JPH03198796A - （＋）‐ホモピロピン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は緑内障治療薬として用いられる（＋）体の塩酸
ピロカルビンを合成する際の有用な中間体である（＋）
−ホモピロピン酸またはその塩を製造する方法に関する
。

〔従来の技術〕

下記の構造式［Ｉ１１］で示される（＋）体の塩酸ピロ
カルビンは現在ブラジルなどに自生するヤボラエステル
という］を強酸性下で加水分解して得られた式［■］で
表わされる（」−）−ホモピロピン酸と、 式［Ｖ］で表わされる　（−）−ホモピロピン酸の混合
物［この混合物を以下（±）−ホモピロピン酸という］ ンジの葉から抽出されている。しかしこのような天然物
からの抽出は、その供給が天候に左右され、安定的に供
給できるとはいい難かった。

一方、（＋）体の塩酸ピロカルビンを全合成によす製造
する場合においては、　（＋）−ホモピロピン酸エステ
ルと（−）−ホモピロピン酸エステルとの混合物［この
混合物を以下（±）−ホモピロピン酸を、ｄ−α−メチ
ルベンジルアミンを用いて光学分割して（−）−ホモピ
ロピン酸を除去したのち、（＋）体の塩酸ピロカルビン
へ導く方法が知られていた（Ｊ、１．ＤｅＧｒａｗら、
およびＪ、Ｐｈａｒｎ＋、Ｓｃｉ、６４＋１７００−１
７０１　（１９７５）　）。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら従来法で示されているような強酸性下で（
±）−ホモピロピン酸エステルを加水分解すると、ラク
トン環が破壊され（＋）−ホモピロピン酸の歩留まりは
低下する。またアルカリ性下で加水分解しても、同様に
ラクトン環が破壊され（＋）−ホモピロピン酸の収率は
著しく低下するという問題があった。そこで本発明の課
題は、上記の問題がなく効率の良い（＋）−ホモピロピ
ン酸の製造方法を提供しようとするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等らは（±）−ホモピロピン酸エステルから（
＋）−ホモピロピン酸を効率良く製造するために鋭意検
討を重ねた結果、微生物または酵素を用いて、ラクトン
環の破壊が起こらないような温和な条件で反応を行うこ
とによって、（＋）−ホモピロピン酸を効率良く製造で
きることを見いだし、本発明を完成した。

すなわち本発明は、（１）アースロハクター属、アスペ
ルギルス属、エシェリキア属、カニンガメラ属、キサン
トモナス属、キャンディダ属、シュードモナス属、セラ
チア属、セルロモナス属、ノカルディア属、バチラス属
、フラボバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミコ
バクテリウム属、リゾムコール属、ロドトルラ属、また
はロドコッカス属に属する微生物の菌体またはその処理
物を用いて、一般式［Ｉ］、［ＴＩ］で表わされる化合
物の混合物である（＋）−ホモピロピン酸エステル（式
中、Ｒ１，Ｒ２ばＣ，〜Ｃ，，の直鎖または分校状の炭
化水素基を示す）を加水分解することを特徴とする（＋
）−ホモピロピン酸またはその塩の製造方法に特徴を有
するものである（以下第（１）の方法という）。

また本発明は、（２）リパーゼ、エステラーゼ、コレス
テロールエステラーゼ、リボプロティンリパーゼのうち
少なくとも１種類の酵素を用いて、一般式［Ｉ］、［Ｉ
Ｉ］で表わされる化合物の混合物である（±）−ホモピ
ロピン酸エステル（式中、Ｒ，、Ｒ，はＣ４〜ＣＩＯの
直鎖または分枝状の炭化水素基を示す）を加水分解する
ことを特徴とする（」−）−ホモピロピン酸またはその
塩の製造方法に特徴を有するものである（以下第（２）
の方法という）。

さらに本発明は、（３）（＋）−ホモピロピン酸エステ
ルに特異的に作用するリパーゼ、エステラーゼ、コレス
テロールエステラーゼから成る群から選ぶ加水分解酵素
あるいはブレビバクテリウム属、エシェリキア属、ロド
トルラ属に属する微生物またはその処理物のうち少なく
とも１種類を用いて、一般式［Ｉ］　（式中、Ｒ３はＣ
ｌ””　Ｃ１ｏの直鎖または分校状の炭化水素基を示す
）で表わされる（＋）−ホモピロピン酸エステルと、一
般式［■］（式中、Ｒ２は０１〜ＣＩＯの直鎖または分
校状の炭化水素基を示す）で表わされる（−）−ホモピ
ロピン酸エステルとの混合物に作用させたのち、未反応
の（＋）ホモピロビン酸エステルを回収し、続いて、回
収した（＋）−ホモピロピン酸エステルを加水分解する
リパーゼ、エステラーゼなどの酵素あるいはアスペルギ
ルス属、エシェリキア属、キサントモナス属、キャンデ
ィダ属、シュードモナス属、セラチア属、セルロモナス
属、ノカルディア属、ハチラス属、フラボバクテリウム
属、ブレビバクテリウム属、ミコバクテリウム属、リゾ
ムコール属、ロドコッカス属に属する微生物またはその
処理物のうち、少なくとも１種類に作用させることを特
徴とする　（］−）−ホモピロピン酸またはその塩の製
造方法に特徴を有するものである（以下第（３）の方法
という）。

以下、本発明をさらに詳述する 本発明において、原料として用いられる一般式［Ｉ］と
［ＩＩ］で表わされた化合物の混合物である（±）−ホ
モピロピン酸エステルのＲ，およびＲ２は、Ｃ，〜Ｃ３
゜の直鎖または分校状の炭化水素基が好ましく、その代
表的な例としてメチル基、エチル基、イソプロピル基、
ｔ−ブチル基およびオクチル基が挙げられる。

