JPH07114713B2 - フエニルアラニン又はフエニルピルビン酸定量用試薬 - Google Patents
フエニルアラニン又はフエニルピルビン酸定量用試薬Info
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- JPH07114713B2 JPH07114713B2 JP5243787A JP5243787A JPH07114713B2 JP H07114713 B2 JPH07114713 B2 JP H07114713B2 JP 5243787 A JP5243787 A JP 5243787A JP 5243787 A JP5243787 A JP 5243787A JP H07114713 B2 JPH07114713 B2 JP H07114713B2
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- phenylalanine
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- phenylpyruvic acid
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，生体液中のフェニルアラニン又はフェニルピ
ルビン酸の定量用試薬に関するものである。
ルビン酸の定量用試薬に関するものである。
（従来の技術） 血清中に通常少量存在するフェニルアラニンは，フェニ
ルアラニン４−モノオキシゲナーゼ欠損，ジヒドロプテ
リジンレダクターゼ欠損等の遺伝性代謝異常疾患などに
おいて，血中に多量貯留され，一部はフェニルピルビン
酸，フェニル乳酸，フェニル酢酸などに代謝された後，
尿中に排出される。これらフェニルアラニン，フェニル
ピルビン酸，フェニル乳酸，フェニル酢酸の蓄積は，フ
ェニルケトン尿症の症状として知能障害，皮膚・髪の色
素の欠乏，強度の湿疹などを引き起こすことが知られて
いる。
ルアラニン４−モノオキシゲナーゼ欠損，ジヒドロプテ
リジンレダクターゼ欠損等の遺伝性代謝異常疾患などに
おいて，血中に多量貯留され，一部はフェニルピルビン
酸，フェニル乳酸，フェニル酢酸などに代謝された後，
尿中に排出される。これらフェニルアラニン，フェニル
ピルビン酸，フェニル乳酸，フェニル酢酸の蓄積は，フ
ェニルケトン尿症の症状として知能障害，皮膚・髪の色
素の欠乏，強度の湿疹などを引き起こすことが知られて
いる。
これらの症状は，新生児期初期にフェニルアラニンの代
謝異常を発見し，早期にフェニルアラニン含量の低い食
事に制限するなどの処置によって予防可能であり，新生
児血中あるいは尿中におけるフェニルアラニン，フェニ
ルピルビン酸などの測定は，臨床診断上きわめて重要な
意義を有している。さらにフェニルケトン尿症患者に
は，低フェニルアラニン含量の食品が必要とされるが，
食品中のフェニルアラニン含量を知るためにも，フェニ
ルアラニンの測定は重要な意義を有している。
謝異常を発見し，早期にフェニルアラニン含量の低い食
事に制限するなどの処置によって予防可能であり，新生
児血中あるいは尿中におけるフェニルアラニン，フェニ
ルピルビン酸などの測定は，臨床診断上きわめて重要な
意義を有している。さらにフェニルケトン尿症患者に
は，低フェニルアラニン含量の食品が必要とされるが，
食品中のフェニルアラニン含量を知るためにも，フェニ
ルアラニンの測定は重要な意義を有している。
フェニルアラニン，フェニルピルビン酸の測定には，種
々の誘導物質に変換後，あるいはそのままの状態で高速
液体クロマトグラフィーによって分画定量する方法の他
に，フェニルピルビン酸については，塩化第二鉄反応を
利用した測定用試薬など，またフェニルアラニンの測定
用試薬としては，カペラー・アドラー（Kapeller−Adle
r）反応を利用した試薬，あるいはガスリ（Gathrie）の
開発した血液濾紙を用いた試薬などが一般に用いられて
いる。塩化第二鉄反応を利用した測定用試薬は，塩化第
二鉄を硫酸の存在下において，フェニルピルビン酸とと
もに緑色に発色させ，比色定量するものである。血液濾
紙を用いた測定用試薬は，寒天を加えたドメイン培地に
フェニルアラニン要求性である枯草菌ATCC 6633芽胞懸
濁液とフェニルアラニン拮抗物質であるβ−２−チエニ
ルアラニンを加えて平板を作成し，血液濾紙よりくり抜
いた円板をその上に並べ,37℃で20時間培養し，円板濾
紙の周囲に生育した菌の発育環の状態によりフェニルア
ラニン含量を求めるものである。この場合のフェニルア
ラニン含量が１〜3mg/dl以下では，β−２−チエチルア
ラニンのもつフェニルアラニンに対する拮抗作用により
菌は発育せず，それ以上のフェニルアラニンを含有する
場合にのみ発育環がみられる。
々の誘導物質に変換後，あるいはそのままの状態で高速
液体クロマトグラフィーによって分画定量する方法の他
に，フェニルピルビン酸については，塩化第二鉄反応を
利用した測定用試薬など，またフェニルアラニンの測定
用試薬としては，カペラー・アドラー（Kapeller−Adle
r）反応を利用した試薬，あるいはガスリ（Gathrie）の
