JP2880204B2 - （＋）‐ホモピロピン酸の製造法 - Google Patents

（＋）‐ホモピロピン酸の製造法

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JP2880204B2 JP1302273A JP30227389A JP2880204B2 JP 2880204 B2 JP2880204 B2 JP 2880204B2 JP 1302273 A JP1302273 A JP 1302273A JP 30227389 A JP30227389 A JP 30227389A JP 2880204 B2 JP2880204 B2 JP 2880204B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は緑内障治療薬として用いられる（＋）体の塩
酸ピロカルピンを合成する際の有用な中間体である
（＋）−ホモプロピン酸またはその塩を製造する方法に
関する。
〔従来の技術〕
下記の構造式［III］で示される（＋）体の塩酸ピロ
カルビンは現在ブラジルなどに自生するヤボラ ンジの葉から抽出されている。しかしこのような天然物
からの抽出は、その供給が天候に左右され、安定的に供
給できるとはいい難かった。
一方、（＋）体の塩酸ピロカルピンを全合成により製
造する場合においては、（＋）−ホモロピン酸エステル
と（−）−ホモピロピン酸エステルとの混合物［この混
合物を以下（±）−ホモピロピン酸エステルという］を
強酸性下で加水分解して得られた式［IV］で表わされる
（＋）−ホモピロピン酸と、 式［Ｖ］で表わされる（−）−ホモピロピン酸の混合物
［この混合物を以下（±）−ホモピロピン酸という］ を、ｄ−α−メチルベンジルアミンを用いて光学分割し
て（−）−ホモピロピン酸を除去したのち、（＋）体の
塩酸ピロカルピンへ導く方法が知られていた（J.I.DeGr
awら，およびJ.Pharm.Sci.64,1700−1701（1975））。
〔発明が解決しようとする課題〕
しかしながら従来法で示されているような強酸性下で
（±）−ホモピロピン酸エステルを加水分解すると、ラ
クトン環が破壊され（＋）−ホモピロピン酸の歩留まり
は低下する。またアルカリ性下で加水分解しても、同様
にラクトン環が破壊され（＋）−ホモピロピン酸の収率
は著しく低下するという問題があった。そこで本発明の
課題は、上記の問題がなく効率の良い（＋）−ホモピロ
ピン酸の製造方法を提供しようとするものである。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者等らは（±）−ホモピロピン酸エステルから
（＋）−ホモピロピン酸を効率良く製造するために鋭意
検討を重ねた結果、微生物または酵素を用いて、ラクト
ン環の破壊が起こらないような温和な条件で反応を行う
ことによって、（＋）−ホモピロピン酸を効率良く製造
できることを見いだし、本発明を完成した。
すなわち本発明は、（１）アースロバクター属、アス
ペルギルス属、エシェリキア属、カニンガメラ属、キサ
ントモナス属、キャンディダ属、シュードモナス属、セ
ラチア属、セルロモナス属、ノカルディア属、バチラス
属、フラボバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミ
コバクテリウム属、リゾムコール属、ロドトルラ属、ま
たはロドコッカス属に属する微生物の菌体またはその処
理物を用いて、一般式［１］、［II］で表わされる化合
物の混合物である（＋）−ホモピロピン酸エステル（式
中、R1、R2はC1〜C10の直鎖または分枝状の炭化水素基
を示す）を加水分解することを特徴とする（＋）−ホモ
ピロピン酸またはその塩の製造方法に特徴を有するもの
である（以下第（１）の方法という）。
また本発明は、（２）リパーゼ、エステラーゼ、コレ
ステロールエステラーゼ、リポプロティンリパーゼのう
ち少なくとも１種類の酵素を用いて、一般式［Ｉ］、
［II］で表わされる化合物の混合物である（±）−ホモ
ピロピン酸エステル（式中、R1、R2はC1〜C10の直鎖ま
たは分枝状の炭化水素基を示す）を加水分解することを
特徴とする（＋）−ホモピロピン酸またはその塩の製造
方法に特徴を有するものである（以下第（２）の方法と
いう）。
さらに本発明は、（３）（＋）−ホモピロピン酸エス
テルに特異的に作用するリパーゼ、エステラーゼ、コレ
