JP2009069013A - メチル化ｄｎａの電気化学的定量方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】試料中に含まれるDNA中のシトシン（C）とメチルシトシン（mC）の両塩基を標識することなく、簡便にかつ高感度に識別、定量し、またその特徴を活用して目的の試料となるDNA中のメチル化率を算出する方法を提供する。
【解決手段】ＤＮＡを含有する電解質溶液の試料中に、シトシン（C）とメチルシトシン（mC）両塩基に基づく酸化を検出可能な電位窓を酸化側に有する作用電極、対極及び参照電極を挿入し、作用電極に電位を印加して試料中の両各核酸塩基の電解酸化電流を測定することにより、ＤＮＡ中のメチル化を電気化学的に検出、定量する。
【選択図】図１
【解決手段】ＤＮＡを含有する電解質溶液の試料中に、シトシン（C）とメチルシトシン（mC）両塩基に基づく酸化を検出可能な電位窓を酸化側に有する作用電極、対極及び参照電極を挿入し、作用電極に電位を印加して試料中の両各核酸塩基の電解酸化電流を測定することにより、ＤＮＡ中のメチル化を電気化学的に検出、定量する。
【選択図】図１
Description
本発明は、導電性カーボン電極を用いて試料中に含まれるDNA中のシトシンとメチルシトシン両塩基を標識することなく、簡便にかつ高感度に識別、定量する方法、またその特徴を活用して目的の試料となるDNA中のメチル化率を容易に算出する方法に関するものである。
遺伝子のcoding領域に生じた先天的な塩基配列の突然変異がさまざまな疾患の病因として網羅的に探索、同定されてきた。近年、これとは別に遺伝子の塩基配列の変異を伴わないが、DNAやヒストンへの後天的な修飾が遺伝子発現の制御に著しい影響を及ぼすことが明らかとなってきた。エピジェネティクス機構と呼ばれるこれらの現象は、主にDNAのメチル化修飾、ヒストンのアセチル化やメチル化、リン酸化などが知られており、遺伝子の塩基配列を変えることなく、つまりコードするアミノ酸配列を変えることなく、タンパク質合成に必要なRNAへの転写を巧みに調節しすることで、遺伝子の発現を制御し、細胞世代を超えて継承されている。
エピジェネティックスの一例であるゲノムDNAのメチル化修飾は、大腸菌から植物、脊椎動物まで広範囲にわたる生物種で見られる様々な生命現象に関係していることが明らかになり、特に哺乳類では個体発生や細胞分化、がん化などの観点からも重要な研究領域になってきた。
哺乳類では、ゲノムDNAのメチル化は主に5’-CG-3’配列（CpG部位）のシトシンの5位に認められる。ゲノム内には、数十〜数百個のこのCpG配列が密集したCpGアイランドと呼ばれる領域が存在し、このCpGアイランドの60〜90％のシトシンがメチル化修飾を受けていると予測されている。
実際に、遺伝子のプロモーター領域にあるCpGアイランドのDNAメチル化により、癌抑制遺伝子が不活性化されることが、１９９３年にRB遺伝子によって見いだされた。以降、さまざまな腫瘍細胞（癌）においてもCpG配列のメチル化は多くの癌抑制遺伝子のサイレンス機構となっている事が確認されており、今や、遺伝子突然変異、染色体欠失に並ぶ、第三の癌抑制遺伝子を不活性化する新たな機構（すなわち発癌機構）として、近年非常に注目されている。
哺乳類では、ゲノムDNAのメチル化は主に5’-CG-3’配列（CpG部位）のシトシンの5位に認められる。ゲノム内には、数十〜数百個のこのCpG配列が密集したCpGアイランドと呼ばれる領域が存在し、このCpGアイランドの60〜90％のシトシンがメチル化修飾を受けていると予測されている。
実際に、遺伝子のプロモーター領域にあるCpGアイランドのDNAメチル化により、癌抑制遺伝子が不活性化されることが、１９９３年にRB遺伝子によって見いだされた。以降、さまざまな腫瘍細胞（癌）においてもCpG配列のメチル化は多くの癌抑制遺伝子のサイレンス機構となっている事が確認されており、今や、遺伝子突然変異、染色体欠失に並ぶ、第三の癌抑制遺伝子を不活性化する新たな機構（すなわち発癌機構）として、近年非常に注目されている。
このように、メチル化シトシンは発現情報を含んだいわば第５番目の塩基として位置づけられており、遺伝子プロモーターをはじめとした様々な遺伝子領域におけるDNAメチル化情報（DNAのメチル化の起こっている配列位置・量）を知る（即時に計測する）ことは、例えば、メチル化による発癌の原因や機構における分子レベルの解明をもたらすだけでなく、それらの知見は臨床応用に直結した診断、治療指針となりうることが期待されるため、非常に重要である。
DNA中のメチル化の計測法としては、次の二種類に大別される。制限酵素を用いて非メチル化認識配列を切断して調べる方法と、亜硫酸水素塩(bisulfite)を用いて非メチル化シトシン（C）を加水分解する方法がある。