開発した血液濾紙を用いた試薬などが一般に用いられて
いる。塩化第二鉄反応を利用した測定用試薬は，塩化第
二鉄を硫酸の存在下において，フェニルピルビン酸とと
もに緑色に発色させ，比色定量するものである。血液濾
紙を用いた測定用試薬は，寒天を加えたドメイン培地に
フェニルアラニン要求性である枯草菌ATCC 6633芽胞懸
濁液とフェニルアラニン拮抗物質であるβ−２−チエニ
ルアラニンを加えて平板を作成し，血液濾紙よりくり抜
いた円板をその上に並べ,37℃で20時間培養し，円板濾
紙の周囲に生育した菌の発育環の状態によりフェニルア
ラニン含量を求めるものである。この場合のフェニルア
ラニン含量が１〜3mg/dl以下では，β−２−チエチルア
ラニンのもつフェニルアラニンに対する拮抗作用により
菌は発育せず，それ以上のフェニルアラニンを含有する
場合にのみ発育環がみられる。
しかしながら、高速液体クロマトグラフィーを利用する
方法は，除蛋白などの前処理を必要とすること，測定に
長時間を有すること，分析機器が高価であることなどの
欠点を有している。また，塩化第二鉄反応を利用した測
定用試薬，カペラー・アドラー反応を利用した測定用試
薬，ガスリによる血液濾紙を用いた測定用試薬は，フェ
ニルアラニンあるいはフェニルピルビン酸以外に多くの
物質に対して反応するため，特異性において重大な欠点
があること，定量性がきわめて不十分であること，測定
に長時間を要すること，強酸あるいは重金属塩を使用す
ることなど，多くの問題点を有するため，臨床検査分野
等の多数の試料を迅速に測定することが要求される分野
には到底供しえないものであった。
方法は，除蛋白などの前処理を必要とすること，測定に
長時間を有すること，分析機器が高価であることなどの
欠点を有している。また，塩化第二鉄反応を利用した測
定用試薬，カペラー・アドラー反応を利用した測定用試
薬，ガスリによる血液濾紙を用いた測定用試薬は，フェ
ニルアラニンあるいはフェニルピルビン酸以外に多くの
物質に対して反応するため，特異性において重大な欠点
があること，定量性がきわめて不十分であること，測定
に長時間を要すること，強酸あるいは重金属塩を使用す
ることなど，多くの問題点を有するため，臨床検査分野
等の多数の試料を迅速に測定することが要求される分野
には到底供しえないものであった。
これに対し，これらの欠点を克服し簡易にフェニルアラ
ニン，フェニルピルビン酸を定量するために，数種の酵
素法が提案されている。これら酵素法に用いる試薬に
は，フェニルアラニン４−モノオキシゲナーゼを用いる
試薬，フェニルアラニンアンモニアリアーゼを用いる試
薬及びフェニルアラニン脱水素酵素と，フェニルアラニ
ンデカルボキシラーゼとを用いる試薬がある。フェニル
アラニン４−モノオキシゲナーゼを用いる試薬は，テト
ラヒドロビオプテリンと分子状酸素の存在下でフェニル
アラニン４−モノオキシゲナーゼがフェニルアラニンを
チロシンに変換することを利用したものであり，チロシ
ンを直接螢光で測定するか，またはニトロソナフトール
のエタノール溶液と濃硝酸を加えて噴霧，風乾後,100℃
で加熱して赤色に発色させることによって測定を行うも
のである。また，フェニルアラニンアンモニアリアーゼ
を利用する試薬は，酵素反応によってフェニルアラニン
から遊離したアンモニアを，グルタミン酸脱水素酵素，
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及び２−
オキソグルタル酸を用いて340nmにおける吸光度の減少
として測定するか，アンモニア電極によって測定するも
のである。フェニルアラニンデカルボキシラーゼを用い
る試薬は，生成するβ−フェニルエチルアミンを有機溶
媒抽出した後，螢光測定するものである。またフェニル
アラニン脱水素酵素を用いる試薬は，酵素反応によって
生成する酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドによ
る340nmにおける吸光度の増減によりフェニルアラニン
又はフェニルピルビン酸の量を求めるものである。
ニン，フェニルピルビン酸を定量するために，数種の酵
素法が提案されている。これら酵素法に用いる試薬に
は，フェニルアラニン４−モノオキシゲナーゼを用いる
試薬，フェニルアラニンアンモニアリアーゼを用いる試
薬及びフェニルアラニン脱水素酵素と，フェニルアラニ
ンデカルボキシラーゼとを用いる試薬がある。フェニル
アラニン４−モノオキシゲナーゼを用いる試薬は，テト
ラヒドロビオプテリンと分子状酸素の存在下でフェニル
アラニン４−モノオキシゲナーゼがフェニルアラニンを
チロシンに変換することを利用したものであり，チロシ
ンを直接螢光で測定するか，またはニトロソナフトール
のエタノール溶液と濃硝酸を加えて噴霧，風乾後,100℃
で加熱して赤色に発色させることによって測定を行うも
のである。また，フェニルアラニンアンモニアリアーゼ
を利用する試薬は，酵素反応によってフェニルアラニン
から遊離したアンモニアを，グルタミン酸脱水素酵素，
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及び２−