ステロールエステラーゼから成る群から選ぶ加水分解酵
素あるいはブレビバクテリウム属、エシェリキア属、ロ
ドトルラ属に属する微生物またはその処理物のうち少な
くとも１種類を用いて、一般式［Ｉ］（式中、R1はC1〜
C10の直鎖または分枝状の炭化水素基を示す）で表わさ
れる（＋）−ホモピロピン酸エステルと、一般式［II］
（式中、R2はC1〜C10の直鎖または分枝状の炭化水素基
を示す）で表わされる（−）−ホモピロピン酸エステル
との混合物に作用させたのち、未反応の（＋）−ホモピ
ロピン酸エステルを回収し、続いて、回収した（＋）−
ホモプロピン酸エステルを加水分解するリパーゼ、エス
テラーゼなどの酵素あるいはアスペルギルス属、エシェ
リキア属、キサントモナス属、キャンディダ属、シュー
ドモナス属、セラチア属、セルロモナス属、ノカルディ
ア属、バチラス属、フラボバクテリウム属、ブレビバク
テリウム属、ミコバクテリウム属、リゾムコール属、ロ
ドコッカス属に属する微生物またはその処理物のうち、
少なくとも１種類に作用させることを特徴とする（＋）
−ホモピロピン酸またはその塩の製造方法に特徴を有す
るものである（以下第（３）の方法という）。
以下、本発明をさらに詳述する。
本発明において、原料として用いられる一般式［Ｉ］
と［II］で表わされた化合物の混合物である（±）−ホ
モピロピン酸エステルのR1およびR2は、C1〜C10の直鎖
または分枝状の炭化水素基が好ましく、その代表的な例
としてメチル基、エチル基、イソプロピル基、ｔ−ブチ
ル基およびオクチル基が挙げられる。
本発明の上記第（１）の方法において用いることので
きる微生物としては、アースロバクター・グロビフォル
ミスIFO 12136、アスペルギルス・ソジェーIAM 2703、
アスペルギルス・テレウスIAM 2179、エシェリキア・コ
アIFO 3366、カニンガメラ・エキニュラータIFO 4443、
キサントモナス・カンペストリスIFO 13303、キサトモ
ナス・オリゼーIFO 3510、キャンディダ・ユチリスIF
O 4961、シュードモナス・エルギノサIAM 1275、セラチ
ア・プリムチカJCM 1244、セルロモナス・ツルバタ 微
工研菌寄第9059号（FERMP−9059）、ノカルディア・エ
リスロポリスIAM 14 84、ノカルディア・オバーカIAM 1
2123、ノカルディア・コラリナIAM 12121、ノカルディ
ア・ルブロペルティンクタJCM 3204、バチラス・サチル
スIFO 3108、フラボバクテリウム・ルテッセンスIFO 30
84、ブリビバクテリウム・ケトグルタミカムATCC 1558
8、ミコバクテリウム・ロドクラスIFO 13161、リゾムコ
ール・ミーハイIFO 9740、ロドコッカス・エリスロポリ
スIFO 12682、ロドトルラ・ルブラIFO 0383が挙げられ
る。
本発明の第（１）の方法においては、これらの微生物
を（±）−ホモピロピン酸エステルを含有する培地に培
養しても（＋）−ホモピロピン酸を製造し得るが、好ま
しくはこれらの微生物をイーストエキス、ペプトン、グ
ルコース、無機塩などからなる培地を用いて、、20〜37
℃で１日から１週間培養して得た培養物、該培養物から
分離した菌体あるいは菌体を除去した培養液、もしくは
液体を破砕して得た粗酵素液等の菌体処理物を（±）−
ホモピロピン酸エステルと接触させることにより行う。
例えば、これら培養物、菌体、菌体を除去した培養物
もしくは菌体処理物等を含有するpH5〜９、好ましくはp
H6.0〜8.0の燐酸緩衝液あるいはトリス塩酸緩衝液中
に、原料の（±）−ホモピロピン酸エステルを0.1〜30
％、好ましくは0.5〜10％添加して、20〜37℃で振とう
しながら２時間〜100時間反応を行うことによって
（＋）−ホモピロピン酸が水溶液中に得られる。水溶液
のpHはホモピロピン酸が生成するにつれて低下するの
で、水酸化ナトリウム水溶液（0.5規定）、炭酸水素ナ
トリウムあるいは炭酸ナトリウムの飽和水溶液で中和し
ながら反応を行うことによって、反応を効率よく進める
ことができる。反応終了後、水または緩衝液に溶解して
いる（＋）−ホモピロピン酸ナトリウムは、通常の溶媒
抽出法あるいはイオン交換樹脂を用いて回収、精製する
ことができる。溶媒抽出法の一例を示すと、まずジエチ
ルエーテルを加えて激しく撹拌して静置したのち、上層
