KR20120099257A

KR20120099257A - 전 세포 바이오촉매

Info

Publication number: KR20120099257A
Application number: KR1020127015439A
Authority: KR
Inventors: 요야킴 호세; 루스 마스; 크리스티안 데첼
Original assignee: 짜이루스 베테일리궁스게젤샤프트 엠베하 운트 코. 파텐테 I 카게
Priority date: 2009-11-16
Filing date: 2010-11-16
Publication date: 2012-09-07
Also published as: CA2780518A1; ZA201202939B; MX2012005682A; US8945887B2; RU2012125031A; BR112012011524A2; JP2013510587A; US20130011890A1; WO2011057820A3; EP2501807A2; RU2534346C2; CN102791855A; WO2011057820A2; EP2338987A1; AU2010318256A1

Abstract

본 발명은 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 미생물의 표면에 위치한 니트릴라아제를 포함하는 미생물 및/또는 상기 미생물의 멤브레인 제조물을 제공하는 단계; 및 (ii) 상기 미생물 및/또는 이의 멤브레인 제조물을 니트릴라아제 활성에 호환적인 조건하에서 하나 이상의 니트릴라아제 기질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 라세믹 만델로니트릴의 전환을 위해 니트릴라아제를 디스플레이하는 전 세포 바이오촉매 또는 이의 멤브레인 제조물을 사용하여 거울상이성질체적으로 순수한 (R)-만델산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

전 세포 바이오촉매{WHOLE CELL BIOCATALYST}

본 발명은 니트릴라아제(nitrilase)에 의해 촉매되는 반응의 산물을 생성하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 미생물의 표면에 위치한 상기 니트릴라아제를 포함하는 미생물 및/또는 상기 미생물의 멤브레인 제조물을 제공하는 단계, 및 (ii) 니트릴라아제 활성과 호환적인 조건 하에서 상기 미생물 및/또는 이의 멤브레인 제조물을 하나 이상의 니트릴라아제 기질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 (i) 미생물의 표면에 니트릴라아제를 포함하는 미생물 및/또는 이의 멤브레인 제조물을 제공하는 단계, (ii) 상기 니트릴라아제가 니트릴의 카르복시산으로의 전환을 촉매할 수 있도록 상기 미생물 및/또는 이의 멤브레인 제조물을 니트릴과 접촉시키는 단계를 포함하는 카르복시산 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 라세믹 만델로니트릴(mandelonitrile)의 처리를 위해 상기 니트릴라아제를 디스플레이하는 전세포 바이오촉매 또는 이의 멤브레인 제조물을 사용하여 거울상이성질체적으로 순수한 (R)-만델산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

니트릴은 예를 들어 카르복시산 또는 아미드와 같은 다양한 산물을 생성하는데 중요한 전구체 분자이다(Banerjee et al., 2002). 그러나, 니트릴의 높은 안정성에 기인하여, 니트릴의 화학적 전환을 위해 이를 고온에서 강염기 또는 강산 조건으로 처리하는 것이 필요하다(Banerjee et al., 2002; Nagasawa et al., 1990). 더욱이, 각 반응 혼합물로부터 이러한 산물의 정제는 매우 오래 걸린다.

니트릴라아제(예, EC 3.5.5.1)는 단일 단계로 니트릴을 이에 상응하는 카르복시산 및 암모니아로 전환시킬 수 있는 효소이다(Thimann and Mahadevan, 1964). 한편으로 상기 카르복시 산물은 종종 매우 다양한 화학 제조 공정에 중간물로서 사용되고, 다른 한편으로, 니트릴라아제는 폐기물 해독에 사용될 수 있기 때문에, 니트릴라아제 효소의 사용은 실질적인 산업적 관심을 받아왔다(Banerjee et al., 2002; Thuku et al., 2009). 더욱이, 니트릴라아제는 고 선택적이며, 그리고 통상적인 화학에서 요구되는 비용 집약적인 블로킹 및 디블로킹 단계 및 촉매를 필요로 하지 않고 온화한(mild) 조건 하에서 거울상이성질체적으로 순수한 카르복시산을 수득한다(Banerjee et al., 2002). 상기 고 선택성은 통상적인 방법을 이용하여서는 달성되지 않거나 어렵게 달성되는 산물의 합성을 가능하게 한다.

양과 관련된 니트릴라아제의 가장 중요한 산업적 적용은 라세믹 만델로니트릴의 거울상이성질체적으로 순수한 (R)-만델산으로의 전환이다(Rey et al., 2004). (R)-만델산은 부분입체 이성질체(diastereomeric salts(diastereomer))를 사용하여 라세미산에서 거울상이성질체를 분리하는데 사용된다. 더욱이, 이는 새로운 활성제의 화학적 합성시 중요한 키랄 중간 산물이다.

에이. 피칼리스(A. feacalis)의 니트릴라아제는 고 거울상 선택성으로 만델로니트릴을 만델산으로 전환살 수 있는 것이 잘 알려져 있다. 만델산과 같은 키랄 카르복시산은 다수의 약학 제제 또는 식물 보호제를 위한 기본 산물로서 제공되기 때문에 유기 화학에서 원하여지는 화합물이다. 따라서, 예를 들어, (R)- 또는 (S)-만델산은 라세믹 아민의 라세믹 분해를 위해 사용된다. 또한, (R)-만델산은 그 합성을 위한 중간물로 사용된다.

그러나, 니트릴라아제는 널리 알려진 바와 같이 불안정한 효소이며(Buchholz, Kasche and Bornscheuer, 2005), 따라서, 산업적으로 정제된 효소로 드물게 사용되거나 전세포 집단으로 사용된다. 니트릴라아제의 활성 중심부는 자가산화(Kobayashi et al., 1992)에 민감하며, 티올-함유 제제와 같은 다수의 화학물질에 대해 반응적인 보존 활성부 시스테인 잔기(Kobayashi et al., 1992)를 포함하는 3 아미노산 잔기(촉매 트리아드)의 촉매 서열을 함유한다.

세포 내에 존재하는 한, 니트릴라아제는 환원적이며(Choi and Lee, 2004), 이에 따라 티올기의 산화를 저해하는 박테리아 사이토졸의 레독스 환경에 의해 보호된다. 그러나, 니트릴라아제는 산소에 노출시 활성을 잃는 것으로 나타났으며, 이러한 관찰은 활성 중심부에서 결정적인 레독스-민감성 트리아드 시스테인의 민감성에 기인한 것으로 여겨진다(Mateo et al., 2006).

충분한 활성 및/또는 안정성 면에서 니트릴라아제의 단점을 극복하기 위해 여러 가지 방안이 이용되어 왔다.

그 중 한 방안으로, 정제된 효소 제조물 보다는 전 니트릴라아제-발현 세포(whole nitrilase-expressing cells)가 사용되며, 이는 니트릴라아제를 스트레인-특이적 또는 재조합 형태로 세포내에 제공한다(Kaul et al., 2007). 예를 들어, 세포내에 위치한 니트릴라아제를 포함하는 전 세포 촉매로서 니트릴라아제를 발현하는 알칼리제네스 피칼리스(Alcaligenes faecalis)가 사용되었다(Kaul, A. Banerjee and U. C. Banerjee, 2006). 97%를 초과하는 거울상이성질체가 달성되었다. 이러한 방법에 대한 근본적인 이유는 상기 효소가 이의 자연 환경인 박테리아 사이토졸에서 유지되고, 여기서 내생적 폴딩 기구 및 연속적 턴오버 및 단백질 생합성이 일정 수준의 안정하면서 활성적인 단백질을 유지하는 데 있다. 그러나, 전 세포 촉매는 시간 소모적이며 노동 집약적인 절차를 통해 제조되고 적절한 매트릭스 시스템(알기네이트)에 부착되어야 한다. 더욱이, 턴오버되는 기질은 사이토졸에서 한 번 선택적 박테리아 세포 멤브레인 및 면을 관통할 필요가 있으며, 다양한 효소들은 대체 활성 및 경합 기질을 갖는다. 결국, 전 세포 촉매는 원하는 산물의 제조물을 오염시키며, 이에 따라 예를 들어, 의약품, 화장품 및 위생 용품 뿐만 아니라 음료 및 식품의 제조와 같은 민감한 적용에서 이러한 산물의 사용을 제외시킨다.

산업적 사용을 위한 증가된 수준의 기능성 니트릴라아제의 제조에 대한 다른 방법은 샤프롱(chaperones)의 사용과 관련된다. GroEL 과의 샤프롱은 ATP-의존적 바인딩, 캡슐화 및 기질 단백질의 방출의 다중 라운드를 통해 바르게 폴딩된 단백질을 세포가 생성하기 위해 필수적인 사이토졸에 위치한 필수 단백질이다(Hartl, F.U. and Hayer-Hartl, M. 2002). GroEL의 결실은 궁극적으로 기능성 저 수준의 기질 단백질 뿐만 아니라 박테리아 세포의 사멸을 일으키며, 이는 다량의 언폴딩된 축적 단백질에 기인한다. 샤프롱, 보다 구체적으로 GroEL 시스템의 성분들은 이. 콜라이(E. coli)의 사이토졸에서 재조합 니트릴라아제와 함께 공발현된다(미국 특허 제 5,629,190호, 도 9). 이러한 방법은 내생적 수준의 샤프롱만 갖는 세포에 비해 보다 높은 수준의 가용성 단백질을 형성한다. 그러나, 이러한 폴딩 기구 또는 개별적으로 정제된 샤프롱 및 이의 보조인자 및 부가적인 기질의 니트릴라아제 제조물에 대한 첨가를 제공하는 전 세포의 사용은 이러한 방법의 전제조건이다.

미국 특허 제 5,629,190호에는 니트릴라아제를 재조합적으로 발현하는 이. 콜라이(E. coli) 전 세포의 사용에, 대해 개시되어 있다. 그러나, 예를 들어, 재조합적으로 발현된 니트릴라아제와 같이 미생물이 합성하는 폴리펩타이드의 폴딩을 돕는 GroEL과 같은 단백질 제제가 재조합적으로 발현되더라도, 상기 세포의 특정 세포내 효소 기구에 기인하여, 그 결과 형성되는 반응은 복잡하고 이의 결과는 예측불가능하다. 미국 특허 제 5,629,190호에 개시된 바와 같이, 니트릴을 카르복시산으로 전환하는 니트릴라아제-촉매 전환은 니트릴 하이드라타아제-촉매 반응(산 아미드 형성을 일으킴)와 경합하며, 이는 수율 감소를 일으키고, 제거하기 어려운 원하지 않는 부산물을 형성한다. 상기 세포에 존재하는 다른 효소는 니트릴기 또는 언 다른 부에서의 니트릴을 변형시킬 수 있다.

다른 방법은 가교 효소 집합체의 제조 및 사용, 즉, 가용성 재조합 효소의 제조 및 글루타르알데히드 또는 폴리(에틸렌이민)과 같은 반응적 이작용성 화학물질을 이용한 후속적인 가교와 관련된다. 그러나, Kaul 등(2007)은 이러한 고정화가 반응 속도의 현저한 감소를 일으키고 특이성 상수를 감소시키는 것을 입증하였다. 또한, 화학적 가교는 기질 특이성을 변환시키고, 특정 형태에서 "잠긴(locked)" 단백질 분자를 잘 생성할 수 있는 가교 프로세스에 연결되는 것으로 관찰되었다. 더욱이, 고정된 효소 집단, 뿐만 아니라 이의 분해 산물 및 잔해는 원하는 반응 산물로부터 분리하기가 간단하지 않을 수 있다.

야마모토 등(1991)은 다양한 분리물(와일드타입 스트레인)에 대해 만델로니트릴을 (R)-(-)-만델산으로 전환시키는 능력을 조사하였다. 에이. 피칼리스(A. feacalis) 스트레인 ATCC 8750은 라세믹 만델로니트릴로부터 (R)-(-)-만델산을 생성하는데 최고 수준의 활성 및 거울상 선택성을 갖는 것으로 발견되었다(Yamamoto et al., 1991). 특히, 휴면 세포에 의한 만델로니트릴로 생성된 (R)-(-)-만델산은 100% 거울상이성질체 과잉률로 존재하였다. 에이. 피칼리스 스트레인 ATCC 8750은 각각, 만델로니트릴 및 만델라미드를 프로세싱하는데 사용되는 (R)-거울상선택성 니트릴라아제 및 아미다아제를 갖는다. 한편으로 만델로니트릴의 (R)- 및 (S)-이성질체 및 다른 한편으로 벤즈알데히드/HCN의 화학적 평형 때문에, (R)-(-)-만델산은 91%의 수율로 라세믹 만델로니트릴로부터 생성되나, (S)-만델로니트릴은 남지 않고, 그 반응에 잔존하는 (S)-(-)-만델로니트릴은 연속적으로 라세미화된다. 결국, 대부분의 모든 만델로니트릴이 소모되고 (R)-(-)-만델산으로 전환된다. 야마모토 등(1991)에 따르면, (R)-만델산의 제조에 사용된 에이. 피칼리스 세포는 특별히 최적화된 배양 조건을 필요로 한다.