オキソグルタル酸を用いて340nmにおける吸光度の減少
として測定するか，アンモニア電極によって測定するも
のである。フェニルアラニンデカルボキシラーゼを用い
る試薬は，生成するβ−フェニルエチルアミンを有機溶
媒抽出した後，螢光測定するものである。またフェニル
アラニン脱水素酵素を用いる試薬は，酵素反応によって
生成する酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドによ
る340nmにおける吸光度の増減によりフェニルアラニン
又はフェニルピルビン酸の量を求めるものである。
（発明が解決しようとする問題点） しかしながら，非酵素的な方法を克服するために提案さ
れた酵素法に用いる試薬も，フェニルアラニン以外のア
ミノ酸に対しても反応性を有し，特異性において問題が
あること，あるいは内因性のチロシンや蛋白質，アンモ
ニアなどによって影響をうけること，酵素が非常に不安
定であること，などの欠点のために，臨床検査における
フェニルアラニン，フェニルピルビン酸測定にふさわし
いものとはなり得なかった。
れた酵素法に用いる試薬も，フェニルアラニン以外のア
ミノ酸に対しても反応性を有し，特異性において問題が
あること，あるいは内因性のチロシンや蛋白質，アンモ
ニアなどによって影響をうけること，酵素が非常に不安
定であること，などの欠点のために，臨床検査における
フェニルアラニン，フェニルピルビン酸測定にふさわし
いものとはなり得なかった。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは，前記の問題点を解決するために鋭意研究
を重ねた結果，フェニルアラニン又はフェニルピルビン
酸の定量用試薬に，きわめて特異性の高い耐熱性のフェ
ニルアラニン脱水素酵素を用いると，生体液中のフェニ
ルアラニン又はフェニルピルビン酸を精度よく測定しう
ることを見い出し，本発明を完成するに到った。
を重ねた結果，フェニルアラニン又はフェニルピルビン
酸の定量用試薬に，きわめて特異性の高い耐熱性のフェ
ニルアラニン脱水素酵素を用いると，生体液中のフェニ
ルアラニン又はフェニルピルビン酸を精度よく測定しう
ることを見い出し，本発明を完成するに到った。
すなわち，本発明は，（ａ）サーモアクチノマイセス
（Thermoactinomyces）属由来耐熱性フェニルアラニン
脱水素酵素及び（ｂ）酸化型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドを含有することを特徴とするフェニルアラニン
又はフェニルピルビン酸定量用試薬を要旨とするもので
ある。
（Thermoactinomyces）属由来耐熱性フェニルアラニン
脱水素酵素及び（ｂ）酸化型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドを含有することを特徴とするフェニルアラニン
又はフェニルピルビン酸定量用試薬を要旨とするもので
ある。
本発明のフェニルアラニン定量用試薬は，サーモアクチ
ノマイセス属由来耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素及
び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド〔以下
NAD+と略記する。〕を主成分とする。またフェニルピル
ビン酸定量用試薬は，サーモアクチノマイセス属由来耐
熱性フェニルアラニン脱水素酵素及び還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド〔以下NADHと略記する。〕
を主成分とし，これにアンモニウムイオンを含ませるこ
とが望まれる。その他にフェニルアラニン定量用試薬又
はフェニルピルビン酸定量用試薬は，通常，促進剤，賦
活剤などの添加剤なるものを含ませることもできる。そ
の添加剤としては，例えば塩化カリウム，酢酸ナトリウ
ムなどの塩類やトリトンＸ−100などを，また防腐剤と
しては，例えばアジ化ナトリウムなどの公知のものを支
障なく使用することもできる。
ノマイセス属由来耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素及
び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド〔以下
NAD+と略記する。〕を主成分とする。またフェニルピル
ビン酸定量用試薬は，サーモアクチノマイセス属由来耐
熱性フェニルアラニン脱水素酵素及び還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド〔以下NADHと略記する。〕
を主成分とし，これにアンモニウムイオンを含ませるこ
とが望まれる。その他にフェニルアラニン定量用試薬又
はフェニルピルビン酸定量用試薬は，通常，促進剤，賦
活剤などの添加剤なるものを含ませることもできる。そ
の添加剤としては，例えば塩化カリウム，酢酸ナトリウ
ムなどの塩類やトリトンＸ−100などを，また防腐剤と