のエーテル層を取り出し、未反応の原料エステルを除去
する。つぎに２規定塩酸あるいは２規定硫酸を加えて水
層のpHを２〜４に調整したあと、飽和濃度になるまで食
塩を添加する。そこへ酢酸エチルを一容加えて、激しく
撹拌したのち、遠心分離を行い、酢酸エチル層を回収す
る。これを減圧乾固することによってホモピロピン酸の
粗結晶が得られる。ホモピロピン酸の（＋）体と（−）
体の組成は用いる微生物によって異なるが、（＋）−ホ
モピロピン酸と（−）−ホモピロピン酸の比は91:9から
25:75である。（＋）−ホモピロピン酸を純度良く得る
にはリゾムコール・ミーハイIFO 9740株が最適である。
ホモピロピン酸の粗結晶中に含まれる（−）−ホモピロ
ピン酸はｄ−α−メチルベンジルアミンなどの光学分割
剤で処理することによって除去すれば純度の高い（＋）
−ホモピロピン酸を得ることができる。この（＋）−ホ
モピロピン酸から、既知の合成法を用いることによって
天然品と同時の塩酸ピロカルピンが得られる。
次に、本発明の前記第（２）の方法において用いるこ
とのできる酵素としては、シュードモナス・スピーシー
ズ由来のリパーゼPS（天野製薬）、リゾプス・デレマー
由来のリパーゼ（生化学工業社製）、ムコール・ミーハ
イ由来のリポザイムIM20（ノボ社製）、シュードモナス
・フラジ由来のリパーゼＢ、およびキャンディダ・シリ
ンドラセー由来のリパーゼOF（名糖産業社製）、シュー
ドモナス・フラジ由来のリパーゼＴ−01（東洋醸造）、
あるいはブタ肝臓由来のエステラーゼ（ベーリンガー社
製）、あるいはシュードモナス・スピーシーズ由来のコ
レステロールエステラーゼＴ−18（東洋醸造社製）、あ
るいはシュードモナス・スピーシーズ由来のリポプロテ
インリパーゼ（和光純薬社製）などが代表的な酵素とし
て挙げることができる。
本発明の第（２）の方法においては、これらの酵素を
水または適当な緩衝液に溶かして、（±）−ホモピロピ
ン酸エステルと接触させることによって行う。酵素と
（±）ホモピロピン酸エステルおよび水または適当な緩
衝液の比は用いる酵素によって異なるが、酵素１部に対
してエステル0.5〜1000部、水または緩衝液２〜1,000,0
00部である。反応時のpHは５〜９、好ましくはpH6.0〜
8.0の燐酸緩衝液あるいはトリス塩酸緩衝液中で、20〜3
7℃で振とうしながら２時間〜100時間反応を行うことに
よって（＋）−ホモピロピン酸が水溶液中に得られる。
またツイーン80などの界面活性剤を0.02〜１％濃度で添
加して反応速度を高めて反応することもできる。水溶液
中のpHはホモピロピン酸が生成するにつれて低下するの
で、水酸化ナトリウム水溶液（0.5規定）、炭酸水素ナ
トリウムあるいは炭素ナトリウムの飽和水溶液で中和す
ることによって、反応は効率よく進む。反応終了後、水
または緩衝液に溶解している（＋）−ホモピロピン酸ナ
トリウムは、上記第（１）の方法の中で述べたような溶
媒抽出法あるいはイオン交換樹脂を用いて回収、精製す
ることができる。培養抽出法で得た粗結晶のホモピロピ
ン酸中の（＋）体と（−）体の組成比は用いる酵素によ
って異なるが、84:16から10:90である。（＋）−ホモピ
ロピン酸を純度良く得るにはパラターゼM1000L（ノボ社
製）が最適である。この段階で含まれる（−）−ホモピ
ロピン酸はｄ−α−メチルベンジルアミンなどの光学分
割剤で（−）−ホモピロピン酸を除去すれば純度の高い
（＋）−ホモピロピン酸を得ることができる。以後はこ
の（＋）−ホモピロピン酸から、既知の合成法を用いる
ことによって天然品と同等の純度を持った（＋）体の塩
酸ピロカルビン［（＋）体の含有率97.5％］が得られ
る。
本発明の第（３）の方法は、従来法及び本発明の前記
第（１）の方法及び第（２）方法において用いられてい
る光学分割工程を必要としないものであり、光学分割工
程の煩雑さ、およびこの工程における（＋）ホモピロピ
ン酸の歩留りの低下という問題点を解消した点に特徴を
有するものである。
この第（３）の方法は第１段目の（±）−ホモピロピ
ン酸でエステル混合物中の（−）−ホモピロン酸エステ
ルを選択的に加水分解し、（＋）−ホモピロピン酸エス
テルを回収する工程、及び第２段目の回収された（＋）
−ホモピロピン酸エステルを加水分解して（＋）−ホモ
ピロピン酸を生成せしめる工程からなるものである。
上記第一段目の反応を用いることのできる代表的な酵
