HU212279B - Process for preparing (+)-homopilopic acid - Google Patents

Process for preparing (+)-homopilopic acid Download PDF

Info

Publication number
HU212279B
HU212279B HU907244A HU724490A HU212279B HU 212279 B HU212279 B HU 212279B HU 907244 A HU907244 A HU 907244A HU 724490 A HU724490 A HU 724490A HU 212279 B HU212279 B HU 212279B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
homopilopic
homopilopic acid
acid
acid ester
ester
Prior art date
Application number
HU907244A
Other languages
English (en)
Other versions
HU907244D0 (en
HUT61292A (en
Inventor
Mikio Hayashida
Junzou Hiratsuka
Shoichi Kise
Aiichiro Ori
Hideaki Yamada
Original Assignee
Iwaki Seiyaku Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Iwaki Seiyaku Kk filed Critical Iwaki Seiyaku Kk
Publication of HU907244D0 publication Critical patent/HU907244D0/hu
Publication of HUT61292A publication Critical patent/HUT61292A/hu
Publication of HU212279B publication Critical patent/HU212279B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • C12P7/38—Cyclopentanone- or cyclopentadione-containing products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
    • C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus
    • Y10S435/839—Bacillus subtilis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/84—Brevibacterium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/939—Rhizopus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Description

Találmányunk (+)-homopilopinsav, valamint sói előállítási eljárására vonatkozik. Ezek a vegyületek a glaukóma gyógykezelésére kiválóan alkalmazható (-t-)-pilokarpin-hidroklorid előállításához alkalmazható intermedierek.
A (III) általános képletű (+)-pilokarpin-hidroklorid előállítása jelenleg a Brazíliában és más országokban is őshonos Pilocarpus jaborandi növény leveleiből történik extrahálással. Az eljárás hátránya azonban, hogy a természetes nyersanyagellátás az időjárás függvénye, és nehéz az állandó szállítás biztosítása.
A (-t-)-pilokarpin-hidroklorid szintézissel való előállításakor erősen savas közegben (+)-homopilopinsavésztert (-)-homopiIopinsav-észtert tartalmazó elegyet [a továbbiakban (±)-homopilopinsav-észter] hidrolizálunk. a kapott (IV) képletű (+)-homopilopinsavat és (V) képletű (-)-homopilopinsavat tartalmazó elegyet [a továbbiakban (±)-homopilopinsav] a (-)-homopilopinsav eltávolítására d-oc-metil-benzil-aminnal optikailag rezolválják, és a (+)-homopilopinsavat (-t-)-pilokarpinhidrokloriddá alakítják át [J. I. DeGraw et al., J. Pharm. Sci., 64: 1700-1701, (1975)].
A (±)-homopilopinsav-észter fentiekben ismertetett erős savas körülmények között megvalósított, eddigiekben alkalmazott hidrolízise a laktongyűrű felhasadását, és emiatt túl alacsony (±)-homopilopinsav hozamot eredményez. Az alkálikus körülmények között megvalósított hidrolízisnél is felhasad a laktongyűrű, és csökken a hozam.
Találmányunk célkitűzése hatékony és nagy hozamú (+)-homopilopinsav előállítási eljárás kidolgozása volt.
Munkánk során azt tapasztaltuk, hogy ha a hidrolízist enyhe körülmények között, és a laktongyűrű-felhasadás megakadályozására valamilyen mikroorganizmus vagy enzim alkalmazásával végezzük, hatékony és nagy hozamú (+)-homopilopinsav előállítás érhető el.
Találmányunk a fentieknek megfelelően a (-t-)-homopilopinsav és sói olyan előállítási eljárására vonatkozik, (1) amelyben (±)-homopilopinsav-észtert, azaz (I) és (II) általános képletű vegyületet tartalmazó elegyet a képletekben R, jelentése 1-10 szénatomos, egyenes vagy elágazó láncú szénhidrogéncsoport - valamilyen mikroorganizmus, amely az Arthrobacter, Aspergillus, Escherichia, Cunninghamella, Xanthomonas, Candida, Pseudomonas, Serratia, Cellulomonas, Nocardia, Bacillus. Brevibacterium. Flavobacterium, Mycobacterium, Rhizomucor, Rhodotorula vagy Rhodococcus nemzetségbe tartozik, vagy ezek kezelésével kapott anyag alkalmazásával hidrolizálunk (1. eljárás); vagy (2) amelyben (±)-homopilopinsav-észter, azaz (I) és (II) általános képletű vegyületet tartalmazó elegyet a képletekben R, jelentése 1-10 szénatomos, egyenes vagy elágazó láncú szénhidrogéncsoport - legalább egy enzim, amely lehet lipáz, észteráz. koleszterol-észteráz vagy lipoprotein-lipáz - alkalmazásával hidrolizálunk (2. eljárás); vagy (3) amelyben (I) általános képletű (-t-)-homopilopinsav-észtert és egy (II) általános képletű (-)-homopilopinsav-észtert - a képletekben R, jelentése egyenes vagy elágazó iáncú szénhidrogén-csoport - tartalmazó elegyet valamilyen hidroláz, amely lehet lipáz, észteráz vagy koleszterol-észteráz, vagy egy Brevibacterium, Escherichia vagy Rhodotorula nemzetiséghez tartozó mikroorganizmus vagy ezek kezelésével nyert anyag, alkalmazásává hidrolizálunk, az el nem reagált (+)-homopilopinsav-észtert kinyerjük, majd ezt valamilyen hidroláz, amely lehet lipáz vagy észteráz vagy valamilyen mikroorganizmus, amely lehet Aspergillus, Escherichia, Xanthomonas, Candida, Pseudomonas, Serratia, Cellulomonas, Nocardia, Bacillus, Flavobacterium, Brevibacterium, Mycobacterium, Rhizomucor vagy Rhodococcus nemzetségbe tartozó mikroorganizmus, vagy ezek kezelésével nyert anyag jelenlétében hidrolizálunk (3. eljárás).
Az 1. ábrán a 7. példában bemutatott eljárással előállított termék metil-észterének tömegspektrométerrel felvett (NMR) spektrumát mutatjuk be (CDCl3-ban, 0,5 ekvivalens Eu(hfc)3 jelenlétében).
A találmányunk szerinti eljárást a következőkben részletesebben ismertetjük.
Az 1-10 szénatomos, egyenes vagy elágazó láncú R, szénhidrogén-csoport lehet például metil-, etil-, izopropil-, terc-butil- vagy oktilcsoport.