한편, 박테리아 기원의 다른 니트릴라아제가 이. 콜라이에서 클로닝되고 재조합적으로 발현된 바 있다(Kiziak et al., 2005; Luo et al., 2008; Rustler et al., 2008; U.S. Patent No. 6,180,359; Ress-Loschke et al., 1998). 상기 니트릴라아제는 생화학적으로 특성화되었다(Kiziak et al., 2005). 이는 또한 이. 콜라이에서 에이. 피칼리스 ATCC8750의 니트릴라아제 유전자를 재조합적으로 발현하고, 그 다음 정제 후 고정화 실험에서 "가교 효소 집합체(cross-linked enzyme aggregates)"로 사용하는 것이 가능하였다(Rey et al., 2004). 이 방법에서, 상기 니트릴라아제는 숙주 생물체, 즉, 이. 콜라이로부터 분리되고 정제되어야 한다. 이러한 방법은 상당히 오래 걸린다. 더욱이, 상기 니트릴라아제는 절차 과정 중에 불활성화될 수 있다.

알칼리제네스 피칼리스 subsp. 피칼리스(Alcaligenes Faecalis subsp . faecalis) ATCC 8750의 니트릴라아제는 서브 유닛 당 32kD의 분자량을 갖는 약 14 서브유닛으로 구성되며, 그 네이티브 단백질은 약 460kD의 총 복합 분자량을 갖는 호모올리고머 효소로서 개시되어 있다(Yamamoto et al., 1992). 일반적으로, 니트릴라아제는 불활성 다이머로서 방출되며, 자가 결합(self-association)을 통해 활성 올리고머를 형성한다. 그러나, 활성에 필요한 서브유닛의 수는 니트릴라아제 마다 상이하다(Thuku et al., 2009).

요약하면, 니트릴라아제는 유기 화합물의 생성시 니트릴라아제의 사용을 방해하는 여러 단점을 갖는다:

● 니트릴라아제는 산화에 민감하여 시간 경과에 따라 니트릴라아제 활성이 감소한다.

● 전 세포 바이오촉매의 형태로 사용할 경우, 세포에 존재하는 다른 효소들(니트릴 하이드라타아제와 같은)에 의해 촉매된 원하지 않는 부 반응이 니트릴라아제에 의해 촉매되는 반응을 방해할 수 있다.

● 니트릴라아제는 반응 혼합물로부터 회수될 수 없다.

오토디스플레이(autodisplay)는 재조합 단백질의 박테리아 표면 디스플레이를 위한 훌륭한 도구이다. 이러한 발현 시스템은 타입 V 분비 시스템에 속하는 오토트랜스포터 과(autotransporter family)의 단백질의 분비 메카니즘에 기초한다.

그람 음성 박테리아에서, 오토트랜스포터 경로는 단백질의 세포 표면으로의 수송 및 단백질의 세포외 환경으로의 분비 모두와 관련된다(Jose and Meyer, 2007). 오토트랜스포터 단백질은 세포 표면으로의 수송을 위한 모든 구조적 요건을 갖는 전구체 단백질로서 합성된다(Jose, 2006). 이들은 내부 멤브레인의 횡단을 가능하게 하는 Sec 경로에 전형적인 N-말단 신호 펩타이드로 합성된다. 주변 세포질에서 신호 펩타이드의 트렁케이션 후에, 상기 전구체의 C-말단부는 소위 β-배럴이라 불리우는 포린성 구조로서 외부 멤브레인으로 폴딩된다. 이러한 포어를 통해, N-말단 결합된 패신저 도메인은 그 표면에 전위된다(Jose, 2002). 이는 자가 단백질 가수분해적으로 또는 부가적인 프로테아제에 의해 분할되거나, 또는 트랜스포터 도메인을 통해 세포 엔벨로프에 정착된 채로 남는다. 천연 패신저를 재조합 단백질로 대체하는 것은 이의 적절한 표면 전위를 일으킨다. 이러한 목적으로, 인공 전구체는 전체 표면 접근에 필요한, 신호 펩타이드, 재조합 패신저, β-배럴 및 이들 사이의 결합 부위로 구성된 유전공학기술에 의해 구성되어야 한다. AIDA-I 오토트랜스포터는 다양한 패신저 도메인의 효율적인 표면 디스플레이를 위해 이러한 방법에 성공적으로 사용되었다(Henderson et al., 2004).

오토디스플레이 시스템에서, 활성 효소에 대한 서브유닛의 자가 결합은, 예를 들어 이합체성 효소 소르비톨 디하이드로게나아제에서 관찰되었다(Jose, 2002; Jose and von Schwichow, 2004).

특히, 오토디스플레이 기술은 이. 콜라이 및 다른 그람 음성 박테리아의 외부 멤브레인의 표면에서 소정의 단백질에 대한 발현 방법이며, 여기서 오토디스플레이 시스템은 오토트랜스포터 단백질의 자연적인 분비에 기초한다(Jose and Meyer, 2007). 이러한 프로세스에서, 재조합 패신저 단백질은 표준 방법의 유전공학기술을 이용하여 이의 코딩 서열을 오토디스플레이 벡터의 신호 펩타이드와 전위 도메인 사이에 인프래임으로 도입함으로써 간단히 이송될 수 있다. 따라서, 외부 멤브레인을 가로질러 이송시키기 위한 패신저 단백질은 이. 콜라이(AIDA-I)의 외부 멤브레인에서 오토트랜스포터라고 불리우는 다른 단백질과 함께 재조합 융합 단백질로 발현된다(Jose, 2006). 오토트랜스포터 단백질의 C-말단부는 이. 콜라이의 외부 멤브레인 내에 포린성 구조(β-배럴)를 형성한다. 이러한 포린성 구조는 재조합 패신저 단백질을 이. 콜라이의 외부 멤브레인의 표면으로 이송시키는 것을 촉진한다(Jose, 1995, 2006, 2007).

본 발명에서 해결하려고 하는 과제는 기질 분자에 쉽게 접근가능한 활성 상태의 니트릴라아제의 생성 및 제조가 가능한 방법을 제공하는 것이다. 더욱이, 다른 효소들의 존재는 원하지 않는 부 반응을 방지하기 위해 회피되어야 한다. 본 발명에서 해결하려고 하는 다른 과제는 재조합 니트릴라아제를 이용하여 니트릴라아제에 의해 촉매되는 반응의 산물(예, 카르복시산)을 제조하는 방법을 제공하는 것이며, 여기서 시간 경과에 따른 활성 감소의 문제는 적어도 부분적으로 해결된다. 본 발명에서 해결하려고 하는 다른 과제는 니트릴라아제에 의해 촉매되는 반응의 산물(예, 카르복시산)이 쉽게 회수될 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

예기치않게도, 본 발명자들은 니트릴라아제가 미생물과 같은 숙주 세포의 표면에서 발현될 수 있으며, 여기서 니트릴라아제는 완전히 기능적인, 즉, 니트릴을 카르복시산의 형태로의 전환을 촉매할 수 있음을 발견하였다.

본 발명의 제1 견지는

(i) 미생물의 표면에 위치한 니트릴라아제를 포함하는 미생물 및/또는 상기 미생물의 멤브레인 제조물을 제공하는 단계; 및

(ii) 상기 미생물 및/또는 이의 멤브레인 제조물을 니트릴라아제 활성에 호환적인 조건하에서 하나 이상의 니트릴라아제 기질과 접촉시키는 단계

를 포함하는, 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물을 제조하는 방법이다.

도 1: pAT-NitAf에 의해 암호화된 오토트랜스포터 융합 단백질의 스킴. 융합 부위의 환경은 서열로 주어진다. 클로닝 절차에 기인하여 부가된 N-말단에서의 두 아미노산을 이탤릭체 및 볼드체로 나타내었다. 신호 펩티다아제 분할 부위를 SP(signal peptidase)로 표시하였다.
도 2: 과발현된 오토트랜스포터 융합 단백질 AFP를 포함하는 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf의 외부 멤브레인 분획(1), 프로테이나아제 K로 처리된 과발현 오토트랜스포터의 전 세포 분해물(2) 및 마커 래인(M)의 SDS-PAGE.
도 3: 니트릴라아제 활성의 입증:
(R,S)-만델로니트릴로부터 (R)-만델산의 생성. 반응 혼합물은 1ml의 총 부피로, Na-포스페이트 버퍼(50mM, pH 7.5), (R.S)-말델로니트릴(10mM) 및 10의 OD₅₇₈에 해당되는 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf의 세포를 함유하였다. 측정점은 3회 실험의 평균이며; 표준 오차를 나타내는 바는 육안으로 보기에는 너무 적었다. 흑색 기호는 OD₅₇₈ 1에서의 유도를 나타내고, 백색 기호는 OD₅₇₈ 0.5에서의 유도를 나타낸다. Tris-HCl 버퍼 pH 7(▼/△), 포스페이트 버퍼 pH 7.5(■/□).
도 4: (R)-만델산의 키랄 HPLC 검출. 이. 콜라이 BL21 pAT-NitAf로 처리한 라세믹 만델로니트릴 전환물에서 얻어진 메탄올에 용해된 순수 (R)-만델산(10mM)(앞), 이. 콜라이 BL21 pAT-NitAf로 처리한 라세믹 만델로니트릴 전환물에서 얻어진 만델산 추출물(뒤).
도 5: (R,S)-만델로니트릴에서 R-만델산으로의 전환율의 pH-의존성. 반응은 50mM 아세테이트 버퍼(백색 바) 또는 50mM 트리스-HCl 버퍼(흑색 바)에서 50mM 아세테이트에서 수행되었다. 반응 시간은 37℃에서 48시간이었다.
도 6: -18℃에서의 보관 중 상기 전 세포 바이오촉매의 안정성. 상기 세포를 20% 글리세롤을 함유하는 배지에서 동결하고, 해동한 후, 50mM 포스페이트 버퍼 pH 7.5, 10mM 만델로니트릴에서 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf에 의해 전환(만델산 생성)을 37℃에서 시작하여 120시간 동안 수행하였다.
도 7: 상이한 버퍼 및 온도 조건에서 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf의 재사용 가능성. 각 사이클은 24시간의 전환 시간에 해당된다. 후속적으로, 상기 바이오촉매는 원심분리(13000rpm에서 60초)에 의해 제거하고, 새로운 버퍼에 재현탁시키고, 새로운 기질과 혼합하고(최종 농도 10mM), 추가 24시간 동안 배양하였다. 흑색 기호는 Tris-HCl 버퍼(50mM, pH 7)를 나타내고, 백색 기호는 소듐 포스페이트 버퍼(50mM, pH 7.5)를 나타낸다. 45℃(●/○), 42℃(■/□), 37℃(▼/△)를 나타낸다.
도 8: KpnI 및 XhoI을 이용한 플라스미드 DNA의 제한 분해. 래인 1) 1kb 마커, 2)-12) KpnI/XhoI을 이용하여 절단된 형질변형체의 플라스미드 DNA 13) 1kb 마커.
도 9: 클론 이. 콜라이 UT 5600(DE3) pAT-NitAf 및 pAT-NitSc의 트립신 분해 후 분리된 외부 멤브레인. 래인 1) 트립신-분해된 pAT-NitSc 2) 분해되지 않은 pAT-NitSc 3) 프로테이나아제 K-분해된 pAT-NitAf 4) 분해되지 않은 pAT-NitAf 5) 분자량 스탠다드(kDa).
도 10: 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf에 의한 만델로니트릴의 전환 후 HPLC 분석.
A) 음성 대조구, 이. 콜라이 BL21(DE3), OD₅₇₈ = 10, 배양 시간: 120h/30℃
1) HPLC 전 용매, 2) 만델로니트릴, 3) 벤즈알데히드
B) 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf에 의한 전환, OD₅₇₈ = 10, 배양 시간: 120h/30℃.
1) HPLC 전 용매, 2) 만델로니트릴, 3) 벤즈알데히드
도 11: 재조합 전 세포 바이오촉매 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf를 이용하여 생성된 만델산.
도 12: 포스페이트 버퍼(pH 7.5)에서 각각, 30℃ 및 37℃에서의 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf에 의한 만델산 생성. OD₅₇₈ = 1에서 세포들을 1mM IPTG를 이용하여 30℃에서 1시간 동안 유도하였다. 시간 t = 0에서의 기질 농도는 10mM 만델로니트릴이었다.
도 13: 포스페이트 버퍼(pH 7.5) 및 다양한 기질 농도를 이용하여 37℃에서의 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf에 의한 만델산 생성. OD₅₇₈ = 1에서 세포들을 1mM IPTG를 이용하여 30℃에서 1시간 동안 유도하였다. 그 다음, 전환은 120시간 동안 수행되었다.
도 14: 다양한 버퍼 시스템에서 37℃에서(도면에 표시된 바와 같이 일부는 다른 온도에서)의 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf에 의한 만델산 생성. OD₅₇₈ = 1에서 세포들을 1mM IPTG를 이용하여 30℃에서 1시간 동안 유도하였다. 시간 t = 0에서의 기질 농도는 10mM 만델로니트릴이었으며, 전환은 120시간 동안 수행되었다.
도 15: 5일 기간에 걸친 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf에 의한 (R)-만델산의 생성의 검출 및 확인. 헥산:2-프로판올:TFA(90:10:0.1)을 갖는 키랄-OM 컬럼(CS-Chromatographie Service), 유속: 0.5ml/분. 210nm에서 검출. A) 에틸 아세테이트로 추출된 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf의 세포 상층액의 분석. B) A)의 전환물과 혼합된 라세믹 만델산.
도 16: 6℃에서 상이한 보관 시간 후 만델산 생성(도 16). 50mM 포스페이트 버퍼(pH 7.5), 10mM 만델로니트릴에서 120시간, 37℃에서 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf에 의한 전환.
도 17: 상이한 버퍼 및 상이한 온도에서 각각 24시간 동안, 10mM 만델로니트릴과 함께 열혼합기에서 1000rpm으로 수행된 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf에 의한 만델산 생성.
도 18: 이. 콜라이 JK321 pAT-NitKp에 의한 3,5-디브로모-4-히드록시-벤조산 생성의 검출. 배양 시간 120시간, OD₅₇₈ = 10, 기질 2.5mM 브로목시닐.

