KR0137134B1

KR0137134B1 - (+)-호모필로핀산 및 그 염의 제조방법

Info

Publication number: KR0137134B1
Application number: KR1019900018915A
Authority: KR
Inventors: 쇼이찌 기세; 미끼오 하야시다; 아이이찌로 오리; 준조우 히라쯔까; 히데아끼 야마다
Original assignee: 이와끼 겐따로; 이와끼 세이야구 가부시끼가이샤
Priority date: 1989-11-22
Filing date: 1990-11-22
Publication date: 1998-04-25
Also published as: HUT61292A; EP0430555B1; HU212279B; JP2880204B2; CA2030218A1; US5182198A; JPH03198796A; EP0430555A1; ATE121137T1; CA2030218C; DE69018576T2; DE69018576D1; HU907244D0; KR910009932A

Abstract

본 발명은 아스로박터(Arthrobacter)속, 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 에세리키아(Escherichia)속, 커닝가멜라(Cunninghamella)속, 크산토모나스(Xanthomonas)속, 칸디다(Candida)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 세라챠(Serratia)속, 셀룰로모나스(Cellulomonas)속, 노카디아(Nocardia)속, 바실러스(Bacillus)속, 브레비박테륨(Brevibacterium)속, 후라보박테륨(Flavobacterium)속, 미코박테륨(Mucobacterium)속, 리조부코르(Rhizomucor)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속 또는 로도코쿠스(Rhodococcus)속 등에 속하는 미생물의 균체 또는 그의 처리물 존재하에, 하기 일반식[Ⅰ]로 표시되는 (+)-호모필로핀산에스테르와 하기 일반식[Ⅱ]로 표시하는 (-)-호모필로핀산 에스테르의 혼합물(식 중, R₁, R₂는 각각 C₀∼ C₁₀의 직쇄 또는 분기상 탄화수소기를 나타낸다)를 가수분해함을 특징으로 하는 (+)-호모필로핀산 및 그 염의 제조방법.

Description

(+)-호모필로핀산 및 그 염의 제조방법

제1도는 실시예37의 생성물의 메틸에스테르를 CDCl₃중 0.5당량 Eu(hfc)₃존재하에서 측정한 NMR 스펙트럼도.

본 발명은 녹내장 치료약으로서 유용한 (+)-필로카핀 하이드로클로라이드(pilocarpinehydrochloirde) 합성에 유용한 중간체인 (+)-호모필로핀산 및 그 염을 제조하는 방법에 관한 것이다. 현재, 하기 구조식(Ⅲ)으로 표시되는 (+)-필로카핀 하이드로 클로라이드는 브라질 등에 자생하는 필로카푸스 야보란디(Pilocarpus jaborandi)의 앞으로부터 추출한다 :

그러나, 상기의 방법은 그 천연원료의 공급이 기후에 좌우되어 안정적인 공급이 곤란한 문제점이 있다. (+)-필로카핀 하이드로클로라이드를 합성법에 의해 제조하는 방법으로서, (+)-호모필로핀산에스테르와 (-)-호모 필로핀산 에스테르와의 혼합물(이 혼합물을 이하에서 (??)-호모필로핀산 에스테르라 한다)을 강산성 조건하에서 가수분해하여 얻어지는 식[Ⅳ]로 표시되는 (+)-호모필로핀산과 하기식[Ⅴ]로 표시되는 (-)-호모필로핀산의

혼합물(이 혼합물을 이하(±)-호모필로핀산이라 한다).

을 , 메틸벤질아민을 사용하여 광학적으로 분할하여 (-)-호모필로핀산을 제거한 후, (+)-호모필로핀산을 (+)-필로카핀 하이드로클로라이드로 변환하는 방법이 알려져 있다.(J. I. DeGraw등, J. Pharm, Sci, 64 : 1700-1701, (1975)). 상기 종래기술에서와 같이 강산성 조건하에서 (??)-호모필로핀 에스테르를 가수분해하면, 락톤 환(ring)이 파괴되어 (+)-호모필로핀산의 수율이 저하된다. 또한 알칼리성 조건하의 가수분해에서도 략톤 링이 파괴되어 수율이 현저히 저하된다. 그러므로, 본 발명의 목적은 (+)-호모필로핀산을 고수율로 제조하는 효율적 제조방법을 제공하는데 있다. 본 발명자등은 미생물 또는 효소를 사용하여 락톤 환의 파괴가 생기지 않는 온화한 조건에서 가수반응을 행함으로써 (+)-호모필로핀사능 고수율로 제조할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성했다. 본 발명은 (1)아스로박터(Arthrovacter)속, 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 에세리키아(Escherichia)속, 커닝가멜라(Cunninghamella)속, 크산토모나스(Xanthomonas)속, 칸디다(Candida)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 세라티아(Serratia)속, 셀룰로모나스(Cellulomonas)속, 노카디아(Nocardia)속, 바실러스(Bacillus)속, 브레비박테륨(Brevibacterium)속, 후라보박테륨(Flavobacterium)속, 미코박테륨(Mucobacterium)속, 리조부코르(Rhizomucor)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속 또는 로도코쿠스(Rhodococcus)속 등에 속하는 미생물의 균체 또는 그의 처리물을 사용하여, 하기 일반식[Ⅰ], [Ⅱ]로 표시되는 화합물들의 혼합물인 (±)-호모필로핀산 에스테르(식 중, R₁, R₂는 각각 C₀∼ C₁₀의 직쇄 또는 분기상 탄화수소기를 나타낸다)를 가수분해함을 특징으로 하는 (+)-호모필로핀산 및 그 염의 제조방법에 관한 것이다(제1방법).