前者は、メチル化感受性もしくは非感受性の制限酵素を用いる方法で、認識配列中の塩基がメチル化されていると、制限酵素による切断活性が変化することを利用している。生じたDNA断片を電気泳動後、サザンブロッティング等により目的のフラグメント鎖長を測定することで、メチル化部位を検出する（例えば特許文献１および非特許文献１参照）。現在入手可能な制限酵素は100種類以上あり、認識配列も多彩であるため、ほとんどのターゲットになるDNA領域を切断することが可能であり、メチル化と非メチル化の割合がバンドの濃さから推察出来る（反応時間は、制限酵素の種類によって異なるが、一般的に数時間程度）。しかしながら、微量な試料DNAを用いた検出は困難であるためPCRによる増幅が必要である。
前者は、メチル化感受性もしくは非感受性の制限酵素を用いる方法で、認識配列中の塩基がメチル化されていると、制限酵素による切断活性が変化することを利用している。生じたDNA断片を電気泳動後、サザンブロッティング等により目的のフラグメント鎖長を測定することで、メチル化部位を検出する（例えば特許文献１および非特許文献１参照）。現在入手可能な制限酵素は100種類以上あり、認識配列も多彩であるため、ほとんどのターゲットになるDNA領域を切断することが可能であり、メチル化と非メチル化の割合がバンドの濃さから推察出来る（反応時間は、制限酵素の種類によって異なるが、一般的に数時間程度）。しかしながら、微量な試料DNAを用いた検出は困難であるためPCRによる増幅が必要である。
一方、現在最も一般的に用いられているbisulfite法は、試料となるDNAにbisulfite処理を行なうとメチルシトシンは変換されず、シトシンのみがウラシルに変換されることを利用している（非特許文献２）。Bisulfite処理後、PCRを行い、シーケンシングするBisulfite genomic sequence法においては、シーケンス反応としてウラシルはチミンとして表現されるので、処理前後で生じるシトシンとチミン(ウラシル)の差異を配列データとして得ることができ、メチル化の有無や位置を決定することが出来る（非特許文献３）。しかしながら、当該シーケンス法はシーケンスの操作が煩雑であり、混合系での検出が困難である。
また、bisulfite処理前後の配列の違いをPCRプライマーに認識させ、PCR産物の有無によって、メチル化DNA及び非メチル化DNAの有無を判別するメチル化特異的PCR（Methylation-specific PCR：MSP）がある（例えば特許文献２参照）。MSP法はメチル化DNAまたは非メチル化DNAを含む配列（ただしbisulfite処理後の配列）に結合しうるPCRプライマーを設計することにより両DNAの一方を選択的に増幅でき、上記シーケンス法に比べて優位性を示す。一方で、広範囲のメチル化を調べるには、それに応じた数多くのプライマーが必要となる。
また、このMSP法にDNAマイクロアレイによる検出を組合せたメチル化DNAの検出方法も良く知られている（特許文献３および非特許文献４）。本法は、DNAマイクロアレイ基板上に固定化した所定のキャプチャープローブとbisulfite処理した被験DNAサンプル間でハイブリダイズさせ、その結果によってシトシンのメチル化の有無を判別する。その際、標識化したプライマーを用い、得られたPCR産物を間接的に標識化することでメチル化DNAの検出が可能となる。
また上記で示した蛍光分子の変わりに、より安価な電気化学的活性を有するインターカレーターを用いる検出方法も考案されている（非特許文献５）。電気化学的手法は、安価で操作性に優れ、かつ高い感度などの条件を充分に有する可能性のある技術の一つであり、蛍光法のような光学的手法で必要なレーザー光源を必要としないため、簡便で極めて安価な部品から検出・測定のシステムを構成できる。
bisulfite法の欠点は、完全修飾に長時間の反応時間を要し（一般的には十数時間）、またその処理による非特異的切断反応が起こり、サンプルの断片化が進んでいることが多く、手法の改善が求められている。
上述までの方法は、いずれもメチルシトシンを直接検出するものではなく、シトシンに対する酵素及bisulfiteの反応性がシトシンのメチル化によってどの程度減少するかを検出するかという間接的な手法である。
上述までの方法は、いずれもメチルシトシンを直接検出するものではなく、シトシンに対する酵素及bisulfiteの反応性がシトシンのメチル化によってどの程度減少するかを検出するかという間接的な手法である。
近年、DNAの塩基配列の中のメチルシトシンに選択的に結合する金属錯体試薬により、メチルシトシンと複合体を形成させることで直接標識させ、さらにその金属錯体に電気化学的活性基を導入することで、シトシンのメチル化を電気化学シグナルによって検出する手法を報告している。この方法は、従来のbisulfite法でのメチル化解析と比べ短時間で終了することができ、また遺伝子サンプルの切断などの損傷が起こらない点に利点を有する（非特許文献６）。