A találmányunk szerinti 1. eljárásban alkalmazható mikroorganizmusok például Arthrobacter globiformis IFO 12136, Aspergillus sojae 1AM 2703, Aspergillus terreus IÁM 2179, Escherichia coli IFO 3366, Cunninghamella echinulata IFO 4443, Xanthomonas campestris IFO 13303, Xanthomonas oryzae IFO 3510, Candida utilis IFO 4961, Pseudomonas aeruginosa IÁM 1275, Serratia plymuthica JCM 1244, Cellulomonas turbata FERM P-9059, Nocardia erythropolis IÁM 1484, Nocardia opaca IÁM 12123, Nocardia corallina IÁM 12121, Nocardia rubropertincta JCM 3204, Bacillus subtilis IFO 3108, Flavobacterium lutescens IFO 3084, Brevibacterium ketoglutaricum ATCC 15588, Mycobacterium rhodochrous IFO 13161, Rhizomucor miehei IFO 9740, Rhodococcus erythropolis IFO 12682, Rhodotorula rubra IFO 0383.
A találmányunk szerinti 1. eljárás kivitelezését úgy is végezhetjük, hogy ezeket a mikroorganizmusokat (±)-homopilopinsav-észter-tarta)mú közegben tenyésztjük ki, előnyösebb azonban, ha a kitenyésztést élesztőkivonatot, peptont, glükózt, ásványi sókat és egyéb szükséges anyagokat tartalmazó közegben, 2037 °C-on és 1 naptól 1 hétig terjedő ideig végezzük, majd a kapott tenyészetet, sejtanyagot, a felülúszót vagy ezek valamilyen kezelésével kapott anyagot, mint például a tenyészkultúra sejtjeinek összetörésével nyert nyers enzim-oldatot (±)-homopiIopinsav-észterrel érintkeztetjük.
A (+)-homopilopinsavat például ügy állítjuk elő vizes oldatban, hogy 5-9, előnyösen 6-8 pH-jú, fenti tenyészetet, sejtanyagot, felülúszót vagy ezek valamilyen kezelésével kapott anyagot tartalmazó foszfátpuffer vagy Triszi-HCl elegyhez 0,1-30 tömeg%, előnyösen 0,5-10 tömeg% (±)-homopilopinsav-észtert adunk, és az elegyet 20-37 ’C-on, 2-100 órán át rázzuk. A hidrolízis előrehaladásával a reakcióoldat pH-ja csökken, ezért az elegy semlegesítéséhez és pH-jának beál2
HU 212 279 Β
Utasához előnyösen 0,5 N nátrium-hidroxid-, telített nátrium-hidrogén-karbonát- vagy telített nátrium-karbonát-oldatot adunk. A reakció befejezése után a (+)homopilopinsav reakcióelegyből való kinyerését és tisztítását valamilyen hagyományos oldószer-extrakciós, ioncserélő kromatográfiás és hasonló eljárásokkal végezhetjük. Az el nem reagált kiindulási anyagot elsősorban dietil-éteres extrahálással távolíthatjuk el. A maradék vizes réteg pH-ját 2 N sósav vagy 2 N kénsav oldattal 2—4-re állítjuk, és telítésig nátrium-kloridot adunk hozzá. Ehhez az elegyhez egyenlő térfogatú etil-acetátot adunk, erőteljesen keverjük, és az etil-acetát réteg kinyerésére centrifugáljuk. A szerves réteget ezután csökkentett nyomáson bepároljuk, és így nyers, kristályos hompilopinsavat kapunk. A (+)-homopilopinsav és a (-)-izomer aránya (91:9)-(25:75) határok között változik, az alkalmazott mikroorganizmus függvényében. Nagy tisztaságú (+)-homopilopinsav előállításához előnyösen Rhizomucor miehei IFO 9740 törzset alkalmazunk. A (-)-homopilopinsav-szennyeződés eltávolítását valamilyen optikai rezolválószerként hagyományosan alkalmazott szerrel, mint például d-ametil-benzil-aminnal végezzük.
Az így kapott (+)-homopilopinsavból a természetes anyagból ismert eljárásokkal kinyerhető pilokarpinhidrokloridnak megfelelő terméket állíthatunk elő.
A találmányunk szerinti 2. eljárásban alkalmazható enzimek képviselői például a következők: a Pseudomonas sp.-ből származó Lipase PS (Amano Pharmaceutical Co.. Ltd.) a Rhizopus delemar-ból származó Lipase (Seikagahn Kogyo Co., Ltd.) a Rhizomucor miehei-bóT származó Lipozyme IM 20 (Novo Nordisk Bioindustry Ltd.). a Pseudomonas fragi-ből származó Lipase B és a Candida cylindraceae-ből származó Lipase OF (Meito Sangyo Co., Ltd.), a Pseudomonas fragi-ből származó Lipase T-01 (Toyo Jozo Co., Ltd.), a sertésmájból származó Esterase (Boehringer Manheim), a Pseudomonas sp.-ből származó Cholesterol Esterase T-18 (Toyo Jozo Co., Ltd.) és a Pseudomonas sp.-ből származó Lipoprotein Lipase (Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.).
A találmányunk szerinti 2. eljárásban úgy játszatjuk le a reakciót, hogy a fenti enzimeket vízben vagy valamilyen, megfelelő pufferben oldjuk, és (±)-homopilopinsav-észterrel érintkeztetjük. Az enzim, (±)-homopilopinsav-észter és oldószer tömegaránya az alkalmazott enzimtől függően változik, és általában 1:(0,51000):(2-1 000 000). A reakció kivitelezését előnyösen úgy végezzük, hogy a reakcióelegyet 20-37 ’C-on, 5-9 pH-jú, előnyösen 6-8 pH-jú foszfátpufferben vagy Trisz-HCl-ban 2-100 órán át rázatjuk, és így a vizes oldatban (±)-homopilopinsav képződik. A reakcióelegyhez a reakció elősegítésére valamilyen felületaktív anyagot, például 0,02-1 tömeg% Tween 80-t adunk. A reakció előrehaladásával a pH értéke csökken, ezért a reakcióelegy semlegesítéséhez és pH-jának beállításához előnyösen 0,5 N nátrium-karbonát-oldatot adunk. A reakció befejezése után a képződött (+)-homopilopinsav-nátriumsó reakcióelegyből való kinyerését, az 1. eljárásban ismertetettekhez hasonlóan, valamilyen hagyományos oldószer-extrakciós, ioncserélő kromatográfiás vagy hasonló eljárásokkal végezhetjük. Az oldószeres extrahálással nyert (+)- és (-)-formájú homopilopinsav aránya az alkalmazott enzimtől függően (84:16)-(10:90) határok között változik. A legnagyobb tisztaságú (+)-homopilopinsavat Paratase M 1000L (Novo Nordisk Bioindustry Ltd.) alkalmazásával kapjuk. A (-)-homopilopinsav szennyeződés eltávolítását valamilyen, optikailag rezolválószerként hagyományosan alkalmazott szerrel, mint például d-ametil-benzil-aminnal végezzük.