本発明の上記第（１）の方法において用いることのでき
る微生物としては、アースロハクター・グロビフォルミ
スＩＦＯ１２１３６、アスペルギルス・ソジェーＩＡＭ
　２７０３、　アスペルギルス・テレウスＪＡＭ２１７
９、エシェリキア・コリ　ＩＦＯ３３６６、カニンガメ
ラ・エステラーゼＩＦ０４４４３、　キサントモナス・
カンペストリスＩＦＯ１３３０３、キサントモ　ナス・
オリゼーＩＦＯ３５１０、キャンディダ・ユチリスＩＦ
０４９６１、　シュードモナス・エルギノサＩＩＩＭ１
２７５、セラチア・ブリムチ力ＪＣＭ　１２４４、　セ
ルロモナス・ツルバタ微工研菌寄第９０５９号（ＦＥＲ
ＭＰ−９０５９）、ノカルディア・エリスロポリスＪＡ
Ｍ　１４８４、ノカルディア・オパーカＪＡＭ　１２１
２３、ノカルディア・コラリナＩＡＭ　１２１２］、ノ
カルディア・ルフ゛ロペルティンクタＪＣＭ　３２０４
、　ハチラス・サチルスＩＦＯ３１０８、フラボバクテ
リウム・ルテッセンスＩＦＯ３０８４、ブレビバクテリ
ウム・ケトグルタミカム＾ＴＣＣ１５５８８、ミコバク
テリウム・ロドクラ／！、ＩＦ０１３１６１、リゾムコ
ール−ミーハイ　ＩＦＯ９７４０、ロドコッカス・エリ
スロポリスＩＰ０１２６Ｂ２、ロドトルラ・ルブラＩＦ
Ｏ０３８３が挙げられる。

本発明の第（１）の方法においては、これらの微生物を
（±）−ホモピロピン酸エステルを含有する培地に培養
しても（＋）−ホモピロピン酸を製造し得るが、好まし
くはこれらの微生物をイーストエキス、ペプトン、グル
コース、無機塩などからなる培地を用いて、２０〜３７
°Ｃで１日から１週間培養して得た培養物、該培養物か
ら分離した菌体あるいは菌体を除去した培養液、もしく
は菌体を破砕して得た粗酵素液等の菌体処理物を（±）
−ホモピロピン酸エステルと接触させることにより行う
。

例えば、これら培養物、菌体、菌体を除去した培養物も
しくは菌体処理物等を含有するｐＨ５〜９、好ましくは
ｐ　Ｈ６，０〜８．０の燐酸緩衝液あるいは１〜リス塩
酸緩衝液中に、原料のく±）−ホモピロピン酸エステル
をＯ，１〜３０％、好ましくは０．５〜１０％添加して
、２０〜３７°Ｃで振とうしながら２時間〜１００時間
反応を行うことによって（＋）−ホモピロピン酸が水溶
液中に得られる。水溶液のｐＨはホモピロピン酸が生成
するにつれて低下するので、水酸化ナトリウム水溶液（
０，５規定）、炭酸水素ナトリウムあるいは炭酸す１−
リウムの飽和水溶液で中和しながら反応を行うことによ
って、反応を効率よく進めることができる。反応終了後
、水または緩衝液に溶解している（」−）−ホモピロピ
ン酸ナトリウムは、通常の溶媒抽出法あるいはイオン交
換樹脂を用いｔ回収、精製することができる。溶媒抽出
法の一例を示すと、ますジエチルエーテルを加えて激し
く攪拌して静置したのち、上層のエーテル層を取り出し
、未反応の原料エステルを除去する。つぎに２規定塩酸
あるいは２規定硫酸を加えて水層のｐＨを２〜４に調整
したあと、飽和濃度になるまで食塩を添加する。そこへ
酢酸エチルを一容加えて、激しく攪拌したのち、遠心分
離を行い、酢酸エチル層を回収する。これを減圧乾固す
ることによってホモピロピン酸の粗結晶が得られる。ホ
モピロピン酸の（＋）体と（−）体（７）組成は用いる
微生物によって異なるが、　（＋）−ホモピロピン酸と
（−）−ホモピロピン酸の比は９１：９から２５　：　
７５である。　（＋）−ホモピロピン酸を純度良く得る
にはりシムコール・ミーハイＩＰ０９７４０株が最適で
ある。ホモピロピン酸の粗結晶中に含まれる（−）−ホ
モピロピン酸はｄ−α−メチルヘンシルアミンなどの光
学分割剤で処理することによって除去すれば純度の高い
（＋）−ホモピロピン酸を得ることができる。この（＋
）−ホモピロピン酸から、既知の合成法を用いることに
よって天然品と同等の塩酸ピロカルビンが得られる。

次に、本発明の前記第（２）の方法において用いること
のできる酵素としては、シュードモナス・スピーシーズ
由来のリパーゼＰＳ（天野製薬）、リゾプス・デレマー
由来のリパーゼ（生化学工業社製）、ムコール・ミーハ
イ由来のりボザイムＩＭ２０（ノボ社製）、シュードモ
ナス・フラジ由来のリパーゼＢ、およびキャンディダ・
シリンドラセ−由来のリパーゼＯＦ（名糖産業社製）、
シュードモナス・フラジ由来のリパーゼＴ−１）１（東
洋醸造）、あるいはブタ肝臓由来のエステラーゼ（ベー
リンガー社製）、　あるいはシュードモナス・スピーシ
ーズ由来のコレステロールエステラーゼＴ−１８（東洋
醸造社製）、　あるいはシュードモナス・スピーシーズ
由来のリポプロティンリパーゼ（和光純薬社製）などが
代表的な酵素として挙げることができる。

