苏氨酸醛缩酶选自节杆菌来源的D-苏氨酸醛缩酶、黄单胞菌来源的D-苏氨酸醛缩酶或无色杆菌来源的D-苏氨酸醛缩酶中的一种或多种。

所述的丝氨酸羟甲基转移酶选自大肠杆菌来源的丝氨酸羟甲基转移酶、枯草芽孢杆菌来源的丝氨酸羟甲基转移酶或酵母来源的丝氨酸羟甲基转移酶中的一种或多种。

所述的脱水酶选自D-丝氨酸脱水酶或L-丝氨酸脱水酶中的一种或两种。

所述的D-丝氨酸脱水酶选自大肠杆菌来源的D-丝氨酸脱水酶、枯草芽孢杆菌来源的D-丝氨酸脱水酶或酵母来源的D-丝氨酸脱水酶中的一种或多种。

所述的L-丝氨酸脱水酶选自大肠杆菌来源的L-丝氨酸脱水酶、枯草芽孢杆菌来源的L-丝氨酸脱水酶或酵母来源的L-丝氨酸脱水酶中的一种或多种。

所述的丝氨酸为D-丝氨酸、L-丝氨酸或D,L-丝氨酸中的一种或多种。

所述的酪氨酸酚裂解酶选自弗氏柠檬酸细菌。

所述的辅酶是磷酸吡哆醛(PLP)。

酶催化的最适反应pH为7.0，最适反应温度为35℃。

具体地，本发明的合成线路可以如下：

路线1：以甲醛、甘氨酸和邻苯二酚为底物；在辅酶存在下，一分子甲醛和一分子甘氨酸在D-苏氨酸醛缩酶催化剂作用下转化为D-丝氨酸，然后D-丝氨酸在D-丝氨酸脱水酶催化剂作用下转化为丙酮酸和氨，最后丙酮酸在酪氨酸酚裂解酶催化剂作用下，和邻苯二酚生成左旋多巴。

路线2：以甲醛、甘氨酸和邻苯二酚为底物；在辅酶存在下，一分子甲醛和一分子甘氨酸在L-苏氨酸醛缩酶或丝氨酸羟甲基转移酶催化剂作用下，转化为L-丝氨酸，然后L-丝氨酸在L-丝氨酸脱水酶催化剂作用下转化为丙酮酸和氨，最后丙酮酸在酪氨酸酚裂解酶催化剂作用下，和邻苯二酚生成左旋多巴。

本发明的醛缩酶、脱水酶和酪氨酸酚裂解酶可采用重组酶，制备方法如下：

(1)重组D-苏氨酸醛缩酶、重组D-丝氨酸脱水酶和重组酪氨酸酚裂解酶由如下方法制备：

1)将来源于无色杆菌的D-苏氨酸醛缩酶基因(SEQ ID NO.1)构建到表达载体pET26b上，得到重组质粒pET-DTAD；将来源于大肠杆菌的D-丝氨酸脱水酶基因(SEQ IDNO.2)构建到质粒pET-DTAD上，得到重组质粒pET-DTAD-DSDH。将来源于弗氏柠檬酸细菌的酪氨酸酚裂解酶基因(SEQ ID NO.3)构建到表达载体pET-DTAD-DSDH上，得到重组质粒pET-DTAD-DSDH-TPL。

2)将重组质粒pET-DTAD-DSDH-TPL转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-DTAD-DSDH-TPL。

(2)重组L-苏氨酸醛缩酶、重组L-丝氨酸脱水酶和重组酪氨酸酚裂解酶由如下方法制备：

1)将来源于大肠杆菌杆菌的L-苏氨酸醛缩酶基因(SEQ ID NO.4)构建到表达载体pET26b上，得到重组质粒pET-LTAD；将来源于大肠杆菌的L-丝氨酸脱水酶基因(SEQ IDNO.5)构建到质粒pET-LTAD上，得到重组质粒pET-LTAD-LSDH。将来源于弗氏柠檬酸细菌的酪氨酸酚裂解酶基因(SEQ ID NO.3)构建到表达载体pET-LTAD-LSDH上，得到重组质粒pET-LTAD-LSDH-TPL。