Az így kapott (+)-homopilopinsavból a természetes anyagokból ismert eljárásokkal kinyerhető (+)-pilokarpin-hidrokloridnak megfelelő terméket állíthatunk elő (tisztaság: 97,5%).
A 3. eljárás, az 1. és 2. eljárásoktól eltérően, nem igényli az optikai rezolválást. A 3. eljárás jellemzője, hogy a bonyolult optikai rezolválás elmarad, és így hozamjavulás érhető el.
A 3. eljárás első lépcsőjében a (+)-homopilopinsavészter kinyerésére először a (±)-homopolopinsav-észter (-)-homopilopinsav-észter komponensét hidrolizáljuk, majd a második lépcsőben az első lépcsőben kapott (-t-)-homopilopinsav-észtert (+)-homopilopinsavvá hidrolizáljuk.
Az első lépcsőben alkalmazható, tipikus enzimek képviselői a következők: a Chromobacterium viscosum-ból származó Lipase T-01 és a Pseudomonas sp.ből származó Cholesterol Esterase T-18 (Toyo Jozo Co., Ltd.), a Pseudomonas fragi-ből származó Lipase B (Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.), a Pseudomonas sp.-ből származó Lipase PS (Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), a Chromobacterium viscosumból származó Lipase (Sigma). Az első lépcsőben alkalmazható mikroorganizmusok tipikus képviselői például a Brevibacterium ammoniagens IFO 12072 törzs, Escherichia vulneris JCM 1688 törzs és a Rhodotorula rubra IFO 0893 törzs. Az első lépésben úgy játszatjuk le a reakciót, hogy legalább egy, fentiekben ismertetett enzimet vagy mikroorganizmust vagy ezek valamilyen kezelésével nyert anyagot vízben vagy megfelelő pufferben oldunk, és a (±)-homopilopinsav-észterrel érintkeztetjük. Az enzim, (±)-homopilopinsav-észter és oldószer tömegaránya az alkalmazott enzimtől függően változik és általában 1:(0,5-1000):(2-1 000 000). Areakcióelegyhez a reakció elősegítésére valamilyen felületaktív anyagot, például 0,02-1 tömeg% Tween 80-t adhatunk. A reakció kivitelezését előnyösen úgy végezzük, hogy a reakcióelegyet 20-37 ’C-on, 5-9 pH-jú, előnyösen 6-8 pH-jú foszfátpufferben vagy Trisz-HClban néhány órától 1 hétig terjedő ideig rázatjuk, és így a vizes rétegben (-)-homopilopinsav képződik, a (+)homopilopinsav pedig az olajos rétegben marad. A reakcióidő az adott enzim és kiindulási észter típusától és mennyiségétől függően változik, és a reakciót előnyösen akkor állítjuk le, ha a vizes rétegben képződő homopilopinsav mennyisége legalább 50 tömeg% vagy ennél több lesz. A reakció előrehaladásával a pH értéke csökken, ezért a reakcióelegy semlegesítéséhez és pHjának beállításához előnyösen 0,5 N nátrium-hidroxid-,
HU 212 279 Β telített nátrium-hidrogén-karbonát- vagy telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldatot adunk. A reakció befejezése után az el nem reagált (-t-)-homopilopinsavat valamilyen szerves oldószerrel, mint például dietil-éterrel vagy etil-acetáttal nyerhetjük ki, és a második lépcsőben kiindulási anyagként alkalmazzuk.
A második lépcsőben alkalmazható enzimek tipikus képviselői például a következők: a Rhizopus delemarból származó Lipase (Seikagahn Kogyo Co., Ltd.), a Rhizomucor miehei-ből származó Lipozyme IM 20 (Novo Nordisk Bioindustry Ltd.), a Candida cylindraceae-ből származó Lipase OF (Meito Sangyo Co., Ltd.) vagy a sertésmájból származó Esterase (Boehringer Mannheim). A második lépcsőben alkalmazható mikroorganizmusok képviselői pedig például: a Aspergillus sojae IÁM 2703, Escherichia coli IFO 3366, Xanthomonas oryzae IFO 3510, Candida utilis IFO 4961, Pseudomonas aeruginosa IÁM 13130, Serratia plymuthica JCM 1244, Cellulomonas turbata FERM P-9059, Nocardia erythropolis IÁM 1484, Nocardia rubropertincta JCM 3204, Bacillus subtilis IFO 3108, Flavobacterium lutescens IFO 3084, Brevibacterium ketoglutaricum ATCC 15588, Micobacterium rhodochorous IFO 13161, Rhizomucor miehei IFO 9740 vagy Rhodococcus erythropolis IFO 12682.
A (+)-homopilopinsav előállítását úgy is végezhetjük. hogy ezeket a mikroorganizmusokat (±)-homopilopinsav-észter-tartalmú közegben tenyésztjük ki, előnyösebb azonban, ha a kitenyésztést élesztőkivonatot, peptont, glükózt, ásványi sókat és egyéb, szükséges anyagokat tartalmazó közegben, 20-37 °C-on és 1 naptól 1 hétig terjedő ideig végezzük, majd a kapott tenyészetet. sejtanyagot, a felülúszót vagy ezek valamilyen kezelésével kapott anyagot, mint például a tenyészkultúra sejtjeinek összetörésével nyert nyers enzim-oldatot (±)-homopilopinsav-észterrel érintkeztetjük.
A második lépcsőben a reakció kivitelezését a fentieknek megfelelően úgy végezhetjük, hogy legalább egy enzimet, mikroorganizmust vagy ezek valamilyen kezelésével nyert anyagot vízben vagy megfelelő pufferben oldunk vagy szuszpendálunk, és ezt az elegyet az első lépcsőből nyers, el nem reagált (+)-homopilopinsav-észterrel érintkeztetjük.
Az enzim, (±)-homopilopinsav-észter és oldószer tömegaránya az alkalmazott enzimtől függően változik. és általában 1:(0,5-1000):(2-1 000 000).