本発明の第（２）の方法においては、これらの酵素を水
または適当な緩衝液に溶かして、　（±）−ホモピロピ
ン酸エステルと接触させることによって行う。酵素と（
±）−ホモピロピン酸エステルおよび水または適当な緩
衝液の比は用いる酵素によって異なるが、酵素１部に対
してエステル０．５〜１０００部、水または緩衝液２〜
１，０００，０００部である。反応時１７）ｐ）（は５
〜９、好ましくはｐ　Ｈ６，０〜８．０の燐酸緩衝液あ
るいはトリス塩酸緩衝液中で、２０〜３７°Ｃで振とう
しながら２時間〜１００時間反応を行うことによって（
＋）−ホモピロピン酸が水？ｔｊｆａ中に得られる。ま
たツイーン８０などの界面活性剤を０．０２〜１％濃度
で添加して反応速度を高めて反応することもできる。水
溶液中のｐｎはホモピロピン酸が生成するにつれて低下
するので、水酸化ナトリウム水溶液（０，５規定）、　
炭酸水素ナトリウムあるいは炭酸ナトリウムの飽和水溶
液で中和することによって、反応は効率よく進む。反応
終了後、水または緩衝液に溶解している　（十）−ホモ
ピロピン酸ナトリウムは、上記第（１）の方法の中で述
べたような溶媒抽出法あるいはイオン交換樹脂を用いて
回収、精製することができる。培養抽出法で得た粗結晶
のホモピロビン酸中の（」−）体と（−）体の組成比は
用いる酵素によって異なるが、８４　：　１６から１０
　：　９０である。　（＋）−ホモピロピン酸を純度良
く得るにはパラターゼＭ１００ＯＬ　（ノボ社製）が最
適である。この段階で含まれる　（−）−ホモピロピン
酸はｄ−α−メチルヘンシルアミンなどの光学分割剤で
（−）−ホモピロピン酸を除去すれば純度の高い（＋）
−ホモピロピン酸を得ることができる。以後はこの（＋
）−ホモピロピン酸から、既知の合成法を用いることに
よって天然品と同等の純度を持った（→−）体の塩酸ピ
ロカルビン［（＋）体の含有率９７．５％］が得られる
。

本発明の第（３）の方法は、従来法及び本発明の前記第
（１）の方法及び第（２）の方法において用いられてい
る光学分割工程を必要としないものであり、光学分割工
程の煩雑さ、およびこの工程における（」−）ホモピロ
ピン酸の歩留りの低下という問題点を解消した点に特徴
を有するものである。

この第（３）の方法は第Ｉ段目の（±）−ホモビロピ”
Ｊ　Ｍｊｔ　Ｔ：　ｘステル混合物中の（−）−ホモピ
ロピン酸エステルを選択的に加水分解し、　（＋）−ホ
モピロピン酸エステルを回収する工程、及び第２段目の
回収された（＋）−ホモピロピン酸エステルを加水分解
して（＋）−ホモピロピン酸を生成せしめる工程からな
るものである。

上記第一段目の反応に用いることのできる代表的な酵素
としては、クロモバクテリウム・ビスコサム由来のリパ
ーゼＴ−０１、シュードモナス・スピーシーズ由来のコ
レステロールエステラーゼＴ１８（以上東洋醸造社製）
、　シュードモナス・フラジ由来のリパーゼＢ（和光純
薬社製）、シュードモナス・スピーシーズ由来のリパー
ゼＰＳ（大野製薬社製）、　クロモバクテリウム・ビス
コサム由来のリパーゼ（シグマ社製）などが挙げられる
。また第一段目の反応に用いることのできる代表的な微
生物としてはブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＩ
ＦＯ１２０７２、エシェリキア・ブルネリスＪＣＭ１６
８８、ロドトルラ・ルブラＩＦ００８９３などが挙げら
れる。これらの酵素あるいは微生物またはその処理物の
うち少なくとも１種類を適当な緩衝液または水に溶解あ
るいは懸濁させて、　（±）−ホモピロピン酸エステル
と接触させることによって加水分解を行う。これらの酵
素と（±）−ホモピロピン酸エステルおよび緩衝液の比
は用いる酵素によって異なるが、酵素１部に対してエス
テル０．５〜１０００部、緩衝液２〜１．０００，００
０部である。またツイーン８０などの界面活性剤を０．
０２〜１％濃度で添加して反応速度を高めることもでき
る。反応時のｐＨは５〜９、好ましくはｐＨ６，０〜８
．０の燐酸緩衝液あるいはトリス塩酸緩衝液中で２０〜
３７°Ｃで、振とうしながら数時間から１週間反応を行
うことによって（−）−ホモピロピン酸が水溶液中に生
成し、未反応物である（＋）−ホモピロピン酸エステル
は油層に残る。反応時間は酵素の種類と添加量、および
原料エステルの種類と添加量によって決められるが、水
溶液中に生成したホモピロピン酸の対原料モル収率が少
なくとも５０％、あるいはそれ以上になったところで反
応を停止することが望ましい。水溶液中のｐＨはホモピ
ロピン酸が生成するにつれて低下するので、水酸化ナト
リウム（０，５規定）、炭酸水素ナトリウムあるいは炭
酸ナトリウムの飽和水溶液などのアルカリ性液でｐＨを
６〜８に調整することによって、反応を効率よく進める
ことができる。反応終了後、未反応の（＋）−ホモピロ
ピン酸エステルは、ジエチルエーテルや酢酸エチルなど
の有機溶媒を用いて回収できるので、これを第二段目の
反応の原料に用いる。

次に第二段目の反応に用いることのできる代表的な酵素
としては、リゾプス・デレマー由来のリパーゼ（生化学
工業社製）、ムコール・ミーハイ由来のりボザイムＩＭ
２０（ノボ社製）、キャンディダ・シリンドラセ−由来
のリパーゼＯＦ（名糖産業社製）、あるいはブタ肝臓由
来のエステラーゼ（ベーリンガー社製）が挙げられる。