2)将重组质粒pET-LTAD-LSDH-TPL转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-LTAD-LSDH-TPL。

(3)重组丝氨酸羟甲基转移酶、重组L-丝氨酸脱水酶和重组酪氨酸酚裂解酶由如下方法制备：

1)将来源于大肠杆菌杆菌的丝氨酸羟甲基转移酶基因(SEQ ID NO.6)构建到表达载体pET26b上，得到重组质粒pET-SHMT；将来源于大肠杆菌来源的L-丝氨酸脱水酶基因(SEQ ID NO.5)构建到质粒pET-SHMT上，得到重组质粒pET-SHMT-LSDH。将来源于弗氏柠檬酸细菌的酪氨酸酚裂解酶基因(SEQ ID NO.3)构建到表达载体pET-SHMT-LSDH上，得到重组质粒pET-SHMT-LSDH-TPL。

2)将重组质粒pET-SHMT-LSDH-TPL转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-SHMT-LSDH-TPL。

(4)上述三种重组大肠杆菌的表达方法如下：将重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-DTAD-DSDH-TPL、重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-LTAD-LSDH-TPL和重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-SHMT-LSDH-TPL分别接种到含有卡那霉素抗性的液体LB培养基中，37℃过夜培养。将活化后得到的培养物接种到含有卡那霉素的液体TB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为3.5，加入终浓度为0.1M的IPTG，于25℃下诱导培养8-10h。离心，收集菌体，超声破壁后即获得含有醛缩酶、脱水酶和酪氨酸酚裂解酶的重组粗酶液。

左旋多巴的制备方法具体为：

向水中投40～60g/L(以初始体积计算)的甘氨酸和20～30g/L的37％甲醛溶液，用浓氨水控制pH在6.0～8.0；

再依次投加抗氧化剂、螯合剂、铵盐、5-磷酸吡哆醛，再次用浓氨水将pH控制在6.0～8.0，温度控制在32℃～38℃，再投加8～12g/L的邻苯二酚和200～300g/L的重组粗酶液，开始反应；

反应过程中，pH会上升，流加37％甲醛溶液以维持反应pH在6.0～8.0之间；

反应开始后，每8～12min投加1.5～2.5g/L的底物邻苯二酚。邻苯二酚的最终投加浓度为60～88g/L(以初始体积计算)。邻苯二酚的最终投料浓度与甘氨酸投料浓度的摩尔比为1:1；

当邻苯二酚投料结束后，继续搅拌反应1～2h。反应结束后，获得左旋多巴转化液，转化率≥95％，转化液中左旋多巴含量可达100～150g/L。

转化步骤中，为促进转化，提高转化率，本发明还在反应体系中添加0.2～0.3mol/L的铵盐，包括但不限于甲酸铵、乙酸铵、氯化铵、硫酸铵中的任意一种或多种组合。投入甘氨酸和甲醛后，还投入1～3g/L的抗氧化剂，抗氧化剂包括但不限于NaHSO₃、Na₂SO₃、Na₂S₂O₅、维生素C及其钠盐的任意一种或多种的组合。投入甘氨酸和抗氧化剂后，还投入0.5～1.5g/L的螯合剂，螯合剂包括但不限于酒石酸及其钾钠盐、乙二胺四乙酸(EDTA)及其二钠盐的任意一种。抗氧化剂、螯合剂也可促进反应，提高转化率。

上述左旋多巴转化液经过提取获得的左旋多巴成品，经检测符合EP和USP标准。

本发明是一种简便有效地利用一锅酶法制备左旋多巴的方法。合成左旋多巴所用底物为甲醛、甘氨酸和邻苯二酚，且醛缩酶和酪氨酸酚裂解酶的辅酶均为磷酸吡哆醛，实现了一种辅酶两处作用；催化路线设计新颖，具有操作简单、生产周期短、生产成本低、收率高、环保压力小、适合大规模的工业化生产等优点。