본 발명의 다른 태양에 의하면, (2) 리파아제, 에스테라아제, 콜레스테롤 에스테라아제, 리포프로테인 리파아제들 중 적어도 1종류의 효소를 사용하여 일반식[Ⅰ], [Ⅱ]로 표시되는 화합물들의 혼합물인 (±)-호모필로핀산 에스테르(식 중, R₁, R₂는 각각 C₀∼ C₁₀의 직쇄 또는 분기상 탄화수소기를 나타낸다)를 가수분해함을 특징으로 하는 (+)-호모필로핀산 및 그 염의 제조방법이 제공된다(제2방법). 본 발명의 또한 태양에 의하면, (3) 리파아제, 에스테라아제, 콜레스테롤 에스테라아제등으로 이루어지는 그룹에서 선택한 가수분해 효소 또는 브레비 박테륨속, 에세리키아속, 로도토룰라속 속하는 미생물 또는 그의 처리물 중 적어도 1종류를 사용하여, 일반식[Ⅰ](식 중, R,는 각각 C₀∼ C₁₀의 직쇄 또는 분기상 탄화수소기를 나타낸다)로 표시되는 (+)-호모필로핀산 에스테르와, 일반식 [Ⅱ](식 중, R₂는 각각 C₀∼ C₁₀의 직쇄 또는 분기상 탄화수소기를 나타낸다)로 표시되는 (-)호모필로핀산 에스테르와의 혼합물을 가수분해한 후 미반응의 (+)-호모필로핀산 에스테르를 회수하고, 계속하여 회수한 미반응 (+)-호모필로핀산 에스테르를 리파아제, 에스테라아제 등의 효소 또는 아스퍼질러스속, 에세리키아속, 크산토모나스속, 칸디다속, 슈도모나스속, 세라티아속, 셀룰로모나스속, 노카디아속, 바실러스속, 후라보박테륨속, 브레비박테륨속, 미코박테륨속, 리조무코트속, 로도코쿠스속에 속하는 미생물 또는 그의 처리물중, 적어도 1종류를 사용하여 가수분해시킴을 특징으로 하는 (+)-호모필로핀산 및 그 염의 제조방법이 제공된다(제3방법). 제1도는 실시예37의 생성물의 메틸에스테르를 CDCl₃중 Eu(hfc)₃0.5당량 존재하에서 측정한 NMR 스펙트럼도이다. 본 발명을 상세히 설명한다. 적합한 R₁과 R₂는 직쇄상 또는 분기상 C₁∼ C₁₀탄화수소기이며, 대표적으로는 메틸, 에틸, 이소프로필, t-부틸 및 옥틸기 등의 있다. 본 발명의 상기 제1방법에서 사용할 수 있는 미생물로는 아스로박터 글로비포트미스(Arhtrovacter globiformis) IFO 12136, 아스퍼질러스 소제(Aspergilus sojae) IAM 2703, 아스퍼지러스 테레우스(Aspergilus terreus) IAM 2179, 에세리키아 콜리(Escherichia coli) IFO 3366, 커닝가멜라 에키눌라타(Cunninghamella echinulata) IFO 4443, 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) IFO 13303, 크산토모나스 오리제(Xanthomonas oryzae) IFO 3510, 칸디다 유티리스(Candida utilis) IFO 4961, 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) IAM 1275, 세라티아 플리무치카(Serratia plymuthica) JCM 1244, 셀룰로모나스 터바타(Cellulomonas turbata) FERM P-9059, 노카디아 에리스로폴리스(Nocardia erythropolis) IAM 1484, 노카디아 오파카(Nocardia opaca) IAM 12123, 노카디아 코랄리나(Nocardia corallina) IAM 12121, 노카디아 루브로퍼팅타(Nocardia robropertincta) JCM 3204, 바실러스 서브티리스(Bacillus subtilis) IFO 3108, 후라보박테륨 루테센스(Flavobacterium lutescens) IFO 3084, 브레비박테륨 케토글류타리쿰(Brevibacterium ketoglutaricum) ATCC 15588, 미코박테륨 로도크라우스(Mycobacterium rhodochrous) IFO 13161, 리조무코르미하이(Rhizomucor miehei) IFO 9740, 로도코쿠스 에리스코콜리스(Rhodococcus erythropolis) IFO 12682, 로도토룰라루브라(Rhodotorula rubra) IFO 0383 등이 있다. 