また第二段目の反応に用いることのできる代表的な微生
物としてはアスペルギルス、ソジェーｒＡＭ　２７０３
、エシェリキア・コリ　ＩＦＯ３３６６、キサントモナ
ス・オリゼーＩＦ０３５１０、キャンディダ・ユチリス
ｒＦｏ４９６１、シュードモナス・エルギノサＴＡＭ１
３１３０、　セラチア・プリムチ力ＪＣＭ　１２４４、
　セルロモナス・ツルバタＦＥＲＭ　Ｐ−９０５９、ノ
カルディア・エリスロポリスＩＡＭ　１４８４、　ノカ
ルディア・ルプロペルティンクタＪＣＭ　３２０４、　
バチラス・サチルスＩＦＯ３１０８フラボバクテリウム
・ルテッセンスｒＦ０３０８４、ブレビバクテリウム・
ケトグルタミカムＡＴＣＣ１５５８８、ミコバクテリウ
ム・ロドクラスＩＦＯ１３１６１、リゾムコール・ミー
ハイ　ＩＦＯ９７４０、ロドコッカス・エリスロポリス
ＩＦ０１２６８２などが挙げられる。これらの微生物を
用いる場合は、これらの微生物を（＋）−ホモピロピン
酸エステルを含有する培地に培養しても（＋）−ホモピ
ロピン酸を得ることができるが、好ましくはこれらの微
生物をイーストエキス、ペプトン、グルコース、無機塩
などからなる培地を用いて、２０〜３７°Ｃで１日から
１週間培養して得た培養物、該培養物から分離した菌体
あるいは菌体を除去した培養液、もしくは菌体を破砕し
て得た粗酵素液等の菌体処理物を用いることが適当であ
る。

すなわち第２段目の反応は、これらの酵素あるいは微生
物またはその処理物のうち少なくとも１種類を、適当な
緩衝液または水に溶解あるいは懸濁させて、第一段目の
反応で回収した未反応の（＋）−ホモピロピン酸エステ
ルと接触させることによって行う。酵素あるいは微生物
またはその処理物と（＋）−ホモピロピン酸エステルお
よび緩衝液の比は用いる酵素あるいは微生物によって異
なるが、酵素あるいは微生物またはその処理物１部に対
してエステル０．５〜１０００部、緩衝液２〜１，００
ｏ　、　ｏｏｏ部である。反応時のｐＨは５〜９、好ま
しくはｐ　Ｈ６，０〜８．０の燐酸緩衝液あるいはトリ
ス塩酸緩衝液中で２０〜３７°Ｃで、振とうしながら数
時間から１時間反応を行うことによって（＋）−ホモピ
ロピン酸が水溶液中に生成する。第一段目の反応と同様
に界面活性剤を添加したり、アルカリ性液を適時添加し
てｐＨを６〜８付近に保つことによって、反応を効率よ
く進めることができる。反応の終了は、高速液体クロマ
トグラフィーなどの分析装置を用いて反応液中の原料エ
ステルを分析し、原料が消失した頃を目安とすればよい
。反応終了後、水溶液中の（＋）−ホモピロピン酸ナト
リウムは、通常の溶媒抽出法あるいはイオン交換樹脂を
用いて回収、精製することができる。回収した粗結晶を
メチルエステル化してＮＭＲで分析すると、　（−）−
ホモピロピン酸に相当するビークは認められず、はぼ純
粋の（＋）−ホモピロピン酸のみが生成していることが
わかる。また天然品と同等の塩酸ピロカルビンを得るに
は、ここで生成した（＋）−ホモピロピン酸を原料とし
て既知の合成法を用いれば良く、この際、面倒な光学分
割を行わなくても良い。

〔発明の効果〕

本発明によれば、酵素や微生物菌体などの生体触媒を用
いて温和な条件で反応を行うので、従来法のように、　
（±）−ホモピロピン酸エステルを加水分解するときに
生成していたラクトンの分解物などの副産物が認められ
ず、（＋）−ホモピロピン酸を極めて収率良く得ること
ができる。

本発明の第（３）の方法によれば、光学分割の工程を必
要としないので、工程の簡略化とともに生産効率も向上
するものである。したがって本発明により緑内障治療薬
として用いられる塩酸ピロカルビンの生産効率を大いに
向上させることが可能となった。

〔実施例］ 以下、本発明を実施例により具体的に説明する。

ただし、本発明はこれらの実施例により限定されるもの
ではない。

なお、実施例中のＮＭＲ分析は、重クロロホルム中ホモ
ピロビン酸のメチルエステルに対し０．５当量のＥｕ（
ｈｆｃ）　（）リス［３−（へブタフルオロプロピルヒ
ドロキシメチレン）−ｄ−カンホラト１　ユウロピウム
（■））を共存させて測定したものである。

以下の実施例１〜２４は本発明第（１）の方法の具体例
を示すものである。

実施例１ ノカルジア・ルブロペルティンクタＪＣＭ　３０２４株
の一白金耳を第１表に示す培地１００ｍＲに植菌し、３
０°Ｃで４日間培養した。培養物を遠心分離して培養液
を除去し、２１６ｍｇの乾燥菌体を得た。この菌体を０
．１Ｍリン酸緩衝液１．９　ｎｒＲ（ｐ　Ｈ７，０）に
懸濁し、１μ！のツイーン８０、　（±）−ホモピロピ
ン酸オクチルエステルを９２μ！添加して、３０°Ｃで
２４時間、攪拌しながら反応を行った。反応の途中、約
６時間毎に飽和炭酸ナトリウム水溶液を添加してｐＨを
７に調整した。反応終了後、溶媒抽出法によってホモピ
ロピン酸の結晶２３■を得た。これをメチルエステル化
したのち、ＮＭＲを用いて（＋）体のホモピロピン酸の
含有率を調べたところ８７％であった。一方、（−）−
ホモピロピン酸の含有率は１３％であった。

