JP4817331B2 - メチル化dnaの電気化学的定量方法 - Google Patents
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哺乳類では、ゲノムDNAのメチル化は主に5’-CG-3’配列(CpG部位)のシトシンの5位に認められる。ゲノム内には、数十〜数百個のこのCpG配列が密集したCpGアイランドと呼ばれる領域が存在し、このCpGアイランドの60〜90%のシトシンがメチル化修飾を受けていると予測されている。
実際に、遺伝子のプロモーター領域にあるCpGアイランドのDNAメチル化により、癌抑制遺伝子が不活性化されることが、1993年にRB遺伝子によって見いだされた。以降、さまざまな腫瘍細胞(癌)においてもCpG配列のメチル化は多くの癌抑制遺伝子のサイレンス機構となっている事が確認されており、今や、遺伝子突然変異、染色体欠失に並ぶ、第三の癌抑制遺伝子を不活性化する新たな機構(すなわち発癌機構)として、近年非常に注目されている。
前者は、メチル化感受性もしくは非感受性の制限酵素を用いる方法で、認識配列中の塩基がメチル化されていると、制限酵素による切断活性が変化することを利用している。生じたDNA断片を電気泳動後、サザンブロッティング等により目的のフラグメント鎖長を測定することで、メチル化部位を検出する(例えば特許文献1および非特許文献1参照)。現在入手可能な制限酵素は100種類以上あり、認識配列も多彩であるため、ほとんどのターゲットになるDNA領域を切断することが可能であり、メチル化と非メチル化の割合がバンドの濃さから推察出来る(反応時間は、制限酵素の種類によって異なるが、一般的に数時間程度)。しかしながら、微量な試料DNAを用いた検出は困難であるためPCRによる増幅が必要である。
上述までの方法は、いずれもメチルシトシンを直接検出するものではなく、シトシンに対する酵素及bisulfiteの反応性がシトシンのメチル化によってどの程度減少するかを検出するかという間接的な手法である。
J. Am Chem Soc. (2007) 5612-5620.
一方で、全く標識の工程を必要としない検出技術として、DNAを構成する核酸塩基の電気化学的な直接酸化が挙げられる。DNAおよびRNAを構成する全ての核酸塩基は電気化学活性であり、それぞれの塩基の酸化される電位が異なることから、原理的にはすべての塩基を検出可能である。実際に、たとえば、全塩基の中で最も酸化の容易なグアニン塩基に着目して、DNA中のグアニン塩基を電気化学的に酸化させてその濃度を測定する方法が知られている(非特許文献7)。
J. Am Chem. Soc. (1995) 8933-8938.
電気化学検出用の電極としては、従来から導電性に優れたグラファイト構造のカーボン材料が多用されてきた。しかしDNAを構成する核酸塩基の直接的な酸化による検出では電極に高電位をかける必要があり、グラファイト電極はこの高電位に不安定であるため、酸性および中性測定溶液中では全塩基のうちグアニンおよびアデニン塩基などに基づく電気信号しか安定に検出できず、酸化に高電位を有するチミンやシトシン塩基の電気信号は検出できない。さらにはグラファイト電極においては、DNAの電極表面への吸着による表面汚染が激しく、安定性・精度の低下を招くといった問題があった。測定溶液として高アルカリ水溶液を用いると、これら核酸塩基の酸化電位は低電位側にシフトするため、グラファイト電極においても酸化、検出されようになる事が報告されているが、反面、酸化電流の減少も伴う。すなわち、電気化学的手法のメリットである高感度測定が達成できない。
その後、さらに検討した結果、シトシン(C)とメチルシトシン(mC)の酸化電位が異なることから、この検出方法を応用して両塩基が同時に直接識別、定量できることを見出し、本発明を完成したものである。
1.DNAを含有する電解質溶液の試料中に、シトシン(C)とメチルシトシン(mC)に基づく酸化電流を検出可能な電位窓を酸化側に有する作用電極、対極及び参照電極を挿入し、作用電極に電位を掃引して試料中のシトシン(C)とメチルシトシン(mC)両核酸塩基の電解酸化電流を測定することを特徴とするDNA中のシトシンとメチルシトシン両塩基の電気化学的検出方法。
2.試料中の各核酸塩基の電解酸化電流のうち、シトシンとメチルシトシンの電解酸化電流を対比して、試料中のメチルシトシンの存在の有無を非標識に検出することを特徴とする1に記載の検出方法。