素としては、クロモバクテリウム・ビスコサム由来のリ
パーゼＴ−01、シュードモナス・スピーシーズ由来のコ
レステロールエステラーゼＴ−18（以上東洋醸造社
製）、シュードモナス・フラジ由来のリパーゼＢ（和光
純薬社製）、シュードモナス・スピーシーズ由来のリパ
ーゼPS（天野製薬社製）、クロモバクテリウム・ビスコ
サム由来のリパーゼ（シグマ社製）などが挙げられる。
また第一段目の反応に用いることのできる代表的な微生
物としてはブレビバクテリウム・アンモニアゲネスIFO
12072、エシェリキア・ブルネリスJCM 1688、ロドトル
ラ・ルブラIFO 0893などが挙げられる。これらの酵素あ
るいは微生物またはその処理物のうち少なくとも１種類
を適当な緩衝液または水に溶解あるいは懸濁させて、
（±）−ホモピロピン酸エステルと接触させることによ
って加水分解を行う。これらの酵素と（±）−ホモピロ
ピン酸エステルおよび緩衝液の比は用いる酵素によって
異なるが、酵素１部に対してエステル0.5〜1000部、緩
衝液２〜1,000,000部である。またツイーン80などの界
面活性剤を0.02〜１％濃度で添加して反応速度を高める
こともできる。反応時のpHは５〜９、好ましくはpH6.0
〜8.0の燐酸緩衝液あるいはトリス塩酸緩衝液中で20〜3
7℃で、振とうしながら数時間から１週間反応を行うこ
とによって（−）−ホモピロピン酸が水溶液中に生成
し、未反応物である（＋）−ホモピロピン酸エステルは
油層に残る。反応時間は酵素の種類と添加量、および原
料エステルの種類と添加量によって決められるが、水溶
液中に生成したホモピロピン酸の対原料モル収率が少な
くとも50％、あるいはそれ以上になったところで反応を
停止することが望ましい。水溶液中のpHはホモピロピン
酸が生成するにつれて低下するので、水酸化ナトリウム
（0.5規定）、炭酸水素ナトリウムあるいは炭酸ナトリ
ウムの飽和水溶液などのアルカリ性液でpHを６〜８に調
整することによって、反応を効率よく進めることができ
る。反応終了後、未反応の（＋）−ホモピロピン酸エス
テルは、ジエチルエーテルや酢酸エチルなどの有機溶媒
を用いて回収できるので、これを第二段目の反応の原料
に用いる。
次に第二段目の反応に用いることのできる代表的な酵
素としては、リゾプス・デレマー由来のリパーゼ（生化
学工業社製）、ムコール・ミーハイ由来のリポザイムIM
20（ノボ社製）、キャンディダ・シリンドラセー由来の
リパーゼOF（名糖産業社製）、あるいはブタ肝臓由来の
エステラーゼ（ベーリンガー社製）が挙げられる。また
第二段目の反応に用いることのできる代表的な微生物と
してはアスペルギルス、ソジェーIAM 2703、エシェリキ
ア・コリIFO 3366、キサントモナス・オリゼーIFO 351
0、キャンディダ・ユチリスIFO4961、シュードモナス・
エルギノサIAM 13130、セラチア・プリムチカJCM 124
4、セルロモナス・ツルバタFERM P−9059、ノカルディ
ア・エリスロポリスIAM 1484、ノカルディア・ルプロペ
ルティンクタJCM 3204、バチラス・サチルスIFO 3108、
フラボバクテリウム・ルテッセンスIFO 3084、ブレビバ
クテリウム・ケトグルタミカムATCC 15588、ミコバクテ
リウム・ロドクラスIFO 13161、リゾムコール・ミーハ
イIFO 9740、ロドコッカス・エリスロポリスIFO 12682
が挙げられる。これらの微生物を用いる場合は、これら
の微生物を（＋）−ホモピロピン酸エステルを含有する
培地に培養しても（＋）−ホモピロピン酸を得ることが
できるが、好ましくはこれらの微生物をイーストエキ
ス、ペプトン、グリコース、無機塩などからなる培地を
用いて、20〜37℃で１日から１週間培養して得た培養
物、該培養物から分離した菌体あるいは菌体を除去した
培養液、もしくは菌体を破砕して得た粗酵素液等の菌体
処理物を用いることが適当である。
すなわち第２段目の反応は、これらの酵素あるいは微
生物またはその処理物のうち少なくとも１種類を、適当
な緩衝液または水に溶解あるいは懸濁させて、第一段目
の反応で回収した未反応の（＋）−ホモピロピン酸エス
テルと接触させることによって行う。酵素あるいは微生
物またはその処理物と（＋）−ホモピロピン酸エステル
および緩衝液の比は用いる酵素あるいは微生物によって
異なるが、酵素あるいは微生物またはその処理物１部に