본 발명의 방법에서, 어느 공지된 니트릴라아제 기질이 이용될 수 있다. 상기 산물은 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응의 산물인 어떠한 화합물일 수 있다. 여기서 사용된 "니트릴라아제 활성에 호환적인 조건(conditions compatible with nitrilase activity)"은 니트릴라아제가 활성적인 조건, 즉, 니트릴라아제가 하나 이상의 기질을 그 산물로 전환시킬 수 있는 조건을 포함한다. 니트릴라아제가 활성적인 어떠한 공지된 조건이 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용된 하나 또는 적어도 하나의 니트릴라아제 기질은 니트릴인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 획득된 산물은 카르복시산인 것이 바람직하다. "니트릴라아제 활성에 호환적인 조건(conditions compatible with nitrilase activity)"은 니트릴라아제가 니트릴을 그 결과 형성되는 카르복시산의 형태로의 전환을 촉매하는 조건일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현은

(i) 미생물의 표면에 위치한 니트릴라아제를 포함하는 미생물 및/또는 이의 멤브레인 제조물을 제공하는 단계; 및

(ii) 상기 미생물 및/또는 이의 멤브레인 제조물을 니트릴과 접촉시켜 니트릴라아제가 니트릴을 그 결과 형성되는 카르복시산의 형태로의 전환을 촉매하는 단계

를 포함하는, 카르복시산 제조 방법이다.

선택적으로, 본 발명의 방법은 단계 (ii)에 사용된 미생물을 회수하는 단계(iii)를 더 포함한다.

본 명세서에 사용된, "단계 (i)", "단계 (ii)" 또는 "단계 (iii)"는 본 명세서에 기재된 바와 같은, 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응의 산물을 제조하는 방법 및 카르복시산을 제조하는 바람직한 방법의 각 단계를 지칭한다.

본 발명은 재조합 방식으로 적절한 오토트랜스포터에 융합될 경우에 박테리아 니트릴라아제가 박테리아 세포의 표면으로 전위되고 활성적인 폴딩된 형태로 박테리아 멤브레인 내에 통합되어, 수일간 촉매적으로 유능한 상태를 보유하고 산업적으로 관련된 반응을 촉매하는데 사용될 수 있음을 예기치 않게 발견한 것에 기초한다. 이는 특히 박테리아 세포의 외부 멤브레인이 사이토졸 단백질에 적절한 단백질 폴딩 기구가 결여되어있기 때문에 예기치 않은 것이다. 더욱이, 본 발명자들은 가장 예기치 않게도, 상기 효소가 환원성 박테리아 사이토졸의 레독스-민감성 효소를 산소가 증가된 수준으로 존재하여 높은 산화적 환경을 생성하는 외부 멤브레인으로 이송한 후 또는 이송 도중에 불활성화되지 않는다는 것을 발견하였다.

이론으로 규정하려는 것은 아니나, 본 발명자들은 오토디스플레이에 의해 박테리아 세포의 표면에 고정될 경우 니트릴라아제는 반응성 촉매 아미노산 잔기를 불활성화로부터 보호하고, 심지어 다량의 박테리아 세포를 성장시키는데 사용되는 통상적인 방법의 일부로서 격한 교반과 관련된 상승된 산소 수준 및 강력한 기계적 힘에 노출될 경우에도 보호하는 집합체를 형성하거나 3차원 구조를 형성하는 것으로 추정한다.

본 명세서에 기재된 전 세포 바이오촉매는 이. 콜라이와 같은 그람-음성 세포의 표면에 활성 니트릴라아제를 최초로 제공하는 것을 가능하게 하며, 이 세포는 니트릴 전환 및 이에 상응하는 카르복시산의 제조에 사용될 수 있다. 특히, 본 명세서에 기재된 니트릴라아제-디스플레이 전 세포 바이오촉매는 니트릴의 생물공학적 전환에 사용될 수 있다.

중요하게도, 상기 반응은 온화한 조건 하에서, 양호한 생성률로, 그리고 독성 부산물의 생성없이 수행된다. 특히, 미생물의 표면에 재조합적으로 발현된 니트릴라아제는 약 pH 7.0에서와 같이 온화한 조건하에서 니트릴의 전환을 촉매할 수 있다.

본 명세서에 사용된, "전 세포 바이오촉매(whole cell biocatalyst)"는 유기 화합물, 특히 니트릴에서 화학적 변형을 수행하기 위한 전 세포, 특히 단백질 효소, 특히 니트릴라아제와 같은 천연 촉매를 포함하는 미생물을 지칭하며, 여기서 상기 천연 촉매는 바람직하게 세포의 표면에 위치한다. 본 발명에 따르면, 상기 촉매는 재조합적으로 발현될 수 있다.

박테리아 세포는 소수성 멤브레인에 의해 서로 분리된 다양한 컴파트먼트를 포함한다. 그람 양성 박테리아 세포는 세포의 내부에 사이토졸을 국한시키는 플라즈마 멤브레인을 포함한다. 반면에, 그람 음성 박테리아는 플라즈마 멤브레인에 부가적으로, 다른 멤브레인(외부 멤브레인으로 칭하여짐)을 갖는다. 본 명세서에 사용된 용어 "표면(surface)"은 바람직하게 예를 들어, 액체 배지와 같은 환경과 접촉하는 미생물의 층을 지칭한다. 본 발명의 바람직한 구현으로, 상기 표면은 액체 배지와 접촉하는 그람 음성 박테리아 세포의 면이다. 본 명세서에 사용된, 용어 "표면에 디스플레이된(displayed on the surface)" 및 "표면에 발현된(expressed on the surface)"은 세포의 표면에 니트릴라아제의 국소화를 지칭한다.

본 명세서에 사용된 "미생물(microorganism)"은 숙주 세포를 지칭한다. 본 발명에 따른 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 미생물, 바람직하게 원핵 미생물, 보다 바람직하게 박테리아 세포, 보다 바람직하게 그람 음성 박테리아 세포일 수 있다. 가장 바람직하게, 상기 미생물은 이. 콜라이 세포이다. 상기 용어 "미생물" 및 "숙주 세포"는 본 명세서에서 호환적으로 사용된다.

본 명세서에 사용된 "니트릴라아제(nitrilase)"는 니트릴라아제 효소, 이의 촉매적으로 활성적인 부분, 유도체 또는 유사체를 지칭하며, 이는 니트릴을 카르복시산 및 암모니아로 전환시키는 것을 촉매한다. 본 명세서에 사용된 분자의 "유도체(derivative)" 또는 "유사체(analogue)"는 그 분자의 일부 유도 형태 또는 변형 형태를 지칭한다. 본 발명에서, 니트릴라아제는 니트릴을 그 결과 형성되는 카르복시산의 형태로 전환시키는 촉매작용을 할 수 있는 니트릴라아제와 같은 어떠한 니트릴라아제일 수 있다. 바람직한 니트릴라아제는 EC 3.5.5.1에 따른 효소(또한 "니트릴 아미노하이드롤라아제(nitrile aminohydrolase)라고도 함)이다.

상기 니트릴라아제는 니트릴라아제 활성만 나타낼 수 있다. 또한, 상기 니트릴라아제는 니트릴라아제 활성에 부가적으로 다른 활성을 나타내는 다작용성 효소일 수 있다.

당해 기술분야의 통상의 기술자는 원핵생물 및 진핵생물을 포함하는 니트릴라아제을 제공하는 다수의 종을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명에 사용되는 니트릴라아제는 보르데텔라(Bordetella), 클렙시엘라(Klebsiella), 아스퍼질러스(Aspergillus), 알칼리제네스(Alcaligenes), 사카로미세스(Saccharomyces), 버콜데리아(Burkholderia), 뉴로스포라(Neurospora), 라칸세아(Lachancea), 데바리오미세스(Debaryomyces), 야로위아(Yarrowia), 칸디다(Candida), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 로도코커스(Rhodococcus), 노카디아(Norcardia) 및/또는 리조비움(Rhizobium)으로부터 획득될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 니트릴라아제를 제공하는 종의 예는 보르데텔라 브론티셉티카(Bordetella bronchiseptica), 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 알칼리제네스 피칼리스(Alcaligenes feacalis), 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 버콜데리아 멀티보란스(Burkholderia multivorans), 아스퍼질러스 퍼미카터스(Aspergillus fumigatus), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 라칸시아 데모톨러란스(Lachancea thermotolerans), 데바리오미세스 한세니(Debaryomyces hansenii), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous), 노카디아 sp.(Nocardia sp .), 리조비움 레그미노사럼(Rhizobium leguminosarum) 및/또는 노카디아 파시니카(Nocardia farcinica)이다.

본 발명의 니트릴라아제는 바람직하게 알칼리제네스(Alcaligenes), 클렙시엘라(Klebsiella) 및/또는 사카로미세스(Saccharomyces)로부터 획득된다. 보다 바람직한 니트릴라아제는 알칼리제네스 피칼리스(Alcaligenes feacalis), 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae) 및 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 획득된다. 알칼리제네스 피칼리스(Alcaligenes feacalis)는 알칼리제네스 피칼리스 subsp.(Alcaligenes feacalis subsp.)일 수 있다. 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae)는 클렙시엘라 뉴모니아에 subsp.(Klebsiella pneumoniae subsp.)일 수 있다. 보다 바람직한 니트릴라아제는 알칼리제네스 피칼리스(Alcaligenes feacalis) 니트릴라아제이다.

본 발명의 니트릴라아제는 니트릴라아제 P_887662[Gl:33600102, 2009년 5월 1일, 보르데텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica) RB50], AAA25057[GM49175, 1993년 4월 26일, 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae)], NP_943299[Gl:38639530, 2009년 4월 30일, 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae)], P10045[Gl: 115192, 2009년 1월 20일, 클렙시엘라 뉴모니아에 subsp.(Klebsiella pneumoniae subsp.) ozaenae], XP_001389617[Gl:145230706, 2008년 2월 28일, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)], ACS13754[Gl:239738518, 2009년 6월 15일, 알칼리제네스 종 ECU0401], BAA02684[Gl:216203, 16-FEB-2008, 알칼리제네스 피칼리스(Alcaligenes feacalis)], CAK46957[Gl: 134083480, 2007년 3월 24일, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)], EDV09642[Gl: 190406375, 2008년 6월 16일, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) RM11-1a], YP_001945058[Gl; 189349430, 2009년 5월 7일, 버콜데리아 멀티보란스(Burkholderia multivorans) ATCC 17616], NP_012102[Gl:6322027, 2008년 6월 16일, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) RM11-1a], 1F89B[Gl:16975400, 2001년 11월 19일, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)], NP_012409[Gl:6322335, 2009년 11월 5일, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)], EDN63257[Gl:151945002, 2007년 7월 13일, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) YJM789], EDN59257[Gl: 151940875, 2007년 7월 13일, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) YJM789], CAY80342[Gl:259147089, 2009년 9월 23일, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) EC1118], EEU05439[Gl:256270219, 2009년 8월 20일, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) JAY291] P40447[Gl:731891, 2009년 11월 3일, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)], XP_751200[Gl:70992703, 2008년 2월 27일, 아스퍼질러스 퍼미카터스(Aspergillus fumigatus) Af293], CAD71250[Gl:28950282, 2006년 11월 14일, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)], CAK48039[Gl:134075478, 2007년 3월 24일, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), CAR23067[Gl:238934886, 2009년 10월 8일, 라칸시아 데모톨러런스(Lachancea thermotolerans)], CAG86637[Gl:199431326, 2008년 9월 10일, 데바리오미세스 한세니(Debaryomyces hansenii)], XP_500602[Gl:50546150, 2008년 10월 29일, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)], CAG78819[Gl:49651877, 2008년 10월 23일, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)], CAG59341[Gl:49525722, 2008년 12월 16일, 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)], XP_454637[Gl:50309261, 2008년 4월 18일, 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis)], P20960[Gl:417386, 2009년 5월 5일, 알칼리제네스 피칼리스(Alcaligenes feacalis)] ABO46008[Gl: 134034945, 2009년 11월 5일, 로도코커스 로도크러스(Rhodococcus rhodochrous)], AAX18182[Gl:60280369, 2005년 3월 2일, 노카디아 sp.(Nocardia sp.) C-14-1], BAA02127[Gl:216932, 2008년 2월 16일, 로도코커스 로도크러스(Rhodococcus rhodochrous)], Q02068[Gl:417382, 2009년 1월 20일, 로도코커스 로도크러스(Rhodococcus rhodochrous)], CAK02877[Gl: 115259785, 2009년 5월 13일, 리조비움 레구미노사럼 bv.(Rhizobium leguminosarum bv.) 비시아에(viciae) 3841], CAF05970[Gl:40882143, 2009년 10월 10일, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)], CAK08726[Gl: 115257629, 2009년 5월 13일, 리조비움 레구미노사럼 bv.(Rhizobium leguminosarum bv.) 비시아에(viciae) 3841], BAD58116[Gl:54016746, 2008년 5월 10일, 노카디아 파시니카(Nocardia farcinica) IFM 10152], 및 Q5Z1 U0 [Gl:81603033, 2009년 11월 3일, 노카디아 파시니카(Nocardia farcinica)]를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 리스트는 서식 "Genbank accession number[Genbank Identifier, Date of database entry, species/strain]"를 활용하였다. 이러한 그룹의 니트릴라아제의 서열은 Genbank 어세션 번호, Genbank 아이덴티화이어(GI), Genbank 데이타베이스 엔트리의 날짜 및 서열이 획득된 종 및/또는 스트레인에 의해 확인될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "니트릴라아제"는 본 명세서에 개시된 니트릴라아제와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 어떠한 니트릴라아제를 포함한다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 예를 들어, BLAST 또는 PBLAST와 같은 아미노산 서열의 수준에 대한 동일성 정도의 측정을 위한 적절한 방법을 알고 있을 것이다.