実施例２ エシェリキア・コリ　ＩＦｏ　３３６６株の一白金耳を
第１表の培地１００瀬に植菌し、３０°Ｃで１日培養し
、２２０ｍｇの乾燥菌体を得た。この菌体を０．１Ｍ）
リス緩衝液１．６　ｍｌ　（ｐ　Ｈ８，０）に懸濁し、
１μｆｆのツイーン８０、　（±）−ホモピロピン酸エ
チルエステルを７５μ！添加して、３０°Ｃで２４時間
、攪拌しながら反応を行った。反応の途中、約６時間毎
に飽和炭酸ナトリウム水溶液を添加してｐＨを８に調整
した。

反応終了後、溶媒抽出法によってホモピロピン酸の結晶
２３ｍｇを得た。これをメチルエステル化したのち、Ｎ
ＭＲを用いて（＋）体のホモピロピン酸の含有率を調べ
たところ７８％であった。一方、（−）ホモピロピン酸
の含有率は２２％であった。

第１表 ニュートリエント イーストエキス グルコース （ＮＩ＋４）２ＳＯ４ ＮａｚｌｉＰＯ，＋　・１２ＨｚＯ ＫＨ２ＰＯ。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ＣａＣ１ｚ　・２ＨｚＯ ＦｅＳＯａ　・７１１ｚＯ ＮａｚＭｏＯ４ ＭｎＳＯａ　４６ＨｚＯ ＺｎＳ０４・７Ｈ２０ ブロス ｇ ｇ ７．５ｇ ｇ ｇ ０．３ｇ ０．１ｇ ０．０５ｇ ０．０１ｇ ０．６ｍｇ ０．６ｍｇ １．２ｍｇ 実施例３ リゾムコール・ミーハイ　ＩＦｏ　９７４０株の胞子を
第２表の培地５　ｍｌに懸濁し、３０″Ｃで３日間培養
を行った。つぎに同じ組成の培地１００ｍＲに全量移し
てさらに３０°Ｃで４日間培養を行った。この培養物を
濾過して、培養液を除去し６５０ｍｇの乾燥菌体を得た
。この菌体を０．１Ｍ　リン酸緩衝液７．５ｍＲ（ｐＨ
７，０）に懸濁し、３μＰのスパン８０、原料として（
±）−ホモピロピン酸エチルエステルを２００μ！添加
して、３０゛Ｃで４８時間、攪拌しながら反応を行った
。反応の途中、約６時間毎に炭酸ナトリウム飽和水溶液
を添加してｐＨを７に調整した。反応終了後、溶媒抽出
法によってホモピロピン酸の結晶２５■を得た。これを
メチルエステル化したのち、ＮＭＲを用いて（」＝）体
のホモピロピン酸の含有率を調べたところ９１％であっ
た。一方、　（−）−ホモピロピン酸は９％であった。

（本頁以下余白） 第２表 第３表 イーストエキス マルトエキス （Ｎｌ＋４）２ＳＯ４ 蔗　　糖 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ＣａＣＩｚ　・２１ｈＯ ｇ ｇ ０　　　ｇ ０．１ｇ ０．０５ｇ 実施例４〜２４ 実施例１〜３と同様な方法で、種々の菌株を用いて（＋
）−ホモピロピン酸の生産を行った。生成したホモピロ
ピン酸のモル収率および（＋）−ホモピロピン酸の含有
率を第３表に示す。

（木頁以下余白） ４７−ス１１バクター・グ■ピアｔｌＬミｙ、ＩＦＯ１
２１３６５７スベルギルス・ソンエー■へＭ２７０３６
アスベルギルス・テレウスＪＡＭ２１７９７　パ、カニ
ンガメラ・エステラーゼ　ＩＦＯ４４４３８キサントモ
ナス・オリセー　ＩＦＯ３５］、０９　　　　キリント
モナス、カン〜ストリス　　ＩＦＯ１３３０３１０キヤ
ンテイダ・１チリスＩＦＯ４９６１１１シュードモナス
・エルギノサ　■へ門　１２７５１２　　　　セラチア
・ブリムチ力　ＪＣＭ　　１２４４（←１））　セルロ
モナス・ツルバタ　ＦＥＲＭ　　Ｐ−９０５９１４ツカ
１岬テイア・エリスロポリス■へと１４８４１５　　　
　ノカルディア・オバー力　ＪＡＭ　　１２１２３１６
ノカ）ｌティア・フラリナＩＡ）’１１２１２１１７ノ
カルテイア・ルプυぺ；レティンクタＪＣＭ３２０４１
８　　　　ハチラス・サチルス　ＩＦｏ　　３１０８１
９フラホバクテリウム・ルテッセンスＩＦ０３０８４２
０ブレビバクテリウム・ケトグルダミカムＡＴＣＣ１５
５８８２１ミコバクテリウム・ＤＦクラスＴＦＯ１３１
６１＊１）原料：　（±）−ホモピロピン酸メチル（Ｍ
ｅ）、エチル（Ｅ　ｔ）、イソプロピル（ｉＰｒ）、Ｌ
−ブチル（ｔＢｕ）、オクチル（Ｏｃｔ）の各エステル
９２）　含有率（χ）：［（＋）−ホモピロピン酸／生
成ホモピロピン酸］　　Ｘ１００エ　　　２８ 以下の実施例２５〜３６は本発明（２）の方法の具体例
を示すものである。

実施例２５ リゾプス・デレマー由来のリパーゼ（生化学工業社製）
３６■を２　ｍｌの０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７）に懸
濁し、１μρのツイーン８０．１００ｍｇの（±）ホモ
ピロピン酸エチルエステルを添加して、３０°Ｃで２４
時間、攪拌しながら反応を行った。反応の途中、約６時
間毎に炭酸すｌ−ＩＪウム飽和溶液を添加してｐＨを７
に調整した。反応終了後、溶媒抽出法によってホモピロ
ピン酸の白色針状結晶１釦ｇを得た。ホモピロピン酸の
モル収率ば１６％であった。