J. Am Chem Soc. (2007) 5612-5620.
J. Am Chem Soc. (2007) 5612-5620.
しかしながら、上記の非特許文献６のように、被験DNAにbisulfite処理をする必要がないような、最も簡便なプロセスだけで済む技術を基にした測定方法においてさえも、何らかの標識分子やその工程が必要不可欠である。
一方で、全く標識の工程を必要としない検出技術として、DNAを構成する核酸塩基の電気化学的な直接酸化が挙げられる。DNAおよびRNAを構成する全ての核酸塩基は電気化学活性であり、それぞれの塩基の酸化される電位が異なることから、原理的にはすべての塩基を検出可能である。実際に、たとえば、全塩基の中で最も酸化の容易なグアニン塩基に着目して、DNA中のグアニン塩基を電気化学的に酸化させてその濃度を測定する方法が知られている（非特許文献７）。
J. Am Chem. Soc. (1995) 8933-8938.
一方で、全く標識の工程を必要としない検出技術として、DNAを構成する核酸塩基の電気化学的な直接酸化が挙げられる。DNAおよびRNAを構成する全ての核酸塩基は電気化学活性であり、それぞれの塩基の酸化される電位が異なることから、原理的にはすべての塩基を検出可能である。実際に、たとえば、全塩基の中で最も酸化の容易なグアニン塩基に着目して、DNA中のグアニン塩基を電気化学的に酸化させてその濃度を測定する方法が知られている（非特許文献７）。
J. Am Chem. Soc. (1995) 8933-8938.
このように電気化学測定は、溶液中の目的成分について、その濃度あるいは濃度変化を電極上での電流信号として変換、出力することで、簡便かつ高感度に測定の対象である目的成分を測定することができることから、この測定方法を、電気化学的に活性な核酸塩基類を構成成分としているDNAの測定に応用することが考えられる。
電気化学検出用の電極としては、従来から導電性に優れたグラファイト構造のカーボン材料が多用されてきた。しかしDNAを構成する核酸塩基の直接的な酸化による検出では電極に高電位をかける必要があり、グラファイト電極はこの高電位に不安定であるため、酸性および中性測定溶液中では全塩基のうちグアニンおよびアデニン塩基などに基づく電気信号しか安定に検出できず、酸化に高電位を有するチミンやシトシン塩基の電気信号は検出できない。さらにはグラファイト電極においては、DNAの電極表面への吸着による表面汚染が激しく、安定性・精度の低下を招くといった問題があった。測定溶液として高アルカリ水溶液を用いると、これら核酸塩基の酸化電位は低電位側にシフトするため、グラファイト電極においても酸化、検出されようになる事が報告されているが、反面、酸化電流の減少も伴う。すなわち、電気化学的手法のメリットである高感度測定が達成できない。
電気化学検出用の電極としては、従来から導電性に優れたグラファイト構造のカーボン材料が多用されてきた。しかしDNAを構成する核酸塩基の直接的な酸化による検出では電極に高電位をかける必要があり、グラファイト電極はこの高電位に不安定であるため、酸性および中性測定溶液中では全塩基のうちグアニンおよびアデニン塩基などに基づく電気信号しか安定に検出できず、酸化に高電位を有するチミンやシトシン塩基の電気信号は検出できない。さらにはグラファイト電極においては、DNAの電極表面への吸着による表面汚染が激しく、安定性・精度の低下を招くといった問題があった。測定溶液として高アルカリ水溶液を用いると、これら核酸塩基の酸化電位は低電位側にシフトするため、グラファイト電極においても酸化、検出されようになる事が報告されているが、反面、酸化電流の減少も伴う。すなわち、電気化学的手法のメリットである高感度測定が達成できない。
したがって、本発明は上記従来技術の問題点を解消して、試料中に含まれるDNA中のシトシンとメチルシトシンの両塩基を標識することなく、簡便にかつ高感度に識別、定量する方法、ならびにその特徴を活用して目的の試料となるDNA中のメチル化率を容易に算出する方法を提供することを目的とする。
本発明者等は、ＤＮＡ及びＲＮＡを構成する５種類の核酸塩基であるグアニン（G）、アデニン（A）、シトシン（C）、チミン（T）およびウラシル（U）のうち、最も酸化電位の高いU塩基に基づく酸化を検出可能な広い電位窓を酸化側に有する作用電極を用いて、試料とするDNA中の各々の核酸塩基を電解酸化して検出することを提案した。（特願2007-140216参照）
その後、さらに検討した結果、シトシン（C）とメチルシトシン（mC）の酸化電位が異なることから、この検出方法を応用して両塩基が同時に直接識別、定量できることを見出し、本発明を完成したものである。
その後、さらに検討した結果、シトシン（C）とメチルシトシン（mC）の酸化電位が異なることから、この検出方法を応用して両塩基が同時に直接識別、定量できることを見出し、本発明を完成したものである。