しては，例えばアジ化ナトリウムなどの公知のものを支
障なく使用することもできる。
本発明に用いられるフェニルアラニン脱水素酵素として
は、サーモアクチノマイセス属に由来する耐熱性のもの
を用いる。サーモアクチノマイセス属に由来する耐熱性
フェニルアラニン脱水素酵素は，基質特異性の厳しい性
質を有し，保存性，安定性に富むものである。サーモア
クチノマイセス属の細菌としては，例えば，サーモアク
チノマイセス・インテルメディウス（Thermoactinomyce
s intermedius）IFO 14230,サーモアクチノマイセス・
ブルガリス（Thermoactinomyces vulgaris）IFO 1251
6,DSM 43184,DSM 43354等が挙げられる。
は、サーモアクチノマイセス属に由来する耐熱性のもの
を用いる。サーモアクチノマイセス属に由来する耐熱性
フェニルアラニン脱水素酵素は，基質特異性の厳しい性
質を有し，保存性，安定性に富むものである。サーモア
クチノマイセス属の細菌としては，例えば，サーモアク
チノマイセス・インテルメディウス（Thermoactinomyce
s intermedius）IFO 14230,サーモアクチノマイセス・
ブルガリス（Thermoactinomyces vulgaris）IFO 1251
6,DSM 43184,DSM 43354等が挙げられる。
本発明のフェニルアラニン定量用試薬の各成分の濃度と
しては，フェニルアラニン脱水素酵素を0.1〜100ユニッ
ト/ml,NAD+を0.1〜50mM,界面活性剤を0.01〜５％，防腐
剤を0.5〜50mMとなるように使用すればよく，フェニル
アラニン脱水素酵素を0.5〜50ユニット/ml,NAD+を0.2〜
20mM,塩類を５〜350mM,界面活性剤を0.02〜２％，防腐
剤を1.0〜30mMとなるように使用することが好ましい。
また，これらの組成物はpH8.5〜11.7に緩衝能を有する
緩衝液に溶解せしめればよい。このような緩衝液として
は通常pH8.5〜11.7のものが使用でき，グルシン−KOH,
炭酸緩衝液，グリシン−ヒドラジン緩衝液などをあげる
ことができる。その濃度としては30〜300mMを有利に使
用することができる。
しては，フェニルアラニン脱水素酵素を0.1〜100ユニッ
ト/ml,NAD+を0.1〜50mM,界面活性剤を0.01〜５％，防腐
剤を0.5〜50mMとなるように使用すればよく，フェニル
アラニン脱水素酵素を0.5〜50ユニット/ml,NAD+を0.2〜
20mM,塩類を５〜350mM,界面活性剤を0.02〜２％，防腐
剤を1.0〜30mMとなるように使用することが好ましい。
また，これらの組成物はpH8.5〜11.7に緩衝能を有する
緩衝液に溶解せしめればよい。このような緩衝液として
は通常pH8.5〜11.7のものが使用でき，グルシン−KOH,
炭酸緩衝液，グリシン−ヒドラジン緩衝液などをあげる
ことができる。その濃度としては30〜300mMを有利に使
用することができる。
本発明のフェニルピルビン酸定量用試薬の各成分の濃度
としては，フェニルアラニン脱水素酵素を0.05〜50ユニ
ット/ml,NADHを0.05〜1.0mM,塩類を５〜500mM,界面活性
剤を0.01〜５％，防腐剤を0.5〜50mMとなるように使用
すればよく，フェニルアラニン脱水素酵素を0.2〜30ユ
ニット/ml,NADHを0.1〜50mM,塩類を５〜350mM,界面活性
剤を0.02〜２％，防腐剤を1.0〜30mMとなるように使用
することが好ましい。また，これらの組成物はpH8.5〜1
0に緩衝能を有する緩衝液に溶解せしめればよい。この
ような緩衝液としては，通常pH8.5〜10のものが使用で
き，炭酸緩衝液，塩化アンモニウム−KOH緩衝液などを
あげることができる。濃度としては30〜300mMを有利に
使用することができる。
としては，フェニルアラニン脱水素酵素を0.05〜50ユニ
ット/ml,NADHを0.05〜1.0mM,塩類を５〜500mM,界面活性
剤を0.01〜５％，防腐剤を0.5〜50mMとなるように使用
すればよく，フェニルアラニン脱水素酵素を0.2〜30ユ
ニット/ml,NADHを0.1〜50mM,塩類を５〜350mM,界面活性
剤を0.02〜２％，防腐剤を1.0〜30mMとなるように使用
することが好ましい。また，これらの組成物はpH8.5〜1
0に緩衝能を有する緩衝液に溶解せしめればよい。この
ような緩衝液としては，通常pH8.5〜10のものが使用で
き，炭酸緩衝液，塩化アンモニウム−KOH緩衝液などを
あげることができる。濃度としては30〜300mMを有利に
使用することができる。
次に本発明のフェニルアラニン定量用試薬の測定原理を
示す。
示す。
このようにフェニルアラニンは（１）式により生成する
NADHを340nmの吸光度の増加として定量することができ
る。
NADHを340nmの吸光度の増加として定量することができ
る。
また生成するNADHをジアホラーゼ，フェナジンメトサル
フェイト，あるいは１−メトキシフェナジンサルフェイ
トの中から選ばれる１種を介して，ジホルマザンに導く
方法を採用することもできる。