附图说明

图1为本发明所构建的重组表达载体pET-DTAD-DSDH-TPL。

图2为本发明所构建的重组表达载体ET-LTAD-LSDH-TPL。

图3为本发明所构建的重组表达载体pET-SHMT-LSDH-TPL。

具体实施方式

本发明针对现有生产左旋多巴的工艺不足，提供了一种全新的生物酶法合成左旋多巴的工艺路线。

路线1：本发明特别的是在酶法生产左旋多巴过程中，直接加入D-苏氨酸醛缩酶、辅酶和D-丝氨酸脱水酶，以廉价的甲醛和甘氨酸为底物催化生产左旋多巴生产中所需要的底物丙酮酸，再在酪氨酸酚裂解酶、辅酶的催化作用下，以邻苯二酚为底物，最终生产左旋多巴。即三酶一锅法制备左旋多巴，其催化工艺如路线1所示。

路线2：本发明特别的是在酶法生产左旋多巴过程中，直接加入L-苏氨酸醛缩酶、辅酶或丝氨酸羟甲基转移酶和L-丝氨酸脱水酶，以廉价的甲醛和甘氨酸为底物催化生产左旋多巴生产中所需要的底物丙酮酸，再在酪氨酸酚裂解酶、辅酶的催化作用下，以邻苯二酚为底物，最终生产左旋多巴。即三酶一锅法制备左旋多巴，其催化工艺如路线2所示。

一锅酶法制备左旋多巴的生产方法，具体步骤如下：

(1)重组表达载体pET-DTAD-DSDH-TPL的构建

根据无色杆菌来源的D-苏氨酸醛缩酶基因(SEQ ID NO.1)、大肠杆菌来源的D-丝氨酸脱水酶基因(SEQ ID NO.2)和弗氏柠檬酸细菌来源的酪氨酸酚裂解酶基因(SEQ IDNO.3)，由上海捷瑞生物工程有限公司进行基因的全合成并连接到pET26b上，获得重组表达载体pET-DTAD-DSDH-TPL(如图1所示)。各基因起始密码子前都具有独立的启动子和核糖体结合位点区域。

(2)重组表达载体pET-LTAD-LSDH-TPL的构建

根据大肠杆菌来源的L-苏氨酸醛缩酶基因(SEQ ID NO.4)、大肠杆菌来源的L-丝氨酸脱水酶基因(SEQ ID NO.5)和弗氏柠檬酸细菌来源的酪氨酸酚裂解酶基因(SEQ IDNO.3)，由上海捷瑞生物工程有限公司进行基因的全合成并连接到pET26b上，获得重组表达载体pET-LTAD-LSDH-TPL(如图2所示)。各基因起始密码子前都具有独立的启动子和核糖体结合位点区域。

(3)重组表达载体pET-SHMT-LSDH-TPL的构建

根据大肠杆菌来源的丝氨酸羟甲基转移酶基因(SEQ ID NO.6)、大肠杆菌来源的L-丝氨酸脱水酶基因(SEQ ID NO.5)和弗氏柠檬酸细菌来源的酪氨酸酚裂解酶基因(SEQID NO.3)，由上海捷瑞生物工程有限公司进行基因的全合成并连接到pET26b上，获得重组表达载体pET-SHMT-LSDH-TPL(如图3所示)。各基因起始密码子前都具有独立的启动子和核糖体结合位点区域。

(4)重组大肠杆菌的表达

将重组质粒pET-DTAD-DSDH-TPL、pET-LTAD-LSDH-TPL和pET-SHMT-LSDH-TPL分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-DTAD-DSDH-TPL、重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-LTAD-LSDH-TPL和重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-SHMT-LSDH-TPL。