상기 본 발명의 방법은 상기 미생물을 (±)-호모필로핀산 에스테르를 함유하는 배지에 배양하여 행할 수 있으나, 바람직하게는 상기 미생물을 효모추출물, 펩톤, 글루코스, 무기염 등으로 된 배지를 사용해서 20∼37℃에서 1일∼1주간 배양하여 얻어진 배양물, 배양물에서 분리한 균체 또는 균체를 제거한 배양액, 또는 균체를 파쇄하여 얻은 조(組)효소액 등의 균체 처리물을 (±)-호모필로핀산 에스테르와 접촉시킴으로써 행한다. 예를 들면, 상기 배양물, 균체, 균체를 제거한 배양물 또는 균체 처리물 등을 함유하는 pH 5∼9, 바람직하게는 pH 6.0∼8.0의 인산버퍼 또는 트리스 염산버퍼중에 (±)-호모필로핀산 에스테르 0.1∼30%, 바람직하게는 0.5∼10% 첨가하여 20∼37℃에서 그 혼합물을 흔들면서 2시간∼100시간 반응을 행함으로써 (+)-호모필토핀산을 얻을 수 있다. 상기 반응액의 pH는 가수분해반응이 진행함에 따라 저하하므로, 0.5N 수산화나트륨 수용액, 탄산수소나트륨 또는 탄산나트륨의 포화수용액으로 중화시켜 pH를 조정하는 것이 좋다. 반응종료후, 통상의 용매-추출법, 이온교환크로마토 그래피법에 의하여, 상기 반응혼합물로부터 (+)-호모필로핀산을 회수 및 정제할 수 있다. 구체적으로, 디에틸에테르로 추출함으로써 상기 미반응 원료 에스테르를 제거할 수 있다. 잔존하는 수층(水層)의 pH를 2N HCI 또는 2N H₂SO₄로 2∼4로 조정하고, NaCl을 가하여 포화시킨다. 이 혼합물에, 동등 용량의 초산 에틸을 가하고, 강 교반하고 원심분리하여 초산에틸층을 회수하고, 이 층을 감압건조하여 호모필로핀산 조결정을 얻는다. (+)-호모필로핀산과 그의 (-)-이성체의 비율은 사용된 미생물 종류에 따라 91:9∼25:75의 범위에서 가변적이다. 바람직하게는 리조무코르 미하이 IFO 9740를 사용하며, (+)-호모필로핀산을 고수율로 얻는다. 혼재하는 (-)-호모필로핀산은 d-α-메틸벤질아민등과 같은 광학분할제로 상용되는 처리제로 처리함으로써 제거할 수 있다. 이와 같이 얻어진 (+)-호모필로피산으로부터 공지된 방법으로 천연품과 동일한 품질을 갖는 필로카핀 하이드로클로라이드를 얻을 수 있다. 상기 본 발명의 제2방법에서 사용할 수 있는 대표적인 효소로는 슈도모나스 스페이즈(Pseudomonas sp.)에서 유래된 리파아제 PS(Amano Pharmaceutical사제), 리조푸스 델레마(Rhizopus delumar)에서 유래된 리파아제(세이가가꾸 고오교오사제), 리조무코르 미하이에서 유래된 리포자임 IM 20(Novo Nordisk Bioimdustry 사제), 슈도모나스 프라지(Pseudomonas fragi)에서 유래된 리파아제 B, 칸디다 실린드라세(Candida cylindra ceae)에서 유래한 리파아제 OF (메이또 산교오사제), 슈도모나스 프라지에서 유래된 리파아제 T-01 (도요 죠조사제), 돼지간에서 유래된 에스테라아제(베링거 만하임사제), 슈도모나스 스페이즈에서 유래된 콜레스테롤 에스테라아제 T-18 (도요 죠조사제) 및 슈도모나스 스페이즈에서 유래된 리포프로테인 리파아제(Wako Pure Chemical Industries 사제)등이 있다. 본 발명의 제2방법에서는 상기 효소들 중 하나를 물 또는 기타 적합한 버퍼에 용해하고 (±)호모필로핀산 에스테르와 접촉시켜 반응을 행한다. 상기 효소, (±)호모필로핀산 에스테르 및 상기 용매의 비율은 사용하는 효소에 따라 다르나, 통상 1 : 0.5 ∼ 1000 : 2∼1,000,000 중량부의 범위내이다. 상기 반응은 pH 5∼9, 바람직하게는 6.0∼8.0의 인산 버퍼 또는 트리스-HC1 버퍼중에서 20∼37℃에서 2∼100시간 흔들어줌으로써 행하며, 그럼으로써 (+)-호모필로핀산이 그 수용액중에 생성된다. 이 반응은 트윈(Tween) 80과 같은 계면활성제를 0.02∼1중량의 농도로 가하여 가속시킬 수도 있다. (+)-호모필로핀산이 생성됨에 따라 반응혼합물의 pH가 떨어지므로, 0.5N 수산화나트륨, 탄산수소나트륨 포화수 또는 탄산나트륨 포화수로 pH를 조정하는 것이 좋다.