対してエステル0.5〜1000部、緩衝液２〜1,000,000部で
ある。反応時のpHは５〜９、好ましくはpH6.0〜8.0の燐
酸緩衝液あるいはトリス塩酸緩衝液中で20〜37℃で、振
とうしながら数時間から１時間反応を行うことによって
（＋）−ホモピロピン酸が水溶液中に生成する。第一段
目の反応と同様に界面活性剤を添加したり、アルカリ性
液を適時添加してpHを６〜８付近に保つことによって、
反応を効率よく進めることができる。反応の終了は、高
速液体クロマトグラフィーなどの分析装置を用いて反応
液中の原料エステルを分析し、原料が消失した頃を目安
とすればよい。反応終了後、水溶液中の（＋）−ホモピ
ロピン酸ナトリウムは、通常の溶媒抽出法あるいはイオ
ン交換樹脂を用いて回収、精製することができる。回収
した粗結晶をメチルエステル化してNMRで分析すると、
（−）−ホモピロピン酸に相当するピークは認められ
ず、ほぼ純粋の（＋）−ホモピロピン酸のみが生成して
いることがわかる。また天然品と同等の塩酸ピロカルピ
ンを得るには、ここで生成した（＋）−ホモピロピン酸
を原料として既知の合成法を用いれば良く、この際、面
倒な光学分割を行わなくても良い。
〔発明の効果〕
本発明によれば、酵素や微生物菌体などの生体触媒を
用いて温和な条件で反応を行うので、従来法のように、
（±）−ホモピロピン酸エステルを加水分解するときに
生成していたラクトンの分解物などの副産物が認められ
ず、（＋）−ホモピロピン酸を極めて収率良く得ること
ができる。
本発明の第（３）方法によれば、光学分割の工程を必
要としないので、工程の簡略化とともに生産効率も向上
するものである。したがって本発明により緑内障治療薬
として用いられる塩酸ピロカルピンの生産効率を大いに
向上させることが可能となった。
〔実施例〕
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。ただ
し、本発明はこれらの実施例により限定されるものでは
ない。
なお、実施例中のNMR分析は、重クロロホルム中ホモ
ピロピン酸のメチルエステルに対し0.5当量のEu（hfc）
｛トリス［３（ヘプタフルオロプロピルヒドロキシメチ
レン）−ｄ−カンホラト］ユウロピウム（III）｝を共
存させて測定したものである。
以下の実施例１〜24は本発明第（１）の方法の具体例
を示すものである。
実施例１ ノカルジア・ルブロペルティンクタJCM 3024株の一白
金耳を第１表に示す培地100mlに植菌し、30℃で４日間
培養した。培養物を遠心分離して培養液を除去し、216m
gの乾燥菌体を得た。この菌体を0.1Mリン酸緩衝液1.9ml
（pH7.0）に懸濁し、１μのツイーン80、（±）−ホ
モピロピン酸オクチルエステルを92μ添加して、30℃
で24時間、撹拌しながら反応を行った。反応の途中、約
６時間毎に飽和炭酸ナトリウム水溶液を添加してpHを７
に調整した。反応終了後、溶媒抽出法によってホモピロ
ピン酸の結晶23mgを得た。これをメチルエステル化した
のち、NMRを用いて（＋）体のホモピロピン酸の含有率
を調べたところ87％であった。一方、（−）−ホモピロ
ピン酸の含有率は13％であった。
実施例２ エシェリキア・コリIFO 3366株の一白金耳を第１表の
培地100mlに植菌し、30℃で１日培養し、220mgの乾燥菌
体を得た。この菌体を0.1Mトリス緩衝液1.6ml（pH8.0）
に懸濁し、１μのツイーン80、（±）−ホモピロピン
酸エステルを75μ添加して、30℃で24時間、撹拌しな
がら反応を行った。反応の途中、約６時間毎に飽和炭酸
ナトリウム水溶液を添加してpHを８に調整した。反応終
了後、溶媒抽出法によってホモピロピン酸の結晶23mgを
得た。これをメチルエステル化したのち、NMRを用いて
（＋）体のホモピロピン酸の含有率を調べたところ78％
であった。一方、（−）−ホモピロピン酸の含有率は22
％であた。
１の水に溶かして、pH7.0に調整した。
実施例３ リゾムコール・ミーハイIFO 9740株の胞子を第２表の
培地5mlに懸濁し、30℃で３日間培養を行った。つぎに
同じ組成の培地100mlに全量移してさらに30℃で４日間
培養を行った。この培養物を濾過して、培養液を除去し
650mgの乾燥菌体を得た。この菌体を0.1Mリン酸緩衝液
7.5ml（pH7.0）に懸濁し、３μのスパン80、原料とし
て（±）−ホモピロピン酸エチルエステルを200μ添