상술한 바와 같이, 활성 니트릴라아제는 약 14 서브유닛으로 구성된 호모올리고머 효소일 수 있다. 본 발명에서, 숙주 세포의 표면에 디스플레이된 니트릴라아제는 3 이상의 동일한 서브유닛을 포함하는 호모멀티머일 수 있다. 특히, 상기 호모멀티머는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16의 동일한 서브유닛과 같은 7 내지 16의 동일한 서브유닛을 포함할 수 있다. 약 14 서브유닛의 수, 즉, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 서브유닛이 바람직하다. 호모멀티머(본 명세서에서 "호모올리고머(Homooligomers)"라고도 함)는 숙주 세포 멤브레인에 디스플레이된 여러 동일한 폴리펩타이드 서브유닛의 연속 결합에 의해 형성될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "니트릴"은 적어도 하나의 -CN 작용기(니트릴기)를 포함하는 어떠한 화합물을 지칭한다. 상기 니트릴은 또한 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 니트릴기를 포함할 수 있다.

상기 니트릴기는 6-14 탄소원자, 바람직하게 6-10 탄소원자를 함유하는 아릴기와 같은 방향족 부에 결합될 수 있다. 상기 아릴기는 1, 2 또는 3의 응축 방향족 고리를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 아릴기는 페닐기일 수 있다. 상기 아릴기는 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 치환체와 같은 1 이상의 치환체에 의해 치환될 수 있다.

상기 니트릴기는 1-8 탄소원자, 1-6 탄소원자, 1-4 탄소원자 또는 1-3 탄소원자를 포함하는 알킬기와 같은 지방족 부에 결합될 수 있다. 상기 알킬기는 직쇄 또는 분지형일 수 있다. 상기 알킬기는 시클릭 부를 포함할 수 있다. 상기 알킬기는 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 치환체와 같은 하나 이상의 치환체에 의해 치환될 수 있다.

상기 니트릴은 알킬 아릴 기를 포함할 수 있으며, 여기서 알킬 및 아릴은 본 명세서에 기재된 바와 같은 의미를 갖는다. 적어도 하나의 니트릴기는 알킬기 및/또는 아릴기에 결합될 수 있다. 알킬 및/또는 아릴부는 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 치환체와 같은 1 이상의 치환체에 의해 치환될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 하나 이상의 치환체는 독립적으로 -OH, 요오드, 브롬, 염소, 불소, 아릴, 알킬, 알콕시 등으로부터 선택될 수 있으며, 여기서 알킬 및 아릴은 본 명세서에 기재된 바와 같은 의미를 가지며, 알콕시는 1-8 탄소원자, 1-6 탄소원자, 1-4 탄소원자 또는 1-3 탄소원자를 포함한다. 바람직한 알콕시기는 메톡시이다. 상기 알콕시기는 직쇄 또는 분지형일 수 있다. 알콕시기는 시클릭 부를 포함할 수 있다.

상기 알킬기, 방향족기 및/또는 알콕시기는 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 헤테로원자와 같은 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하여, 적어도 하나의 헤테로원자가 탄소원자를 대체할 수 있다. 상기 헤테로원자는 독립적으로 N, O 및 S로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 니트릴라아제의 기질로서 사용되는 예시적인 니트릴은 만델로니트릴, 벤조니트릴, 페닐프로피오니트릴, 페닐기시노니트릴, 브로목시닐, 이옥시닐, 클로록시닐, 아니소니트릴, 3-브로모-4-히드록시벤조니트릴, 3-플루오로-4-히드록시벤조니트릴, 4-히드록시-3,5-디메토벤조니트릴 및 프루나신과 같은 방향족 니트릴; 및 n-부티로니트릴, n-발레로니트릴, 이소-부티로니트릴 및 숙시노니트릴과 같은 지방족 니트릴이다.

본 발명에 따르면, 알칼리제네스 피칼리스의 니트릴라아제를 위한 바람직한 기질은 만델로니트릴 및 프루나신이다. 클렙시엘라 뉴모니아에의 니트릴라아제를 위한 바람직한 기질은 브로목시닐, 이옥시닐, 클로록시닐, 아니소니트릴, 3-브로모-4-히드록시벤조니트릴, 3-플루오로-4-히드록시벤조니트릴 및 4-히드록시-3,5-디메토벤조니트릴이다. 사카로미세스 세레비지아에의 니트릴라아제를 위한 바람직한 기질은 벤조니트릴, 페닐프로비오니트릴, 만델로니트릴, 페닐글리시노니트릴, n-부티로니트릴, n-발레로니트릴, 이소부티로니트릴 및 숙시노니트릴이다.

본 발명의 일 견지로, 니트릴라아제를 암호화하는 유전자는 PCR에 의해 알칼리제네스 피칼리스의 전 DNA(whole DNA)로부터 증폭되고 클로닝된다. 상기 유전자는 PCR 프라이머에 부착된 적절한 제한효소 부위에 의해 오토트랜스포터의 리딩 프래임과 적절히 융합될 수 있다. 상기 융합 단백질의 발현은 표준 실험실 방법으로 이루어질 수 있다. 그 표면에서 발현되고 그 위에 고정된 상기 효소는 부가된 기질(이 경우에 라세믹 만델로니트릴)을 세포외적으로 전환시킬 수 있다.

현재 적용되고 있는 배양 및 발현 조건으로 5일 후에 약 50%, 바람직하게 약 60%, 보다 바람직하게 약 70% 그리고 보다 바람직하게 약 80%의 전환율이 이루어질 수 있다. 비대칭 C 원자를 갖는 화합물이 본 발명의 방법에 의해 거울상이성질체 과잉률로 생성될 수 있다. 산물에 대한, 특히 카르복시산에 대한 거울상이성질체 과잉률(%ee)은 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게 적어도 약 99% 또는 그 이상일 수 있다. 특히 (R)-만델산에 대해 키랄 HPLC에 의해 나타낸 바와 같이, 5일 후 약 80%의 전환율 및 99%이상의 거울상이성질체 과잉률(%ee)이 달성되었다.

본 명세서에 사용된 물질의 거울상이성질체 과잉률(ee)은 물질의 광학 순도의 척도이다. 거울상이성질체 과잉률은 분석하고자 하는 화합물의 용액에서 측정될 수 있다. 적절한 용매(소수성 및 친수성 용매와 같은) 및 이의 혼합물이 알려져 있다.

상기 거울상이성질체 과잉률은 하기 식에 의해 산출될 수 있다:

ee% = 100 * ([R] - [S]) / ([R] + [S])

상기 식에서 [R], [S]는 종의 농도를 나타내며; 그리고 여기서 R 및 S는 각각, (R)- 및 (S)-이성질체를 나타낸다. 따라서, 라세믹 혼합물, 즉, [R]=[S]에서, ee% = 100 * 0 / ([R] + [S]) = 0%, 즉, S에 대한 R의 초과는 없으며 또한 그 역도 마찬가지이다. 따라서, 라세막 혼합물의 거울상이성질체 과잉률은 0%이며, 거울상이성질체적으로 순수한 화합물의 거울상이성질체 과잉률은 100%이다. (R)- 및 (S)-이성질체의 농도는 이에 한저어하는 것은 아니나, 예를 들어, 혼합물의 고유 광회전도의 측정, 키랄 컬럼 크로마토그래피(예, 키랄 HPLC) 및 NMR 스펙트로스커피와 같이, 비대칭 C-원자를 갖는 화합물의 측정을 위한 어떠한 알려진 방법에 의해 검출될 수 있다.

본 명세서에 기재된 본 발명은 니트릴의 가수분해 도중에 온화한 반응 조건이 그 산물의 용이한 정제 방법과 함께 사용되는 이점을 가지며, 그 이유는 이러한 목적을 위해 세포는 반응 뱃치로부터 원심분리만 하면 되기 때문이다.

상기 니트릴라아제는 미생물에서 재조합적으로 발현되고 그 세포 표면에 이송될 수 있다. 미생물은 독립적으로 번식하고 상기 효소 자체를 생성하여, 바이오촉매의 정교한 정제가 더 이상 필요로 하지 않는다. 이러한 미생물에 대한 예는 본 명세서에 실시예 1에 기재된 이. 콜라이 스트레인이다.

본 명세서에 사용된 용어 "재조합(recombinant)"은 서로 자연적으로 연결되지 않은 적어도 두 핵산 서열을 서로 작동적으로 연결하여 이루어진 핵산 서열을 지칭한다. 상기 적어도 두 서열은 동일한 생물체로부터 획득될 수 있다. 예를 들어, 재조합 구조체는 알칼리제네스 종의 신호 서열 및 상기 신호 서열에 정상적으로 연결되지 않은 이와 동일한 알칼리제네스 종의 니트릴라아제 암호 서열을 포함할 수 있다. 상기 적어도 두 서열은 적어도 두 가지의 다른 생물체로부터 획득될 수 있다. 예를 들어, 이. 콜라이의 신호 펩타이드, 알칼리제네스의 니트릴라아제 유전자, 이. 콜라이의 트랜스멤브레인 링커 및 이. 콜라이의 오토트랜스포터 도메인이 작동적으로 연결될 수 있다. 다른 예는 신호 펩타이드가 콜레라 독소 β 서브유닛(CTB)로부터 유래되며, 오토트랜스포터 도메인 및 트랜스멤브레인 링커는 이. 콜라이로부터 기원하며, 그리고 니트릴라아제는 알칼리제네스로부터 유래된 재조합 폴리펩타이드이다.

본 발명의 바람직한 구현으로, 용어 "재조합적으로 발현(expressing recombinantly)"은 용어 "재조합 방식으로 발현(expressed in a recombinant manner)"와 동의어로 사용되며, 이는 재조합 핵산 서열의 발현을 지칭한다. 예를 들어, 이. 콜라이 또는 실제의 어떠한 생물체에서 이. 콜라이 신호 펩타이드 및 알칼리제네스 니트릴라아제 서열을 포함하는 핵산 서열의 발현은 재조합 발현을 구성한다.

상기 니트릴라아제는 오토트랜스포너의 트랜스포터 도메인에 융합되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 오토트랜스포터의 트랜스포터 도메인은 오토트랜스포터의 어떠한 트랜스포터 도메인일 수 있으며, 바람직하게 β-배럴 구조를 형성할 수 있는 것이다. β-배럴 구조의 상세한 설명 및 β-배럴 오토트랜스포터의 바람직한 예는 본 명세서에 참조로 편입된 WO97/35022에 개시되어 있다. Henderson 등(2004)dms 적절한 오토트랜스포터 도메인을 포함하는 오토트랜스포터 단백질에 대해 개시한 바 있다(요약에 대해 Henderson et al., 2004 참조). Henderson 등(2004)의 문헌은 본 명세서에 참조로 편입된다. 예를 들어, 오토트랜스포터의 트랜스포터 도메인은 Ssp(P09489, S. marcescens), Ssp-h1(BAA33455, S. marcescens), Ssp-h2(BAA11383, S. marcescens), PspA(BAA36466, P. fluorescens), PspB(BAA36467, P. fluorescens), Ssa1(AAA80490, P. haemolytica), SphB1(CAC44081, B. pertussis), AspA/NalP(AAN71715, N. meningitidis), VacA(Q48247, H. pylon), AIDA-I(Q03155, E. coli), IcsA(AAA26547, S. flexneri), MisL(AAD16954, S. enterica), TibA(AAD41751, E. coli), Ag43(P39180, E. coli), ShdA(AAD25110, S. enterica), AutA(CAB89117, N. meningitidis), Tsh(I54632, E. coli), SepA(CAC05786, S. flexneri), EspC(AAC44731, E. coli), EspP(CAA66144, E. coli), Pet(AAC26634, E. coli), Pic(AAD23953, E. coli), SigA(AAF67320, S. flexneri), Sat(AAG30168, E. coli), Vat(AAO21903, E. coli), EpeA(AAL18821, E. coli), EatA(AA017297, E. coli), Espl(CAC39286, E. coli), EaaA(AAF63237, E. coli), EaaC(AAF63038, E. coli), 퍼탁틴(Pertactin)(P14283, B. pertussis), BrkA(AAA51646, B. pertussis), Tef(AAQ82668, B. pertussis), Vag8(AAC31247, B. pertussis), PmpD(084818, C. trachomatis), Pmp20(Q9Z812, C. pneumoniae), Pmp21(Q9Z6U5, C. pneumoniae), lgA1 프로테아제(NP_283693, N. meningitidis), App(CAC14670, N. meningitidis), lgA1 protease(P45386, H. influenzae), Hap(P45387, H. influenzae), rOmpA(P15921, R. nckettsii), rOmpB(Q53047, R. rickettsii), ApeE(AAC38796, S. enterica), EstA(AAB61674, aeruginosa), Lip-1(P40601, X. luminescens), McaP(AAP97134, M. catarrtialis), BabA(AAC38081, H. pylon), SabA(AAD06240, H. pylon), AlpA(CAB05386, H. pylon), Aae(AAP21063, A. actinomycetemcomitans), NanB(AAG35309, R. haemolytica), 및 이러한 오토트랜스포터의 변이체로부터 선택될 수 있다. 상기 각 예시적인 오토트랜스포터 단백질들에 대해 괄호안에 주어진 것들은 상기 오토트랜스포터가 획득될 수 있는 적절한 Genbank 어세션 번호의 예 및 종이다. 바람직하게 상기 오토트랜스포터의 트랜스포터 도메인은 예를 들어, Niewert U., Frey A., Voss T., Le Bouguen C, Baljer G., Franke S., Schmidt MA에 의해 기재된 바와 같은 이. 콜라이 AIDA-I 단백질 또는 이의 변이체이다. 상기 AIDA 오토트랜스포터 시스템은 이. 콜라이 분리물의 F18 및 Stx2e(Pigs Diagnosed with Edema Disease and Postweaning Diarrhea. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2001 Jan, 8(1):143-149;9)와 관련된다.