반응종료후, 상기 제1방법과 마찬가지로, 통상의 용매추출볍, 이온교환 크로마토 그래피 등에 의해 상기 반응혼합물로부터 (+)호모필로핀산의 나트륨염을 회수 및 정제할 수 있다. 용매추출법에 의해 회수된 호모필로핀산의 (+)-체와 (-)체의 비율은 사용된 효소에 따라 84:16∼10:90의 범위내이다. 파라타아제(Paratase)M1000L (Novo Nordisk Bioindustry사제)를 사용하면 최고로 순도로 (+)-호모필로핀산을 얻을 수 있다. 혼재하는 (-)-호모필로핀산은 광학 분할제로 상용되는 d-α-메틸벤질아민과 같은 처리제로 처리함으로써 제거할 수 있다. 이와 같이하여 얻어진 (+)-호모필로핀산으로부터 공지기술에 의하여 천연품과 품질이 동일한 (+)-필로카핀 하이드로클로라이드를 얻을 수 있다.(순도 97.5%).

제1방법과 제2방법과는 달리, 본 발명의 제3방법은 상기 광학분할공정을 요하지 않는다. 이 제3방법의 특징은 상기 복잡한 광학분할 공정이 배제되어 수율이 향상된다는 점이다. 상기 제3방법은 (±)호모필로핀산 에스테르중의 (-)-호모필로핀산 에스테르를 선택적으로 가수분해하여 (+)-호모필로핀산 에스테르를 회수하는 제1공정과, 이 회수된 (+)-호모필로핀산 에스테르를 가수분해하여 (+)-호모필로핀산을 얻는 제2공정으로 이루어진다. 상기 제1공정에서 사용할 수 있는 대표적인 효소들로는 크로모박테륨 비스코숨(Chromobacterium viscosum)에서 유래된 리파아제 T-01, 슈도모나스 스페이즈에서 유래된 콜레스테롤 에스테라아제 T-18 (도요 죠조사제), 슈도모나스 프라지에서 유래된 리파아제 B(Wako Pure Chemical Industries 사제), 슈도모나스 스페시즈에서 유래된 리파아제 PS(Amamo Pharmaceutical 사제) 크로모박테륨비스코숨(Chromobacterium viscosum)에서 유래된 리파아제(시그마 사제)등이 있다. 이 제1공정에서 사용할 수 있는 대표적인 미생물로는 브레비박테륨 암모니아겐스(Brevibacteriumammoniagens) IFO 12070,에세리키아불너리스(Escherichia vulneris) JCM 1688, 로도토룰라루브라 IFO 0893 등이 있다. 상기 제1공정의 반응은 상기 효소들 또는 균체 또는 그이 처리물 중 적어도 하나를 수중 또는 적당한 버퍼중에 용해하고 (±)호모필로핀산 에스테르와 접촉시켜 행한다. 상기 효소, (±)호모필로핀산 에스테르 및 용매의 비율은 사용하는 효소에 따라 다르나, 통상 1 : 0.5∼1,000 : 2∼1,000,000 중량부의 범위내이다. 이 반응은 트윈 80과 같은 계면활성제를 0.02∼1중량%의 농도로 가하여 가속시킬 수 있다. 반응은 pH 5∼9, 바람직하게는 6.0∼8.0의 인산버퍼 또는 트리스-HCl 버퍼중에서 20∼37℃에서 수시간∼1주간 흔들어 줌으로써 행하며 그럼으로써 수층중에 (-)호모필로핀산이 생성되며, (+)-호모필로핀산는 유층중에 잔존한다. 반응시간은 사용효소 및 원료 에스테르의 종류 및 양에 따라 다르며, 수층 중에 생성된 호모필로핀산의 수율이 50%이상에 달할 때 반응을 종료하는 것이 좋다. 반응혼합물의 pH는 호모필로핀산의 생성에 따라 저하되므로 0.5N 수산화나트륨, 탄산수소나트륨 포화수 또는 탄산나트륨 포화수로 pH를 6∼8로 조정하는 것이 바람직하다. 반응종료후, 미반응 (+)-호모필로핀산 에스테르는 디에틸에테르 또는 초산에틸 등의 유기용매를 사용하여 회수할 수 있으며 이것은 제2공정의 출발원료로 사용한다. 제2공정에서 사용할 수 있는 대표적 효소로는 리조푸스 델레마에서 유래된 리파아제(세이가가꾸고요꼬오사제), 리조무코르 미하이에서 유래된 리포자임 IM 20 (Novo Nordisk Bioindustry 사제), 칸디다 실리드라세에서 유래된 리파아제 OF(메이또 산교오사제), 돼지간에서 유래된 에스터라아제(베링거 만하임사제)등이 있다. 제2공정에서 사용된는 적합한 미생물로는 아스퍼질러스소제 IAM 2703, 에세리키아콜리 IFO 3366, 크산토모나스 오리제 IFO 3510, 칸디다유티리스 IFO 4961, 슈도모나스 에루기노사 IAM 13130, 세라티아 플리무치카 JCM 1244, 셀룰로모나스 터바타 FERM P-9059, 노카디아 에리스로폴리스 IAM 1484, 노카디아 루브로퍼팅타 JCM 3204, 바실러스 서브티리스 IFO 3108, 후라보박테륨 루테센스 IFO 3084, 브레비박테륨 케토글루타리큠 ATCC 15588, 미코박테륨 로드크라우스 IFO 13161, 리조무코트 미하이 IFO 9740, 로도코쿠스 에리스로폴리스 IFO 12682 등이 있다. 이들 미생물들을 (+)호모필로핀산 에스테르함유배지 중에서 배양해서 (+)-호모필로핀산을 얻을 수 있으나, 바람직하게는 상기 미생물을 효모 추출물, 펩톤, 글루코스, 무기염 등으로 된 배지를 사용해서, 20∼37℃에서 1일∼1주간 배양하여 얻어진 배양물 또는 배양물에서 분리한 균체 또는 균체를 제거한 배양액 또는 균체를 파쇄하여 얻은 조효소액 등의 균체처리물을 사용하여 상기 공정을 행한다. 즉, 상기 제2공정의 반응은 상기 효소 또는 균체 또는 그의 처리물 중 적어도 하나를 수중 또는 적당한 버퍼중에 용해 또는 현탁시켜 이 혼합물을 제1공정에서 회수한 상기 미반응 (+)-호모필로핀산 에스테르와 접촉시켜 행할 수 있다. 상기 효소 또는 효소활성물질, (±)호모필로핀산 에스테로와 상기 용매의 비율은 사용하는 효소 또는 미생물에 따라 다르나, 통상 1 : 0.5∼1000 : 2∼1,000,000 중량부의 범위내이다. 이 반응은 pH 5∼9, 바람직하게는 6.0∼8.0의 인산버퍼 또는 트리스-HCl버퍼중에서 20∼37℃에서 1시간∼수시간 동안 흔들어줌으로써 행하며 그럼으로써 수용액중에 (+)-호모필로핀산이 생성된다. 제1공정에서와 마찬가지로 계면활성제를 가함으로써 또는 알칼리용액으로 반응혼합물의 pH를 6∼8로 조정함으로써 반응을 가속시킬 수도 있다. 반응종료는 HPLC 등에 의해서 탐지할 수 있다. 반응종료후, 용매 추출법과 이온교환 크로마토 그래피법 등의 통상적인 방법에 의해서 반응혼합물로부터 (+)-호모필로핀산의 나트륨염을 회수 및 정제할 수 있다. 회수된 생성물의 메틸에스테르의 NMR분석결과, (-)-호모필로핀산에 대응하는 피크가 없었으며, 이것은 실질적으로 순수한 (+)-호모필로핀산이 생성됐음음 의미한다. 이와 같이 얻어진 (+)-호모필로핀산으로 부터, 공지된 방법으로 천연품과 동일한 품질의 (+)-필로카핀 하이드로클라이드를 얻을 수 있다. 본 발명에 의하면, 효소, 미생물등이 생체촉매를 사용하여 반응을 행하므로, 반응조건이 온화하여 락톤환이 파괴되지 않고 (+)-호모필로핀산의 수율이 매우 높다. 본 발명의 제3방법은 상기 광학분할공정을 요하지 않으므로, 절차가 더욱 간단해지고 수율이 높아진다. 그러므로, 본 발명은 녹내장 치료제로서 유용한 필로카핀 하이드로 클로라이드의 생산성에 크게 기여한다. 본 발명을 실시예들로써 설명하나, 본 발명이 이 실시예들에 한정되지는 않느다. 실시예들에서 NMR데이터는 CDCl₃중에서 0.5당량의 측정한 것이다. 하기 실시예 1∼24는 본 발명의 제1방법에 의한 것이다.