加して、30℃で48時間、撹拌しながら反応を行った。反
応の途中、約６時間毎に炭酸ナトリウム飽和水溶液を添
加してpHを７に調整した。反応終了後、溶媒抽出法によ
ってホモピロピン酸の結晶25mgを得た。これをメチルエ
ステル化したのち、NMRを用いて（＋）体のホモピロピ
ン酸の含有率を調べたところ91％であった。一方、
（−）−ホモピロピン酸は９％であった。
１の水に溶かしてpH6.0に調整した。
実施例４〜24 実施例１〜３と同様な方法で、種々の菌株を用いて
（＋）−ホモピロピン酸の生産を行った。生成したホモ
ピロピン酸のモル収率および（＋）−ホモピロピン酸の
含有率を第３表に示す。
以下の実施例25〜36は本発明（２）の方法の具体例を
示すものである。
実施例25 リゾプス・デレマー由来のリパーゼ（生化学工業社
製）36mgを2mlの0.1M燐酸緩衝液（pH7）に懸濁し、１μ
のツイーン80、100mgの（±）−ホモプロピン酸エチ
ルエステルを添加して、30℃で24時間、撹拌しながら反
応を行った。反応の途中、約６時間毎に炭酸ナトリウム
飽和溶液を添加してpHを７に調整した。反応終了後、溶
媒抽出法によってホモピロピン酸の白色針状結晶19mgを
得た。ホモピロピン酸のモル収率は16％であった。この
標品をメチルエステル化したのち、NMRを用いて（＋）
体のホモピロピン酸の含有率を調べた。（＋）−ホモピ
ロピン酸は69％、（−）−ホモピロピン酸は31％であっ
た。
実施例26 ブタ肝臓由来のエステラーゼ（1000U/ml、ベーリンガ
ー社製）60Uを2mlの0.1M燐酸緩衝液（p7.0）に懸濁す
る。そこに１μのツイーン80、（±）−ホモピロピン
酸ブチルエステルを100mg添加して、30℃で24時間、撹
拌しながら反応を行った。反応の途中、約６時間毎に炭
酸ナトリウム飽和溶液を添加してpHを７に調整した。反
応終了後、溶媒抽出法によってホモピロピン酸の結晶30
mgを得た。ホモプロピン酸のモル収率は25％であった。
この標本をメチルエステル化したのち、NMRを用いた
（＋）体のホモピロピン酸の含有率を調べた。（＋）−
ホモピロピン酸は71％であった。一方（−）−ホモピロ
ピン酸は29％含まれていた。
実施例27〜35 実施例25〜26と同様な方法で、種々の酵素を用いて
（＋）−ホモピロピン酸の生産を行った。ホモピロピン
酸の収率および（＋）体の含有率を第４表に示す。
以下の実施例は本発明第（３）の方法の具体例を示す
ものである。
なおNMRの分析は90MHzを用いて行い、比旋光度
（［α］Ｄ）は試料をクロロホルムに溶かして室温で測
定した。
実施例36 シュードモナス・フラジ由来のリパーゼＢ（和光純薬
社製）8.5mgを10mlの0.1M燐酸緩衝液（pH7.0）に懸濁
し、そこに（±）−ホモピロピン酸エチルエステルを60
0mgおよび４μのツイーン80を添加して撹拌しなが
ら、30℃で反応を行った。反応の途中、約６時間毎に炭
酸ナトリウムの飽和溶液を添加してpHを７に調整した。
19時間反応後、反応液のpHを8.0に調整し、10mlのヂエ
チルエーテルを加えて激しく撹拌したあと遠心分離によ
ってエーテル層を回収した。この抽出操作を３回繰り返
したあとエーテルを除去することによって（＋）−ホモ
ピロピン酸エチルエステルを235mg回収した。エステル
の回収率は39％であった。またこのエステルの比旋光度
［α］Ｄは76.1度であった。
実施例37 実施例36で得られた回収エステル235mgと３μのツ
イーン80およびリパーゼOF 150mgを12mlの0.1M燐酸緩衝
液（pH7.0）に添加して、加水分解反応を行った。反応
後、溶媒抽出法によってホモピロピン酸の結晶127mgを
得た。第一段および第二段で反応したときの通算のモル
収率は25％であった。本結晶の比旋光度［α］Ｄは79.4
度であった。一方、本結晶をメチルエステル化したの
ち、NMRで分析したところ（−）−ホモピロピン酸メチ
ルエステルに相当するシグナルはほとんど認められなか
った（第１図）。
実施例38 第二段目の反応に用いるバチラス・サチルスIFO 3108
の培養を行い、その菌体を調整した。すなわち本菌の一
白金耳を第５表に示す培地100mlに植菌し、さらにエス
テル分解活性を高めるために、培地に１％の大豆油を添
加して、30℃で１日間培養した。培養物を遠心分離して
培養液を除去し、360mgの乾燥菌体を得た。