この標品をメチルエステル化したのち、ＮＭＲを用いて
（＋）体のホモピロピン酸の含有率を調べた。

（＋）−ホモピロピン酸は６９％、（−）−ホモピロピ
ン酸は３１％であった。

実施例２６ ブタ肝臓由来のエステラーゼ（１０００Ｕ　／　ｍｌ、
ベーリンガー社製）６０Ｕを２ｍｌの０．１Ｍ燐酸緩衝
液（ｐＨ７，０）に懸濁する。そこに１μでのツイーン
８０、（＋）−ホモピロピン酸ブチルエステルを１００
ｍｇ添加して、３０°Ｃで２４時間、攪拌しながら反応
を行った。反応の途中、約６時間毎に炭酸ナトＩＪウム
飽和溶液を添加してｐＨを７に調整した。反応終了後、
溶媒抽出法によってホモピロピン酸の結晶３０ｍｇを得
た。ホモピロピン酸のモル収率ば２５％であった。この
標品をメチルエステル化したのぢ、ＮＭＲを用いて（＋
）体のホモピロピン酸の含有率を調べた。　（＋）−ホ
モピロピン酸は７１％であった。

一方（＝）−ホモピロピン酸は２９％含まれていた。

実施例２７〜３５ 実施例２５〜２６と同様な方法で、種々の酵素を用いて
（＋）−ホモピロピン酸の生産を行った。ホモピロピン
酸の収率および（＋）体の含有率を第４表に示す。

（本頁以下余白） 以下の実施例は本発明第（３）の方法の具体例を示すも
のである。

なおＮＭＲの分析は９０ＭＨｚを用いて行い、比旋光度
（［α１．）は試料をクロロホルムに溶かして室温で測
定した。

実施例３６ シュードモナス・フラジ由来のリパーゼＢ　（和光純薬
社製）８．５ｍｇを１０ｍ２の０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）に懸濁し、そこに（±）−ホモピロピン酸エ
チルエステルを６００ｍｇおよび４μ！のツイーン８０
を添加して攪拌しながら、３０°Ｃで反応を行った。反
応の途中、約６時間毎に炭酸ナトリウムの飽和溶液を添
加してｐＨを７に調整した。１９時間反応後、反応液の
ｐＨを８．０に調整し、１０ｍ１のヂエチルエーテルを
加えて激しく攪拌したあと遠心分離によってエーテル層
を回収した。この抽出操作を３回繰り返したあとエーテ
ルを除去することによって（＋）−ホモピロピン酸エチ
ルエステルを２３５■回収した。エステルの回収率は３
９％であった。またこのエステルの比旋光度［α１．は
７６．１度であった。

実施例３７ 実施例３６で得られた回収エステル２３５ｍｇと３μ！
のツイーン８０およびリパーゼＯＦ１５０ｍｇを１２　
ｍｌの０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）に添加して、
加水分解反応を行った。反応後、溶媒抽出法によってホ
モピロピン酸の結晶１２７ｍｇを得た。第一段および第
二段で反応したときの通算のモル収率ば２５％であった
。本結晶の比旋光度［α１．は７９．４度であった。一
方、本結晶をメチルエステル化したのち、ＮＭＲで分析
したところ（＝）−ホモピロピン酸メチルエステルに相
当するシグナルはほとんど認められなかった（第１図）
。

実施例３８ 第二段目の反応に用いるバチラス・ザチルスＩＦＯ３１
０８の培養を行い、その菌体を調製した。すなわち本菌
の一白金耳を第５表に示す培地１００ｍＲに植菌し、さ
らにエステル分解活性を高めるために、培地に１％の大
豆油を添加して、３０°Ｃで１日間培養した。培養物を
遠心分離して培養液を除去し、３６０ｍｇの乾燥菌体を
得た。

第５表 ニュートリエント イーストエキス グルコース （Ｎｌ＋４）２ＳＯ４ ＮａＪＰＯａ　４２１（ｚ。

ＨｚＰＯａ ＭｇＳＯｎ・７Ｈ２０ ＣａＣｌｚ　’　２１１ｚＯ ＦｅＳＯｎ　Ｈ７Ｈ２Ｏ ａＪｏＯ４ ＭｎＳＯ４・６ＨｚＯ フロス ｇ ｇ ７．５　ｇ ｇ ０．３　ｇ ｏ、１　ｇ ０．０５ｇ ０．０１ｇ ０．６ｍｇ ０．６ｍｇ 実施例３９ 実施例３８で得られたハチラス・サチルスＩＦ０３１０
８の乾燥菌体３６０ｍｇを５ｄの０．１Ｍ燐酸緩衝液（
ｐＨ７，０）に懸濁させ、実施例３６で得られた（＋）
ホモピロピン酸エチルエステルを１００ｍｇおよび２μ
ｌのツイーン８０を添加して攪拌しながら、３０’Ｃで
反応を行った。反応の途中、約６時間毎に炭酸ナトリウ
ムの飽和溶液を添加してｐＨを７に調整した。７２時間
反応後、前述の溶媒抽出法によって（＋）−ホモピロピ
ン酸を抽出した。白色の針状結晶７１■を得た（モル収
率は８４％）。この結晶の比旋光度ＣαＩＤは８１．２
度であった。