3.試料中のシトシンとメチルシトシンの両核酸塩基の電解酸化電流と標準試料中のシトシンとメチルシトシンの両核酸塩基の電解酸化電流を対比して、試料中のメチルシトシンを非標識に検出することを特徴とする1に記載の検出方法。
4.DNAを含有する試料中のシトシンのメチル化率を非標識に定量することを特徴とする3に記載の検出方法。
好ましい作用電極としては、銀・塩化銀電極(Ag/AgCl)に対して2.0〜2.1ボルト(VvsAg/AgCl)の電位窓を酸化側に有するものが挙げられる。このような電極としては、ナノオーダーの平坦面性に優れる電極表面を有するものを使用することが好ましい。
具体例としては、例えば、本発明者等が先に提案した、ECRスパッタ法等により作製された高導電性カーボン薄膜電極を使用することができる。(特許文献4参照)
本発明で作用電極として使用する高導電性カーボン薄膜電極としては、その炭素間結合のsp3結合の比率がsp3とsp2結合の和に対して、0.1〜0.5程度であることが望ましい。このような電極は、上記したシトシンとメチルシトシン両塩基だけでなく、他の全ての核酸塩基(G、A、TおよびU)に基づく酸化電流を測定可能な電位窓を有し、かつ電極として使用するに十分な導電性と核酸塩基に対する電極活性を有する。
また、対極及び参照電極として使用する電極には特に制限はなく、従来このような電極に使用されている電極はいずれも使用することができる。
図1は、本発明の核酸塩基の電気化学的検出方法に使用する測定装置の1例を示す模式図である。この装置1は、電解質水溶液を収容する反応室2内に、作用電極3、対極4及び参照電極5を配置したもので、これらの電極はポテンシオスタット6を介してコンピュータ7に接続されている。作用電極3の表面には、既知の面積を有する穴をあけた絶縁テープ8を貼り付けることにより、電極面積を所定のものとすることができる。
まず、上記作用電極を、適当な対極、参照電極と組み合わせて電解質水溶液中に挿入する。使用する電解質溶液の濃度、種類、およびpHについては、特に制限はないが、安定で、安価なものが好ましい。具体的には、作用電極に高電位を印加した場合でも電解質の分解が起こりにくく、感度良くピーク電流値が得られる弱酸性のpH緩衝液の使用が好ましい。例えば、pH5前後、濃度50〜100mmol/L前後の酢酸およびリン酸緩衝液等が好都合に用いられる。また、緩衝液中においてDNA分子の自己相補形成が懸念される場合には、それを防ぐための手段として、高電位を印加した場合でも分解が起こりにくい支持塩(過塩素酸塩類、硝酸塩類など)を緩衝液中に0.3〜2mol/L程度の濃度で適宜添加しても良い。
すなわち、対象とするオリゴヌクレオチド4の結果から標準とするオリゴヌクレオチド3の結果を差し引くと、対象サンプルにメチル化のあった場合、メチルシトシンに基づくピークがグラフとしてはメチルシトシンが正の値(増加)として、また逆に減ったシトシンの値がグラフとしては負の値として得られる(図5参照)。
このように目的のサンプル中にA、Tなどの他の塩基成分が存在していても、ECRを用い標準となるDNAサンプルと対象サンプル間の差分を取り比較することで、対象サンプル中のメチルシトシンが検出可能となる。
上記のとおり、本発明のDNA中のシトシンとメチルシトシン両塩基の識別、定量、およびメチル化率の算出および測定装置は、従来の手段に必要不可欠であった標識、bisulfite処理、プライマーの設計およびハイブリダイゼーションの工程を不要とするものであり、対象DNAサンプル中のメチル化を簡便、迅速、かつ高感度に判別する上で極めて有効である。
基板としてシリコンウエハー(サイズ:2インチ)を使用し、ECRスパッタ法によって作製された膜厚40nmのカーボン薄膜上に、直径1mmの穴を開けた絶縁テープを貼り付けて電極面積が既知のカーボン薄膜電極とした。
このカーボン電極を、0.3mol/Lの過塩素酸ナトリウムを含むpH5.0の0.05mol/L酢酸緩衝液中に挿入し、ポテンシオスタット(CHIインスツルメンツ社製、ALS760)に参照電極(Ag/AgCl)、対極(Pt)とともに接続した。ここに濃度が100μmol/Lとなるようにシトシンおよびメチルシトシン塩基成分である各ヌクレオシド、シチジン及び5−メチルシチジンを添加し、一定のパルス振幅、0.05V(対銀一塩化銀電極)を50ミリ秒、電位増加(パルス高さ)+0.005V、パルス周期0.2秒と設定して測定した場合の結果を図2に示した。
図2から明らかなように、両塩基成分の酸化電流が明確に観測され、さらには、両ヌクレオシドにおいて、繰り返し測定に良好な再現性が見られた。なお、この結果によれば、各々のヌクレオシド単位は、S(応答電流)/N(バックグラウンド電流)=2とした場合、およそ1μmol/L程度まで検出可能であった。
上記実施例1において、ECRカーボン電極のかわりに従来から使用されているグラッシーカーボンディスク電極(電極直径:3mm)を用い、同様の条件で検討した結果、図3に示したように5−メチルシチジンの電解電流値は観察されたが、より高酸化電位を有するシチジンの酸化電流値は観察されなかった。
すなわち、グラッシーカーボン電極は、より高酸化電位を有するシトシンを酸化するに必要な高電位に対して不安定であり、グラッシーカーボン電極の有する電位窓範囲内では、メチルシトシン(およびグアニン、アデニン)に基づく酸化しか測定できなかった。このことは、メチルシトシンの直接定量はある程度高濃度の範囲内で可能なものの、シトシンの直接計測が不可能なため、DNA中のメチル化の割合が解析できないことを意味している。
以上のことから、ECRカーボン電極は従来のグラッシーカーボン電極に比べて顕著な優位性を示すことがわかった。
実施例1と同様の作用電極、実験装置、測定条件にてDNAオリゴヌクレオチド中のシトシンとメチルシトシンの電気化学検出を行った。濃度が10μmol/Lとなるようにオリゴヌクレオチド1(5’-C-G-C-G-C-G-3’)、およびオリゴヌクレオチド2(5’-mC-G-mC-G-mC-G-3’)を添加し、電気化学測定を行った場合の結果を図4に示した。
図4から明らかなように、オリゴヌクレオチド1、およびオリゴヌクレオチド2の測定において、各々のオリゴヌクレオチド中の各塩基量に基づく酸化電流が観測された。オリゴヌクレオチド1ではグアニンとシトシンに基づく酸化ピークが、オリゴヌクレオチド2ではグアニンとメチルシトシンに基づく酸化ピークがそれぞれ検出可能であった。このように、シトシンとメチルシトシンの酸化電位が異なることから、ECRを用いることでその両塩基の検出及び定量が可能であった。なお、上記測定結果から、各々のメチル化率は0%および100%であった。また予め、DNAの構成単位である両核酸塩基もしくはそれらの誘導体の濃度と電流値の検量線を作製しておけば、オリゴヌクレオチド分子中での各塩基のメチル化率が容易に決定することができる。
実施例1と同様の作用電極、実験装置、測定条件にてオリゴヌクレオチド間のメチルシトシンの電気化学検出を行った。濃度が10μmol/Lとなるようにオリゴヌクレオチド3(5’-TTA-mC-G-C-3’)、およびオリゴヌクレオチド4(5’-TTA-mC-G-mC-3’)を添加し、電気化学測定を行った場合の結果を図5に示した。
図5から明らかなように、オリゴヌクレオチド3、およびオリゴヌクレオチド4の測定において、各々のオリゴヌクレオチド中の各塩基量に基づく酸化電流が観測された。この各々の結果を差し引くと、たとえばオリゴヌクレオチド4の測定結果からオリゴヌクレオチド3の結果を差し引いた場合、シトシン塩基がメチル化していることが検出可能であった。このように、AやTなどの他の塩基成分が存在していても、ECRを用い標準となるDNAサンプルと被験サンプル間の差異を取り比較することで、被験サンプル中のメチルシトシンが検出可能であった。
2 反応室
3 作用電極
4 対極
5 参照電極
6 ポテンシオスタット
7 コンピュータ
8 絶縁テープ
Claims (4)
- DNAを含有する電解質溶液の試料中に、シトシン(C)とメチルシトシン(mC)に基づく酸化電流を検出可能な電位窓を酸化側に有する作用電極、対極及び参照電極を挿入し、作用電極に電位を掃引して試料中のシトシン(C)とメチルシトシン(mC)両核酸塩基の電解酸化電流を測定することを特徴とするDNA中のシトシンとメチルシトシン両核酸塩基の電気化学的検出方法。
- 試料中の各核酸塩基の電解酸化電流のうち、シトシン(C)とメチルシトシン(mC)の電解酸化電流を対比して、試料中のメチルシトシンの存在の有無を非標識に検出することを特徴とする請求項1に記載の検出方法。
- 試料中のシトシンとメチルシトシンの両核酸塩基の電解酸化電流と標準試料中のシトシン(C)とメチルシトシン(mC)の両核酸塩基の電解酸化電流を対比して、試料中のメチルシトシンを非標識に検出することを特徴とする請求項1に記載の検出方法。
- DNAを含有する試料中のシトシンのメチル化率を非標識に定量することを特徴とする請求項3に記載の検出方法。
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