分别将上述三种重组大肠杆菌接种到含有卡那霉素抗性的液体LB培养基中，37℃过夜培养。将活化后得到的培养物接种到含有卡那霉素的液体TB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为3.5，加入终浓度为0.1M的IPTG，于25℃下诱导培养8-10h。离心，收集菌体，超声破壁后即获得含有醛缩酶、脱水酶和酪氨酸酚裂解酶的重组粗酶液。

(5)左旋多巴的生物合成采用以下方式之一：

1)在一个生物反应器中加入底物甘氨酸和邻苯二酚，辅酶PLP，加入含有重组D-苏氨酸醛缩酶、重组D-丝氨酸脱水酶和重组酪氨酸酚裂解酶的粗酶液(10～20％的湿菌体破壁获得)；通过流加的方式加入一定量的甲醛。

2)在一个生物反应器中加入底物甘氨酸和邻苯二酚，辅酶PLP，加入含有重组L-苏氨酸醛缩酶、重组L-丝氨酸脱水酶和重组酪氨酸酚裂解酶的粗酶液(10～20％的湿菌体破壁获得)；通过流加的方式加入一定量的甲醛。

3)在一个生物反应器中加入底物甘氨酸和邻苯二酚，辅酶PLP，加入含有重组丝氨酸羟甲基转移酶、重组L-丝氨酸脱水酶和重组酪氨酸酚裂解酶的粗酶液(10～20％的湿菌体破壁获得)；通过流加的方式加入一定量的甲醛。

上述步骤温度优选35℃，反应pH优选7.0，反应时间优选6-12h。

通过高效液相色谱(HPLC)检测过程中底物甘氨酸、邻苯二酚和产物左旋多巴的浓度变化以及产品的质量控制。HPLC分析方法为：色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6*250mm,5μm)；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；流动相A:0.05mol/L的磷酸二氢氨溶液，用磷酸调pH至2.7；流动相B：甲醇。

为了能够更加清楚的理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例1:2.5吨体系的转化

向生物反应器内依次加入水1600L，120kg的甘氨酸，55kg的甲醛溶液(37％)，用浓氨水控制pH在6.0～8.0；加入5-磷酸吡哆醛0.33kg，再次用浓氨水将pH控制在6.0～8.0，温度控制在32℃～38℃。加入25kg邻苯二酚和650kg含重组D-苏氨酸醛缩酶、重组D-丝氨酸脱水酶、重组酪氨酸酚解酶的酶液，开始反应。反应过程中流加37％甲醛溶液以维持反应pH在6.0～8.0之间。之后每10min投加5kg的底物邻苯二酚。邻苯二酚的总投入量为176kg。当邻苯二酚投料结束后，继续反应2h，取样检测，左旋多巴的浓度为67g/L，转化率约为53.2％。经后处理得到多巴成品127kg，收率为76％，成品经检测符合EP和USP标准。

实施例2：2.5吨体系的转化

向生物反应器内依次加入水1600L，140kg的甘氨酸，62.5kg的甲醛溶液(37％)，用浓氨水控制pH在6.0～8.0；再依次投加亚硫酸钠5kg，EDTA2.5kg、乙酸铵50kg、5-磷酸吡哆醛0.33kg，再次用浓氨水将pH控制在6.0～8.0，温度控制在32℃～38℃。加入25kg邻苯二酚和600kg含重组D-苏氨酸醛缩酶、重组D-丝氨酸脱水酶、重组酪氨酸酚解酶的酶液，开始反应。反应过程中流加37％甲醛溶液以维持反应pH在6.0～8.0之间。之后每10min投加5kg的底物邻苯二酚。邻苯二酚的总投入量为205kg。当邻苯二酚投料结束后，继续反应1h，取样检测，左旋多巴的浓度为142g/L，转化率约为97.1％。经后处理得到多巴成品293kg，收率为82％，成品经检测符合EP和USP标准。