상기 오토프랜스포터 서열의 변이체들은 예를 들어 트랜스멤브레인 부의 일부가 아닌 β-배럴의 루프 구조로 상기 아미노산 서열을 변환시킴으로써 획득될 수 있다. 선택적으로, 상기 표면 루프를 암호화하는 핵산 부는 완전히 결실될 수 있다. 더욱이, 보존 아미노산 교환, 즉, 친수성 아미노산의 다른 친수성 아미노산으로의 교환 및/또는 소수성 아미노산의 다른 소수성 아미노산으로의 교환이 양친매성 β-시트 내에서 일어날 수 있다. 바람직하게, 변이체는 오토트랜스포터 도메인의 각 네이티브 서열에 대해, 특히 β-시트 범위 내에서, 아미노산 수준으로 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는다.

바람직하게, 본 발명의 방법의 단계 (i)은

(a) 발현 조절 서열과 작동적으로 연결된 핵산 서열을 포함하며, 상기 핵산 서열은

(1) 신호 펩타이드를 암호화하는 부분(portion);

(2) 디스플레이되는 재조합 니트릴라아제를 암호화하는 부분;

(3) 선택적으로 프로테아제 인지 부위를 암호화하는 부분;

(4) 트랜스멤브레인 링커를 암호화하는 부분; 및

(5) 오토트랜스포터의 트랜스포터 도메인을 암호화하는 부분

을 포함하는, 미생물을 제공하는 단계,

(b) (a)의 핵산 서열이 발현되고, 상기 핵산 서열의 발현 산물이 상기 미생물의 표면에 디스플레이되는 조건하에서 상기 미생물을 배양하는 단계

를 포함한다.

당해 기술분야의 통상의 기술자라면 상기 핵산 서열이 발현되는 조건을 고안할 수 있을 것이며, 이는 단지 예를 들면, 다양한 온도, 배지, 세포 밀도 및/또는 발현을 유도하는 화학물질의 농도를 시험하는 통상적인 실험을 포함한다.

단계 (a)에 따라 제공되는 미생물은 발현 조절 서열과 작동적으로 연결된 핵산 서열을 이용한 형질변형에 의해 획득될 수 있으며, 여기서 상기 핵산은

(1) 신호 펩타이드를 암호화하는 부분,

(3) 선택적으로 프로테아제 인지 부위를 암호화하는 부분;

(4) 트랜스멤브레인 링커를 암호화하는 부분; 및

을 포함하며,

여기서, 상기 구성요소 (1) 내지 (5)는 하기에 기재되는 핵산 서열이다.

어느 알려진 방법의 형질변형이 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "형질변형(transformed)"은 바람직하게 이종 구조물을 세포, 바람직하게는 박테리아 세포 내로 도입하는 것을 가리키며, 이는 이후에 형질변형되는 것으로 칭하여진다. 당해 기술분야의 숙련자라면 예를 들어, 일렉트로트랜스포메이션 또는 화학적 컴피턴트 세포의 형질변형과 같이 형질변형 프로토콜 및 절차에 대해 알 수 있을 것이다.

다른 구현으로, 본 발명의 방법은 (b)의 미생물로부터 멤브레인 제조물을 제조하는 단계 (c)를 더 포함한다.

본 발명에 사용되는 멤브레인 제조물은 촉매 활성적인 니트릴라아제를 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "멤브레인 제조물(membrane preparation)"은 바람직하게 멤브레인 성분이 풍부한 산물을 지칭한다. 당해 기술분야의 통상의 기술자라면 멤브레인 제조물을 획득하는데 사용될 수 있는 프로토콜 및 절차에 익숙할 것이다. 예를 들어, 박테리아 세포는 배양물로부터 수거되고, 예를 들어, 동결-융해 사이클, 초음파처리, 용해 버퍼에서의 재현탁 등의 수단으로 용해한 후, 이를 차등 원심분리하여 세포의 멤브레인 분획을 분리함으로써 멤브레인 제조물을 얻을 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현으로, 상기 멤브레인 제조물은 외부 멤브레인 제조물, 즉, 사이토졸, 내부 멤브레인 및 페리플라즘과 같은 다른 멤브레인 및 컴파트먼트의 성분들에 비해 외부 멤브레인의 성분이 풍부한 제조물이다. 당해 기술분야의 통상의 기술자라면 예를 들어, 박테리아 세포의 라이소자임 처리 및 후속적인 원심분리 단계와 같이 외부 멤브레인을 분리하는데 사용될 수 있는 프로토콜 및 절차에 익숙할 것이다. 본 발명의 바람직한 구현으로, 상기 멤브레인 제조물은 촉매 활성적인 니트릴라아제를 포함하는 외부 멤브레인 제조물이며, 이 멤브레인 제조물은 사이토졸에서 상기 니트릴라아제를 합성하고 후속적으로 이를 외부 멤브레인으로 이송하는 세포에서 만들어진 것이다. 다른 구현으로, 상기 멤브레인 제조물은 예를 들어, 니트릴라아제 융합 단백질과 같은 멤브레인 단백질을 인공 소낭에 도입함으로써 적절히 처리될 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 기술자라면 예를 들어, 적절한 디터전트를 사용하여 소낭에 멤브레인 단백질을 기능적으로 재구성하는 방법을 알 수 있을 것이다.

본 발명의 방법의 단계 (a)는 미생물의 제공에 관한 것이다. 상기 미생물은 본 명세서에 기재된 어떠한 미생물일 수 있다. 단계 (a)에서, 숙주 세포, 특히 숙주 박테리아는 발현 조절 서열, 즉, 프로모터와 작동적으로 연결된 핵산 서열 및 선택적으로 각 숙주 세포에서 유전자 발현에 필요한 추가 서열을 포함하는 것으로 제공된다. 본 명세서에 사용된 "발현 조절 서열과 작동적으로 연결된 핵산 서열(nucleic acid sequence operatively linked with an expression control sequence)"은 발현 조절 서열과 핵산 서열의 기능적 관계를 가리킨다. 당해 기술분야의 통상의 기술자라면 적절한 프로모터 및 발현 조절 서열을 알 수 있을 것이다. 상기 프로모터 및/또는 발현 조절 서열은 숙주 세포에 동종 또는 이종성일 수 있다.

바람직하게, 상기 핵산 서열은 재조합 벡터, 예를 들어, 플라스미드 벡터에 위치한다.

단계 (a)에 따른 핵산 서열은 (1) 내부 세포 멤브레인을 통해 주변세포질 내로 수송되도록 하는, 신호 펩타이드를 암호화하는 부분, 바람직하게는 그람 음성 신호 펩타이드를 암호화하는 부분을 포함한다. 상기 신호 펩타이드는 숙주 세포에 동종인 신호 펩타이드일 수 있다. 상기 신호 펩타이드는 또한 숙주 세포에 이종인 신호 펩타이드일 수 있다.

또한, 상기 핵산 서열은 (2) 디스플레이되는 니트릴라아제를 암호화하는 부분("=패신저 폴리펩타이드" 또는 "패신저")을 포함한다. 본 명세서에 기재된 어떠한 니트릴라아제를 암호화하는 핵산이 사용될 수 있다.

상기 핵산 서열은 선택적으로 (3) 프로테아제 인지 부위를 암호화하는 부분을 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "프로테아제 인지 부위(protease recognition site)"는 프로테아제 인지 부위에 의해 표시된 아미드 결합의 가수분해에 의해 폴리펩타이드를 후속적으로 분할하는 특이적 프로테아제에 의해 인지되는 특정 아미노산 서열을 지칭한다. 상기 프로테아제 인지 부위는 고유 프로테아제, 즉, 숙주 세포에서 자연적으로 발생하는 프로테아제 또는 외부적으로 부가된 프로테아제에 대한 인지 부위일 수 있다. 예를 들어, 외부적으로 부가된 프로테아제는 IgA 프로테아제(cf. EP-A-0 254 090), 트롬빈 또는 팩터 X일 수 있다. 고유 프로테아제는 예를 들어, OmpT, OmpK 또는 프로테아제 X로부터 선택될 수 있다. 프로테아제 인지 부위는 숙주 세포에 동종성일 수 있다. 상기 프로테아제 인지 부위는 또한 숙주 세포에 이종성일 수 있다.

또한, 상기 핵산 서열은 숙주 세포의 외부 멤브레인의 표면에 (4) 패신저 폴리펩타이드, 즉, 재조합 니트릴라아제 (2)의 프리젠테이션에 필요한 트랜스멤브레인 링커를 암호화하는 부분을 포함한다. 트랜스멤브레인 링커 도메인은 오토트랜스포터에 대해 동종성인 것이 사용될 수 있으며, 즉, 상기 트랜스멤브레인 링커 도메인은 오토트랜스포터 도메인을 암호화하는 핵산 서열의 5' 말단에 직접 융합된 핵산 부분에 의해 암호화된다. 또한, 상기 오토프랜스포터에 대해 이종성인 트랜스멤브레인 링커 도메인이 사용될 수 있다. 상기 트랜스멤브레인 링커의 길이는 바람직하게 30-160 아미노산이다.

또한, 상기 핵산 서열은 (5) 오토트랜스포터의 트랜스포터 도메인을 암호화하는 부분을 포함한다. 본 발명의 정황상, 오토디스플레이는 어떠한 그람 음성 박테리아에서 오토트랜스포터에 의한 단백질 또는 폴리펩타이드의 재조합 표면 디스플레이일 수 있다. 상기 트랜스포터 도메인은 본 명세서에 기재된 어떠한 트랜스포터 도메인일 수 있다.

본 발명의 핵산 서열에서 성분 (1) 내지 (5)는 바람직하게 5' 에서 3'로 배향된다. 단계 (b)에서 획득된 산물의 발현시, 핵산 서열 (1) 내지 (5)로 암호화된 아미노산 서열은 바람직하게 N 말단에서 C 말단으로 배열된다.

본 발명의 방법의 단계 (b)는 단계 (a)의 핵산 서열이 발현되고, 재조합 니트릴라아제를 포함하는 발현 산물이 미생물의 표면에서 디스플레이되는 조건하에서 미생물을 배양하는 것에 관한 것이다. 당해 기술분야의 통상의 기술자라면 적절한 배양 조건을 알 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 방법은 미생물, 특히 이. 콜라이 또는 다른 그람 음성 박테리아 세포의 표면에 하기 조성의 액체 배지를 이용하여 세포 당 최대 100,000 이상의 분자의 패신저 단백질의 효과적인 발현을 가능하게 한다: 5g/l 내지 20g/l, 바람직하게 약 10g/l 트립톤, 2g/l 내지 10g/l, 바람직하게 약 5g/l 이스트 추출물, 5g/l 내지 20g/l, 특히 약 10g/l NaCl 및 나머지 부의 물. 상기 배지는 가능한 가장 적은 양의 이가 양이온을 함유하여야 하며, 따라서 바람직하게, 예를 들어 밀리포어(Millipore) 물과 같이 아쿠아 비데스트(Aqua bidest) 또는 고정제수가 사용된다. 상기 액체 배지는 또한 바람직하게 2μM 내지 20μM, 특히 10μM의 농도로 EDTA를 함유할 수 있다. 더욱이, 이는 바람직하게, 2-머캅토 에탄올 또는 디티오트레이톨 또는 디티오에리트리톨과 같은 환원제를 2mM 내지 20mM의 바람직한 농도로 함유할 수 있다. 상기 환원제는 이송중 상기 폴리펩타이드의 논폴딩 구조에 호의적이다. 또한, 상기 액체 배지는 분비, 즉, 상기 패신저이 주변 배지로의 이송에 호의적이기 위해, 부가적인 C-공급원, 바람직하게 글루코즈를 예를 들어, 최대 10g/l의 양으로 함유할 수 있다. 표면 디스플레이를 위해, 바람직하게 부가적인 C-공급원이 첨가되지 않는다. 이. 콜라이와 같은 그람 음성 세포에 대한 바람직한 배양 조건은 실시예에 기재된다.