フェイト，あるいは１−メトキシフェナジンサルフェイ
トの中から選ばれる１種を介して，ジホルマザンに導く
方法を採用することもできる。
次に本発明のフェニルピルビン酸定量用試薬の測定原理
を示す。
を示す。
このようにフェニルピルビン酸は（２）式により生成す
るNADを340nmの吸光度の減少として測定することによっ
て求めることができる。
るNADを340nmの吸光度の減少として測定することによっ
て求めることができる。
本発明のフェニルアラニン定量用試薬又はフェニルピル
ビン酸定量用試薬を用いて血清や尿などの生体液中のフ
ェニルアラニン又はフェニルピルビン酸を定量するとき
の反応温度としては，通常の酵素反応の20〜50℃を使用
すればよい。
ビン酸定量用試薬を用いて血清や尿などの生体液中のフ
ェニルアラニン又はフェニルピルビン酸を定量するとき
の反応温度としては，通常の酵素反応の20〜50℃を使用
すればよい。
（実施例） 次に本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例1,比較例１ ペプトン5g/，グリセリン5g/，リン酸一カリウム1g
/，リン酸二カリウム2g/，硫酸マグネシウム0.1g/
，塩化カルシウム0.05g/，酵母エキス2g/，肉エ
キス2g/，ビオチン９μg/，チロシン0.4g/塩化ア
ンモニウム5g/をpH7.2に調製した培地を用いてサーモ
アクチノマイセス・インテルメディウス（Thermoactino
myces intermedius）IFO 14230を培養し菌体を得た。
次にこの菌体を常法にて破砕後遠心し，次いで硫酸アン
モニウム分画（25〜60％），レッドセファロース4Bアフ
ィニィティクロマトグラフィー（ファルマシア社製），
スラブ調製用電気泳動（7.5％ポリアクリルアミドゲル,
pH8.9）を経て精製した（比活性13.8ユニット/mg蛋白
質，収率35％）。
/，リン酸二カリウム2g/，硫酸マグネシウム0.1g/
，塩化カルシウム0.05g/，酵母エキス2g/，肉エ
キス2g/，ビオチン９μg/，チロシン0.4g/塩化ア
ンモニウム5g/をpH7.2に調製した培地を用いてサーモ
アクチノマイセス・インテルメディウス（Thermoactino
myces intermedius）IFO 14230を培養し菌体を得た。
次にこの菌体を常法にて破砕後遠心し，次いで硫酸アン
モニウム分画（25〜60％），レッドセファロース4Bアフ
ィニィティクロマトグラフィー（ファルマシア社製），
スラブ調製用電気泳動（7.5％ポリアクリルアミドゲル,
pH8.9）を経て精製した（比活性13.8ユニット/mg蛋白
質，収率35％）。
次に，このようにして得られたサーモアクチノマイセス
・インテルメディウス由来のフェニルアラニン脱水素酵
素0.64ユニット/ml,NAD+5.0mM,グリシン−ヒドラジン緩
衝液（pH10.0）100mMからなるフェニルアラニン定量用
試薬を調製した。さらにこの試薬1.8mlを37℃にて２分
間予備加熱し,340nmにおける初期吸光度（A0）を測定し
た後，各種濃度のフェニルアラニン溶液0.2mlを加え,37
℃で反応を行わせて吸光度変化を測定し，吸光度が一定
の値を示す時点（約５分以内）での吸光度（Ａ）を求め
た。この吸光度変化量（Ａ−A0）とフェニルアラニン量
との関係を第１図に示した。
・インテルメディウス由来のフェニルアラニン脱水素酵
素0.64ユニット/ml,NAD+5.0mM,グリシン−ヒドラジン緩
衝液（pH10.0）100mMからなるフェニルアラニン定量用
試薬を調製した。さらにこの試薬1.8mlを37℃にて２分
間予備加熱し,340nmにおける初期吸光度（A0）を測定し
た後，各種濃度のフェニルアラニン溶液0.2mlを加え,37
℃で反応を行わせて吸光度変化を測定し，吸光度が一定
の値を示す時点（約５分以内）での吸光度（Ａ）を求め
た。この吸光度変化量（Ａ−A0）とフェニルアラニン量
との関係を第１図に示した。
このように，第１図から明らかなごとく，低濃度から高
濃度までの広範囲のＬ−フェニルアラニン量に対して吸
光度変化量が，化学量論的に直線関係を示し，微量のフ
ェニルアラニンを定量することも可能であることがわか
る。
濃度までの広範囲のＬ−フェニルアラニン量に対して吸
光度変化量が，化学量論的に直線関係を示し，微量のフ
ェニルアラニンを定量することも可能であることがわか
る。
尚，比較のため，ブレビバクテリウム属の細菌（Brevib
acterium sp.）DSM2448から公知文献アチーブス・オブ
・マイクロバイオロジー（Archives of Microbiolog
y）137巻,47頁（1984年）に従ってフェニルアラニン脱
水素酵素を精製した。
acterium sp.）DSM2448から公知文献アチーブス・オブ
・マイクロバイオロジー（Archives of Microbiolog
y）137巻,47頁（1984年）に従ってフェニルアラニン脱
水素酵素を精製した。
次にこのようにして得られたブレビバクテリウム属由来
のフェニルアラニン脱水素酵素0.64ユニット/ml,NAD+5.