实施例3：7.5吨体系的转化

向生物反应器内依次加入水4800L，450kg的甘氨酸，180kg的甲醛溶液(37％)，用浓氨水控制pH在6.0～8.0；再依次投加VC15kg，EDTA7.5kg、甲酸铵120kg、5-磷酸吡哆醛1kg，再次用浓氨水将pH控制在6.0～8.0，温度控制在32℃～38℃。加入75kg邻苯二酚和1800kg含重组L-苏氨酸醛缩酶、重组L-丝氨酸脱水酶、重组酪氨酸酚解酶的酶液,开始反应。反应过程中流加37％甲醛溶液以维持反应pH在6.0～8.0之间。之后每10min投加15kg的底物邻苯二酚。邻苯二酚的总投入量为660kg。当邻苯二酚投料结束后，继续反应1.5h，取样检测，左旋多巴的浓度为150g/L，转化率约为95.2％。经后处理得到多巴成品956kg，收率为85％，成品经检测符合EP和USP标准。

实施例4：15吨体系的转化

向生物反应器内依次加入水9600L，750kg的甘氨酸，350kg的甲醛溶液(37％)，用浓氨水控制pH在6.0～8.0；再依次投加VC30kg，酒石酸钾15kg、甲酸铵250kg、5-磷酸吡哆醛2kg，再次用浓氨水将pH控制在6.0～8.0，温度控制在32℃～38℃。加入150kg邻苯二酚和3500kg含重组丝氨酸羟甲基转移酶、重组L-丝氨酸脱水酶、重组酪氨酸酚解酶的酶液，开始反应。反应过程中流加37％甲醛溶液以维持反应pH在6.0～8.0之间。之后每10min投加30kg的底物邻苯二酚。邻苯二酚的总投入量为1100kg。当邻苯二酚投料结束后，继续反应1h，取样检测，左旋多巴的浓度为128g/L，转化率约为97.5％。经后处理得到多巴成品1595kg，收率为83％。成品经检测符合EP和USP标准。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 长兴制药股份有限公司

<120> 一锅酶法制备左旋多巴的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1134

<212> DNA

<213> D-苏氨酸醛缩酶(D-threonine aldolase2 Ambystoma laterale xAmbystoma jeffersonianum)

<400> 1

atgtcccagg aagtcatacg cggcatagcg ctgcccccgg cggcccagcc gggcgatccc 60

ttggcccgag tcgacacgcc cagcctggtg ctggacctgc cggccttcga ggcgaacctg 120

cgcgccatgc aggcctgggc cgaccggcac gaggtggccc tgcggcccca cgccaaggcg 180

cacaagtgcc cggaaatcgc cttgcgccag ctggccctgg gcgcgcgcgg catctgctgc 240

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gacggcgtgg tgcaggacgt ctgggaaatc gcggcgcgcg gcttctcgcg ctga 1134

<210> 2

<211> 1329

<212> DNA

<213> D-丝氨酸脱水酶(D-serine dehydratase)

<400> 2

atggaaaacg ctaaaatgaa ctcgctcatc gcccagtatc cgttggtaaa ggatctggtt 60

gctcttaaag aaaccacctg gtttaatcct ggcacgacct cattggctga aggtttacct 120

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tgcttttttg ccgaaccaac gcactcccct tgtatgttgt taggcgtcca tacaggatta 960

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ggccgttaa 1329

<210> 3

<211> 1371

<212> DNA

<213> 酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol lyase)