A reakció kivitelezését előnyösen úgy végezzük, hogy a reakcióelegyet 20-37 °C-on, 5-9 pH-jú, előnyösen 6-8 pH-jú foszfátpufferben vagy Trisz-HClban 1 órától néhány óráig terjedő ideig rázatjuk, és így a vizes oldatban (-t-)-homopilopinsav képződik. A reakció elősegítésére az első lépcsőhöz hasonlóan alkalmazhatunk felületaktív anyagot vagy, a reakcióelegy pH-jának 6-8 értékre való beállításával, alkalikus oldatot. A reakció befejeződését nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) elemzéssel figyelhetjük. A reakció befejeződése után a (+)-homopilopinsav-nátriumsó kinyerésére és tisztítására valamilyen hagyományos eljárást, mint például oldószeres extrahálást vagy ioncserés gázkromatográfiát alkalmazhatunk. Akinyert tennék metil-észterének NMR analízise nem mutatja a (-)-pilopinsavnak megfelelő csúcsot, ami arra utal, hogy lényegében tiszta (+)-homopilopinsav képződött.
Az így kapott (+)-homopilopinsavból a természetes anyagokból ismert eljárásokkal kinyerhető (+)-pilokarpin-hidrokloridnak megfelelő terméket állíthatunk elő.
A találmányunk szerinti eljárással a reakció kivitelezését biokatalizátorral, mint például enzimmel vagy mikroorganizmussal végezzük, emiatt a reakciókörülmények olyan enyhék, hogy laktongyűrű felhasadása nem fordul elő és így a (+)-homopilopinsav hozam rendkívül nagy.
A találmányunk szerinti 3. eljárásban nem szükséges az optikailag rezolváló lépcső alkalmazása, ezért az eljárás egyszerűsödik, és a hozam nő. Ezek következtében a találmányunk szerinti eljárás nagy mértékben hozzájárul a glaukóma kezelésére alkalmazható pilokarpin-hidroklorid termelékenység növeléséhez.
A következő példákat a találmányunk szerinti eljárás részletesebb ismertetésére mutatjuk be.
A példákban ismertetett NMR-adatok felvételét CDCl?-ban, 0,5 ekvivalens Eu(hfc) {trisz[3-(heptafluor-propil-hidroxi-metilén)-d-kámfor]-európium(III)) jelenlétében végeztük.
J. példa
100 ml 1. táblázatban bemutatott összetételű tápközeget beoltottunk egy platinahuroknyi Nocardia rubropertincta JCM 3024 törzzsel, és 4 napig, 30 “C-on tenyésztettük. A kapott kultúrát a felülúszó eltávolítására centrifugáltuk, és a pelletet (száraz tömegre számolva 216 mg sejt) 1,9 ml 0,1 mólos foszfátpufferben (pH = 7) szuszpendáltuk. A szuszpenzióhoz 1 pl Tween 80-t és 92 pl (±)-homopiIopinsav-oktilésztert adtunk, és keverés közben hagytuk reagálni 30 °C-on, 24 órán át. A reakció alatt a pH = 7 beállítására minden 6 órában telített nátrium-karbonát-oldatot adtunk az elegyhez. A reakció befejeződése után oldószeres extrahálással 23 mg. kristályos homopilopinsavat kaptunk. A termék (+)-homopilopinsav-tartalmát metilészterré átalakított formában NMR spektroszkópiával határoztuk meg. A (+)-homopilopinsav-tartalom 87%, a (-)-homopilopinsav-tartalom 13% volt.
]. táblázat
tápoldat 4g
élesztőkivonat 2g
glükóz 7,5g
(NH4)2SO4 5g
Na2HPO4 12 H2O 3g
KH2PO4 0,3 g
MgSO4 7 H2O 0,1 g
CaCl2 2 H2O 0,05 g
FeSO4 7 H2O 0,01 g
Na2MoO4 0,6 mg
MnSO4 6 H2O 0,6 mg
ZnSO4 7 H2O 1,2 mg
Feloldjuk 1 liter vízben, és pH-ját 7,0-re állítjuk.
HU 212 279 B
2. példa
100 ml 1. táblázatban bemutatott összetételű tápközeget beoltottunk egy platinahuroknyi Escherchia coli IFO 3366 törzzsel és 1 napig, 30 °C-on tenyésztettük. A kapott kultúrát a felülúszó eltávolítására centrifugáltuk, és a pelletet (száraztömegre számolva 220 mg) 1,6 ml 0,1 mólos Tris oldatban (pH = 8) szuszpendáltuk. A szuszpenzióhoz 1,0 μΐ Tween 80-t és 75 μΐ (±)-homopilopinsav-etil-észtert adtunk, és keverés közben hagytuk reagálni 30 °C-on, 24 órán át. A reakció alatt a pH = 8 beállítására minden 6 órában telített nátrium-karbonát-oldatot adtunk az elegyhez. A reakció befejeződése után oldószeres extrahálással 23 mg kristályos homopilopinsavat kaptunk. A termék (+)-homopilopinsav-tartalmát metilészterré átalakított formában NMR spektroszkópiával határoztuk meg. A (+)-homopilopinsav-tartalom 78%, a (-)-forma 22% volt.
3. példa ml 2. táblázatban ismertetett összetételű tápközeget beoltottunk Rhizomucor miehei IFO 9740 spórákkal, és 3 napig 40 °C-on tenyésztettük. A kapottt tenyészetet 100 ml fenti közegbe oltottuk, és 4 napon át, 30 °C-on tenyésztettük. A kapott kultúrát a felülúszó eltávolítására centrifugáltuk, és a pelletet (száraztömegre számolva 650 mg sejt) 7,5 ml 0,1 mólos foszfátpufferben (pH = 7,0) szuszpendáltuk. A szuszpenzióhoz 3 μΐ Span 80-t és 200 μΐ (±)-homopilopinsav-etilésztert adtunk, és keverés közben hagytuk reagálni 30 C-on 48 órán át. A reakció alatt a pH = 7 beállítására minden 6 órában telített nátrium-karbonát oldatot adtunk az elegyhez. A reakció befejeződése után oldószeres extrahálással 25 mg kristályos homopilopinsavat kaptunk. A termék (+)-homopilopinsav-tartalmát metilészterré átalakított formában NMR spektroszkópiával határoztuk meg. A (+)-homopilopinsav-tartalom 91%, a (-)-forma 9% volt.
2. táblázat
élesztőkivonat 5 g
maláta extraktum 5g
(NH4)2SO4 5g
Szacharóz 10g
MgSO4 7 H2O 0,1 g
CaCl2 2 H2O 0,05 g
FeSO4 7 H2O 0,01 g
1 vízben oldjuk, és pH-ját 6,0-ra állítjuk.