水１リットルに溶かしてpH7.0に調整した。
実施例39 実施例38で得られたバチラス・サチルスIFO 3108の乾
燥菌体360mgを5mlの0.1M燐酸緩衝液（pH7.0）に懸濁さ
せ、実施例36で得られた（＋）−ホモピロピン酸エチル
エステルを100mgおよび２μのツイーン80を添加して
撹拌しながら、30℃で反応を行った。反応の途中、約６
時間毎に炭酸ナトリウムの飽和溶液を添加してpHを７に
調整した。72時間反応後、前述の溶媒抽出法によって
（＋）−ホモピロピン酸を抽出した。白色の針状結晶71
mgを得た（モル収率は84％）。この結晶の比旋光度
［α］Ｄは81.2度であった。
実施例40 第二段目の反応を用いるリゾムコール・ミーハイIFO
9740株を培養し、その菌体を調整した。本菌の胞子を第
６表の培地5mlに懸濁し、30℃で３日間培養を起った。
つぎに同じ組成の培地100mlに全量移してさらに30℃で
４日間培養を行った。この培養物を濾過して培養液を除
去し、920mgの乾燥菌体を得た。
水１リットルに溶かしてpH6.0に調整した。
実施例41 実施例36で得られた（＋）−ホモピロピン酸エチルエ
ステル100mgと実施例40で得られたリゾムコール・ミー
ハイIFO 9740株の培養菌体200mgおよび２μのツイー
ン80を5mlの0.1M燐酸緩衝液（pH7.0）に添加し、30℃で
反応を行った。反応の途中、約６時間毎に炭酸ナトリウ
ム飽和溶液を添加してpHを７に調整した。68時間反応し
た後、溶媒抽出法によってホモピロピン酸の粗結晶61mg
を得た。ホモピロピン酸のモル収率は72％であった。ま
たこの結晶の比旋光度［α］Ｄは79.8度であった。これ
をメチルエステル化したのち、NMRで分析したところ
（−）−ホモピロピン酸メチルエステルに担当するシグ
ナルはほとんど観察されなかった。
実施例42〜45 （−）−ホモピロピン酸エステルに選択的に作用する
４種類の酵素を用いて反応した後、未反応の（＋）−ホ
モピロピン酸エステルを回収した。（＋）−ホモピロピ
ン酸エステルの回収率、比旋光度［α］Ｄを第７表に示
す。
実施例46〜47 （＋）−ホモピロピン酸エステルを加水分解する酵素
を用いて、実施例44で得られた（＋）−ホモピロピン酸
エチルエステルの加水分解を行った。生成した（＋）−
ホモピロピン酸の収率および比旋光度［α］Ｄを第８表
に示す。
実施例48〜49 （＋）−ホモピロピン酸エステルを加水分解する酵素
を用いて実施例45で得られた（＋）−ホモピロピン酸エ
チルエステルの加水分解を行った。生成した（＋）−ホ
モピロピン酸の収率および比旋光度［α］Ｄを第８表に
示す。
実施例50〜52 （＋）−ホモピロピン酸エステルを加水分解する酵素
を用いて、実施例42で得られた（＋）−ホモピロピン酸
エチルエステルの加水分解を行った。生成した（＋）−
ホモピロピン酸の収率および比旋光度［α］Ｄを第９表
に示す。
実施例53〜58 （＋）−ホモピロピン酸エステルを加水分解する酵素
を用いて実施例43で得られた（＋）−ホモピロピン酸エ
チルエステルの加水分解を行った。生成した（＋）−ホ
モピロピン酸の収率および比旋光度［α］Ｄを第９表に
示す。
実施例59〜61 （＋）−ホモピロピン酸エステルを加水分解する酵素
を用いて実施例45で得られた（＋）−ホモピロピン酸エ
チルエステルの加水分解を行った。生成した（＋）−ホ
モピロピン酸の収率および比旋光度［α］Ｄを第９表に
示す。
実施例62 （＋）−ホモピロピン酸エステルを加水分解する酵素
を用いて実施例44で得られた（＋）−ホモピロピン酸 エチルエステルの加水分解を行った。生成した（＋）−
ホモピロピン酸の収率および比旋光度［α］Ｄを第９表
に示す。
実施例63〜65は第一段目の反応に用いるための微生物
菌体の調製を行った。
実施例63 第一段目の反応に用いるブレビバクテリウム・アンモ
ニアゲスIFO 12072株を、第５表に示す培地（100ml）を
用いて30℃で１日培養し、270mgの乾燥菌体を得た。
実施例64 エシェリキア・ブルネリスJCM 1688株を、第５表に示
す培地（100ml）を用いて30℃で１日培養し、540mgの乾
燥菌体を得た。
実施例65 ロドトルラ・ルブラIFO 0893を第６表に示す培地（10
0ml）を用いて30℃で２日間培養し、750mgの乾燥菌体を
得た。
以下の実施例66〜68は、実施例63〜65で調製した菌体