단계 (ii)는 호기 조건 및/또는 산화 조건하에서 수행될 수 있다. 바람직한 구현으로, 용어 "호기 조건(aerobic conditions)"은 산소의 존재로 특성화된 조건을 지칭한다. 다른 바람직한 구현으로, 용어 "호기 조건"은 주어진 온도 및 액체에 대해 일반적인 수준과 비교하여 증강된 수준의 산소의 존재를 지칭한다. 다른 바람직한 구현으로, 용어 "호기" 조건은 예를 들어, 액체 배지와 같은 액체와 예를 들어, 공기와 같은 산소를 포함하는 주변 기체 환경 과의 증강된 기체 교환으로 특성화된 조건을 지칭한다. 당해 기술분야의 통상의 기술자라면 예를 들어, 적절한 산소-민감성 전극의 사용을 통해 산소 수준을 측정할 수 있을 것이다. 더욱이, 당해 기술분야의 통상의 기술자라면, 예를 들어, 공기 또는 산소와 함께 버퍼 또는 배지를 플러싱하거나, 산소-방출 화학물질을 첨가하거나 또는 단순히 산소 또는 공기의 존재하에서 이러한 버퍼 또는 배지를 격렬히 흔듬으로써 호기 조건을 형성할 수 있을 것이다. 반면에, 당해 기술분야의 통상의 기술자라면 예를 들어, 아르곤 또는 질소와 함께 배지 또는 버퍼를 격렬히 플러싱하거나, 또는 기체 교환을 최소화하기 위해 배양 용기를 밀봉함으로써 혐기 조건을 형성할 수 있을 것이다.

바람직한 구현으로, 본 명세서에 사용된 용어 "산화 조건(oxidising conditions)"은 배지 또는 버퍼에 산화제의 첨가 또는 산화제의 존재, 즉, 효소가 산화되기 쉽도록 다른 화학물질이 전자를 방출하도록 하는 화학물질의 첨가 또는 존재를 지칭한다. 예를 들어, 환원된 레독스 효소는 산소의 존재하에서 산화되는 경향이 있다. 반면에, 본 명세어세 사용된 용어 "환원(reducing)" 또는 "환원 조건(reducing conditions)"은 배지 또는 버퍼에 환원제의 첨가 또는 환원제의 존재, 즉, 다른 화학물질이 전자를 취득하도록 하는 화학물질의 첨가 또는 존재를 지칭한다. 당해 기술분야의 통상의 기술자라면 예를 들어, 산소와 같은 산화제의 첨가 및 예를 들어, 머캅토에탄올 또는 DTT와 같은 티올 시약과 같은 환원제의 첨가를 통해 선택된 레독스 환경을 설정할 수 있을 것이다. 더욱이, 당해 기술분야의 통상의 기술자라면 예를 들어, 레독스 전극의 사용을 통해 용액의 레독스 포텐셜을 측정할 수 있을 것이다.

이. 콜라이와 같은 그람 음성 박테리아 숙주 세포에서, 재조합 패신저의 전위 후, 상기 패신저는 β-배럴에 의해 외부 멤브레인의 표면에 부착된 채로 잔존하며, 이는 외부 멤브레인 내에 앵커로 작용한다. 외부 멤브레인 내에 β-배럴의 조절된 통합에 기인하여, β-배럴의 C 말단부는 외부 멤브레인의 내부면으로 배향하고, 반면에 재조합 패신저 단백질이 공유결합된 링커의 N 말단부는 외부 멤브레인의 외표면, 즉, 환경으로 배향한다.

단계 (b)는 미생물로부터 멤브레인 제조물을 제조하는 것에 관한 것이다. 멤브레인 제조물을 얻는 적절한 방법은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.

본 명세서에 사용되는 멤브레인 제조물은 바람직하게 외부 멤브레인 제조물이다.

본 발명의 방법의 단계 (ii)는 상기 미생물 및/또는 이의 멤브레인 제조물을 니트릴라아제 활성과 호환적인 조건하에서 하나 이상의 니트릴라아제 기질과 접촉시키는 것과 관련된다. 상기한 바와 같이, 바람직한 구현으로, 단계 (ii)는 상기 미생물 및/또는 이의 멤브레인 제조물을 니트릴라아제 활성과 호환적인 조건하에서 하나 이상의 니트릴라아제 기질과 접촉시키는 것과 관련되며, 여기서 상기 니트릴라아제는 니트릴을 카르복시산 형태로 형성하는 전환을 촉매한다. 당해 기술분야에 알려진 어떠한 적절한 조건이 사용될 수 있다. 특히, 상기 반응은 액체 배지에서 수행된다. 액체 배지에서, 상기 미생물은 현탁액을 형성할 수 있다. 또한, 상기 미생물은 고정화될 수 있다. 멤브레인 제조물이 사용될 경우, 그 멤브레인 제조물은 액체 배지에 분산될 수 있는 입자를 형성할 수 있다. 그 반응은 약 5.0-9.0, 바람직하게 약 6.0-8.0 및 보다 바람직하게 약 6.5-7.5 범위의 pH에서 수행될 수 있다.

본 발명의 방법의 단계 (iii)는 단계 (ii)에서 사용된 미생물의 회수와 관련된다. 본 발명의 실시예에 의해 입증된 바와 같이, 예를 들어 24시간 동안의 반응 사이클 후, 박테리아 세포는 여전히 현저한 활성을 나타낸다. 따라서, 상기 세포는 추가 반응 사이클에 이용될 수 있다. 회수는 반응 혼합물의 원심분리에 의해 수행될 수 있다. 필요에 따라, 세포는 세정될 수 있다.

본 발명의 다른 견지는 그 표면에 니트릴라아제를 발현하는 미생물 및/또는 이의 멤브레인 제조물을, 니트릴라아제 의해 촉매되는 반응의 산물, 특히, 카르복시산의 제조를 위해 사용하는 용도에 관한 것이다. 생성된 카르복시산은 만델산, 특히 (R)-말델산이 바람직하다.

본 발명의 다른 견지는 그 표면에 재조합 니트릴라아제를 발현하는 미생물에 관한 것으로, 여기서 상기 미생물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 미생물이며, 그리고 상기 니트릴라아제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 니트릴라아제이다. 특히, 상기 미생물은 그 표면에 오 신호 펩타이드, 재조합 니트릴라아제, 선택적인 프로테아제 인지 부위, 트랜스멤브레인 링커 및 오토트랜스포터의 트랜스포터 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 디스플레이하며, 여기서 융합 단백질의 성분은 본 명세서에 기재된 바와 같다.

본 발명의 다른 견지는 니트릴라아제를 포함하는 멤브레인 제조물에 관한 것이다. 상기 멤브레인 제조물은 예를 들어, 본 발명의 방법의 단계 (c)에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 미생물로부터 획득될 수 있다. 상기 니트릴라아제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 어떠한 니트릴라아제일 수 있다.

본 발명의 다른 견지는 미생물에 핵산 서열을 도입하는 것을 포함하는, 그 표면에 재조합 니트릴라아제를 디스플레이하는 미생물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 핵산 서열은

(1) 신호 펩타이드를 암호화하는 부분,

(3) 선택적으로 프로테아제 인지 부위를 암호화하는 부분;

(4) 트랜스멤브레인 링커를 암호화하는 부분; 및

을 포함하며,

여기서, 상기 핵산은 발현 조절 서열과 작동적으로 연결된다. 여기서, 상기 구성요소 (1) 내지 (5)는 상기에 기재된 바와 같은 핵산 서열이다. 상기 미생물은 박테리아, 구체적으로 그람 음성 박테리아, 보다 구체적으로 이. 콜라이와 같이 본 명세서에 기재된 어떠한 미생물일 수 있다. 상기 니트릴라아제는 본 명세서에 기재된 어떠한 니트릴라아제일 수 있다. "미생물에 핵산을 도입하는 것(introducing a nucleic acid into said microorganism)"은 본 명세서에 기재된 형질변형을 포함한다.

본 발명은 하기 도면 및 실시예를 통해 더욱 상세히 설명되나, 본 발명의 범위로 이에 한정하려는 것은 아니다.

실시예

하기 실시예는 본 발명자들이 다른 생물체로부터 3가지 니트릴라아제 유전자를 동정하고, 상기 유전자를 오토디스플레이 시스템에 클로닝할 수 있었음을 입증한다.

실시예 1: 알칼리제네스 피칼리스의 니트릴라아제

전 세포 바이오촉매는 대량 생성을 위해 그리고 특히 부분 합성이나 거울상 선택성 합성이 필요한 경우 희귀한 화학물질의 생성을 위해 매력적인 기술적 수단이다. 본 시험에서, 기질로서 만델로니트릴을 사용하여 (R)-만델산의 합성을 위한 전 세포 바이오촉매가 제조되었다. 이러한 목적을 위해, 알칼리제네스 피칼리스 subsp. 피칼리스 ATCC 8750의 니트릴라아제가 오토디스플레이를 사용하여 에스케리챠 콜라이(이. 콜라이)의 표면에서 발현되었다. 상기 오토디스플레이 시스템은 그람 음성 박테리아를 위한 강력한 표면 디스플레이 시스템이며, 오토트랜스포터 경로에 기초한다. 이러한 기술을 이용하여, 이. 콜라이의 표면에 활성 형태로 멀티 등가 동의(multihomomeric) 니트릴라아제를 발현시킬 수 있었으며, 거울상이성질체적으로 순수한 (R)-만델산을 99%이상의 거울상이성질체 과잉률로 생성할 수 있었다. 외부 멤브레인에 니트릴라아제-오토트랜스포터 융합 단백질의 통합은 SDS-PAGE에 의해 모니터되었으며, 상기 효소의 표면 노출은 프로테아제 접근성 시험에 의해 증명될 수 있었다. 최적화된 조건하에서 소규모 생체내 변화로 OD₅₇₈의 박테리아 현탁액(1ml)으로 24시간 내에 2.6mM의 (R)-만델산을 생성할 수 있었다.

멀티 등가 동의 효소를 위한 모델로서, 알칼리제네스 피칼리스 subsp. 피칼리스 ATCC 8750의 니트릴라아제가 사용되었다.

상기 니트릴라아제는 전 세포 분해 중에 프로테아제 분할에 접근가능하였으며, 벤즈알데히드에 대하여 그 프리 효소(free enzyme)와 동일한 기질 저해도를 나타내었다.

결과

융합 단백질 제작

공개 서열 데이타로부터 추정된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 니트릴라아제 유전자를 알칼리제네스 피칼리스 subsp. 피칼리스 ATCC 8750의 게놈 DNA로부터 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시켰다(실험 섹션 참조). 오토디스플레이를 위해 필요한 오토트랜스포터 도메인에 대한 프래임에 상기 니트릴라아제의 융합에 요구되는, 니트릴라아제 암호화 부위의 5' 말단의 XhoI 사이트 및 3' 말단의 KpnI 사이트에 PCR 프라이머를 첨가하였다. 벡터 백본으로서, 오토트랜스포터 프래임워크를 암호화하는 pET-Adx를 기존에 기재된 바와 같이 사용하였다(Jose, 2001). 그 결과 형성된 PCR 산물을 XhoI / KpnI 분할된 pET-Adx 내로 결찰시켰으며, 이는 이전의 Adx 패신저를 대체하여 pAT-NitAf를 제공하였다. 그 결과 형성된 오토트랜스포터 융합 단백질은 신호 펩타이드, 패신저로서 니트릴라아제, 트랜스멤브레인 링커 및 β-배럴을 함유하는 전형적인 구조를 나타낸다(도 1). 콜레라 독소 β 서브유닛(CTB)으로부터 유래된 신호 펩타이드가 내부 멤브레인을 통한 이송에 사용된다. 외부 멤브레인을 통한 패신저의 전위를 위한 β-배럴(오토트랜스포터의 트랜스포터 도메인) 및 전 표면 접근을 이루기 위한 연결 부위(트랜스멤브레인 링커)는 AIDA-I(Jose, 2001)로부터 기원하였다.

그 결과 형성된, pAT-NitAf에 의해 암호화된 성숙 융합 단백질은 상기 신호 펩티다아제에 의한 프로세싱 후 약 90kDa의 예측 분자량을 갖는다. pAT-NitAf는 디스플레이된 니트릴라아제의 분할을 저해하는 OmpT 음성 돌연변이인 이. 콜라이 BL21(DE3) 내로 형질변형되었다. 이 스트레인은 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf으로 명명되었다.

니트릴라아제 오토트랜스포터 융합 단백질의 발현

이러한 인공 융합 단백질의 단백질 생합성은 상기 실험 섹션에 따라 1mM IPTG의 첨가에 의해 시작되었다. 상기 니트릴라아제가 세포의 표면 또는 주변 세포질에 완전히 노출되는지 조사하기 위해, 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf의 온전한 세포(intact cell)를 이용한 전 세포 분해를 수행하였다. 이. 콜라이의 외부 멤브레인은 프로테아제 K 또는 트립신과 같은 프로테아제에 대해 투과가능하지 못하기 때문에, 외부적으로 첨가된 프로테아제에 의한 단백질 분해는 이의 표면 노출에 기인한 것에 틀림없다. 그 발현 및 전 세포 분해를 소듐 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)로 모니터하였다. 쿠마시 브릴리언트 블루로 후속적인 염색을 한 결과, 프로테이나아제 K의 첨가는 상기 융합 단백질 밴드의 상당한 감소를 일으킨 것으로 나타났다(도 2).