0mM,グリシン−ヒドラジン緩衝液（pH10.0）100mMから
なるフェニルアラニン定量用試薬を調製した。
のフェニルアラニン脱水素酵素0.64ユニット/ml,NAD+5.
0mM,グリシン−ヒドラジン緩衝液（pH10.0）100mMから
なるフェニルアラニン定量用試薬を調製した。
このフェニルアラニン定量用試薬を5.0mlを37℃にて２
分間予備加熱し,340nmにおける初期吸光度を測定した
後，フェニルアラニン又は各種アミノ酸溶液50mMを0.5m
l加え,37℃で反応を行わせて吸光度変化を測定し，吸光
度変化量を求めた。
分間予備加熱し,340nmにおける初期吸光度を測定した
後，フェニルアラニン又は各種アミノ酸溶液50mMを0.5m
l加え,37℃で反応を行わせて吸光度変化を測定し，吸光
度変化量を求めた。
その結果を、フェニルアラニンの吸光度変化量を100と
した場合の，各種アミノ酸の吸光度変化量の相対値を第
１表に示す。
した場合の，各種アミノ酸の吸光度変化量の相対値を第
１表に示す。
さらに実施例１で使用したサーモアクチノマイセス・イ
ンテルメディウス由来の酵素を用いたフェニルアラニン
定量用試薬を用いて上記と同様の操作を行い，フェニル
アラニンの吸光度変化量を100とした場合の他のアミノ
酸の吸光度変化量の相対値も第１表に示し，先のブレビ
バクテリウム属由来の酵素を用いたフェニルアラニン定
量用試薬と比較した。
ンテルメディウス由来の酵素を用いたフェニルアラニン
定量用試薬を用いて上記と同様の操作を行い，フェニル
アラニンの吸光度変化量を100とした場合の他のアミノ
酸の吸光度変化量の相対値も第１表に示し，先のブレビ
バクテリウム属由来の酵素を用いたフェニルアラニン定
量用試薬と比較した。
このように，ブレビバクテリウム属由来の酵素を用いた
フェニルアラニン定量用試薬（比較例１）がフェニルア
ラニン以外のアミノ酸に対しても反応するのに対し，サ
ーモアクチノマイセス・インテルメディウス由来の酵素
を用いた試薬（実施例１）はフェニルアラニンを特異的
に定量しうることがわかる。
フェニルアラニン定量用試薬（比較例１）がフェニルア
ラニン以外のアミノ酸に対しても反応するのに対し，サ
ーモアクチノマイセス・インテルメディウス由来の酵素
を用いた試薬（実施例１）はフェニルアラニンを特異的
に定量しうることがわかる。
実施例2,比較例２ 実施例１で精製したフェニルアラニン脱水素酵素0.32ユ
ニット/ml,NADH0.3mM,塩化アンモニウム100mM,炭酸緩衝
液（pH9.0）200mMからなるフェニルピルビン酸定量用試
薬を調製した。さらにこの試薬1.8mlを37℃にて２分間
予備加熱し,340nmにおける初期吸光度（A0）を測定した
後，各種濃度のフェニルピルビン酸溶液0.2mlを加え,37
℃で反応を行わせて吸光度変化を測定し，吸光度が一定
の値を示す時点（約３分以内）での吸光度（Ａ）を求め
た。この吸光度変化量（Ａ−A0）とフェニルピルビン酸
との関係を第２図に示した。
ニット/ml,NADH0.3mM,塩化アンモニウム100mM,炭酸緩衝
液（pH9.0）200mMからなるフェニルピルビン酸定量用試
薬を調製した。さらにこの試薬1.8mlを37℃にて２分間
予備加熱し,340nmにおける初期吸光度（A0）を測定した
後，各種濃度のフェニルピルビン酸溶液0.2mlを加え,37
℃で反応を行わせて吸光度変化を測定し，吸光度が一定
の値を示す時点（約３分以内）での吸光度（Ａ）を求め
た。この吸光度変化量（Ａ−A0）とフェニルピルビン酸
との関係を第２図に示した。
このように，第２図から明らかなごとく，低濃度から高
濃度までの広範囲のフェニルピルビン酸量に対して吸光
度変化量が，化学量論的に直線関係を示し，微量のフェ
ニルピルビン酸を定量することも可能であることがわか
る。
濃度までの広範囲のフェニルピルビン酸量に対して吸光
度変化量が，化学量論的に直線関係を示し，微量のフェ
ニルピルビン酸を定量することも可能であることがわか
る。
尚，比較のため，比較例１で精製したブレビバクテリウ
ム属由来のフェニルアラニン脱水素酵素0.32ユニット/m
l,NADH0.3mM,塩化アンモニウム100mM,炭酸緩衝液（pH9.
0）200mMからなるフェニルピルビン酸定量用試薬を調製
した。さらにこの試薬2.0mlを37℃にて２分間予備加熱
し,340nmにおける初期吸光度を測定した後,50mMのフェ
ニルピルビン酸又は各種フェニルピルビン酸類似物溶液
0.5mlを加え,37℃で反応を行わせ吸光度変化量を求め
た。
ム属由来のフェニルアラニン脱水素酵素0.32ユニット/m
l,NADH0.3mM,塩化アンモニウム100mM,炭酸緩衝液（pH9.
0）200mMからなるフェニルピルビン酸定量用試薬を調製
した。さらにこの試薬2.0mlを37℃にて２分間予備加熱
し,340nmにおける初期吸光度を測定した後,50mMのフェ
ニルピルビン酸又は各種フェニルピルビン酸類似物溶液
0.5mlを加え,37℃で反応を行わせ吸光度変化量を求め
た。
その結果を，フェニルピルビン酸の吸光度変化量を100
とした場合の，他のフェニルピルビン酸類似物の吸光度
変化量の相対値を第２表に示す。
とした場合の，他のフェニルピルビン酸類似物の吸光度
変化量の相対値を第２表に示す。
さらに実施例２で使用したサーモアクチノマイセス・イ
ンテルメディウス由来のフェニルピルビン酸定量用試薬
を用いて上記と同じ操作を行い，フェニルピルビン酸の
吸光度変化量を100とした場合の他のフェニルピルビン
酸類似物の吸光度変化量の相対値を第２表に示し，先の
ブレビバクテリウム属由来の酵素を用いたフェニルアラ
ニン定量用試薬と比較した。
ンテルメディウス由来のフェニルピルビン酸定量用試薬
を用いて上記と同じ操作を行い，フェニルピルビン酸の
吸光度変化量を100とした場合の他のフェニルピルビン
酸類似物の吸光度変化量の相対値を第２表に示し，先の
ブレビバクテリウム属由来の酵素を用いたフェニルアラ
ニン定量用試薬と比較した。
このように，サーモアクチノマイセス・インテルメディ
ウス由来のフェニルアラニン脱水素酵素を用いたフェニ
ルピルビン酸定量用試薬（実施例２）はフェニルピルビ
ン酸を特異的に定量しうることがわかる。
ウス由来のフェニルアラニン脱水素酵素を用いたフェニ
ルピルビン酸定量用試薬（実施例２）はフェニルピルビ
ン酸を特異的に定量しうることがわかる。
実施例3,比較例３ 実施例１で調製したサーモアクチノマイセス・インテル
メディウス由来の酵素を用いたフェニルアラニン定量用
試薬，実施例２で調製したフェニルピルビン酸定量用試
薬，比較例１で調製したブレビバクテリウム属由来の酵
素を用いたフェニルアラニン定量用試薬，比較例２で調
製した同酵素を用いたフェニルピルビン酸定量用試薬の
４種の試薬を，それぞれ37℃にて保存し，経日的にフェ
ニルアラニンあるいはフェニルピルビン酸2mMの溶液を
加え,37℃で反応を行わせて吸光度変化量を求めること
により，フェニルアラニンあるいはフェニルピルビン酸
の検出率を求めた。
メディウス由来の酵素を用いたフェニルアラニン定量用
試薬，実施例２で調製したフェニルピルビン酸定量用試
薬，比較例１で調製したブレビバクテリウム属由来の酵
素を用いたフェニルアラニン定量用試薬，比較例２で調
製した同酵素を用いたフェニルピルビン酸定量用試薬の
４種の試薬を，それぞれ37℃にて保存し，経日的にフェ
ニルアラニンあるいはフェニルピルビン酸2mMの溶液を
加え,37℃で反応を行わせて吸光度変化量を求めること
により，フェニルアラニンあるいはフェニルピルビン酸
の検出率を求めた。
この検出率はそれぞれ試薬の調製直後を100としたとき
の値である。
の値である。
この結果を第３表に示す。
このように，ブレビバクテリウム属由来の酵素を用いた
試薬（比較例1,2）が１日後で使用不可能であるのに対
し，サーモアクチノマイセス・インテルメディウス由来
の酵素を用いた試薬（実施例1,2）は,10日後でも検出率
はほとんど変化せず，きわめて安定な性質を有している
ことがわかる。
試薬（比較例1,2）が１日後で使用不可能であるのに対
し，サーモアクチノマイセス・インテルメディウス由来
の酵素を用いた試薬（実施例1,2）は,10日後でも検出率
はほとんど変化せず，きわめて安定な性質を有している
ことがわかる。
（発明の効果） 本発明のフェニルアラニン又はフェニルピルビン酸定量
用試薬は，耐熱性のフェニルアラニン脱水素酵素を用い
た従来にない安定な定量用試薬であって，従来の試薬に
みられた問題点，すなわち測定に長時間要すること，特
異性が不十分であることなどを克服したものであるうえ
に，血中の共存物質の影響を受けず，前処理などの煩雑
な操作を必要とせずに，微量のフェニルアラニン又はフ
ェニルピルビン酸を，化学量論的に精度よく測定するこ
とができる。
用試薬は，耐熱性のフェニルアラニン脱水素酵素を用い
た従来にない安定な定量用試薬であって，従来の試薬に
みられた問題点，すなわち測定に長時間要すること，特
異性が不十分であることなどを克服したものであるうえ
に，血中の共存物質の影響を受けず，前処理などの煩雑
な操作を必要とせずに，微量のフェニルアラニン又はフ
ェニルピルビン酸を，化学量論的に精度よく測定するこ
とができる。
このように本発明の試薬は，多数の検体を精度よく迅速
に分析することが要求される臨床検査分野などへ多大な
寄与をなすものである。
に分析することが要求される臨床検査分野などへ多大な
寄与をなすものである。
第１図は，本発明のフェニルアラニン定量用試薬の定量
性を示す図であり，縦軸には340nmにおける吸光度変化
量を，横軸にはフェニルアラニン量（終濃度）を示して
いる。 第２図は本発明のフェニルピルビン酸定量用試薬の定量
性を示す図であり，縦軸には340nmにおける吸光度変化
量を，横軸にはフェニルピルビン酸量（終濃度）を示し
ている。
性を示す図であり，縦軸には340nmにおける吸光度変化
量を，横軸にはフェニルアラニン量（終濃度）を示して
いる。 第２図は本発明のフェニルピルビン酸定量用試薬の定量
性を示す図であり，縦軸には340nmにおける吸光度変化
量を，横軸にはフェニルピルビン酸量（終濃度）を示し
ている。
Claims (1)
- 【請求項１】（ａ）サーモアクチノマイセス（Thermoac
tinomyces）属由来耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素
及び（ｂ）酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを
含有することを特徴とするフェニルアラニン又はフェニ
ルピルビン酸定量用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5243787A JPH07114713B2 (ja) | 1987-03-06 | 1987-03-06 | フエニルアラニン又はフエニルピルビン酸定量用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5243787A JPH07114713B2 (ja) | 1987-03-06 | 1987-03-06 | フエニルアラニン又はフエニルピルビン酸定量用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63219399A JPS63219399A (ja) | 1988-09-13 |
| JPH07114713B2 true JPH07114713B2 (ja) | 1995-12-13 |
Family
ID=12914721
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5243787A Expired - Lifetime JPH07114713B2 (ja) | 1987-03-06 | 1987-03-06 | フエニルアラニン又はフエニルピルビン酸定量用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07114713B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021070943A1 (ja) * | 2019-10-11 | 2021-04-15 | 味の素株式会社 | 改変フェニルアラニン脱水素酵素 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4029296A1 (de) * | 1990-09-17 | 1992-03-19 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren und anordnung zur enzymatischen bestimmung von substanzen mit nichtendstaendigen nad(pfeil hoch)+(pfeil hoch)-abhaengig enzymatisch umsetzbaren gruppen, insb. von aspartam |
| CN103614485B (zh) * | 2013-12-11 | 2015-08-05 | 中国食品发酵工业研究院 | 一种快速鉴别中间型高温放线菌的特异pcr方法 |
-
1987
- 1987-03-06 JP JP5243787A patent/JPH07114713B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021070943A1 (ja) * | 2019-10-11 | 2021-04-15 | 味の素株式会社 | 改変フェニルアラニン脱水素酵素 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63219399A (ja) | 1988-09-13 |
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