4-24. példák
Az 1-3. példákban ismertetett eljárással, különböző típusú mikroorganizmusok alkalmazásával (+)-homopilopinsavat állítottunk elő. A kapott eredményeket a 3. táblázatban foglaljuk össze.
3. táblázat
Példa- szám Törzs Kiindu- lási anyag *1 Hozam (%) Tartalom *2 (%)
4 Arlhrobacter globiformis IFO 12136 Et 14 62
5 Aspergillus sojae IÁM 2703 Me 58 52
6 Aspergillus terreus IÁM 2179 Et 38 43
7 Cunninghamella echinulata IFO 4443 Et 42 35
8 Xanthomonas oryzae IFO 3510 Et 35 57
9 Xanthomonas campestris IFO 13303 Et 35 51
10 Candida utilis IFO 4961 Et 38 48
11 Pseudomonas aeruginosa IÁM 1275 Et 36 77
12 Serratia plymuthicaJCM 1244 Et 21 67
13 Cellulomonas turbata FERM P9059 Et 31 53
14 Nocardia erythropolis 1AM 1484 tBu 25 79
15 Nocardia opaca IÁM 12123 Et 41 49
16 Nocardia corallina IÁM 12121 Et 36 75
17 Nocardia rubropertincta JCM 3204 Okt 40 89
18 Bacillus subtilis IFO 3108 Et 38 79
19 Flavobacterium lutescens IFO 3084 Et 36 67
20 Brevibacterium ketoglutaricum ATCC 15588 Et 33 64
21 Mycobacterium rhodochrous IFO 13161 Et 25 71
22 Rhizomucor miehei IFO 9740 Okt 50 80
23 Rhodococcus erythropolis IFO 12682 Et 37 69
24 Rhodotorula rubra IFO 0383 iPr 65 26
*1 Kiindulási észter: (+)-homopilopinsav-metil-észter (Me). -etilészter (Et). -izopropil-észter (iPr). -terc-butil-észter (tBu), -oktil-észter (Okt).
*2 Tartalom (%): |(+)-homopilopinsav/összes képződött homoptlopinsav] x 100
HU 212 279 B
25. példa mg Rhizopus delemar-ból származó Lipase-t (Seikagaku Kogyo) 2 ml 0,1 mólos foszfátpufferban (pH = 7) szuszpendáltunk, majd a szuszpenzióhoz 1 μΐ Tween 80-t adtunk, és keverés közben hagytuk reagálni 30 'C-on, 24 órán át. A reakció alatt a pH = 7 beállítására minden 6 órában telített nátrium-karbonát-oldatot adtunk az elegyhez. A reakció befejezése után oldószeres extrahálással 19 mg, fehér, tűkristályos homopilopinsavat kaptunk (hozam: 16%). A termék (+)-homopilopinsav-tartalmát metil-észterré átalakított formában NMR spektroszkópiával határoztuk meg. A (+)-homopilopinsav-tartalom 69%, a (-)-forma 31% volt.
26. példa
Sertésmájból származó 60 egység Esterase-t (1000 egység/ml, Boehringer Mannheim) 2 ml 0,1 mólos foszfátpufferben (pH = 7,0) szuszpendáltunk, és ehhez 0,1 μΐ Tween 80-t és 100 mg (±)-homopilopinsav-butilésztert adtunk, majd keverés közben hagytuk reagálni 30 °C-on, 24 órán át. A reakció alatt a pH = 7,0 beállí5 tására minden 6 órában telített nátrium-karbonát-oldatot adtunk az elegyhez. A reakció befejezése után oldószeres extrahálással 30 mg, kristályos homopilopinsavat kaptunk (hozam; 25%). A termék (+)-homopilopinsav-tartalmát metil-észter formában NMR spektroszkó10 piával határoztuk meg. A (+)-homopilopinsav-tartalom 71%, a (-)-forma 29% volt.
27-35. példa
A 25-26. példákban ismertetett eljárással, különbö15 ző típusú enzimek alkalmazásával (+)-homopilopinsavat állítottunk elő. A kapott eredményeket a 4. táblázatban foglaljuk össze.
4. táblázat
Példa- szám Enzim Kiindulási észter * 1 (mg) Enzim (mg) Oldószer *2 Reakcióidő (ó) Hozam (%) Tartalom *3 (%)
27 Lipase OF (Meito) 2200 (Me) 400 8 24 24 54
28 Lipase IM 20 (Novo) 132 (Et) 30 1 24 42 73
29 Paratase Μ 1000L 132 (Et) 50 1 24 16 84
30 Lipoprotein lipase 132 (Okt) 13 1 24 13 40
31 Lipoprotein lipase 132 (iPr) 13 1 24 11 38
32 Lipase T-01 (Toyo Jozo) 220 (Et) 7 10 20 45 17
33 Cholesterol esterase TI 8 (Toyo Jozo) 220 (Et) 7 10 20 52 10
34 Lipase P (Amano) 1320 (Et) 200 20 88 55 14
35 Lipase B (Wako) 672 (Et) 9 10 19 55 17
*1, Kiindulási észter (±)-homopilopinsav-metil-észter (Me). -etil-észter (Et). -izopropil-észter (iPr), -oktil-észter (Okt) *2) 0,1 mólos foszfátpuffer (pH = 7) *3) Tanalom: |(+)-homopilopinsav/összesen képződött homopiloptnsav] x 100
A következő példákkal a találmányunk szerinti 3. eljárást mutatjuk be.
Az NMR spektrum meghatározást 90 MHz-en végeztük. és a fajlagos forgatást ([a]D) kloroformban, szobahőmérsékleten határoztuk meg.
36. példa
8.5 mg Pseudomonas fragi-ból származó Lipase-t (Wako) 10 ml 0,1 mólos foszfátpufferban (pH = 7,0) szuszpendáltunk, 4 μ] Tween 80-at és 600 mg (±)-homopilopinsav-etil-észtert adtunk hozzá, és az elegyet keverés közben hagytuk reagálni 30 ‘C-on. A reakció alatt a pH = 7,0 beállítására minden 6 órában telített nátrium-karbonát-oldatot adtunk az elegyhez. A 19 órás reakció befejezése után az elegy pH-ját 8,0-ra állítottuk, 10 ml dietil-étert adtunk hozzá, erőteljesen kevertük, és az éteres fázis kinyerésére centrifugáltuk. Ezt az extrahálást háromszor ismételtük, és az egyesített extraktumokból 235 mg (39%) (+)-homopilopinsav-észtert kaptunk. [a]D: 76,1°.