분석된 세포의 보전성에 대해 민감한 마커는 Omp F/C 및 OmpA의 단백질 밴드의 강도이다. 분해된 시료 및 분해되지 않은 시료에서 두 Omp 밴드의 비율은 quss화가 없어야 한다. 만일 OmpA의 밴드가 사라진 경우에, 그 외부 멤브레인은 구멍이 생긴 것이며 OmpA의 주변 세포질 부는 프로테이나아제 K에 의해 분해되었다. 본 실험에서, OmpA의 크기 및 양은 프로테이나아제 처리된 세포 및 프로테이나아제 처리되지 않은 세포에서 동일하였다.

요약하면, 본 발명자들은 거의 모든 패신저 효소가 상기 박테리아 표면에 노출된 것으로 결론지을 수 있다.

표면 디스플레이된 니트릴라아제의 효소 활성

상기 pAT-NitAf 플라스미드를 갖는 이. 콜라이 BL21(DE3)을 분석하기 위해, 이를 1ml의 총 부피로 50mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.5)에서 578nm(OD₅₇₈)의 광학 밀도로 조절하였다. 상기 효소는 히드록시니트릴에 기질-특이성을 나타내는 것으로 기술되었기 때문에, 라세믹 만델로니트릴이 기질로서 10mM의 최종 농도로 사용되었다. 생물전환(bioconversion)을 HPLC에 의해 분석하고, 생성된 만델산을 산출하였다. 제1 생물전환은 OD₅₇₈ 0.5에서 IPTG로 유도된 세포를 이용하여 수행되었다. 이는 72시간의 생물전환 후 2.1mM 만델산의 생성을 일으켰다. 추가 120시간까지의 배양은 생성되는 만델산의 추가 증가를 일으키지 않았다. 생물전환은 1의 OD₅₇₈에서 IPTG를 이용한 유도에 의해 2배로 현저히 향상될 수 있다. 이러한 변형으로 생물전환은 72시간에 수평으로 유지되지 못하였으나, 반면에 120시간의 관찰 기간 중에 총 6.6mM 만델산으로 증가하였다(도 3). 첨가된 기질의 양은 만델로니트릴의 분해에 의해 자발적으로 형성된 프리 벤즈알데히드(Yamamoto et al., 1992)에 의해 야기된 효소 저해의 발생에 기인하여 제한되었다.

만델로니트릴의 만델산으로의 전환

HPLC 방법은 산물(만델산)으로부터 기질(만델로니트릴)을 분리하고 이를 검출하기 위해 사용되었다. 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf를 이용하여, 만델로니트릴의 만델산으로의 전환을 확인하였다(도 10). 또한, HPLC 분석은 수성 시스템에서 만델로니트릴이 예측대로 벤즈알데히드(+HCN)와 평형적으로 존재함을 보여주었다(도 10). 여러 반응 파라미터의 적응은 10의 OD₅₇₈의 세포 현탁액을 사용한 경우, 5mM의 기질 농도로부터 시작하여 120시간 후에, 시료 1ml 당 0.36mg의 질량에 해당되는 2.4mM의 생성물 농도를 형성하였다.

거울상이성질체 과잉

다음 단계는 생성된 만델산의 거울상이성질체 과잉을 입증하기 위한 것이다. 이러한 목적으로 만델산은 에틸아세테이트를 이용하여 용매 추출에 의해 수성 버퍼로부터 추출하였다. 추출된 만델산을 메탄올에 용해하고, 직접 키랄 HPLC 분석에 사용하였다. 거울상이성질체 과잉률(ee)은 37℃에서 생물전환에 대해 ee>99% 인 것으로 측정되었다(도 4 및 15A). 이는 에이. 피칼리스의 표면 디스플레이된 니트릴라아제가 높은 거울상이성질체 순도로 (R)-만델산을 생성할 수 있음을 보여준다. 도 15A로부터 만델산의 (R)-거울상이성질체의 체류 시간의 거의 독점적인 피크 특성이 검출가능하였음을 분명히 알 수 있다. 산출된 거울상이성질체 순도는 99% 이상이었다. 도 15B는 도 15A의 전환율을 이용한 순수 (R)- 및 (S)-거울상이성질체의 스파이킹에 의해 측정된 (R)-만델산의 아이덴티티를 보여준다.

pH 최적 조건

알칼리제네스 피칼리스 니트릴라아제의 pH 최적 조건은 기존에 pH 7.5인 것으로 공개된 바 있으나, 본 발명자들은 상기 표면 노출에 기인하여 이러한 pH 최적 조건에서의 변화가 있었는지를 조사하였다. 상기 세포들을 아세테이트 버퍼 또는 Tris-HCl 버퍼(모두 50mM)에 최종 10의 OD₅₇₈로 재현탁시켰다. 37℃에서 120시간 배양 후, 그 상층액을 HPLC로 분석하고, 만델산의 전환된 양을 산출하였다. 본 발명자들은 5.5mM 만델산의 전환율로 pH 7에서 pH 최적 조건을 측정하였다. pH 7 내지 pH 8 사이에서 강한 활성 손실이 검출가능하였다. 추가적으로 조사한 pH 7.5의 포스페이트 버퍼는 다른 동일한 조건하에서 단지 4.4mM 만델산의 전환율을 형성하였다(데이타로 나타내지 않음)(도 5).

반응 온도 및 pH 값의 최적화로 24시간 내에 최대 2.6mM 만델산으로의 전환이 가능하였다. 만델라미드는 어느 시점에서도 검출될 수 없었다.

동역학

일련의 실험으로 만델산 생성에 대한 이들의 영향에 대해 여러 파라미터들을 실험실 스캐일로 분석하였다. 도 12는 상이한 온도에서 만델산 생성의 동역학을 나타낸다. 37℃에서, 생성물 농도는 30℃에서의 전환과 비교하여 약 20% 증가한 것으로 검출되었다. 30℃ 및 37℃ 모두에서의 전환 진행은 또한, 생성된 만델산의 농도가 약 144시간의 전환 후에 단지 서서히 증가하는 것으로 나타났다.

기질 농도

또한, 만델산의 생성에 미치는 기질 농도의 영향을 분석하였다. 수용액에서, 기질 만델로니트릴은 벤즈알데히드 및 HCN과 평형으로 존재한다. 그러나, 과잉 농도에서 벤즈알데히드는 세포에 독성적인 영향을 나타내어, 이에 따라 도 13에 나타낸 바와 같이 기질 농도의 증가는 제한된다. 니트릴 농도의 10mM 이하로의 추가 감소는 생성 속도의 추가 증가를 일으키지 못하며, 이는 최적 기질 농도로서 10mM 만델로니트릴의 사용을 제시해 준다.

상이한 버퍼 시스템

또한, 상이한 버퍼 시스템을 이용하여 전 세포 촉매 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf를 이용한 만델산 생성의 비교 시험을 수행하였다. 도 14는 사용된 어떠한 다른 버퍼에 비하여 pH 6.5의 Tris-완충 용액을 이용하여 최적 결과가 도출되었음을 보여준다.

저장 안정성

제조된 전 세포 바이오촉매의 저장 안정성을 측정하기 위해, 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf의 IPTG-유도 세포가 20%(vv-1) 글리세롤을 함유한 50mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.5)에 50의 OD₅₇₈로 적용되고, -18℃에 보관하였다. 세포의 용해를 방지하기 위해 항동결제로서 글리세롤을 -18℃의 상기 시료에 첨가하였다. 상이한 시간 간격 시료들을 포스페이트 버퍼에서 1회 세정하고 10의 OD₅₇₈로 조절하였다. 변형적으로, IPTG 유도 후에 세포 분액을 6℃ 냉장고에 보관하고, 상이한 보관 시간 후에 니트릴라아제를 분석하였다. 반응은 10mM 만데로니트릴의 첨가에 의해 시작되었으며, 그 시료를 37℃에서 120시간 배양하였다. -18℃에서 35일간 보관한 후, 그 세포들은 이들의 초기 활성의 72%를 여전히 보유하였다(도 6). +6℃에서 1주일 후에 상기 전 세포 촉매의 활성은 단지 초기 활성의 약 50%이었다(도 16). 또한, 이러한 실험에서 이는 세포의 용해가 관찰된 것과 상관성이 있었다. 여기서, 또한 세포의 일부는 측정된 기간에 걸쳐 상대적으로 안정한 잔류 활성을 나타내는 것으로 여겨졌다.

전 세포 촉매의 온도 의존성

에이. 피칼리스로부터 정제된 효소의 최적 온도는 40-45℃인 것으로 나타났다. 이러한 발견은 30-45℃ 범위의 온도 시험을 나타내는 도 17에 의해 확인된다. 반응 혼합물에서 포스페이트 버퍼 또는 트리스 버퍼의 사용은 특별한 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.

전 세포 촉매의 재사용 가능성(도 7)

전 세포 바이오촉매의 재사용 가능성 및 안정성을 조사하기 위해, 5사이클의 24시간 전환 반응을 상이한 버퍼 및 온도 조건에서 수행하였다. "사이클(cycle)"은 24시간 전환 반응 후 이. 콜라이 세포의 원심분리 및 다음 사이클을 위한 새로운 기질의 첨가이다. 24시간 내에 최고 수율은 2.62mM 만델산을 함유한 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.5, 45℃)에서 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf로 달성되었으나, 그 활성은 5 사이클 후에 본래 활성의 단지 최소 10%로 신속히 저하되었다. Tris-HCl 버퍼(pH 7, 45℃)를 이용한 경우에, 24시간 내에 2.53mM 만델산의 전환이 달성될 수 있었으며, 5 사이클 후에 처음 전환률의 33% 이상이 획득될 수 있었다. Tris-HCl(37℃)에서 세포의 활성은 제1 사이클에서 2.24mM이었던 것이 5 사이클 후에 1.25mM로 저하되었으며, 이는 55% 이상의 잔류 활성을 나타낸다. 제1 사이클 중에, 소듐 포스페이트 버퍼 또는 Tris-HCl 버퍼에 재현탁된 세포들 사이에 생산 속도의 단지 최소한의 차이가 있을 뿐이었지만, 반면에 전체적인 성능은 항상 Tris-HCl 버퍼로 시험된 시료에서 더 우수하였다.

실험 섹션

박테리아 스트레인 및 플라스미드

서브클로닝을 위해, 이. 콜라이 TOP10[F^- mcrA Δ(mrr-hsd RMS-mcrBC)Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG](Invitrogen(Carlsbad, CA, USA))를 사용하였다. 이. 콜라이 BL21 (DE3) [B, F^-, dcm, ompT, Ion, hsdS (rB^- mB^-), gal, λ (DE3)]를 오토트랜스포터 융합 단백질의 발현을 위해 사용하였다.

이. 콜라이 스트레인은 앰피실린(100㎍mL^-1)을 함유하는 루리아-버타니(Luria-Bertani(LB)) 배지에서 격렬히 교반하면서(200rpm) 37℃에서 통상적으로 성장시켰다. 상기 배지에 아가로즈(1.5%, wv^-1)의 첨가로 고형 배지를 제조하였다.

플라스미드 pCR®4-TOPP®(Invitrogen(Carlsbad, CA, USA))가 상기 니트릴라아제 유전자를 서브클로닝하기 위해 사용되었다. AIDA-I 오토트랜스포터 프래임워크를 함유하는 플라스미드 pET-Adx04의 제조는 이전에 기재되어 있다(Rustler et al., 2008; U.S. Patent No. 6,180,359). 도 8은 11 형질변형체로부터 분리된 플라스미드를 나타내며, 여기서 상기 PCR 프레그먼트에 상응하는 약 1kb의 합당한 DNA 프레그먼트가 KpnI 및 XhoI을 이용한 분해 후에 7 클론에서 합당한 오토트랜스포터 플라스미드(약 7kb) 내에서 검출되었다.

재조합 DNA 기술

상기 니트릴라아제를 암호화하는 유전자는 알칼리제네스 피칼리스 subsp. 피칼리스 ATCC 8750 (LGC Standards GmbH, Wesel, Germany)로부터 증폭되었다.

상기 니트릴라아제의 증폭용 프라이머는 에이. 피칼리스 ATCC 8750(Kaul et al., 2007)의 니트릴라아제 유전자에 대해 이미 알려진 서열 정보로부터 유도되었다. 포워드 프라이머 Nit-XhoI(5'-CCGCTCGAGCAGACAAGAAAAATCGTCC) 및 리버스 프라이머 Nit-KpnI(3'-GGGGTACCGGACGGTTCTTGCACC)를 사용하여 상기 니트릴라아제 유전자를 함유하는 1073bp 프레그먼트를 증폭하였다. PCR 산물의 클로닝을 촉진하기 위해, XhoI 및 KpnI 제한 부위가 첨가되었다(프라이머에서 밑줄친 부분은 각 효소에 대한 제한 부위를 나타낸다.). PCR 반응은 10μL의 부피에 10ng의 게놈 DNA, 적절한 양의 Eppendorf PCR Mastermix(Eppendorf(Hamburg, Germany)), 1μL(10μM 스톡 용액)의 포워드 및 리버스 프라이머(Sigma-Aldrich Chemical Company, Milwaukee, USA)를 함유하였다. PCR 반응은 Eppendorf Mastercycler gradient(Eppendorf(Hamburg, Germany))에서 수행되었다. PCR 프로토콜은 95℃에서 5분의 초기 변성 단계 후, 94℃에서 30초, 64℃에서 1분, 72℃에서 1분의 30 사이클 및 72℃에서 6분의 최종 연장 단계의 마지막 단계로 구성되었다.