실시예 1

노카디아 루브로퍼팅타 JCM 3024 균주의 1백금이를 표1에 나타낸 배지 100㎖에 접종하고, 30℃에서 4일간 배양했다. 배양물을 원심분리하여 배양액을 제거하고, 그 펠릿(216㎎의 건조균체)을 0.1M 인산 버퍼 1.9㎖(pH 7.0)에 현탁하고, 1μℓ의 트윈 80, (±)-호모필로핀산 옥틸에스테르를 92μℓ첨가하여, 30℃에서 24시간, 교반하면서 반응을 행하여다.반응도중, 매6시간마다 포하 탄산나트륨수용액을 첨가하여 pH를 7로 조정했다. 반응종료후 용매추출법에 의해서 호모필산의 결정 23㎎을 얻어다.이것을 메틸에스테르화한후, NMR 분광법을 사용하여 (+)-호모필로핀산의 함유율을 조사한 결과 87%여다. 한편, (-)-호모필로핀산의 함유율은 13%였다.

표 1

1ℓ수중에 용해시켜 pH 7.0으로 조정했다.

실시예 2

에세리키아 콜라이 IFO 3366 균주의 1백금이를 표 1에 나타낸 배지 100㎖에 접종하고, 30℃에서 1일간 배양했다. 배양물을 원심분리하여 배양액을 제거하고, 그 펠릿(220㎎의 건조균체)을 0.1M 트리스(pH 0.8) 1.6㎖에 현탁하고, 1㎕의 트윈 80, (±)-호모필로핀산 에틸에스테르를 75㎕ 첨가하여, 30℃에서 24시간, 교반하면서 반응을 행하였다. 반응도중 매 6시간마다 포화 탄산나트륨수용액을 첨가하여 pH를 8로 조정했다. 반응종료후 용매추출법에 의해서 호모필로핀산의 결정 23㎎을 얻었다. 이것을 메틸에스테르화한후, NMR분광법을 사용하여 (+)-호모필로핀산의 함유율울 조사한 결과 78%였다. 한편, (-)-호모필로핀산의 함유율은 22%였다.

실시예 3

리조무코르 미하이 IFO 9740 균주의 포자를 표2에 나타낸 배지 5㎖에 접종하고, 30℃에서 3일간 배양하고, 그 배양액을 동일배지 100㎖에 옮겨서 30℃에서 4일간 더 배양했다. 그 배양물을 여과하여 배양액을 제거하고, 그 펠릿(650㎎의 건조균체)을 0.1M 인산 버퍼 7.5㎖(pH 7.0)에 현탁하고, 3㎕의 스핀(span)80, (±)-호모필로핀산 에틸에스테르를 200㎕첨가하여, 30℃에서 48시간 교반하면서 반응을 행하였다. 반응도중, 매 6시간마다 포화 탄산나트륨수용액을 첨가하여 pH를 7로 조정했다. 반응종료후 용매추출법에 의해서 호모필로핀산의 결정 25㎎을 얻었다. 이것을 메틸에스테르화한후, NMR 분광법을 사용하여 (+)-호모필로핀산의 함유율을 조사한 결과 91%였다. 한편, (+)-호모필로핀산의 함유율 9%였다.

표 2

1ℓ수중에 용해시켜 pH 6.0으로 조정했다.

실시예 4∼24

여러종류의 미생물을 사용해서 실시예 1∼3과 유사한 방법으로 호모필로핀산을 제조했다. 그 결과들을 표 3에 나타냈다.