37. példa
A 36. példa szerinti eljárással előállított, 235 mg észtert 3 μΐ Tween 80, 150 mg Lipase OF és 12 ml 0,1 mólos foszfátpuffer (pH = 7,0) jelenlétében hidrolizáltunk. Oldószeres extrahálással 127 mg, kristályos homopilopinsavat kaptunk. Az 1. és 2. lépcsőkben lefolytatott eljárással összesen 25% homopilopinsav hozamot értünk el. [oc]D: 79,4°. A termék metil-észter formában végzett NMR spektroszkópiás elemzése lényegében nem mutatott (-)-homopilopinsav-metil-észter jelenlétet (1. ábra).
38. példa
Bacillus subtilis IFO 3108 tenyészetet készítettünk, majd 100 ml, 5. táblázat szerinti összetételű tápközeget beoltottunk egy platinahuroknyi Bacillus subtilis IFO 3108 törzzsel. Az elegyhez az észterbomlás elősegítésére 1% koncentrációjú szójaolajat adtunk, majd az így kapott elegyet 30 °C-on, 1 napig tenyésztettük. A kapott tenyészetből centrifugálással pelletet (360 mg sejt, száraz tömegre számolva) kaptunk.
HU 212 279 Β
5. táblázat
tápoldat 4g
élesztőkivonat 2g
glükóz 7.5g ,
(NH4)2SO4 5g
Na2HPO4 12 H2O 3 g
KH2PO4 0,3 g
MgSO4 7 H2O 0,1 g
CaCl2 · 2 H2O 0,05 g
FeSO4 7 H2O 0,01 g
Na2MoO4 0,6 mg
MnSO4 6 H2O 0,6 mg
ZnSO4 7 H2O 1,2 mg
Feloldjuk 1 liter vízben, és pH-ját 7,0-re állítjuk.
39. példa
A 38. példa szerinti eljárással előállított, 360 mg (száraz tömeg) Bacillus subtilis IFO 3108 pelletet 5 ml,
0,1 mólos foszfátpufferben (pH = 7,0) szuszpendáltuk, és 100 mg. 36. példa szerinti (+)-homopilopinsav-etil- 25 észtert és 2 μΐ Tween 80-t adtunk hozzá, majd a komponenseket hagytuk keverés közben, 30 °C-on reagálni. A reakció alatt a pH = 7 beállítására minden 6 órában telített nátrium-karbonát-oldatot adtunk az elegyhez. 72 órás reakció után oldószeres extrahálással 30 71 mg. fehér, tűkristályos homopilopinsavat kaptunk (hozam: 84%). [oc]D: 81,2.
40. példa
Rhizomucor miehei IFO 9740 tenyészetet készítet- 35 tünk, majd 5 ml. 6. táblázat szerinti összetételű tápközeget beoltottunk Rhizomucor miehei IFO 9740 spórákkal és 3 napon át. 30 °C-on tenyésztettük. A kapott kultúrát 100 ml, fenti tápközegbe oltottuk, majd 4 napon át, 30 °C-on tenyésztettük. A tenyészetet a felülúszó eltávolítására leszűrtük. így 920 mg (száraz tömeg) sejtet kaptunk.
6. táblázat
élesztőkivonat 5g
maláta extraktum 5g
(NH4)2SO4 5g
Szacharóz 10 g
MgSO4 7 H2O 0,1 g
CaCl2H H2 H2O 0,05 g
FeSO4 · 7 H2O 0,01 g
Feloldjuk 1 1 vízben, és pH-ját 6,0-ra állítjuk.
41. példa ml 0,1 mólos foszfátpufferhez (pH = 7,0) 100 mg 36. példa szerint előállított (+)-homopilopinsav-etilésztert és 200 mg, 40. példa szerinti Rhizomucor miehei IFO 9740 törzs tenyészetet és 2 μΐ Tween 80-t adtunk, és hagytuk reagálni 30 °C-on. A reakció alatt a pH - 7 beállítására minden 6 órában telített nátriumkarbonát-oldatot adtunk az elegyhez. 68 órás reakció után oldószeres extrahálással 61 mg nyers, kristályos homopilopinsavat kaptunk. (Hozam: 72%.) [a]D:79,8°. A termék metil-észter formában való NMR spektroszkópiás elemzése azt mutatja, hogy lényegében nem tartalmaz (-)-homopilopinsav-metil-észtert.
42^45. példa
A (-)-homopilopinsav-észter képződése szelektív hatású. 4-típusú enzim alkalmazásával (+)-homopilopinsav-észtert nyertünk ki. A reakció kivitelezését 10 ml 0,1 mólos foszfátpufferral (pH = 7,0) végeztük 30 °C-on. A kapott eredményeket a 7. táblázatban foglaljuk össze.
(Első lépcső)
Példaszám Enzim Enzim (mg) Kiindulási észter *1 (mg) Reakcióidő (ó) Észter-kinyerés (%) Fajlagos forgatás [ a]D
42 LipaseT-01 (Toyo Jozo) 7 200 (Et) 30 28 74,1
43 Cholesterol esterase TI 8 (Toyo Jozo) 7 200 (Et) 20 40 73,2
44 Lipase (Sigma) 4 300 (Okt) 14 28 75,0
45 Lipase PS (Amano) 50 600 (Et) 55 48 74,4
*1) Kiindulási észter: (+)-homopilopinsav-etil-észter, (Okt): (±)-homopilopinsav-oktil-észter
46-47. példa
A 44. példa szerint kinyert (+)-homopilopinsav-észtert a 8. táblázatban ismertetett különböző enzimek alkalma- 60 zásával hidrolizáltunk. A reakció kivitelezését 5 ml 0,1 mólos foszfátpufferben (pH = 7,0), 30 °C-on végeztük. A kapott eredményeket a 8. táblázatban foglaljuk össze.
HU 212 279 Β
8. táblázat
Példás zám Enzim Enzim (mg) Kiindulási észter *1 (mg) Reakcióidő (ó) Hozam *2 (%) Fajlagos forgatás [a]D
46 Lipase (Seikagaku Kogyo) 20 50 45 88 79,3
47 Esterase (Boehringer) 10 (egység) 50 45 89 80,5
48 Lipozyme IM 20 (Novo) 10 50 50 92 81,5
49 Lipase OF (Meito) 20 50 55 94 78,1
*1) 46. és 47 példa: 44. példa szerint kinyert észtert alkalmaztunk *2) 48. és 49 példa: 45. példa szerint kinyert észtert alkalmaztunk
48—49. példák
A 45. példa szerint kinyert (+)-homopilopinsavetil-észtert a 8. táblázatban ismertetett, különböző, (+)- 15 homopilopinsav-észterre ható enzimek alkalmazásával hidrolizáltunk. A kapott eredményeket a 8. táblázatban foglaljuk össze.