実施例４０ 第二段目の反応に用いるリゾムコール・ミーハイ　ＪＦ
ｏ　９７４０株を培養し、その菌体を調製した。

本菌の胞子を第６表の培地５　ｍｌ、に懸濁し、３０’
Ｃで３日間培養を行った。つぎに同じ組成の培地１００
成に全量移してさらに３０″Ｃで４日間培養を行った。

この培養物を濾過して培養液を除去し、９２０ｍｇの乾
燥菌体を得た。

（来夏以下余白） 第６表 イーストエキス マルトエキス （ＮＩ＋４）２ＳＯ４ 蔗　　糖 ＭｇＳＯ４・７１１２０ ＣａＣＩｚ　・２ＨｚＯ ｇ ｇ ｇ ０　　　ｇ Ｏ，Ｉｇ ０．０５ｇ 実施例４１ 実施例３６で得られたく＋）−ホモピロピン酸エチルエ
ステル１００ｍｇと実施例４０で得られたりシムコール
・ミーハイ　ＩＰｏ　９７４０株の培養菌体２００ｍｇ
および２μ尼のツイーン８０を５　ｍｌの０．１Ｍ燐酸
緩衝液（ｐＨ７，０）に添加し、３０°Ｃで反応を行っ
た。反応の途中、約６時間毎に炭酸ナトリウム飽和溶液
を添加してｐＨを７に調整した。６８時間反応した後、
溶媒抽出法によってホモピロピン酸の［結晶６１ｍｇを
得た。ホモピロピン酸のモル収率は７２％であった。ま
たこの結晶の比旋光度［αＩＤは７９．８度であった。

これをメチルエステル化したのち、ＮＭＲで分析したと
ころ（−）−ホモピロピン酸メチルエステルに相当する
シグナルはほとんど観察されなかった。

実施例４２〜４５ （−）−ホモピロピン酸エステルに選択的に作用する４
種類の酵素を用いて反応した後、未反応の（＋）−ホモ
ピロピン酸エステルを回収した。（」−）ホモピロピン
酸エステルの回収率、比旋光度［α１゜を第７表に示す
。

（来夏以下余白） 実施例４６〜４７ （＋）−ホモピロピン酸エステルを加水分解する酵素を
用いて、実施例４４で得られたく＋）−ホモピロピン酸
エチルエステルの加水分解を行った。生成した（＋）−
ホモピロピン酸エステルの収率および比旋光度［αＩＤ
を第８表に示す。

実施例４８〜４９ （＋）−ホモピロピン酸エステルを加水分解する酵素を
用いて実施例４５で得られたく＋）−ホモピロピン酸エ
チルエステルの加水分解を行った。生成した（＋）−ホ
モピロピン酸エステルの収率および比旋光度［αＩＤを
第８表に示す。

（本頁以下余白） 実施例５０〜５２ （＋）−ホモピロピン酸エステルを加水分解する酵素を
用いて、実施例４２で得られた（」−）−ホモピロピン
酸エチルエステルの加水分解を行った。生成した（」−
）−ホモピロピン酸の収率および比旋光度［αＩＤを第
９表に示す。

実施例５３〜５８ （＋）−ホモピロピン酸エステルを加水分解する一酵素
を用いて実施例４３で得られた（＋）−ホモピロピン酸
エチルエステルの加水分解を行った。生成した（＋）−
ホモピロピン酸の収率および比旋光度［α１．を第９表
に示す。

実施例５９〜６１ （＋）−ホモピロピン酸エステルを加水分解する酵素を
用いて実施例４５で得られた（＋）−ホモピロピン酸エ
チルエステルの加水分解を行った。生成した（＋）−ホ
モピロピン酸の収率および比旋光度［α］、を第９表に
示す。

実施例６２ （＋）−ホモピロピン酸エステルを加水分解する酵素を
用いて実施例４４で得られた（＋）−ホモピロピン酸エ
チルエステルの加水分解を行った。生成した（＋）−ホ
モピロピン酸の収率および比旋光度［α１．を第９表に
示す。

（本頁以下余白） 第　９　表（第二段目の微生物反応） ５０　　　　アスペルギルス・ソシエー　ｒＡＭ　　２
７０３’　　　　　　　　　　　　　３２　　　　　　
　　　Ｅｔ　　　　　　　　３６５１　　　　エシェリ
キア・ゴリ　　ＩＦＯ３３６６＊２）　　　　　　　　
Ｅｌ　　　　　　　　６８５２　　　　キサントモナス
・オリセー　■ＰＯ３５１０４２Ｅｔ　　　　　　　　
１２５３　　　　キャンティダ・１チリス　ＩＦＯ４９
６１２３Ｅｔ　　　　　　　　８５４　　　　シュード
モナス・エルギハ　ｒＦｏ　　１３１３０　　　　　　
　　　　　３０　　　　　　　　　ｐｔ　　　　　　　
　１０５５　　　　セラチア・ブリムチ力　ＪＣＭ１２
４４　　　　　　　　　　　　　　　１３　　　　　　
　　　Ｅｔ　　　　　　　　１４５６　　　　セルｌモ
ナス・ツルバタ　ＦＥＲＭ　　Ｐ−９０５９１７Ｅｔ　
　　　　　　　６０５７　　　　ツカルティア・エリス
ロポリス　■へＭ１４８４　　　　　　　　　　　１８
　　　　　　　　　Ｅｔ　　　　　　　１４５８　　　
　ツカルティア・ルプロペルティンクタ　ＪＣＭ３２０
４　　　　　　　　４３　　　　　　　　　ＩＥｔ　　
　　　　　　　４５９　　　　フラホバクテリウム・ル
テッセンス　ＩＦＯ３０８４２０Ｅｔ　　　　　　　　
２９６０　　　　ブレビバクテリウム・ケトグルタミカ
ム　ＡＴＣＣ１５５８８１６Ｅｔ　　　　　　　　５９
６１　　　　ＴＪ）コツカス・エリスロポリス　ｒＦｏ
　　１２６８２　　　　　　　　　　１８　　　　　　
　　　ロ（３３６２ミコバクテリウム−Ｄドクラス　ｒ
ＦＯ１３１６１６０ｃｔ　　　　　　　　６反応は、０
．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）５−中に各種の原料エ
ステルを１１０ｍｇ添加して３０℃で４８ｈｒ行った。