を用いて、それぞれ第一段目の反応を行ったあと、ひと
つづき未反応の（＋）−ホモピロピン酸エステルを原料
として第二段目の反応を行った具体例を示すものであ
る。なお、第二段目の反応ではリパーゼ0Fを用いて加水
分解を行った。生成したホモピロピン酸の比旋光度を第
10表に示す。
【図面の簡単な説明】
第１図に、実施例37で得られたカルボン酸をメチルエス
テルにみちびき、重クロロホルム中0.5当量のEu（hfc）
３共存させて測定したNMRスペクトルを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:64） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:385） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:365） (72)発明者 平塚 純造 山口県玖珂郡和木町和木６丁目１番２号 三井石油化学工業株式会社内 (72)発明者 山田 秀明 京都府京都市左京区松ケ崎木本町19―１ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 41/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アースロバクター属、アスペルギルス属、
    エシェリキア属、カニンガメラ属、キサントモナス属、
    シュードモナス属、セラチア属、ノカルディア属、バチ
    ラス属、ブレビバクテリウム属、フラボバクテリウム
    属、ミコバクテリウム属、リゾムコール属、ロドトルラ
    属、またはロドコッカス属に属する微生物の菌体または
    その処理物を用いて、一般式［Ｉ］（式中、R1はC1〜C
    10の直鎖または分枝状の炭化水素基を示す）で表わされ
    る（＋）−ホモピロピン酸エステルと、 一般式［II］（式中、R2はC1〜C10の直鎖または分枝状
    の炭化水素基を示す）で表わされ る（−）−ホモピロピン酸エステルとの混合物を加水分
    解することを特徴とする（＋）−ホモピロピン酸または
    その塩の製造方法。
  2. 【請求項２】リパーゼ、エステラーゼ、コレステロール
    エステラーゼ、リポプロテインリパーゼのうち少なくと
    も１種類の酵素を用いて、一般式［Ｉ］（式中、R1はC1
    〜C10の直鎖または分枝状の炭化水素基を示す）で表わ
    される（＋）−ホモピロピン酸エステルと、 一般式［II］（式中、R2はC1〜C10の直鎖または分枝状
    の炭化水素基を示す）で表わされ る（−）−ホモピロピン酸エステルとの混合物を加水分
    解することを特徴とする（＋）−ホモピロピン酸または
    その塩の製造方法。
  3. 【請求項３】一般式［Ｉ］（式中、R1はC1〜C10の直鎖
    または分枝状の炭化水素基を示す）で表わされる（＋）
    −ホモピロピン酸エステルと、 一般式［II］（式中、R2はC1〜C10の直鎖または分枝状
    の炭化水素基を示す）で表わされ る（−）−ホモピロピン酸エステルとの混合物を、
    （−）−ホモピロピン酸エステルを選択的に加水分解す
    るリパーゼ、エステラーゼ、コレステロールエステラー
    ゼから成る群から選ぶ加水分解酵素あるいはブレビバク
    テリウム属、エシェルキア属、ロドトルラ属に属する微
    生物またはその処理物のうち少なくとも１種類に作用さ
    せたのち、未反応の（＋）−ホモピロピン酸エステルを
    回収し、続いてこのエステルを（＋）−ホモピロピン酸
    エステルを加水分解するリパーゼ、エステラーゼから成
    る群から選ぶ加水分解酵素あるいはアスペルギルス属、
    エシェリキア属、キサントモナス属、シュードモナス
    属、セラチア属、ノカルディア属、バチラス属、フラボ
    バクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミコバクテリ
    ウム属、リゾムコール属、ロドコッカス属に属する微生
    物またはその処理物のうち、少なくとも１種類に作用さ
    せることを特徴とする（＋）−ホモピロピン酸またはそ
    の塩の製造方法。
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