<400> 3

atgaattatc cggcagaacc cttccgtatt aaaagcgttg aaactgtatc tatgatcccg 60

cgtgatgaac gccttaagaa aatgcaggaa gcgggttaca atactttcct gttaaattcg 120

aaagatattt atattgacct gctgaccgac agtggcacca acgcaatgag cgacaagcag 180

tgggccggaa tgatgatggg tgatgaagcg tacgcgggca gcgaaaactt ctaccatctg 240

gaaagaacgg ttcaggaact gtttggcttt aaacatattg ttccgactca ccagggccgc 300

ggcgctgaaa acctgttatc gcagctggct attaaacctg ggcaatatgt tgccgggaat 360

atgtatttca ccactacccg ttatcaccag gaaaaaaatg gcgcggtgtt tgtcgatatc 420

gttcgtgacg aagcgcacga tgccggtctg aatattgcat ttaaaggtga tatcgatctt 480

aaaaaattac aaaagctgat tgatgaaaaa ggcgccgaga atattgccta tatctgcctg 540

gcggtgacgg ttaacctcgc gggcgggcag ccggtatcga tggcaaacat gcgtgcggta 600

cgtgaactga caaaagcaca cggcattaaa gtgttctacg acgccacccg ctgcgtagaa 660

aacgcctact ttatcaaaga gcaagagcag ggctttgaga acaagagcat cgcagagatc 720

gtgcatgaga tgttcagcta cgccgacggt tgtaccatga gtggtaaaaa agactgtctg 780

gtaaacatcg gcggtttcct gtgcatgaat gatgacgaaa tgttctctgc tgccaaagag 840

ttagtcgtgg tctacgaagg gatgccatcc tacggcggcc tggccggacg cgacatggaa 900

gccatggcga ttggtctgcg cgaagccatg cagtatgagt acattgagca ccgcgtgaag 960

caggtgcgct acctgggcga caagctgaaa gctgctggcg taccgattgt tgaaccggtg 1020

ggtggccatg cggtattcct cgatgcgcgc cgcttctgcg agcatctgac gcaggacgag 1080

ttcccggcgc aaagcctggc tgccagcatc tatgtagaaa ctggtgtacg tagtatggag 1140

cgcggaatta tctctgcggg tcgtaataac gtgaccggcg aacaccacag accgaaactg 1200

gaaaccgtgc gtctgacgat tccacgtcgc gtttatacct acgcgcatat ggatgtggtg 1260

gccgacggta ttattaaact ttaccagcac aaagaagata ttcgcgggct gaagtttatt 1320

tatgagccga agcagttgcg tttctttacc gcgcgctttg attatatcta a 1371

<210> 4

<211> 1002

<212> DNA

<213> L-苏氨酸醛缩酶(L-serine aldolase)

<400> 4

atgattgatt tacgcagtga taccgttacc cgaccaagcc gcgccatgct cgaagcgatg 60

atggccgccc cggttgggga cgacgtttac ggagacgacc ctaccgttaa tgctctgcag 120

gactacgcag cagagctttc cggtaaagaa gccgccattt ttctgcctac cggcactcag 180

gccaacctgg tcgctctgct cagtcactgc gaacgcggcg aagagtatat tgtcggtcag 240

gccgcgcata actatctgtt tgaagccggt ggcgcggcgg tgctgggcag tattcaaccg 300

caacccatag acgcggctgc cgacggcacg ctaccgctgg ataaagtggc gatgaaaatc 360

aaacccgacg atatccattt cgcccgcacc aaattactca gtctggaaaa cacccacaac 420

ggcaaagtgt tgccgcggga atacctgaaa gaagcatggg aatttacccg cgagcgcaat 480

ctggcgctgc atgttgacgg tgcgcgcatc tttaatgccg tggtggctta cggctgcgaa 540

ctgaaagaga tcacgcaata ttgtgattcg ttcaccattt gcctgtcgaa aggtcttggg 600

acgccagtcg gttcattact cgtcggtaat cgtgattaca ttaaacgtgc cattcgctgg 660

cggaaaatga caggtggcgg gatgcgccag tccggcattc tggctgccgc cgggatatat 720

gccctgaaaa ataacgttgc gcgcttgcag gaagaccacg acaacgctgc ctggatggcg 780

gagcagctgc gtgaagcagg cgcggatgtg atgcgtcagg acaccaatat gctgtttgtt 840

cgcgtcgggg aagaaaatgc tgccgcgtta ggcgaataca tgaaagcgag aaacgtgctg 900

attaacgcct cgccgattgt ccgcctggtg acgcatcttg acgtctcgcg cgaacaactg 960

gcggaagtcg ccgcccactg gcgtgcattc ctggcgcgtt aa 1002

<210> 5

<211> 1002

<212> DNA

<213> L-丝氨酸脱水酶(L-serine dehydratase)