PCR 산물은 제조자의 지시에 따라 pCR^®4-TOPP^® Vector에 서브클로닝을 위해 직접 사용되었다. 플라스미드 DNA의 제조는 상술한 바와 같이 수행되었다. 그 결과 형성된 플라스미드는 XhoI/KpnI으로 분해되고 Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 아가로즈겔 전기영동에 의해 정제되었다.

그 결과 형성된 프레그먼트는 XhoI/KpnI으로 분할된 pET-Adx04 벡터에 삽입되었으며, 여기서 이는 Adx04를 암호화하는 유전자를 대체하여 pAT-NitAf를 제공하였다.

외부 멤브레인 제조 및 SDS - PAGE

이. 콜라이 세포를 밤새 성장시키고, 적절한 양의 배양물을 2-머캅토에탄올(10mM) 및 앰피실린(100㎍mL^-1)을 함유하는 LB 배지의 접종에 사용하였다. 세포들은 0.5 또는 1의 광학 밀도(OD₅₇₈)에 이를 때까지 37℃에서 배양되었다. 유도 발현을 위해 Roth(Karlsruhe, Germany)로부터 구입한 IPTG(1mM 최종 농도)를 첨가하였다. 30℃에서 60분 후, 세포들을 수거하고, Tris-HCl(0.2M, pH 8.2)로 세정하였다. 프로테아제 접근성 시험을 위해, 세포들을 25μL의 프로테이나아제 K 용액(2%)을 함유한 2ml Tris-HCl(0.2M, pH 6.8)에 재현탁시키고, 37℃에서 워터 배스에서 60분간 배양하였다. 차등 세포 분획을 Hantke(Hanttke, 1981)의 방법의 변형에 따라 수행하였다.

SDS-PAGE를 위해, 외부 멤브레인 분리물을 Tris-HCl(100mM, pH 6.8), 소듐 도데실 설페이트(4%), 브로모페놀 블루(0.2%), 2-머캅토에탄올(2%), 디티오트레이톨(0.2M) 및 글리세롤(20%)로 구성된 시료 버퍼로 1:2로 희석하고, 5분간 끓이고, 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하였다. 단백질들을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하고, Fermentas(St. Leon-Rot, Germany)로부터 구입한 파게룰러 언스테인드 단백질 래더를 크기 측정용으로 사용하였다.

표준 전환 수행

표준 실험은 다음과 같이 수행된다: 재조합 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitAf 스트레인의 예비 배양물을 1:100의 비율로 주 배양물을 접종하는데 사용하고, 쉐이킹 인큐베이터에서 37℃에서 200rpm으로 배양한다. 1의 OD₅₇₈에 이를 경우에, 1mM의 최종 농도를 이용한 도입을 위해 IPTG를 첨가한다. 그 다음, 도입은 30℃, 200rpm에서 1시간 동안 수행한다. 그 후, 세포들을 50mM 포스페이트 버퍼(pH 7.5)로 1회 세정하고, 동일한 버퍼를 사용하여 10의 OD₅₇₈로 최종적으로 조절한다. 그 다음, 상기 세포 현탁액의 1ml 분액을 20㎕ 만델로니트릴(0.5M)과 혼합하고, 다른 온도(구체적으로 37℃)에서 1000rpm 또는 200rpm으로 열혼합기에서 배양한다. 다른 시간 간격으로 시료들을 취하고, 원심분리하고(6000 x g, 5분), VWR(Darmstadt, Germany)로부터 구입한 0.2㎛ 폴리에테르설폰 멤브레인 필터로 멸균 여과하였다. 상층액을 HPLC에 의해 직접 분석하였다. 멸균 여과 후에 추가적인 생물전환이 검출될 수 없었다.

분석 방법

니트릴 전환은 다이오드 어레이 디텍터 996 및 2695 분리 모듈(Waters(MA, USA))이 장착된 HPLC(Millenium Chromatography Manager 3.2)에 의해 분석되었다. 아키랄 분석을 위해, 역상 컬럼[100mm x 4.6mm(내경), Hypersil ODS 5㎛ 직경 입자로 채워짐](Hewlett Packard(Boblingen, Germany))을 사용하여 전환 산물을 확인하였으며, 이는 210nm에서 분광 검출되었다. 메탄올(40%vv^-1) 및 물에 용해된 인산(0.1%)을 HPLC 분리용 이동상으로 사용하였다. 만델산 거울상이성질체의 분리를 위해, 키랄 상 컬럼[150mm x 4.6mm(내경), Reprosil Chiral-OM 5㎛ 직경 입자로 채워짐](CS-Chromatographie Service(Langerwehe, Germany))을 사용하였다.

이동상은 헥산(90%vv^-1), 이소프로필 알코올(10% vv^-1) 및 트리플루오로아세트산(0.1%vv^-1)으로 구성되었다. 만델산은 디클로로메탄 대신에 에틸 아세테이트가 사용된 경미한 변형으로(Yamamoto, 1991), 상기한 바와 같이 생물전환 시료로부터 추출되었다.

실시예 2: 클렙시엘라 뉴모니아에( Klebsiella pneumoniae )의 니트릴라아제

클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae)의 니트릴라아제를 실시예 1에 기재된 바와 같이, PCR을 이용하여 증폭시키고, 이에 상응하는 오토디스플레이 벡터 내로 삽입한 다음 이. 콜라이 스탠다드 벡터 내로 중간 클로닝하고, 서열을 분석하였다. 케이. 뉴모니아에(K. pneumoniae) 니트릴라아제, 실시예 1에서 pAT-NitAf에 대해 기재된, 오토트랜스포터 도메인, 트랜스멤브레인 링커 및 신호 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 오토디스플레이 구조물을 pAT-NitKp라고 명명하였다. 그 표면에 융합 폴리펩타이드를 디스플레이하는 이에 상응하는 이. 콜라이 스트레인을 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitKp라고 명명하였다.

클렙시엘라 뉴모니아에 니트릴라아제의 발현 및 표면 국소화의 검출은 알칼리제네스 피칼리스 니트릴라아제(cf. 실시예 1)에 대한 방법과 같은 방식으로 수행되었다.

상기 니트릴라아제는 브로목시닐에 대해 매우 높은 기질 특이성을 나타낸다는 것은 문헌상 잘 알려져 있다. 상기 독성 화합물은 농업에서 제초제로서 폭넓게 사용되고 있으며, 해마다 독일에서 산업적인 규모로 적용되고 있다. 이에 상응하는 카르복시산은 자연에서 보다 낮은 독성 및 안정성을 나타낸다.

이. 콜라이 JK321 pAT-NitKp에 의한 브로목시닐로부터 3,5-디브로모-4-히드록시-벤조산의 생성을 도 18에 나타내었다. 이 도면은 이. 콜라이 세포의 표면에 발현된 케이. 뉴모니아에 니트릴라아제가 니트릴을 이에 상응하는 카르복시산으로 전환할 수 있음을 나타낸다.

실시예 3: 사카로미세스 세레비지아에( Saccharomyces cerevisiae )의 니트릴라아제

에스. 세레비지아에(S. cerevisiae)의 니트릴라아제를 실시예 1에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 증폭시키고 클로닝하였다. 서열 분석 결과, 데이타베이스로부터 획득된 에스. 세레비지아에의 니트릴라아제와 100% 동일성을 나타내었다. 상기 니트릴라아제를 실시예 1에 기재된 바와 같이 오토트랜스포터 도메인, 트랜스멤브레인 링커 및 신호 펩타이드를 포함하는 융합 단백질로서 이. 콜라이 내로 클로닝하였다. 또한, 서열 분석 결과, 데이타베이스로부터 획득된 서열과 100% 동일성을 나타내었다. 발현의 검출은 실시예 1과 같은 방식으로 수행되었다.

에스. 세레비지아에 니트릴라아제, 실시예 1에서 pAT-NitAf에 대해 기재된 바와 같은 오토트랜스포터 도메인, 트랜스멤브레인 링커 및 신호 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 오토디스플레이 구조물을 pAT-NitSc라고 명명하였다. 그 표면에 상기 융합 폴리펩타이드를 디스플레이하는 이에 상응하는 이. 콜라이 스트레인을 이. 콜라이 BL21(DE3) pAT-NitSc라고 명명하였다.

IPTG 유도 후, 에스. 세레비지아에 니트릴라아제를 포함하는 상기 융합 단백질이 그 표면에 국소화된 것으로 발견되었다. 실시예 1에 기재된 전 세포의 트립신 분해를 적용하였다. 그 결과를 도 9에 요약하였다.

참고문헌

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Claims

(i) 미생물의 표면에 위치한 니트릴라아제를 포함하는 미생물 및/또는 상기 미생물의 멤브레인 제조물을 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 미생물 및/또는 이의 멤브레인 제조물을 니트릴라아제 활성에 호환적인 조건하에서 하나 이상의 니트릴라아제 기질과 접촉시키는 단계
를 포함하는, 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물을 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물은 카르복시산이며, 적어도 하나의 니트릴라아제 기질은 니트릴인, 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물을 제조하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 니트릴라아제는 상기 미생물에서 재조합적으로 발현되며, 이의 표면으로 이송되는, 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물을 제조하는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서,
상기 니트릴라아제는 오토트랜스포터의 트랜스포터 도메인에 융합되는, 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물을 제조하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (i)은
(a) 발현 조절 서열과 작동적으로 연결된 핵산 서열을 포함하며, 상기 핵산 서열은
(1) 신호 펩타이드를 암호화하는 부분(portion);
(2) 디스플레이되는 재조합 니트릴라아제를 암호화하는 부분;
(3) 선택적으로 프로테아제 인지 부위를 암호화하는 부분;
(4) 트랜스멤브레인 링커를 암호화하는 부분; 및
(5) 오토트랜스포터의 트랜스포터 도메인을 암호화하는 부분
을 포함하는, 미생물을 제공하는 단계,
(b) (a)의 핵산 서열이 발현되고, 상기 핵산 서열의 발현 산물이 상기 미생물의 표면에 디스플레이되는 조건하에서 상기 미생물을 배양하는 단계
를 포함하는, 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물을 제조하는 방법.
제5항에 있어서,
(c) (b)의 상기 미생물로부터 멤브레인 제조물을 생성하는 단계
를 더 포함하는, 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물을 제조하는 방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 오토트랜스포터의 트랜스포터 도메인은 Ssp, Ssp-h1, Ssp-h2, PspA, PspB, Ssa1, SphB1, AspA/NalP, VacA, AIDA-I, IcsA, MisL, TibA, Ag43, ShdA, AutA, Tsh, SepA, EspC, EspP, Pet, Pic, SigA, Sat, Vat, EpeA, EatA, Espl, EaaA, EaaC, Pertactin, BrkA, Tef, Vag8, PmpD, Pmp20, Pmp21 , lgA1 protease, App, Hap, rOmpA, rOmpB, ApeE, EstA, Lip-1, McaP, BabA, SabA, AlpA, Aae, NanB 및 이의 변이체를 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물을 제조하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 니트릴라아제는 알칼리제네스(Alcaligenes) 니트릴라아제, 클렙시엘라(Klebsiella) 니트릴라아제 및 사카로미세스(Saccharomyces) 니트릴라아제를 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물을 제조하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미생물은 그람 음성 박테리아, 바람직하게는 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)인, 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물을 제조하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (ii)는 약 6.5 내지 약 7.5 범위의 pH에서 수행되는, 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물을 제조하는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (ii)는 호기 조건 및/또는 산화 조건하에서 수행되는, 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물을 제조하는 방법.
제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 니트릴은 만델로니트릴, 프루나신, 브로목시닐, 이옥시닐, 클로록시닐, 아니소니트릴, 3-브로모-4-히드록시벤조니트릴, 3-플루오로-4-히드록시벤조니트릴, 4-히드록시-3,5-디메토벤조니트릴, 벤조니트릴, 페닐프로비오니트릴, 페닐글리시노니트릴, n-부티로니트릴, n-발레로니트릴, 이소부티로니트릴 및 숙시노니트릴을 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물을 제조하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
니트릴라아제에 의해 촉매된 상기 반응 산물은 카르복시산이며, 그리고 상기 카르복시산은 적어도 약 70%의 거울상이성질체 과잉률로 생성되는, 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물을 제조하는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (ii)에서 사용된 미생물을 회수하는 단계 (iii)를 더 포함하는, 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물을 제조하는 방법.
니트릴라아제를 디스플레이하는 미생물로서, 그 표면에 재조합 니트릴라아제를 디스플레이하는 미생물.
제15항의 미생물로부터 획득된 재조합 니트릴라아제를 포함하는, 멤브레인 제조물.
제15항의 미생물 및/또는 제16항의 멤브레인 제조물을 니트릴라아제에 의해 촉매된 반응 산물의 제조에 사용하는 용도.
미생물에 핵산 서열을 도입하는 것을 포함하는, 미생물의 표면에 재조합 니트릴라아제를 디스플레이하는 미생물을 제조하는 방법으로서, 상기 핵산 서열은
(1) 신호 펩타이드를 암호화하는 부분,
(2) 디스플레이되는 재조합 니트릴라아제를 암호화하는 부분;
(3) 선택적으로 프로테아제 인지 부위를 암호화하는 부분;
(4) 트랜스멤브레인 링커를 암호화하는 부분; 및
(5) 오토트랜스포터의 트랜스포터 도메인을 암호화하는 부분
을 포함하며,
여기서, 상기 핵산은 발현 조절 서열과 작동적으로 연결되는, 재조합 니트릴라아제를 디스플레이하는 미생물을 제조하는 방법.