50-52. példák 20
A 42. példa szerint kinyert 110 mg (+)-homopilopinsav-etil-észtert különböző, (+)-homopilopinsav-észterre ható enzimmel hidrolizáltunk. A reakció kivitelezését 5 ml 0,1 mólos foszfátpufferben (pH = 7,0), 'C-on, 48 órán át végeztük. A kapott eredményeket 25 a 9. táblázatban foglaljuk össze.
9. táblázat (Második lépcső mikroorganizmus alkalmazással)
Példa- szám Törzs Mikroorganizmus száraz tömeg (mg) Kiindulási * 1 észter Hozam (%)
50 Aspergillus sojae 1AM 2703 32 Et 36
51 Escherichia coli IFO 3366 *2) Et 68
52 Xanthomonas oryzae IFO 3510 42 Et 12
53 Candida ulilis IFO 4961 23 Et 8
54 Pseudomonas aeruginosa IÁM 13130 30 Et 10
55 Serratia plymuthica JCM 1244 13 Et 14
56 Cellulomonas turbata FERM P9059 17 Et 60
57 Nocardia erythropolis IÁM 1484 18 Et 14
58 Nocardia rubropertincta JCM 3204 43 Et 4
59 Flavobacterium lutescens IFO 3084 20 Et 29
Példa- szám Törzs Mikroorganizmus száraz tö- meg (mg) Kiindulási *1 észter Hozam (%)
60 Brevibacterium ketoglutaricum ATCC 15588 16 Et 59
61 Rhodococcus erythropolis IFO 12682 18 Et 33
62 Micobacterium rhodoclass IFO 13161 6 Okt 6
*1) El: (+)-homopilopinsav-etil-észter, Okt: (+)-oktil-észter. Az 5052., 53-58., 59-61. és 62. példákban rendre a 42., 43., 45. és
44. példákban kinyeri észtereket alkalmaztuk.
*2) Az 1. táblázatban bemutatott összetételű tápközegben való, ’C-on, 24 órán át megvalósított tenyésztés után 110 mg kinyer, észtert adtunk hozzá, és hagytuk reagálni 48 órán át
53-58. példák
A 43. példa szerint kinyert (-t-)-homopilopinsavetil-észtert különböző enzimek alkalmazásával hidrolizáltuk. Az eredményeket a 9. táblázatban foglaljuk össze.
59-61. példák
A 45. példa szerint kinyert (-t-)-homopilopinsavetil-észtert különböző enzimek alkalmazásával hidrolizáltuk. Az eredményeket a 9. táblázatban foglaljuk össze.
62. példa
A 44. példa szerint kinyert (+)-homopilopinsavetil-észtert a 9. táblázatban ismerteit enzim alkalmazásával hídrólizáltűk. Az eredményeket a 9. táblázatban foglaljuk össze.
A következő, 63-65. példákban a 3. eljárás első lépcsőjében alkalmazható tenyészet előállítását ismertetjük.
63. példa
Brevibacterium ammoniagens, IFO 12072 törzs, a tenyészetet 100 ml, 5. táblázatban ismertett összetételű tápközetben, 30 °C-on, 1 napig történő tenyésztéssel állítottuk elő. Az így kapott sejtek száraz tömegre számított mennyisége 270 mg volt.
HU 212 279 Β
64. példa
Escherichia vulneris, JCM 1688 törzs, a tenyészetet 100 ml, 5. táblázatban ismertetett összetételű tápközegben, 30 °C-on 1 napig történő tenyésztéssel állítottuk elő. Az így kapott sejtek száraz tömegre számított mennyisége 540 mg volt.
65. példa
Rhodotorula rubra, IFO 0893 törzs, a tenyészetet 100 ml 6. táblázatban ismertett összetételű tápközegben, 30 °C-on, 2 napig történő tenyésztéssel állítottuk elő. Az így kapott sejtek száraz tömegre számolt mennyisége 750 mg volt.
66-68. példák
Ezekben a példákban olyan, (+)-homopilopinsav előállítási eljárást mutatunk be, amelyben az első lépcsőben a 63-65. példákban ismertett eljárással előállított sejteket, a második lépcsőben az első lépcsőben kinyert (+)-homopilopinsav-észtert és Lipase OF enzimet alkalmaztunk. A kapott eredményeket a 10. táblázatban foglaljuk össze.
10. táblázat
Példa- szám Első lépcső * 1 .. Második lépcső *2 A térmék fajlagos forgatása [CC]d
Mikro- organiz- mus (mg) Vissza- nyert észter (mg) Lipase OF Hozam (%) *3
66 270 30 50 28 80,3
67 540 28 40 25 79,8
68 750 25 30 25 78,9
*1) 0.1 M Tns (pH = 7.5): 2 ml. (+)-homopilopinsav-etil-észter:
100 mg, 30 ‘C. 50 óra.
*2) 0.1 M Tris (pH = 7,5): I ml, Lipase OF, 30 ’C. 50 óra *3) Homopilopinsav hozam

Claims (3)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás (-t-)-homopilopinsav és sói előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (I) általános képletű homopilopinsav-észtert és (II) általános képletű (-)-homopilopinsav-észtert tartalmazó elegyet - a képletekben R, jelentése 1-10 szénatomos egyenes vagy elágazó láncú szénhidrogéncsoport - valamely Arthrobacter globiformis, Aspergillus sojae, Aspergillus terreus, Escherichia coli, Cunninghamella echinulata, Xanthomonas campestris, Xanthomonas oryzae, Candida utilis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia plymuthica, Cellulomonas turbata, Nocardia erythropolis, Nocardia opaca, Nocardia corallina, Nocardia rubropertincta, Bacillus subtilis, Flavobacterium lutescens, Brevibacterium ketoglutaricum, Mycobacterium rhodochrous, Rhizomucor miehei, Rhodococcus erythropolis vagy Rhodotorula rubra fajba tartozó mikroorganizmus vagy a mikroorganizmus-sejtek tenyészetben történt elroncsolásával kapott nyers enzimoldat alkalmazásával hidrolizálunk.