<400> 5

atgattgatt tacgcagtga taccgttacc cgaccaagcc gcgccatgct cgaagcgatg 60

atggccgccc cggttgggga cgacgtttac ggagacgacc ctaccgttaa tgctctgcag 120

gactacgcag cagagctttc cggtaaagaa gccgccattt ttctgcctac cggcactcag 180

gccaacctgg tcgctctgct cagtcactgc gaacgcggcg aagagtatat tgtcggtcag 240

gccgcgcata actatctgtt tgaagccggt ggcgcggcgg tgctgggcag tattcaaccg 300

caacccatag acgcggctgc cgacggcacg ctaccgctgg ataaagtggc gatgaaaatc 360

aaacccgacg atatccattt cgcccgcacc aaattactca gtctggaaaa cacccacaac 420

ggcaaagtgt tgccgcggga atacctgaaa gaagcatggg aatttacccg cgagcgcaat 480

ctggcgctgc atgttgacgg tgcgcgcatc tttaatgccg tggtggctta cggctgcgaa 540

ctgaaagaga tcacgcaata ttgtgattcg ttcaccattt gcctgtcgaa aggtcttggg 600

acgccagtcg gttcattact cgtcggtaat cgtgattaca ttaaacgtgc cattcgctgg 660

cggaaaatga caggtggcgg gatgcgccag tccggcattc tggctgccgc cgggatatat 720

gccctgaaaa ataacgttgc gcgcttgcag gaagaccacg acaacgctgc ctggatggcg 780

gagcagctgc gtgaagcagg cgcggatgtg atgcgtcagg acaccaatat gctgtttgtt 840

cgcgtcgggg aagaaaatgc tgccgcgtta ggcgaataca tgaaagcgag aaacgtgctg 900

attaacgcct cgccgattgt ccgcctggtg acgcatcttg acgtctcgcg cgaacaactg 960

gcggaagtcg ccgcccactg gcgtgcattc ctggcgcgtt aa 1002

<210> 6

<211> 1254

<212> DNA

<213> 丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyrltransferase)