＋ｕ＋　Ｅｔ：　（±）−ホモピロピン酸エチルエステ
ル酸オクチルエステルを表わす。実施例５０〜５２、５
３〜５８、５９〜６１および６２の原料は、それぞれ実
施例４２，　４３，　４５．　４４で調製した回収エス
テルを用いた。

申２）第１表の培地を用いて３０°Ｃで２４ｈｒ培養後
、回収エステルを１１０ｍｇ添加して４８ｈｒ反応した
。

実施例６３〜６５は第一段目の反応に用いるための微生
物菌体の調製を行った。

実施例６３ 第一段目の反応に用いるブレビバクテリウム・アンモニ
アゲスＩＦ０　１２０７２株を、第５表に示す培地（１
００ｍＲ）を用いて３０°Ｃで１日培養し、２７０ｍｇ
の乾燥菌体を得た。

実施例６４ エシェリキア・ブルネリスＪＣＭ　１６８８株を、第５
表に示す培地（１００ｍＲ）を用いて３０°Ｃで１日培
養し、５　４　０　ｒｎｇの乾燥菌体を得た。

実施例６５ ０ドトルラ・ルブラＩＦＯ　０８９３を第６表に示す培
地（１０　０　ｍｌ　）を用いて３０°Ｃで２日間培養
し、７５０ｍｇの乾燥菌体を得た。

以下の実施例６６〜６８は、実施例６３〜６５で調製し
た菌体を用いて、それぞれ第一段目の反応を行ったあと
、ひきつづき未反応の（＋）−ホモピロピン酸エステル
を原料として第二段目の反応を行った具体例を示すもの
である。なお、第二段目の反応ではリパーゼ叶を用いて
加水分解を行った。生成したホモピロピン酸の比旋光度
を第１０表に示す。

（零頁以下余白）

【図面の簡単な説明】

第１図に、実施例３７で得られたカルボン酸をメチルエ
ステルにみちびき、重クロロボルム中０．５当量のＥｕ
　（ｈｆｃ）　：ｌを共存させて測定したＮＭＲスペク
トルを示す。 出願人　三井石油化学工業株式会社 代理人　弁理士　平　木　祐　輔 同　　弁理士　石　井　貞　次 第 ニルエステル ＝７０２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アースロバクター属、アスペルギルス属、エシェリ
   キア属、カニンガメラ属、キサントモナス属、キャンデ
   ィダ属、シュードモナス属、セラチア属、セルロモナス
   属、ノカルディア属、バチラス属、ブレビバクテリウム
   属、フラボバクテリウム属、ミコバクテリウム属、リゾ
   ムコール属、ロドトルラ属、またはロドコッカス属に属
   する微生物の菌体またはその処理物を用いて、一般式［
   I ］（式中、Ｒ＿１はＣ＿１〜Ｃ＿１＿０の直鎖また
   は分枝状の炭化水素基を示す）で表わされる（＋）−ホ
   モピロピン酸エステルと、▲数式、化学式、表等があり
   ます▼［ I ］ 一般式［II］（式中、Ｒ＿２はＣ＿１〜Ｃ＿１＿０の直
   鎖または分枝状の炭化水素基を示す）で表わされ▲数式
   、化学式、表等があります▼［II］ る（−）−ホモピロピン酸エステルとの混合物を加水分
   解することを特徴とする（＋）−ホモピロピン酸または
   その塩の製造方法。 ２、リパーゼ、エステラーゼ、コレステロールエステラ
   ーゼ、リボプロテインリパーゼのうち少なくとも１種類
   の酵素を用いて、一般式［ I ］（式中、Ｒ＿１はＣ＿
   １〜Ｃ＿１＿０の直鎖または分枝状の炭化水素基を示す
   ）で表わされる（＋）−ホモピロピン酸エステルと、 ▲数式、化学式、表等があります▼［ I ］ 一般式［II］（式中、Ｒ＿２はＣ＿１〜Ｃ＿１＿０の直
   鎖または分枝状の炭化水素基を示す）で表わされ▲数式
   、化学式、表等があります▼［II］ る（−）−ホモピロピン酸エステルとの混合物を加水分
   解することを特徴とする（＋）−ホモピロピン酸または
   その塩の製造方法。 ３、一般式［ I ］（式中、Ｒ＿１はＣ＿１〜Ｃ＿１＿
   ０の直鎖または分枝状の炭化水素基を示す）で表わされ
   る（＋）−ホモピロピン酸エステルと、 ▲数式、化学式、表等があります▼［ I ］ 一般式［II］（式中、Ｒ＿２はＣ＿１〜Ｃ＿１＿０の直
   鎖または分枝状の炭化水素基を示す）で表わされ▲数式
   、化学式、表等があります▼［II］ る（−）−ホモピロピン酸エステルとの混合物を、（−
   ）−ホモピロピン酸エステルを選択的に加水分解するリ
   パーゼ、エステラーゼ、コレステロールエステラーゼか
   ら成る群から選ぶ加水分解酵素あるいはブレビバクテリ
   ウム属、エシェリキア属、ロドトルラ属に属する微生物
   またはその処理物のうち少なくとも１種類に作用させた
   のち、未反応の（＋）−ホモピロピン酸エステルを回収
   し、続いてこのエステルを（＋）−ホモピロピン酸エス
   テルを加水分解するリパーゼ、エステラーゼから成る群
   から選ぶ加水分解酵素あるいはアスペルギルス属、エシ
   ェリキア属、キサントモナス属、キャンディダ属、シュ
   ードモナス属、セラチア属、セルロモナス属、ノカルデ
   ィア属、バチラス属、フラボバクテリウム属、ブレビバ
   クテリウム属、ミコバクテリウム属、リゾムコール属、
   ロドコッカス属に属する微生物またはその処理物のうち
   、少なくとも１種類に作用させることを特徴とする（＋
   ）−ホモピロピン酸またはその塩の製造方法。