  2. 2. Eljárás (+)-homopilopinsav és sói előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (I) általános képletű (+)-homopilopinsav-észtert és (Π) általános képletű (-)-homopilopinsav-észtert tartalmazó elegyet - a képletekben R] jelentése 1-10 szénatomos egyenes vagy elágazó láncú szénhidrogéncsoport - lipáz, észteráz, koleszterol-észteráz és lipoprotein-lipáz közül legalább egy enzim alkalmazásával hidrolizálunk.
  3. 3. Eljárás (+)-homopilopinsav és sói előállítására azzal jellemezve, hogy (I) általános képletű (+)-homopilopinsav-észtert és (Π) általános képletű (-)-homopilopinsav-észtert tartalmazó elegyet - a képletekben Rí jelentése 1-10 szénatomos egyenes vagy elágazó láncú szénhidrogéncsoport - lipáz, észteráz és koleszterolészteráz közül legalább egy hidroláz alkalmazásával vagy valamely Brevibacterium ammoniagens, Escherichia vulneris vagy Rhodotorula rubra fajba tartozó mikroorganizmus vagy a mikroorganizmus-sejtek tenyészetben történt elroncsolásával kapott nyers enzimoldat alkalmazásával hidrolizálunk, az el nem reagált (+)-homopilopinsav-észtert kinyerjük, majd ezt egy lipáz vagy észteráz alkalmazásával vagy valamely Aspergillus sojae, Escherichia coli, Xanthomonas oryzae, Candida utilis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia plymuthica, Cellulomonas turbata, Nocardia erythropolis, Nocardia rubropertincta, Bacillus subtilis, Flavobacterium lutescens, Brevibacterium ketoglutaricum, Mycobacterium rhodochrous, Rhizomucor miehei vagy Rhodococcus erythropolis fajba tartozó mikroorganizmus vagy a mikroorganizmus-sejtek tenyészetben történt elroncsolásával kapott nyers enzimoldat alkalmazásával hidrolizáljuk.
HU907244A 1989-11-22 1990-11-22 Process for preparing (+)-homopilopic acid HU212279B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP1302273A JP2880204B2 (ja) 1989-11-22 1989-11-22 （＋）‐ホモピロピン酸の製造法

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU907244D0 HU907244D0 (en) 1991-05-28
HUT61292A HUT61292A (en) 1992-12-28
HU212279B true HU212279B (en) 1996-04-29

Family

ID=17907023

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU907244A HU212279B (en) 1989-11-22 1990-11-22 Process for preparing (+)-homopilopic acid

Country Status (8)

Country Link
US (1) US5182198A (hu)
EP (1) EP0430555B1 (hu)
JP (1) JP2880204B2 (hu)
KR (1) KR0137134B1 (hu)
AT (1) ATE121137T1 (hu)
CA (1) CA2030218C (hu)
DE (1) DE69018576T2 (hu)
HU (1) HU212279B (hu)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5529929A (en) * 1995-06-07 1996-06-25 Seprachem, Inc. Optical resolution of alkyl 1,4-benzodioxan-2-carboxylates using esterase from serratia marcescens
US20070086958A1 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Medafor, Incorporated Formation of medically useful gels comprising microporous particles and methods of use
US20070087061A1 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Medafor, Incorporated Method and composition for creating and/or activating a platelet-rich gel by contact with a porous particulate material, for use in wound care, tissue adhesion, or as a matrix for delivery of therapeutic components
JP2007166908A (ja) * 2005-12-19 2007-07-05 Sumitomo Chemical Co Ltd 光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸又は３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの製法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5037747A (en) * 1988-01-26 1991-08-06 Hoffmann-La Roche Inc. Production of benzopyran-2-carboxylic acids and esters by enzymatic hydrolysis

Also Published As

Publication number Publication date
US5182198A (en) 1993-01-26
JPH03198796A (ja) 1991-08-29
KR0137134B1 (ko) 1998-04-25
KR910009932A (ko) 1991-06-28
CA2030218C (en) 1998-12-08
DE69018576T2 (de) 1995-08-17
HU907244D0 (en) 1991-05-28
DE69018576D1 (de) 1995-05-18
ATE121137T1 (de) 1995-04-15
EP0430555B1 (en) 1995-04-12
CA2030218A1 (en) 1991-05-23
EP0430555A1 (en) 1991-06-05
JP2880204B2 (ja) 1999-04-05
HUT61292A (en) 1992-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4629701A (en) Process for preparing optically active carboxylic acids and antipode esters thereof
KR960004455B1 (ko) 광학 활성 3-페닐글리시드산 에스테르의 제조방법
US5219731A (en) Method for preparing optically-active amino acid derivatives
WO1984003714A1 (en) Process for biochemical optical resulution of cyclopentenolone derivative
US5552317A (en) Method for preparing optically active homophenylalanine and esters thereof using lipase from wheat germ or Candida lipolytica
HU212279B (en) Process for preparing (+)-homopilopic acid
EP0350811B1 (en) Enzymatic resolution process
US6121025A (en) Process for producing optically active 3-quinuclidinol derivatives
EP0528607B1 (en) Process for preparing optically active 3-phenylglycidic acid esters
EP0289804A2 (en) Process for preparing optically active mercapto compound
US5248601A (en) Process for preparing L(-)-carnitine chloride
WO1987005328A1 (en) Process for preparing optically-active 3-acylthio-2-methylpropionic acid derivatives
JPS6012992A (ja) 光学活性カルボン酸の製造法
US5391494A (en) Process for selectively producing optically active 1-derivatized-2-diol using lipase CES and triglyceride
JP3741758B2 (ja) 光学活性グリセロール誘導体の製法
US5986095A (en) Enantioselective preparation of halophenyl alcohols and acylates
EP0745137B1 (en) Enzymatic resolution of substituted 2-methyl-propionic acid
JP2006050990A (ja) 光学活性２−置換−３−（４−置換オキシフェニル）プロピオン酸およびその対掌体エステルの製造方法
US5716815A (en) Method for preparing dimethylcarboxylic acid compounds
JP3960667B2 (ja) β−カルバモイルイソ酪酸類及びその製造方法
JP3007461B2 (ja) 光学活性２−シクロヘキセニル酢酸及びそのエステルの製造方法
JP3893721B2 (ja) 光学活性化合物の製造方法
JP2782438B2 (ja) パントテン酸またはその塩の製造法
JPS6363396A (ja) ｄ−２−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロピオン酸の製造方法
JPH0751533B2 (ja) 光学活性なテルフェニル誘導体の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: IWAKI SEIYAKU CO., LTD, JP

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee