JP5697324B2 - 重炭酸イオン濃度測定方法及び該方法に用いる溶液 - Google Patents
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Description
本発明は、試料中（特に血清又は血漿中）の重炭酸イオン濃度を測定する方法、及び当該方法に用いる溶液に関する。
血液は、非常に大量の炭酸ガスを溶かすことができる。血液に溶けた炭酸ガスは、炭酸として存在している。血液中の炭酸（Ｈ２ＣＯ３）は、重炭酸イオン（ＨＣＯ３ −）と平衡状態にある。重炭酸イオンは、血液中では塩化物イオンに次いで多く存在するイオンであり、血液中で重要な生理学的緩衝作用系を形成している。特に、炭酸と重炭酸イオンとの平衡は体液の酸性度を調節する上で非常に重要である。このため、血清または血漿の重炭酸イオン濃度の測定値は電解質分散及びアニオン不足等の有意な標識として用いることができ、呼吸、代謝系の酸−塩基不均衡の医学的診断の助けになっている。例えば血清および血漿中の正常重炭酸イオン濃度は２２〜３２ｍｍｏｌ／Ｌであるが、異常時には１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下の低値または４０ｍｍｏｌ／Ｌ以上の高値へと変動する。
血清および血漿中の重炭酸イオン濃度を測定する方法として、例えばホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを用いる方法が知られている。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、ホスホエノールピルビン酸及び重炭酸イオンに作用して、オキザロ酢酸とリン酸イオンを生成する反応を触媒する酵素である。当該酵素は、臨床検査薬の分野において体液（特に血清及び血漿）中の重炭酸イオン測定のために従来から用いられてきた。
体液中の重炭酸イオン量の測定は様々な方法で実施可能であるが、例えば次に述べる酵素反応によって生じる変化を追跡することにより行われている。まず、重炭酸イオンとホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）にホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）を作用させる。これにより、オキザロ酢酸とリン酸が生成する。生成したオキザロ酢酸を還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）存在下、マレイン酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）と反応させる。当該反応の際のＮＡＤＨの減少量を公知方法（例えばエンド法もしくはレート法）で測定し、当該測定値から重炭酸イオン濃度を算出する。当該方法の概要を以下に示す。
溶液中に溶解した炭酸ガスは炭酸となって存在するが、炭酸と重炭酸イオンの平衡は特に酸性ｐＨにおいては炭酸形成側に偏るため、炭酸ガスとなって大気中に放出されてしまう。また、酸性ｐＨでは補酵素として働くＮＡＤＨも不安定となってしまう。従って溶液中の炭酸測定は、できるだけアルカリ性ｐＨ条件下で行われることが好ましい。上記の重炭酸イオン濃度測定方法においてもｐＨ８．０以上の緩衝液が汎用されている。しかしながら、炭酸と重炭酸イオンの平衡はアルカリ性ｐＨにおいては重炭酸イオン形成側に偏るため、重炭酸イオン濃度測定に用いられる緩衝液には炭酸ガスが溶けやすくなる。このため、従来、重炭酸イオン濃度測定に用いられる溶液は、アルカリ性ｐＨであること、かつ、密閉するなどして炭酸ガス又は炭酸ガスを含む気体（例えば大気）にふれない状態で保管すること、が求められてきた。
しかし、例えば、臨床検査の現場等では、通常自動分析機の保冷庫に試薬を設置したまま分析が行なわれる。そのため、試薬は冷蔵で保存されるものの数時間から数日開封状態が維持されることもしばしばある。その結果、重炭酸イオン濃度測定においては、弱アルカリ性からアルカリ性の試薬（重炭酸イオン濃度測定に用いられる溶液）へ空気中の二酸化炭素が溶け込んで炭酸イオンとなり、酵素反応が進行するため、開封状態では試薬の安定性が著しく低下するという課題が指摘されていた。
その上、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼはアルカリ側のｐＨで不安定な酵素であり、このため該酵素を含むアルカリ性の重炭酸イオン濃度測定試薬は液状で長時間保存できないという問題もある。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとして通常市販されているものは、大部分がトウモロコシの葉や小麦の胚等の植物由来の酵素であり、これらはｐＨ８．０での安定性が極めて低い。
他生物由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの探索も行われている。例えば、ハイフォミクロビウム由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを使用する重炭酸イオンの測定法が公知である（特許文献１） 。該酵素は微生物起源によるものであり、植物起源のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが有する“アルカリ側のｐＨで不安定”という欠点を有していない。しかしながら、重炭酸イオン測定試薬で用いられる酵素濃度（通常０．０５〜５Ｕ／ｍＬ）では安定性が不十分である。また、特許文献２に記載の重炭酸イオン濃度測定法では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが使用されている。しかしながら、該酵素も弱アルカリ性である重炭酸イオン測定試薬中では安定性が低く、さらに該酵素は活性化のために高価なアセチルＣｏＡを必要とする。
このように、重炭酸イオン濃度測定に用いられる溶液（試薬）は、重炭酸イオンが炭酸ガスとなって大気中に放出されるのを防ぐためアルカリ性であることが好ましいが、アルカリ性であることにより、大気中の二酸化炭素により酵素反応が進んでしまい、また、当該試薬に用いるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼも不安定となって、試薬の安定性が著しく低下するいう問題を有する。
本発明は、測定用試薬が長時間大気にふれていても、測定能が低下することのない重炭酸イオン濃度測定方法及び当該方法に用いられる溶液（試薬）を提供することを課題とする。
本発明者らは、驚くべき事に、上で概要を記した重炭酸イオン濃度測定方法において、測定をｐＨ７以上８未満の溶液中で行うこととし、さらに当該溶液の外気と接触する表面積と当該溶液の体積の比が０．２未満とし、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとして酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを用いることで、前記課題を解決し得ることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は例えば以下の項１〜６に記載の重炭酸イオン濃度測定方法、重炭酸イオン濃度測定用溶液、及び重炭酸イオン濃度測定用溶液製造用粉体組成物を包含する。
項１．
試料中の重炭酸イオン濃度を測定する方法であって、
（Ａ）：試料中の重炭酸イオン、及びホスホエノールピルビン酸を、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ存在下で反応させ、オキザロ酢酸を生成させる工程
（Ｂ）：（Ａ）工程で生成したオキザロ酢酸、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体を、マレイン酸デヒドロゲナーゼ存在下で反応させる工程
（Ｃ）：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド若しくはその類似体の減少を測定する工程
を含み、
前記（Ａ）〜（Ｃ）工程のうち少なくとも（Ａ）工程はｐＨ７以上８未満の溶液中で行われ、当該溶液の外気と接触する表面積と当該溶液の体積の比が０．２未満であり、
前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼである、
重炭酸イオン濃度測定方法。
項２．
前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体が、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくは還元型３−アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドである、項１に記載の重炭酸イオン濃度測定方法。
項３．
前記酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが、アセトバクター・パスツリアヌス由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アセトバクター・アセチ由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アセトバクター・ザイリナム由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アセトバクター・ハンゼニイ由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、及びグルコノバクター・オキシダンス由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼである、項１又は２に記載の重炭酸イオン濃度測定方法。
項４．
ホスホエノールピルビン酸、酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体、及びマレイン酸デヒドロゲナーゼを含み、ｐＨ７以上８未満である、重炭酸イオン濃度測定用溶液。
項５．
外気と接触する表面積と体積の比が０．２未満となるよう容器に格納された、項４に記載の重炭酸イオン濃度測定用溶液。
項６．
重炭酸イオン濃度測定用溶液の製造用粉体組成物であって、
ホスホエノールピルビン酸、酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体、及びマレイン酸デヒドロゲナーゼを含む、項５に記載の重炭酸イオン濃度測定用溶液の製造用粉体組成物。
項１．
試料中の重炭酸イオン濃度を測定する方法であって、
（Ａ）：試料中の重炭酸イオン、及びホスホエノールピルビン酸を、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ存在下で反応させ、オキザロ酢酸を生成させる工程
（Ｂ）：（Ａ）工程で生成したオキザロ酢酸、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体を、マレイン酸デヒドロゲナーゼ存在下で反応させる工程
（Ｃ）：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド若しくはその類似体の減少を測定する工程
を含み、
前記（Ａ）〜（Ｃ）工程のうち少なくとも（Ａ）工程はｐＨ７以上８未満の溶液中で行われ、当該溶液の外気と接触する表面積と当該溶液の体積の比が０．２未満であり、
前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼである、
重炭酸イオン濃度測定方法。
項２．
前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体が、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくは還元型３−アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドである、項１に記載の重炭酸イオン濃度測定方法。
項３．
前記酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが、アセトバクター・パスツリアヌス由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アセトバクター・アセチ由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アセトバクター・ザイリナム由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アセトバクター・ハンゼニイ由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、及びグルコノバクター・オキシダンス由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼである、項１又は２に記載の重炭酸イオン濃度測定方法。
項４．
ホスホエノールピルビン酸、酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体、及びマレイン酸デヒドロゲナーゼを含み、ｐＨ７以上８未満である、重炭酸イオン濃度測定用溶液。
項５．
外気と接触する表面積と体積の比が０．２未満となるよう容器に格納された、項４に記載の重炭酸イオン濃度測定用溶液。
項６．
重炭酸イオン濃度測定用溶液の製造用粉体組成物であって、
ホスホエノールピルビン酸、酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体、及びマレイン酸デヒドロゲナーゼを含む、項５に記載の重炭酸イオン濃度測定用溶液の製造用粉体組成物。
本発明の、試料中の重炭酸イオン濃度を測定する方法であれば、測定用溶液（測定用試薬）を大気にふれさせた状態で長時間保存したとしても、測定能が低下しない。当該溶液はアルカリ性であるが、溶解させたホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは安定に保持され、大気中の炭酸ガスもほとんど溶解せず、長時間大気にふれたままで安定に保存できる。
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。なお、以下、酵素の説明に関しては、特に断らない限り、好適温度において１分間に１μｍｏｌの基質を変化させる量を１単位（ユニット：Ｕ）とする。
＜重炭酸イオン濃度測定方法＞
本発明の、試料中の重炭酸イオン濃度を測定する方法は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）工程を含む。
本発明の、試料中の重炭酸イオン濃度を測定する方法は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）工程を含む。
（Ａ）：試料中の重炭酸イオン、及びホスホエノールピルビン酸を、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ存在下で反応させ、オキザロ酢酸を生成させる工程
（Ｂ）：（Ａ）工程で生成したオキザロ酢酸、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体を、マレイン酸デヒドロゲナーゼ存在下で反応させる工程
（Ｃ）：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド若しくはその類似体の吸光度の減少を測定する工程
（Ｂ）：（Ａ）工程で生成したオキザロ酢酸、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体を、マレイン酸デヒドロゲナーゼ存在下で反応させる工程
（Ｃ）：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド若しくはその類似体の吸光度の減少を測定する工程
本発明の、試料中の重炭酸イオン濃度を測定する方法では、上記（Ａ）〜（Ｃ）工程のうち少なくとも（Ａ）工程は、ｐＨ７以上８未満の溶液中で行われることが好ましい。また、上記（Ａ）〜（Ｃ）工程のうち少なくとも（Ａ）工程は、当該溶液の外気と接触する表面積と当該溶液の体積の比が０．２未満であることが好ましい。さらに、（Ａ）工程で用いるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、ｐＨ７以上８未満の溶液中であっても安定であり、触媒能が低下し難いものを用いるのが好ましい。
（Ａ）工程
（Ａ）工程は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸、及び重炭酸イオンを含有する試料を混合し、反応させることで行われる。当該反応により、オキザロ酢酸が生成される。より詳細には、当該反応により、ホスホエノールピルビン酸及び重炭酸イオンから、オキザロ酢酸及びリン酸が生成される。
（Ａ）工程は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸、及び重炭酸イオンを含有する試料を混合し、反応させることで行われる。当該反応により、オキザロ酢酸が生成される。より詳細には、当該反応により、ホスホエノールピルビン酸及び重炭酸イオンから、オキザロ酢酸及びリン酸が生成される。
当該工程は通常溶液中で行う。特に、緩衝液中で行うことが好ましい。特に制限はされないが、例えばホスホエノールピルビン酸及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを溶解した緩衝液に、重炭酸イオンを含有する試料を添加することにより当該工程を行うことができる。用いる緩衝液としては、特に制限はされないが、ｐＨ７以上８未満を実現する緩衝液が好ましく、例えばトリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、グット緩衝液（Ｇｏｏｄ ＮＥｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５ｐ４６７−７７（１９６６ Ｆｅｂ））等を挙げることができる。緩衝液を調製するために溶解させる物質（例えばトリス塩、ホウ酸塩、リン酸塩等の緩衝塩）の量は、当該物質が溶解したときに示す緩衝能等に応じて適宜設定することができ、特に制限されないが、例えば５〜１００ｍＭ、好ましくは１０〜５０ｍＭとなるように用いればよい。
当該工程で用いるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、ｐＨ７以上８未満の溶液中であっても安定であり、触媒能が低下し難いものであることが好ましい。例えば、酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが好ましい。酢酸菌由来ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、弱アルカリ性でも比較的安定であるからである。当該工程に用いる好適なホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを産生する酢酸菌としては、特に制限はされないが、例えばアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ）属、フラチュリア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ ）属およびアシドモナス（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ） 属などが挙げられる。これらの酢酸菌のうち、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを著量生産する酢酸菌から該酵素を精製することが経済的には望ましい。特に好適なホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとしては、例えばアセトバクター・パスツリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ ）、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ ）、アセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ ）、アセトバクター・ハンゼニイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ）由来のものが挙げられる。より具体的には、例えばアセトバクター・ハンゼニイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｈａｎｓｅｎｉｉ）ＩＦＯ１４８２０、アセトバクター・パスツリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）ＩＦＯ１４８１４、アセトバクター・ザイリナム（（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）ＩＦＯ１５２３７ 又はグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＩＦＯ３４６２等由来のものを挙げることができる。
本発明に好適なアセトバクター・ハンゼニイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｈａｎｓｅｎｉｉ）からのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの精製例を次に記載する。例えばアセトバクター・ハンゼニイＩＦＯ１４８３２０ を栄養培地で生育させ、集菌後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁させ、フレンチプレスで破砕する。この破砕物を遠心後、得られた上清の３０〜５０％硫酸アンモニウム画分を取得する。得られた画分（酵素を含む液）は次いでイオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等で精製し、約２５Ｕ／ｍｇ蛋白の酵素液を得ることができる。該方法は酢酸菌に属する他の菌株のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの精製にも適用可能である。
また、酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼには、既に報告されているものもあり、例えばアセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ ）（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２２，１０９（１９７９））、アセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ ）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９８，１００５（１９６９ ）等由来のものが知られている。このような文献には酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの精製方法も報告されており、当該精製方法は他の酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを精製するのにも利用できる。本発明に、例えば上記の論文に記載の方法に従って酢酸菌から精製したホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを用いることもできる。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
用いるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの量は特に制限されないが、当該工程が溶液中で行われる場合、好ましくは０．００５〜５０Ｕ／ｍＬ、より好ましくは０．０１〜１０Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは０．０５〜１Ｕ／ｍＬである。
また、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、触媒として働くためにマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）又はマンガンイオン（Ｍｎ２＋）が存在することが好ましいため、マグネシウム塩又はマンガン塩を併せて用いることが望ましい。このような塩としては特に制限されず、例えば硫酸マグネシウム及び／又は硫酸マンガンを用いることができる。当該塩は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。用いる当該塩の量も特に制限されないが、好ましくは濃度が１〜２００ｍＭ、より好ましくは３〜１００ｍＭである。
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性は、例えば次の方法によって算出できる。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３ 、３．２ｍＭホスホエノールピルビン酸、１００ ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１４ｍＭ ＮＡＤＨ、５０Ｕ／ｍＬマレイン酸デヒドロゲナーゼを含む反応混液２．９ｍＬをキュベット（ｄ＝１ｃｍ）に調製し、３０℃で約５分間予備加温する。次に酵素溶液０．１ｍＬを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照に３０℃に制御された分光光度計で３４０ｎｍの吸光度変化を２〜３分間記録し、その初期直線部分から１分間当りの吸光度変化を求める（ΔＯＤｔｅｓｔ）。盲検は酵素溶液の代わりに５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、同様に操作を行って、１分間当りの吸光度変化を求める（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。１ｍＭのＮＡＤＨ溶液を３４０ｎｍの測定波長で吸光度を測定すると６．２２Ａｂｓとなることがよく知られているため、上記のように吸光度変化を求めれば酵素活性を算出することができる。例えば、吸光度変化量を測定し、１分間に６．２２ｍＡｂｓの変化（減少）が生じれば、１μｍｏｌ／ＬのＮＡＤＨが減少したことになる。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性は、上記条件で１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを消費する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
上述のように、当該工程は通常溶液中で行われる。よって、例えばホスホエノールピルビン酸塩を溶液に溶解させてホスホエノールピルビン酸を溶液中に存在させ、反応に用いることで、当該工程を行うことができる。ホスホエノールピルビン酸塩としては、特に制限されないが、例えばホスホエノールピルビン酸のカリウム塩、ナトリウム塩、トリシクロヘキシルアンモニウム塩、又はモノシクロヘキシルアンモニウム塩等が挙げられる。当該塩は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。用いるホスホエノールピルビン酸塩量は特に制限されないが、好ましくは濃度が１〜１０ｍＭ、より好ましくは２〜５ｍＭである。
本発明において、（Ａ）〜（Ｃ）工程のうち、少なくとも（Ａ）工程は、当該工程が行われる溶液の外気と接触する表面積と当該溶液の体積の比が０．２未満となる条件下で行うことが好ましい。ここでの外気は炭酸ガスを含有するものである。通常、溶液がアルカリ性である場合、外気に溶液の表面が接触している以上、外気中の炭酸ガスは溶液中に溶解し、重炭酸イオン濃度の測定に悪影響を及ぼしてしまう。しかし、意外なことに、溶液のｐＨを７以上８未満の弱アルカリ性とし、かつ溶液の外気と接触する表面積と当該溶液の体積の比が０．２未満（より好ましくは１．８以下）とすることにより、外気中の炭酸ガスが重炭酸イオン濃度測定に与える影響を無くすことができる。
「溶液の外気と接触する表面積と当該溶液の体積の比」とは、当該表面積をｃｍ２で表記したときの値を、当該体積をｃｍ３で表記したときの値で除したものである。例えば、溶液の外気接触表面積が１０ｃｍ２であり、当該溶液の体積が１００ｃｍ３である場合、「溶液の外気と接触する表面積と当該溶液の体積の比」は（１０／１００）＝０．１である。
このような条件下で（Ａ）工程を行うためには、（Ａ）工程を行う溶液を格納する容器や当該容器に格納する液量を適宜選択すればよい。容器の形状は特に制限されず、例えば、口が比較的狭く容量が大きい容器や、長細い容器から、このような条件を満たすものを見出して適宜利用することができる。また、容器の材質は特に制限されず、例えばガラス、プラスチック等であってよい。
（Ｂ）工程
（Ｂ）工程は、（Ａ）工程で生成したオキザロ酢酸、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体を混合し、反応させることで行われる。当該反応により、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体は、酸化型へと変わる。例えば、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を用いた場合、酸化されて、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）へと変わる。これにより、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体は、減少することになる。
（Ｂ）工程は、（Ａ）工程で生成したオキザロ酢酸、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体を混合し、反応させることで行われる。当該反応により、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体は、酸化型へと変わる。例えば、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を用いた場合、酸化されて、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）へと変わる。これにより、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体は、減少することになる。
当該工程は通常溶液中で行う。特に、緩衝液中で行うことが好ましい。特に制限はされないが、例えば（Ａ）工程に用いた緩衝液へ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体を添加することにより当該工程を行うことができる。また、例えば（Ａ）工程を行うに際し、ホスホエノールピルビン酸及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼだけではなく、さらにマレイン酸デヒドロゲナーゼ、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体を混合させた溶液（好ましくは緩衝液）を用いれば、当該溶液中で（Ａ）工程及び（Ｂ）工程の反応が連鎖的に起こるため、好ましい。
（Ｂ）工程に用いる緩衝液は特に制限されず、例えばトリス塩酸緩衝液、グット緩衝液、ホウ酸緩衝液リン酸緩衝液等を挙げることができる。また、上記のように（Ａ）工程及び（Ｂ）工程を同一緩衝液中で行う場合は、（Ｂ）工程もｐＨ７以上８未満の緩衝液中で行うことが好ましい。
マレイン酸デヒドロゲナーゼとしては、例えば豚心臓由来、サーマス属由来、又はバチルス属由来のもの等を用いることができ、由来の異なるもの１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。また、用いるマレイン酸デヒドロゲナーゼ量は、特に制限されないが、好ましくは１〜１００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは５〜５０Ｕ／ｍＬである。
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類似体としては、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）と同様に電子供与体として働き得るものであれば特に制限されず、公知のものを用いることができる。例えば、３−アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセチルＮＡＤＨ、又はａＮＡＤＨ）を挙げることができる。
用いる還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体の量は特に制限されないが、好ましくは濃度が０．０１〜５ｍＭ、より好ましくは０．０５〜１ｍＭ、さらに好ましくは０．１〜０．５ｍＭである。
なお、試料中にラクテートデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸が存在すると、妨害反応を起こすおそれがあるため、これを抑えるために例えばオキザメートのようなラクテートインヒビターを溶液中に約１〜２０ｍＭ程度添加してもよい。
（Ｃ）工程
（Ｃ）工程は、（Ｂ）工程における還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体の減少を測定する工程である。これにより得られる測定値から、試料中の重炭酸イオン量を算出することができる。（Ｂ）工程における変化を測定することから、（Ｃ）工程は（Ｂ）工程と並行して行われることが好ましい。
（Ｃ）工程は、（Ｂ）工程における還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体の減少を測定する工程である。これにより得られる測定値から、試料中の重炭酸イオン量を算出することができる。（Ｂ）工程における変化を測定することから、（Ｃ）工程は（Ｂ）工程と並行して行われることが好ましい。
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体の減少を測定できる方法であれば、測定方法は特に制限されず、公知の方法を用いることができる。例えば、好適な測定方法として、吸光度測定を挙げることができる。還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体は３４０ｎｍ付近に吸収極大をもつことがよく知られており、３４０ｎｍ吸収度変化は種々の酵素活性の測定及び指示反応に広く応用されている。測定は、例えばエンド法（反応の終末点で測定する方法）又はレート法（一定時間の反応速度を測定する方法）のいずれでも行うことができる。
例えば、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを用いたレート法による測定において、３４０ｎｍ吸収度減少量が６．２２ｍＡｂｓ／ｍｉｎの場合、１μｍｏｌのＮＡＤＨが１分間に減少したことになる。また、予め標準液（重炭酸イオン既知濃度溶液）を測定した場合の吸光度変化量を求め、試料を測定した場合の吸光度変化量が標準液の何倍になるかを求めることによって、試料中の重炭酸イオン量を算出することもできる。
なお、（Ａ）〜（Ｃ）工程は、異なった容器に格納された溶液中で行ってもよい（つまり、それぞれの工程を行うたび、他の容器へと移しかえてもよい）が、上述のとおり、（Ａ）工程及び（Ｂ）工程を同一溶液中で行うことができ、（Ｃ）工程は（Ｂ）工程と並行して行われることが好ましいため、（Ａ）〜（Ｃ）工程は全て一の容器に格納された同一溶液中で行うことができる。（Ａ）〜（Ｃ）工程は全て一の容器に格納された同一溶液中で行う場合も、用いる容器の形状は特に制限されず、例えば、口が比較的狭く容量が大きい容器や、長細い容器から、このような条件を満たすものを見出して適宜利用することができる。また、容器の材質は特に制限されず、例えばガラス、プラスチック等であってよい。コスト及び手間の観点から、（Ａ）〜（Ｃ）工程は同一溶液中で行うことが好ましい。この場合、（Ａ）〜（Ｃ）の工程は、溶液の外気と接触する表面積と当該溶液の体積の比が０．２未満となる条件下で行うことが好ましい。また、各工程で述べた溶液に溶解させる物質を同一溶液内に溶解させて用いることができる。
特に制限される訳ではないが、例えば、ホスホエノールピルビン酸、酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体、及びマレイン酸デヒドロゲナーゼを含有する弱アルカリ性緩衝液を調製し、当該緩衝液１．５〜３．０ｍＬと重炭酸イオンを含む試料０．０１ｍＬを混合し、３７℃で５〜１０分間反応させ、ＮＡＤＨ濃度に応じて、例えば３４０ｎｍ、３６５ｎｍ、３８０ｎｍ等、あるいはアセチルＮＡＤＨの濃度に応じて４００ｎｍ、４０５ｎｍ、４１０ｎｍ等における吸光度の減少を測定することで、（Ａ）〜（Ｃ）工程は全て一の容器に格納された同一溶液中で行うことができる。
＜重炭酸イオン濃度測定試薬＞
また、本発明は、上述した重炭酸イオン濃度を測定する方法に用いるための試薬をも提供する。特に、（Ａ）〜（Ｃ）工程を同一溶液内で行えるように調製した溶液は、長時間開封状態で保存しても、大気中の二酸化炭素（炭酸ガス）の影響を受けることなく安定であり、重炭酸イオン濃度測定に好ましく用いることができる。
また、本発明は、上述した重炭酸イオン濃度を測定する方法に用いるための試薬をも提供する。特に、（Ａ）〜（Ｃ）工程を同一溶液内で行えるように調製した溶液は、長時間開封状態で保存しても、大気中の二酸化炭素（炭酸ガス）の影響を受けることなく安定であり、重炭酸イオン濃度測定に好ましく用いることができる。
本発明の、重炭酸イオン濃度測定用試薬として用いることができる溶液の一態様は、ホスホエノールピルビン酸、酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体、及びマレイン酸デヒドロゲナーゼを含み、ｐＨ７以上８未満である、重炭酸イオン濃度測定用溶液である。
本発明の重炭酸イオン濃度測定試薬に用いる、好ましいホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びその量、好ましい還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体及びその量、並びに、好ましいマレイン酸デヒドロゲナーゼ及びその量、は上記「重炭酸イオン濃度測定方法」欄で述べたのと同様である。これらを、ｐＨ７以上８未満となるよう、溶液に溶解させたものを、本発明の重炭酸イオン濃度測定用溶液として好ましく用いることができる。
当該溶液は緩衝液であることが好ましい。特に制限はされないが、ｐＨ７以上８未満を実現する緩衝液が好ましく、例えばトリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、グット緩衝液（Ｇｏｏｄ ＮＥｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５ｐ４６７−７７（１９６６ Ｆｅｂ））等の弱アルカリ性緩衝液を挙げることができる。緩衝液を調製するために溶解させる物質（例えばトリス塩、ホウ酸塩、リン酸塩等の緩衝塩）の量は、当該物質が溶解したときに示す緩衝能等に応じて適宜設定することができ、特に制限されないが、例えば５〜１００ｍＭ、好ましくは１０〜５０ｍＭとなるように用いればよい。
例えば、本発明の重炭酸イオン濃度測定用溶液の一態様として、下記の組成を有するものを挙げることができる。
弱アルカリ性緩衝液 （ｐＨ７以上８未満）１０〜５０ｍＭ
ホスホエノールピルビン酸塩 ２〜５ｍＭ
マグネシウムイオン ３〜１００ｍＭ
ＮＡＤＨ ０．１〜０．５ｍＭ
マレイン酸デヒドロゲナーゼ ５〜５０Ｕ／ｍＬ
酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ ０．０５〜１０Ｕ／ｍＬ
ホスホエノールピルビン酸塩 ２〜５ｍＭ
マグネシウムイオン ３〜１００ｍＭ
ＮＡＤＨ ０．１〜０．５ｍＭ
マレイン酸デヒドロゲナーゼ ５〜５０Ｕ／ｍＬ
酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ ０．０５〜１０Ｕ／ｍＬ
より具体的には、例えば下記組成を有するものを挙げることができる。
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８） １０〜５０ｍＭ
ホスホエノールピルビン酸カリウム塩 ２〜５ｍＭ
硫酸マグネシウム ３〜１００ｍＭ
ＮＡＤＨ ０．１〜０．５ｍＭ
マレイン酸デヒドロゲナーゼ ５〜５０Ｕ／ｍＬ
酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ ０．５〜５Ｕ／ｍＬ
ホスホエノールピルビン酸カリウム塩 ２〜５ｍＭ
硫酸マグネシウム ３〜１００ｍＭ
ＮＡＤＨ ０．１〜０．５ｍＭ
マレイン酸デヒドロゲナーゼ ５〜５０Ｕ／ｍＬ
酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ ０．５〜５Ｕ／ｍＬ
また、試料中にラクテートデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸が存在すると、妨害反応を起こすおそれがあるため、これを抑えるために例えばオキザメートのようなラクテートインヒビターを約１〜２０ｍＭ程度添加してもよい。
このようにして調製される、本発明の重炭酸イオン濃度測定用溶液は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが溶液中で安定であり、重炭酸イオン濃度測定に好ましく用いることができる。
このように調製できる本発明の重炭酸イオン濃度測定用溶液は、特に当該溶液の外気と接触する表面積と当該溶液の体積の比が０．２未満となる条件を満たすように、容器に格納されることが好ましい。「溶液の外気と接触する表面積と当該溶液の体積の比」については、前述したのと同様である。当該条件を満たすことにより、外気中の炭酸ガスが重炭酸イオン濃度測定に与える影響をほぼ無くすことができる。容器の形状は特に制限されず、例えば、口が比較的狭く容量が大きい容器や、長細い容器から、このような条件を満たすものを見出して適宜利用することができる。また、容器の材質は特に制限されず、例えばガラス、プラスチック等であってよい。
また、特定量の水に溶解させることで、上述した本発明の本発明の重炭酸イオン濃度測定用溶液を調製することができるように予め秤量された、ホスホエノールピルビン酸、酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、及び緩衝液を調製するために溶解させる物質を混合したもの（重炭酸イオン濃度測定用溶液製造用粉体組成物）も、本発明の重炭酸イオン濃度測定用試薬に包含される。
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
実施例１
下記の試薬組成に従い、重炭酸イオン濃度測定用溶液（以下「実施例１試薬溶液」という）を調製した。
下記の試薬組成に従い、重炭酸イオン濃度測定用溶液（以下「実施例１試薬溶液」という）を調製した。
〔試薬組成〕
トリス（ｐＨ７．８）
トリトンＸ−１００ ０．１％
ＰＥＰナトリウム塩 ５ｍＭ
ａＮＡＤＨ ０．３ｍＭ
ＰＥＰＣ ０．４Ｕ／ｍＬ
ＭＤＨ ５Ｕ／ｍＬ
トリス（ｐＨ７．８）
トリトンＸ−１００ ０．１％
ＰＥＰナトリウム塩 ５ｍＭ
ａＮＡＤＨ ０．３ｍＭ
ＰＥＰＣ ０．４Ｕ／ｍＬ
ＭＤＨ ５Ｕ／ｍＬ
なお、トリスはナカライテスク社製、トリトンＸ−１００は和光純薬社製、硫酸マグネシウムはナカライテスク社製、ＰＥＰナトリウム塩（ホスホエノールピルビン酸ナトリウム塩）はシグマアルドリッチ社製、ａＮＡＤＨ（３−アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド）はオリエンタル酵母工業製、ＰＥＰＣ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ）及びＭＤＨ（マレイン酸デヒドロゲナーゼ）は東洋紡績社製（それぞれＰＰＣ−３０１及びＭＡＤ−２１１）を用いた。
実施例１試薬溶液を用い、下記の４種類の試料中の重炭酸イオン濃度を測定した。
〔試料〕
精製水、
キャリブレーター（既知濃度（３１．４ｍＭ）重炭酸ナトリウム水溶液）、
プール血清（２種類：血清α及び血清β（いずれも管理血清））
〔試料〕
精製水、
キャリブレーター（既知濃度（３１．４ｍＭ）重炭酸ナトリウム水溶液）、
プール血清（２種類：血清α及び血清β（いずれも管理血清））
具体的には、プラスチックキュベットにおいて、各試料３μＬに実施例１試薬溶液３００μＬを添加し３７℃でインキュベーション後１分後と４分後の４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、１分間当たりの吸光度変化量を求めた。そして、キャリブレーターの吸光度変化量を基準として、プール血清中に存在した重炭酸イオン量を算出した。
また、測定は、初日、３日後、７日後、１１日後、１４日後、１７日後に行った。測定期間中実施例１試薬溶液は９℃で開封状態で保存した。実施例１試薬溶液は開口表面積と体積の比が０．２未満となるよう維持した。その結果を図１に示す。図１から、１４日後も実施例１試薬溶液の重炭酸イオン濃度測定能は維持されることがわかった。
比較例１
下記の試薬組成に従い、重炭酸イオン濃度測定用溶液（以下「比較例１試薬溶液」という）を調製した。
下記の試薬組成に従い、重炭酸イオン濃度測定用溶液（以下「比較例１試薬溶液」という）を調製した。
〔試薬組成〕
トリス（ｐＨ８．０）
トリトンＸ−１００ ０．１％
ＰＥＰナトリウム塩 ５ｍＭ
ａＮＡＤＨ ０．３ｍＭ
ＰＥＰＣ ０．４Ｕ／ｍＬ
ＭＤＨ ５Ｕ／ｍＬ
トリス（ｐＨ８．０）
トリトンＸ−１００ ０．１％
ＰＥＰナトリウム塩 ５ｍＭ
ａＮＡＤＨ ０．３ｍＭ
ＰＥＰＣ ０．４Ｕ／ｍＬ
ＭＤＨ ５Ｕ／ｍＬ
なお、各成分の販社は上記と同じである。
比較例１試薬溶液を用い、下記の４種類の試料中の重炭酸イオン濃度を測定した。
〔試料〕
精製水、
キャリブレーター（既知濃度（３１．４ｍＭ）重炭酸ナトリウム水溶液）、
プール血清（２種類：血清α及び血清β（いずれも管理血清））
〔試料〕
精製水、
キャリブレーター（既知濃度（３１．４ｍＭ）重炭酸ナトリウム水溶液）、
プール血清（２種類：血清α及び血清β（いずれも管理血清））
具体的には、プラスチックキュベットにおいて、各試料３μＬに比較例１試薬溶液３００μＬを添加し３７℃でインキュベーション後１分後と４分後の４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、１分間当たりの吸光度変化量を求めた。そして、キャリブレーターの吸光度変化量を基準として、プール血清中に存在した重炭酸イオン量を算出した。
また、測定は、初日、３日後、７日後、１１日後、１４日後、１７日後に行った。測定期間中比較例１試薬溶液は９℃で開封状態で保存した。また、開口表面積と体積の比が０．３以上で保存した。結果を図２に示す。図２から、保存期間が長くなるにつれ、比較例１試薬溶液の重炭酸イオン濃度測定能は低下し、１４日後には測定が不能になることがわかった。
Claims (4)
- 試料中の重炭酸イオン濃度を測定する方法であって、
（Ａ）：試料中の重炭酸イオン、及びホスホエノールピルビン酸を、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ存在下で反応させ、オキザロ酢酸を生成させる工程
（Ｂ）：（Ａ）工程で生成したオキザロ酢酸、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体を、マレイン酸デヒドロゲナーゼ存在下で反応させる工程
（Ｃ）：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド若しくはその類似体の減少を測定する工程
を含み、
前記（Ａ）〜（Ｃ）工程のうち少なくとも（Ａ）工程はｐＨ７以上８未満の溶液中で行われ、当該溶液の外気と接触する表面積と当該溶液の体積の比が０．２未満であり、
前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼである、
重炭酸イオン濃度測定方法。 - 前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体が、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくは還元型３−アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドである、請求項１に記載の重炭酸イオン濃度測定方法。
- 前記酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが、アセトバクター・パスツリアヌス由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アセトバクター・アセチ由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アセトバクター・ザイリナム由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アセトバクター・ハンゼニイ由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、及びグルコノバクター・オキシダンス由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼである、請求項１又は２に記載の重炭酸イオン濃度測定方法。
- ホスホエノールピルビン酸、酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはその類似体、及びマレイン酸デヒドロゲナーゼを含み、ｐＨ７以上８未満であり、
外気と接触する表面積と体積の比が０．２未満となるよう容器に格納された
重炭酸イオン濃度測定用溶液。
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