<400> 6

atgttaaagc gtgaaatgaa cattgccgat tatgatgccg aactgtggca ggctatggag 60

caggaaaaag tacgtcagga agagcacatc gaactgatcg cctccgaaaa ctacaccagc 120

ccgcgcgtaa tgcaggcgca gggttctcag ctgaccaaca aatatgctga aggttatccg 180

ggcaaacgct actacggcgg ttgcgagtat gttgatatcg ttgaacaact ggcgatcgat 240

cgtgcgaaag aactgttcgg cgctgactac gctaacgtcc agccgcactc cggctcccag 300

gctaactttg cggtctacac cgcgctgctg gaaccaggtg ataccgttct gggtatgaac 360

ctggcgcatg gcggtcacct gactcacggt tctccggtta acttctccgg taaactgtac 420

aacatcgttc cttacggtat cgatgctacc ggtcatatcg actacgccga tctggaaaaa 480

caagccaaag aacacaagcc gaaaatgatt atcggtggtt tctctgcata ttccggcgtg 540

gtggactggg cgaaaatgcg tgaaatcgct gacagcatcg gtgcttacct gttcgttgat 600

atggcgcacg ttgcgggcct ggttgctgct ggcgtctacc cgaacccggt tcctcatgct 660

cacgttgtta ctaccaccac tcacaaaacc ctggcgggtc cgcgcggcgg cctgatcctg 720

gcgaaaggtg gtagcgaaga gctgtacaaa aaactgaact ctgccgtttt ccctggtggt 780

cagggcggtc cgttgatgca cgtaatcgcc ggtaaagcgg ttgctctgaa agaagcgatg 840

gagcctgagt tcaaaactta ccagcagcag gtcgctaaaa acgctaaagc gatggtagaa 900

gtgttcctcg agcgcggcta caaagtggtt tccggcggca ctgataacca cctgttcctg 960

gttgatctgg ttgataaaaa cctgaccggt aaagaagcag acgccgctct gggccgtgct 1020

aacatcaccg tcaacaaaaa cagcgtaccg aacgatccga agagcccgtt tgtgacctcc 1080

ggtattcgtg taggtactcc ggcgattacc cgtcgcggct ttaaagaagc cgaagcgaaa 1140

gaactggctg gctggatgtg tgacgtgctg gacagcatca atgatgaagc cgttatcgag 1200

cgcatcaaag gtaaagttct cgacatctgc gcacgttacc cggtttacgc ataa 1254

Claims (12)

1.一锅酶法制备左旋多巴的方法，其特征在于，以甲醛、甘氨酸和邻苯二酚为底物；甲醛和甘氨酸在醛缩酶和其辅酶存在下发生催化反应转化为丝氨酸，然后丝氨酸在脱水酶作用下转化为丙酮酸和氨，最后在酪氨酸酚裂解酶作用下，丙酮酸与邻苯二酚生成左旋多巴。

2.根据权利要求1所述的一锅酶法制备左旋多巴的方法，其特征在于，所述的醛缩酶选自D-苏氨酸醛缩酶、L-苏氨酸醛缩酶或丝氨酸羟甲基转移酶中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的一锅酶法制备左旋多巴的方法，其特征在于，所述的D-苏氨酸醛缩酶选自节杆菌来源的D-苏氨酸醛缩酶、黄单胞菌来源的D-苏氨酸醛缩酶或无色杆菌来源的D-苏氨酸醛缩酶中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述的一锅酶法制备左旋多巴的方法，其特征在于，所述的L-苏氨酸醛缩酶选自大肠杆菌来源的L-苏氨酸醛缩酶、假单胞菌来源的L-苏氨酸醛缩酶或酵母来源的L-苏氨酸醛缩酶中的一种或多种。

5.根据权利要求2所述的一锅酶法制备左旋多巴的方法，其特征在于，所述的丝氨酸羟甲基转移酶选自大肠杆菌来源的丝氨酸羟甲基转移酶、枯草芽孢杆菌来源的丝氨酸羟甲基转移酶或酵母来源的丝氨酸羟甲基转移酶中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的一锅酶法制备左旋多巴的方法，其特征在于，所述的脱水酶选自D-丝氨酸脱水酶或L-丝氨酸脱水酶中的一种或两种。

7.根据权利要求6所述的一锅酶法制备左旋多巴的方法，其特征在于，所述的D-丝氨酸脱水酶选自大肠杆菌来源的D-丝氨酸脱水酶、枯草芽孢杆菌来源的D-丝氨酸脱水酶或酵母来源的D-丝氨酸脱水酶中的一种或多种。

8.根据权利要求6所述的一锅酶法制备左旋多巴的方法，其特征在于，所述的L-丝氨酸脱水酶选自大肠杆菌来源的L-丝氨酸脱水酶、枯草芽孢杆菌来源的L-丝氨酸脱水酶或酵母来源的L-丝氨酸脱水酶中的一种或多种。

9.根据权利要求1所述的一锅酶法制备左旋多巴的方法，其特征在于，所述的丝氨酸为D-丝氨酸、L-丝氨酸或D,L-丝氨酸中的一种或多种。

10.根据权利要求1所述的一锅酶法制备左旋多巴的方法，其特征在于，所述的酪氨酸酚裂解酶选自弗氏柠檬酸细菌。

11.根据权利要求1所述的一锅酶法制备左旋多巴的方法，其特征在于，所述的辅酶是5-磷酸吡哆醛(PLP)。

12.根据权利要求1所述的一锅酶法制备左旋多巴的方法，其特征在于，反应体系中还加入有铵盐、抗氧化剂和螯合剂。