표 3

1) 원료에스테르 : (±)-호모필로핀산 메틸에스테르(Me), 에틸에스테르(Et), 이소프로필에스테르(iPr), t-부틸에스테르(tBu), 옥틸에스테르(Oct).

2) 함유율(%) : 〔(+)-호모필로핀산 /생성된 호모필로핀산 총량〕×100 하기 실시예 25∼35는 본 발명의 제2방법에 의한 것이다.

실시예 25

리조푸스 텔레마에서 유래된 리파아제(세이가가꾸 고오교오사제) 36㎎을 2㎖의 0.1M 인산버퍼(pH 7)에 현탁하고, 1㎕의 트윈 80, 100㎎의 (±)-호모필로핀산 에틸에스테르를 첨가하여 30℃에서 24시간, 교반하면서 반응을 행하였다. 반응도중, 6시간마다 탄산나트륨 포화수용액을 첨가하여 pH를 7로 조정했다. 반응종료후, 용매추출법에 의해서 호모필로핀산의 백색침상 결정 19㎎을 얻었다. 호모필로핀산의 수율은 16%였다. 이것을 메틸에스테르화한 후, NMR 분광법을 사용하여 (+)-호모필로핀산의 함유율을 조사했다. (+)-호모필로핀산은 69%, (-)-호모필로핀산은 31%였다.

실시예26

돼지간에서 유래된 에스터라아제(베링거만하임사제) 60U(1000 U/㎖)을 2㎖의 0.1M 인산 버퍼(pH 7)에 현탁하고, 1㎕의 트윈 80, 100㎎의 (±)-호모필로핀산 부틸에스테르를 첨가하여 30℃에서 24시간, 교만하면서 반응을 행하였다. 반응도중, 6시간마다 탄산나트륨 포화수용액을 첨가하여 pH 를 7로 조정했다. 반응종료후, 용매추출법에 의해서 호모필로핀산의 결정 30㎎을 얻었다. 호모필로핀산의 수율은 25%였다. 이것을 메틸에스테르화한 후, NMR 분광법을 사용하여 (+)-호모필로핀산의 함유율을 조사했다. (+)-호모필로핀산은 71%, (-)-호모필로핀산은 29%였다.

실시예 27∼35

여러종류의 효소를 사용하여 실시예 25∼26과 유사한 방법으로 (+)-호모필로핀산을 제조했다. 그 결과들을 표 4에 나타냈다.

표 4

1) 원료:(±)-호모필로핀산 메틸에스테르(Me), 에틸에스테르(Et), 이소프로필 에스테르(iPr) 및 옥틸에스테르(Oct)

2) 0.1M 인산버퍼(pH 7.0)

3) 함유율(%): [(+)-호모필로핀산/생성된 호모필로핀산 총량]×100 하기 실시예들은 본 발명의 제3방법에 의한 것 들이다. NMR 스펙트럼은 90MH_Z에서 측정하였고 실온 클로로포름중에서 비선광도([α]D)를 측정했다.

실시예 36

슈도모나스 후라지에서 리파아제 B(Wako 사제) 8.5㎎을 0.1M 인산버퍼(pH 7.0) 10㎖중에 현탁하고 트윈 80 4㎕와 (±)-호모필로핀산 에틸에스테르 600㎎을 가하여 그 혼합물을 30℃에서 교반하면서 반응시켰다. 반응도중, 탄산타트륨 포화수용액을 매 6시간 반응시킨 후, 반응혼합물의 pH를 8.0으로 조정하고, 디에틸에테르 10㎖를 가하고, 강교반하고 원심분리하여 에테르층을 회수했다. 이 추출조작을 3회 반복하고 에테르를 제거함으로써 (+)-호모필로핀산 에틸에스테르 235㎎을 회수했다. 에스테르의 회수율은 39%였다. [α]D : 76.1。

실시예37

실시예36에서 얻어진 상기 회수된 에스테르 235㎎을 트윈 80 3㎕, 리파아제 OF 150㎎ 및 0.1M 인산버퍼(pH 7.0) 12㎖ 존재하에서 가수분해 했다. 용매추출법에 의해서 호모필로핀산 결정 127㎎을 얻었다. 제1 및 제2공정을 거친 호모필로핀산의 전체 수율은 25%였다. [α]D : 79.4。 이 호모필로핀산을 메틸에스테르화한 것을 NMR 분광법에 의해 측정한 결과, (-)-호모필로핀산 메틸에스테르에 대응하는 피크가 실질상 없었다. (제1도 참조).

실시예38

바실러스 서브티리스 IFO 3108을 배양했다. 즉, 표5에 나타낸 바와 같은 배지 100㎖에 바실러스 서브티리스 IFO 3108 1백금이를 접종했다. 에스테르 분해활성을 높이기 위해서, 1%의 대두유를 가하고, 30℃에서 1일간 배양했다. 그 배양물을 원심분리하여 펠릿(360㎎의 건조 균체)을 얻었다.

표 5

1ℓ 수중에 용해시켜 pH 7.0으로 조정했다.

실시예 39

실시예 38에서 얻은 바실러스 서브틸리스 IFO 3108의 펠릿 360㎎(건조중량)을 0.1M 인산버퍼(pH 7.0) 5㎖중에 현탁하고, 실시예 36에서 얻은 (+)-호모필로핀산 에틸에스테르 100㎎과 트윈 80 2㎕을 가하고, 30℃에서 교반하면서 반응을 행하였다. 반응도중, 탄산나트륨 포화수용액을 매 6시간마다 가하여 pH를 7로 조정했다. 72시간 반응후에 용매추출법에 의해 백색침상 (+)-호모필로핀산 결정 71㎎을 얻었다(수율: 84%). [α]D : 81.2。

실시예 40

리조무코르 미하이 IFO 9740을 배양했다. 즉, 표6에 나타난 바와 같은 배지 5㎖에 리조무코르미하이 IFO 9740의 포자를 접종하고, 30℃에서 30일간 배양했다. 그 배양물을 상기와 동일배지 100㎖에 옮기고, 30℃에서 4일간 더 배양했다. 이 배양물을 여과하여 배양액을 제거하여 920㎎의 건조 균체를 얻었다.

표 6

1ℓ 수중에 용해시켜 pH 6.0으로 조정했다.

실시예 41

실시예 36에서 얻어진 (+)-호모필로핀산 에스테르 100㎎, [α]_D실[α]_D[α]_D시예 40에서 얻은 리조무코르 미하이 IFO 9740 균주의 배양물 200㎎과, 트윈 80 2㎕를 0.1M 인산버퍼 (pH 7.0) 10㎖ 중에서 30℃에서 반응시켰다. 반응도중, 매 6시간마다 탄산나트륨 수용액을 가하여 pH를 7로 조정했다. 68시간 반응후에 용매추출법에 의해서 호모필로핀산 조결정 61㎎을 얻었다.(수율 72%). [α]_D: 79.8。 상기 호모필로핀산 결정을 메틸에스테르화한 것을 NMR 분석한 결과, (-)-호모필로핀산 메틸 에스테르를 나타내는 피크는 실질상 나타나지 않았다.

실시예 42∼45

(-)-호모필로핀산 에스테르에 선택적으로 작용하는 4종의 효소들을 사용하여 반응시킨후, 미반응의 (+)-호모필로핀산 에스테르를 회수 했다. 0.1M 인산버퍼 (pH 7.0) 10㎖ 중에서 30℃에서 반응을 행하였다. 그 결과들을 표7에 나타냈다.

표 7(제1공정)

＊1) Et :(±)-호모필로핀산 에틸에스테르(Oct):(±)-호모필로핀산 옥틸에스테르

실시예 46 ∼47

실시예 44에서 회수된 (+)-호모필로핀산을 표 8에 표시된 여러 효소들을 사용하여 가수 분해 하였다. 0.1M 인산버퍼 (pH 7.0) 5㎖ 중에서 반응을 행하였다. 그 결과들을 표8에 나타냈다.

표 8(제2공정)

* 1) 실시예 46, 47: 실시예 44에서 회수된 에스테르를 사용 실시예 48, 49: 실시예 45에서 회수된 에스터르를 사용

* 2) 호모필로핀산 수율

실시예 48∼49

실시예 45에서 회수된 (+)-호모필로핀산 에틸에스테르를 (+)-호모필로핀산 에스테르에 작용하는 여러효소들을 사용해서 상기 실시예 들에서와 마찬가지로 가수분해하였다. 그 결과들을 표 8에 나타냈다.

실시예 50∼52

실시예 42에서 회수된 (+)-호모필로핀산 에틸에스테를 110㎎을 (+)-호모필로핀산 에스테르에 작용하는 여러 효소들을 사용해서 가수분해 했다. 0.1M 인산버퍼 (pH 7.0) 5㎖ 중에서 30℃에서 48시간 동안 반응을 행하였다. 그 결과들을 표9에 나타냈다.

표 9(제2공정, 미생물사용)

* 1) Et ;(±)-호모필로핀산 에틸에스테르, Oct:(±)-옥틸에스테르, 실시예 50∼52, 53∼58, 59∼61 및 61과 62에서는 실시예 42, 43, 45 및 44에서 회수한 에스테르를 각각 사용했음.

* 2) 표1의 배지에서 30℃, 24시간 배양한후 상기 회수 에스테르(110㎎)를 가하여 48시간 반응시켰음.

실시예 53~58

실시예 43에서 회수된 (+)-호모필로핀산 에틸에스테르를 상기 실시예들과 마찬가지로 여러효소를 사용해서가수분해했다. 그 결과를 표9에 나타냈다.

실시예 59~61

상기 실시예들과 마찬가지로, 실시예 45에서 회수된 (+)-호모필로핀산 에틸에스테르를 여러효소를 사용하여 가수분해했다. 그 결과들을 표9에 나타냈다.

실시예 62

상기 실시예들과 마찬가지로, 실시예 44에서 회수된 (+)-호모필로핀산 옥틸에스테르를 표9의 효소들을 사용하여 가수분해했다. 그 결과들을 표9에 나타냈다. 하기 실시예들 63~65는 상기 제3방법의 제1공정에서 사용되는 배양물 제조에 관한 것이다.

실시예 63

표5의 배지 100㎖중에서, 브레비박테륨 암모니아겐즈 IFO 12072 균주를 30℃에서 1일간 배양하여 270㎎의 건조 균체를 얻었다.

실시예 64

표5의 배지 100㎖중에서, 에세리키아 불너리스 JCM 1688 균주를 30℃에서 1일간 배양하여 540㎎의 건조 균체를 얻었다.

실시예 65

표6의 배지 100㎖중에서, 로도토룰라 루브라 IFO 0893 균주를 30℃에서 2일간 배양하여 750㎎의 건조 균체를 얻었다.

실시예 66~68

이 실시예들은 실시예 63~65에서 얻어진 균체를 사용하는 제1공정과 회수된 (+)-호모필로핀산 에스테르와 리피아제 OF를 사용하는 제2공정을 결합하여 행한 (+)-호모필로핀산 제조에 관한 것이다. 그 결과들을 표10에 나타냈다.

표 10

* 1) 0.1M트리스(pH 7.5) : 2㎖, (±)-호모필로핀산 에틸에스테르: 100㎎, 30℃, 50시간

* 2) 0.1M트리스(pH 7.5) : 1㎖, 리파아제 OF, 30℃, 50시간

* 3) 호모필로핀산 수율

Claims

아스로박터 글로비포르미스(Arthrovacter globiformis), 아스퍼질러스 소재(Aspergillus sojae), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus), 에세리키아 콜리(Escherichia coli), 커닝가멜라 에키눌라타(Cunninghamella echinulata), 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 크산토모나스 오리제(Xanthomonas oryzae),

칸디다 유티리스(Candida utilis), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 세라티아 플리무치카(Serratia plymuthica), 셀룰로모나스터바타(Cellulomonas turbata), 노카디아 에리스로폴리스(Nocardia erythropolis), 노카디아 오파카(Nocardia opaca), 노카디아 코랄리나(Nocardia corallina), 노카디아 루브로퍼팅타(Nocardiarubropertincta), 바실러스 서브티리스(Bacillus sabtilis), 후라보박테륨 루테센스(Flavobacterium lutescens), 브레비박테륨케토글루타리쿰(Brevibacterium ketoglutaricum), 미코박테륨로도크라우스(Mucobacterium rhodochrous), 리조부코르 미하이(Rhizomucor miehei), 로도코쿠스 에리스로 폴리스(Rhodococcus erythropolis), 로도토룰라루브라(Rhodotorula rubra)에 속하는 미생물의 배양물, 배양물에서 분리한 균체 또는 균체를 제거한 배양액, 균체를 파쇄하여 얻은 조효소액 존재하에, 하기 일반식[Ⅰ]로 표시되는 (+)-호모필로핀산 에스테르와 하기 일반식[Ⅱ]로 표시되는 (-)-호모필로핀산 에스테르의 혼합물을 가수분해함을 특징으로 하는 (+)-호모필로핀산 및 그 염의 제조방법.

(식 중, R₁은 C₁∼ C₁₀의 직쇄 또는 분기상 탄화수소기를 나타냄)(식 중, R₂는 C₁∼ C₁₀의 직쇄 또는 분기상 탄화수소기를 나타냄)
리파아제, 에스테라아제, 콜레스테롤 에스테라아제, 리포프로테인 리파아제들 중 적어도 1종류의 효소를 사용하여 일반식[Ⅰ]로 표시되는 (+)-호모필로핀산 에스테르와

(식 중, R₁은 C₁∼ C₁₀의 직쇄 또는 분기상 탄화수소기를 나타냄) 일반식[Ⅱ]로 표시되는 (-)-호모필로핀산 에스테르의 (식 중, R₂는 C₁∼ C₁₀의 직쇄 또는 분기상 탄화수소기를 나타냄) 혼합물을 가수분해함을 특징으로 하는 (+)-호모필로핀산 및 그 염의 제조방법.
일반식[Ⅰ]로 표시되는 (+)-호모필로핀산 에스테르와

(식 중, R₁은 C₁∼ C₁₀의 직쇄 또는 분기상 탄화수소기를 나타냄) 일반식[Ⅱ]로 표시되는 (-)-호모필로핀산 에스테르의 (식 중, R₂는 C₁∼ C₁₀의 직쇄 또는 분기상 탄화수소기를 나타냄) 혼합물을 리파아제, 에스테라아제, 콜레스테롤 에스테라아제로 이루어진 그룹에서 선택한 가수분해 효소 또는 브레비박테륨 암모니아겐스(Brevibacterium ammoniagens), 에세리키아 불너리스(Escherichia Vulneris), 로도토루라 루부라(Rhodotorula rubra)에 속하는 미생물의 배양물, 배양물에서 분리한 균체 또는 균체를 제거한 배양액, 균체를 파쇄하여 얻은 조효소액을 사용하여 가수분해한 다음 미반응의 (+)-호모필로핀산 에스테르를 회수하고, 회수한 미반응 (+)-호모필로핀산 에스테르를 리파제, 에스테라아제에서 선택한 가수분해효소 또는 아스퍼질러스 소재(Aspergillus sojae), 에세리키아 콜리(Escherichia coli), 크산토모나스 오리제(Xanthomonas oryzae), 칸디다 유티리스(Candida utilis), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 세라티아 플리무치카(Serratia plymuthica), 셀룰로모나스터바타(Cellulomonas turbata), 노카디아 에리스로폴리스(Nocardia erythropolis), 노카디아 루브로퍼팅타(Nocardia rubropertincta), 바실러스 서브티리스(Bacillus sabtilis), 후라보박테륨 루테센스(Flavobacterium lutescens), 브레비박테륨케토글루타리쿰(Brevibacterium ketoglutaricum), 미코박테륨로도크라우스(Mucobacterium rhodochrous), 리조부코르 미하이(Rhizomucor miehei), 로도코쿠스 에리스로 폴리스(Rhodococcus erythropolis)에 속하는 미생물의 배양물, 배양물에서 분리한 균체 또는 균체를 제거한 배양액, 균체를 파쇄하여 얻은 조효소액을 사용하여 가수분해함을 특징으로 하는 (+)-호모필로핀산 및 그 염의 제조방법.