即ち、本発明はつぎの１〜４の構成を採用するものである。
１．ＤＮＡを含有する電解質溶液の試料中に、シトシン（C）とメチルシトシン（mC）に基づく酸化電流を検出可能な電位窓を酸化側に有する作用電極、対極及び参照電極を挿入し、作用電極に電位を掃引して試料中のシトシン（C）とメチルシトシン（mC）両核酸塩基の電解酸化電流を測定することを特徴とするＤＮＡ中のシトシンとメチルシトシン両塩基の電気化学的検出方法。
２．試料中の各核酸塩基の電解酸化電流のうち、シトシンとメチルシトシンの電解酸化電流を対比して、試料中のシトシンのメチル化率を非標識に定量することを特徴とする１に記載の検出方法。
３．試料中のシトシンとメチルシトシンの両核酸塩基の電解酸化電流と標準試料中のシトシンとメチルシトシンの両核酸塩基の電解酸化電流を対比して、試料中のメチルシトシンを非標識に検出することを特徴とする１に記載の検出方法。
４．ＤＮＡを含有する試料中のシトシンのメチル化率を非標識に定量することを特徴とする３に記載の検出方法。
１．ＤＮＡを含有する電解質溶液の試料中に、シトシン（C）とメチルシトシン（mC）に基づく酸化電流を検出可能な電位窓を酸化側に有する作用電極、対極及び参照電極を挿入し、作用電極に電位を掃引して試料中のシトシン（C）とメチルシトシン（mC）両核酸塩基の電解酸化電流を測定することを特徴とするＤＮＡ中のシトシンとメチルシトシン両塩基の電気化学的検出方法。
２．試料中の各核酸塩基の電解酸化電流のうち、シトシンとメチルシトシンの電解酸化電流を対比して、試料中のシトシンのメチル化率を非標識に定量することを特徴とする１に記載の検出方法。
３．試料中のシトシンとメチルシトシンの両核酸塩基の電解酸化電流と標準試料中のシトシンとメチルシトシンの両核酸塩基の電解酸化電流を対比して、試料中のメチルシトシンを非標識に検出することを特徴とする１に記載の検出方法。
４．ＤＮＡを含有する試料中のシトシンのメチル化率を非標識に定量することを特徴とする３に記載の検出方法。
本発明によれば、DNA中のシトシンとメチルシトシン両塩基を標識することなく簡便に、かつ高感度に電気化学的に識別、定量することが可能であり、またその特徴を利用してメチル化率を容易に算出することが可能となる。このため、従来のように標識、bisulfite処理、PCRプライマー設計、ならびにハイブリダイゼーションの工程を必要とせず簡便、かつ高感度に低コストで検出することができる。
本発明では、ＤＮＡを含有する電解質溶液の試料中に、シトシンとメチルシトシンに基づく酸化を検出可能な電位窓を酸化側に有する作用電極、対極及び参照電極を挿入し、作用電極に電位を印加して試料中のシトシンとメチルシトシン両核酸塩基の電解酸化電流を測定することによりＤＮＡ中のメチル化を電気化学的に検出、定量する。したがって、本発明においては両塩基に由来する酸化を検出可能な広い電位窓を酸化側に有する作用電極を使用することが必要となる。
好ましい作用電極としては、銀・塩化銀電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）に対して２．０〜２．１ボルト（ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ）の電位窓を酸化側に有するものが挙げられる。このような電極としては、ナノオーダーの平坦面性に優れる電極表面を有するものを使用することが好ましい。
具体例としては、例えば、本発明者等が先に提案した、ECRスパッタ法等により作製された高導電性カーボン薄膜電極を使用することができる。（特許文献４参照）
特開２００６−０９０８７５号公報
好ましい作用電極としては、銀・塩化銀電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）に対して２．０〜２．１ボルト（ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ）の電位窓を酸化側に有するものが挙げられる。このような電極としては、ナノオーダーの平坦面性に優れる電極表面を有するものを使用することが好ましい。
具体例としては、例えば、本発明者等が先に提案した、ECRスパッタ法等により作製された高導電性カーボン薄膜電極を使用することができる。（特許文献４参照）
この高導電性カーボン薄膜電極は、使用用途に応じて選択した基板にECRスパッタ法等により高導電性カーボン薄膜を堆積させることによって作製することができる。このような基板としては、例えば、導電性基板であれば、ドープしたシリコン単結晶ウエハが使用され、絶縁基板であればガラスやポリジメチルシロキサン（PDMS）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、オレフィン樹脂、等の各種高分子が使用される。
本発明で作用電極として使用する高導電性カーボン薄膜電極としては、その炭素間結合のsp3結合の比率がsp3とsp2結合の和に対して、０．１〜０．５程度であることが望ましい。このような電極は、上記したシトシンとメチルシトシン両塩基だけでなく、他の全ての核酸塩基（G、A、TおよびU）に基づく酸化電流を測定可能な電位窓を有し、かつ電極として使用するに十分な導電性と核酸塩基に対する電極活性を有する。
本発明で作用電極として使用する高導電性カーボン薄膜電極としては、その炭素間結合のsp3結合の比率がsp3とsp2結合の和に対して、０．１〜０．５程度であることが望ましい。このような電極は、上記したシトシンとメチルシトシン両塩基だけでなく、他の全ての核酸塩基（G、A、TおよびU）に基づく酸化電流を測定可能な電位窓を有し、かつ電極として使用するに十分な導電性と核酸塩基に対する電極活性を有する。
本発明において作用電極とするカーボン薄膜電極としては、シトシンとメチルシトシン両塩基の電解酸化による識別、定量が可能な広い電位窓を酸化側に有する作用電極であれば、上記の電極に制限されるものではない。
また、対極及び参照電極として使用する電極には特に制限はなく、従来このような電極に使用されている電極はいずれも使用することができる。
また、対極及び参照電極として使用する電極には特に制限はなく、従来このような電極に使用されている電極はいずれも使用することができる。
本発明の測定手法において測定される対象分子は、核酸塩基を有する分子であれば特に限定されない。具体的な対象分子としては、例えば、デオキシリボヌクレオチドからなるDNA、具体的には、プロモーター領域中に多数存在するCpG配列（CpGアイランド）に相当する分子などが挙げられる。配列の長さとしては、数十塩基程度が望ましいが、必要に応じて適当な制限酵素で断片化し、電気泳動にかけて目的の配列を含むDNA断片を抽出し使用しても良い。
以下、ECRスパッタ法により作製された高導電性カーボン薄膜電極を使用する場合を例にとり、本発明について説明する。
図１は、本発明の核酸塩基の電気化学的検出方法に使用する測定装置の１例を示す模式図である。この装置１は、電解質水溶液を収容する反応室２内に、作用電極３、対極４及び参照電極５を配置したもので、これらの電極はポテンシオスタット６を介してコンピュータ７に接続されている。作用電極３の表面には、既知の面積を有する穴をあけた絶縁テープ８を貼り付けることにより、電極面積を所定のものとすることができる。
図１は、本発明の核酸塩基の電気化学的検出方法に使用する測定装置の１例を示す模式図である。この装置１は、電解質水溶液を収容する反応室２内に、作用電極３、対極４及び参照電極５を配置したもので、これらの電極はポテンシオスタット６を介してコンピュータ７に接続されている。作用電極３の表面には、既知の面積を有する穴をあけた絶縁テープ８を貼り付けることにより、電極面積を所定のものとすることができる。
つぎに、図１の測定装置を使用して核酸塩基を電気化学的に検出する手順を説明する。
まず、上記作用電極を、適当な対極、参照電極と組み合わせて電解質水溶液中に挿入する。使用する電解質溶液の濃度、種類、およびpHについては、特に制限はないが、安定で、安価なものが好ましい。具体的には、作用電極に高電位を印加した場合でも電解質の分解が起こりにくく、感度良くピーク電流値が得られる弱酸性のpH緩衝液の使用が好ましい。例えば、pH5前後、濃度50〜100mmol／L前後の酢酸およびリン酸緩衝液等が好都合に用いられる。また、緩衝液中においてDNA分子の自己相補形成が懸念される場合には、それを防ぐための手段として、高電位を印加した場合でも分解が起こりにくい支持塩（過塩素酸塩類、硝酸塩類など）を緩衝液中に0.3〜２mol／L程度の濃度で適宜添加しても良い。
まず、上記作用電極を、適当な対極、参照電極と組み合わせて電解質水溶液中に挿入する。使用する電解質溶液の濃度、種類、およびpHについては、特に制限はないが、安定で、安価なものが好ましい。具体的には、作用電極に高電位を印加した場合でも電解質の分解が起こりにくく、感度良くピーク電流値が得られる弱酸性のpH緩衝液の使用が好ましい。例えば、pH5前後、濃度50〜100mmol／L前後の酢酸およびリン酸緩衝液等が好都合に用いられる。また、緩衝液中においてDNA分子の自己相補形成が懸念される場合には、それを防ぐための手段として、高電位を印加した場合でも分解が起こりにくい支持塩（過塩素酸塩類、硝酸塩類など）を緩衝液中に0.3〜２mol／L程度の濃度で適宜添加しても良い。
次に、上記作用電極に電位を印加し、バックグラウンド測定の結果を得る。ここへ目的分子を添加し、十分に攪拌した後、再度上記作用電極へ電位を印加する。測定結果として、例えばGpG配列から構成されるDNAオリゴヌクレオチド１（5’-CGCGCG-3’）を添加した場合、各G、Cに応じたピーク電流が異なる電位に同時に得られる。また、この結果からバックグラウンド電流の結果を差し引くことによって、より明瞭な結果が得られる。この時、例えばオレゴヌクレオチド１と同じくGpG配列から構成されるが、その配列中のシトシンがすべてメチル化された同濃度のDNAオリゴヌクレオチド２（5’-mC G mC G mC G-3’）の測定結果では、オリゴヌクレオチド1のシトシンのピーク電流とは異なった位置にピーク電流値が得られる（メチルシトシンに基づく酸化電流値に相当）(図４参照)。これらの各塩基の電流量は、分子の濃度、および分子中における個数に比例する。このため、予め、DNAの構成単位である個々の核酸塩基もしくはそれらの誘導体の濃度と電流値の検量線を作製しておけば、オリゴヌクレオチドとしての濃度、および分子中での各塩基の成分比が容易に決定することができる。従って、シトシンとメチルシトシン成分の測定値の比からメチル化率も容易に算出可能である。
次に、CpG配列ではないDNAサンプル中におけるメチルシトシンの検出方法について説明する。上記同様に、電解質水溶液についてバックグラウンド測定を行った後、ここへ目的分子を添加し、十分に攪拌した後、再度上記作用電極へ電位を印加する。測定結果として、例えばG、A、T、Cから構成されそのうち一つのシトシンがメチル化されたオリゴヌクレオチド３（5’-TTA mC GC-3’）を添加した場合、各塩基数に応じたピーク電流が異なる電位に同時に得られる。これと同様に上述と同じくG、A、T、Cから構成されるが、もう一つのシトシン塩基もメチル化された同濃度のオリゴヌクレオチド４（5’-TTA mC G mC-3’）の測定では、オリゴヌクレオチド３とはシトシンとメチルシトシンのピーク電流が異なった結果が得られる。
すなわち、対象とするオリゴヌクレオチド４の結果から標準とするオリゴヌクレオチド３の結果を差し引くと、対象サンプルにメチル化のあった場合、メチルシトシンに基づくピークがグラフとしてはメチルシトシンが正の値（増加）として、また逆に減ったシトシンの値がグラフとしては負の値として得られる（図５参照）。
このように目的のサンプル中にA、Tなどの他の塩基成分が存在していても、ECRを用い標準となるDNAサンプルと対象サンプル間の差分を取り比較することで、対象サンプル中のメチルシトシンが検出可能となる。
すなわち、対象とするオリゴヌクレオチド４の結果から標準とするオリゴヌクレオチド３の結果を差し引くと、対象サンプルにメチル化のあった場合、メチルシトシンに基づくピークがグラフとしてはメチルシトシンが正の値（増加）として、また逆に減ったシトシンの値がグラフとしては負の値として得られる（図５参照）。
このように目的のサンプル中にA、Tなどの他の塩基成分が存在していても、ECRを用い標準となるDNAサンプルと対象サンプル間の差分を取り比較することで、対象サンプル中のメチルシトシンが検出可能となる。
また、実際の測定系で二つのサンプル濃度が異なる場合、電流値の差から変異点を検出することは困難であると予想される。その様な場合、測定結果の濃度補正を適宜行う必要がある。例えば、上述のオリゴヌクレオチド３の濃度がオリゴヌクレオチド４の１０倍であった場合、対応する測定結果において、メチル化に関与しない３種類（Ｇ、A、Ｔ）のいずれかの塩基の電流値を利用して濃度で規格化し補正した後に差分を計算することで、上述と同様にメチル化シトシン検出が可能である。その際、各々の測定結果から予めバックグラクウンド電流を差し引いておく必要がある。
本発明のシトシンとメチルシトシン両塩基の識別、定量、およびメチル化率の算出を行う装置は、上記のように５つの核酸塩基およびメチルシトシン全ての酸化を検出可能な電位窓の広い電極を備えている電気化学セルを具有していることが好ましい。さらに、pH調製剤、電流-電位測定装置等、本発明の測定系を構築するための部材あるいは試薬等を組み合わせて測定キットとしてもよい。また、複数の遺伝子のプロモーターにおける複数のCpGアイランドのメチル化を同時に測定することのできるような多電極とし、およびそれに対応できるマルチ電流-電位測定装置を組合せても良い。
上記のとおり、本発明のDNA中のシトシンとメチルシトシン両塩基の識別、定量、およびメチル化率の算出および測定装置は、従来の手段に必要不可欠であった標識、bisulfite処理、プライマーの設計およびハイブリダイゼーションの工程を不要とするものであり、対象DNAサンプル中のメチル化を簡便、迅速、かつ高感度に判別する上で極めて有効である。
上記のとおり、本発明のDNA中のシトシンとメチルシトシン両塩基の識別、定量、およびメチル化率の算出および測定装置は、従来の手段に必要不可欠であった標識、bisulfite処理、プライマーの設計およびハイブリダイゼーションの工程を不要とするものであり、対象DNAサンプル中のメチル化を簡便、迅速、かつ高感度に判別する上で極めて有効である。
以下、本発明について実施例及び比較例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。電気化学的な測定法として、下記では微分パルスボルタンメトリーによる実施例を示すが、その他にも、スクウェアパルスボルタンメトリー、ノーマルパルスボルタンメトリー、交流ボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー、等の手法が適宜使用可能である。
（実施例１）ECRスパッタカーボン電極を用いたシトシンとメチルシトシン成分の測定
基板としてシリコンウエハー（サイズ：２インチ）を使用し、ECRスパッタ法によって作製された膜厚４０nmのカーボン薄膜上に、直径1mmの穴を開けた絶縁テープを貼り付けて電極面積が既知のカーボン薄膜電極とした。
このカーボン電極を、0.3mol／Lの過塩素酸ナトリウムを含むpH5.0の0.05mol／L酢酸緩衝液中に挿入し、ポテンシオスタット（CHIインスツルメンツ社製、ALS760）に参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）、対極（Ｐｔ）とともに接続した。ここに濃度が100μmol／Lとなるようにシトシンおよびメチルシトシン塩基成分である各ヌクレオシド、シチジン及び５−メチルシチジンを添加し、一定のパルス振幅、0.05V（対銀一塩化銀電極）を50ミリ秒、電位増加（パルス高さ）+0.005V、パルス周期0.2秒と設定して測定した場合の結果を図２に示した。
基板としてシリコンウエハー（サイズ：２インチ）を使用し、ECRスパッタ法によって作製された膜厚４０nmのカーボン薄膜上に、直径1mmの穴を開けた絶縁テープを貼り付けて電極面積が既知のカーボン薄膜電極とした。
このカーボン電極を、0.3mol／Lの過塩素酸ナトリウムを含むpH5.0の0.05mol／L酢酸緩衝液中に挿入し、ポテンシオスタット（CHIインスツルメンツ社製、ALS760）に参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）、対極（Ｐｔ）とともに接続した。ここに濃度が100μmol／Lとなるようにシトシンおよびメチルシトシン塩基成分である各ヌクレオシド、シチジン及び５−メチルシチジンを添加し、一定のパルス振幅、0.05V（対銀一塩化銀電極）を50ミリ秒、電位増加（パルス高さ）+0.005V、パルス周期0.2秒と設定して測定した場合の結果を図２に示した。
図２において、横軸は電位、縦軸はパルスを与える直前と与えた後のそれぞれの電解電流の差分値である。
図２から明らかなように、両塩基成分の酸化電流が明確に観測され、さらには、両ヌクレオシドにおいて、繰り返し測定に良好な再現性が見られた。なお、この結果によれば、各々のヌクレオシド単位は、S（応答電流）／N（バックグラウンド電流）＝2とした場合、およそ1μmol／L程度まで検出可能であった。
図２から明らかなように、両塩基成分の酸化電流が明確に観測され、さらには、両ヌクレオシドにおいて、繰り返し測定に良好な再現性が見られた。なお、この結果によれば、各々のヌクレオシド単位は、S（応答電流）／N（バックグラウンド電流）＝2とした場合、およそ1μmol／L程度まで検出可能であった。
（比較例１）
上記実施例１において、ECRカーボン電極のかわりに従来から使用されているグラッシーカーボンディスク電極（電極直径：３mm）を用い、同様の条件で検討した結果、図３に示したように５−メチルシチジンの電解電流値は観察されたが、より高酸化電位を有するシチジンの酸化電流値は観察されなかった。
すなわち、グラッシーカーボン電極は、より高酸化電位を有するシトシンを酸化するに必要な高電位に対して不安定であり、グラッシーカーボン電極の有する電位窓範囲内では、メチルシトシン（およびグアニン、アデニン）に基づく酸化しか測定できなかった。このことは、メチルシトシンの直接定量はある程度高濃度の範囲内で可能なものの、シトシンの直接計測が不可能なため、DNA中のメチル化の割合が解析できないことを意味している。
以上のことから、ECRカーボン電極は従来のグラッシーカーボン電極に比べて顕著な優位性を示すことがわかった。
上記実施例１において、ECRカーボン電極のかわりに従来から使用されているグラッシーカーボンディスク電極（電極直径：３mm）を用い、同様の条件で検討した結果、図３に示したように５−メチルシチジンの電解電流値は観察されたが、より高酸化電位を有するシチジンの酸化電流値は観察されなかった。
すなわち、グラッシーカーボン電極は、より高酸化電位を有するシトシンを酸化するに必要な高電位に対して不安定であり、グラッシーカーボン電極の有する電位窓範囲内では、メチルシトシン（およびグアニン、アデニン）に基づく酸化しか測定できなかった。このことは、メチルシトシンの直接定量はある程度高濃度の範囲内で可能なものの、シトシンの直接計測が不可能なため、DNA中のメチル化の割合が解析できないことを意味している。
以上のことから、ECRカーボン電極は従来のグラッシーカーボン電極に比べて顕著な優位性を示すことがわかった。
（実施例２）ECRスパッタカーボン電極によるオリゴヌクレオチド中のメチルシトシンの検出（メチル化率算出）
実施例１と同様の作用電極、実験装置、測定条件にてDNAオリゴヌクレオチド中のシトシンとメチルシトシンの電気化学検出を行った。濃度が１０μmol／Lとなるようにオリゴヌクレオチド１（5’-C-G-C-G-C-G-3’）、およびオリゴヌクレオチド２（5’-mC-G-mC-G-mC-G-3’）を添加し、電気化学測定を行った場合の結果を図４に示した。
図４から明らかなように、オリゴヌクレオチド１、およびオリゴヌクレオチド２の測定において、各々のオリゴヌクレオチド中の各塩基量に基づく酸化電流が観測された。オリゴヌクレオチド１ではグアニンとシトシンに基づく酸化ピークが、オリゴヌクレオチド２ではグアニンとメチルシトシンに基づく酸化ピークがそれぞれ検出可能であった。このように、シトシンとメチルシトシンの酸化電位が異なることから、ECRを用いることでその両塩基の検出及び定量が可能であった。なお、上記測定結果から、各々のメチル化率は０％および１００％であった。また予め、DNAの構成単位である両核酸塩基もしくはそれらの誘導体の濃度と電流値の検量線を作製しておけば、オリゴヌクレオチド分子中での各塩基のメチル化率が容易に決定することができる。
実施例１と同様の作用電極、実験装置、測定条件にてDNAオリゴヌクレオチド中のシトシンとメチルシトシンの電気化学検出を行った。濃度が１０μmol／Lとなるようにオリゴヌクレオチド１（5’-C-G-C-G-C-G-3’）、およびオリゴヌクレオチド２（5’-mC-G-mC-G-mC-G-3’）を添加し、電気化学測定を行った場合の結果を図４に示した。
図４から明らかなように、オリゴヌクレオチド１、およびオリゴヌクレオチド２の測定において、各々のオリゴヌクレオチド中の各塩基量に基づく酸化電流が観測された。オリゴヌクレオチド１ではグアニンとシトシンに基づく酸化ピークが、オリゴヌクレオチド２ではグアニンとメチルシトシンに基づく酸化ピークがそれぞれ検出可能であった。このように、シトシンとメチルシトシンの酸化電位が異なることから、ECRを用いることでその両塩基の検出及び定量が可能であった。なお、上記測定結果から、各々のメチル化率は０％および１００％であった。また予め、DNAの構成単位である両核酸塩基もしくはそれらの誘導体の濃度と電流値の検量線を作製しておけば、オリゴヌクレオチド分子中での各塩基のメチル化率が容易に決定することができる。
（実施例３）ECRスパッタカーボン電極によるオリゴヌクレオチド間のメチルシトシンの検出
実施例１と同様の作用電極、実験装置、測定条件にてオリゴヌクレオチド間のメチルシトシンの電気化学検出を行った。濃度が１０μmol／Lとなるようにオリゴヌクレオチド３（5’-TTA-mC-G-C-3’）、およびオリゴヌクレオチド４（5’-TTA-mC-G-mC-3’）を添加し、電気化学測定を行った場合の結果を図５に示した。
図５から明らかなように、オリゴヌクレオチド３、およびオリゴヌクレオチド４の測定において、各々のオリゴヌクレオチド中の各塩基量に基づく酸化電流が観測された。この各々の結果を差し引くと、たとえばオリゴヌクレオチド４の測定結果からオリゴヌクレオチド３の結果を差し引いた場合、シトシン塩基がメチル化していることが検出可能であった。このように、AやTなどの他の塩基成分が存在していても、ECRを用い標準となるDNAサンプルと被験サンプル間の差異を取り比較することで、被験サンプル中のメチルシトシンが検出可能であった。
実施例１と同様の作用電極、実験装置、測定条件にてオリゴヌクレオチド間のメチルシトシンの電気化学検出を行った。濃度が１０μmol／Lとなるようにオリゴヌクレオチド３（5’-TTA-mC-G-C-3’）、およびオリゴヌクレオチド４（5’-TTA-mC-G-mC-3’）を添加し、電気化学測定を行った場合の結果を図５に示した。
図５から明らかなように、オリゴヌクレオチド３、およびオリゴヌクレオチド４の測定において、各々のオリゴヌクレオチド中の各塩基量に基づく酸化電流が観測された。この各々の結果を差し引くと、たとえばオリゴヌクレオチド４の測定結果からオリゴヌクレオチド３の結果を差し引いた場合、シトシン塩基がメチル化していることが検出可能であった。このように、AやTなどの他の塩基成分が存在していても、ECRを用い標準となるDNAサンプルと被験サンプル間の差異を取り比較することで、被験サンプル中のメチルシトシンが検出可能であった。
本発明は、該導電性カーボン電極を用い、DNA中の各々のシトシンとメチルシトシン両塩基を標識することなく同時に、識別、定量し、またその特徴を利用してメチル化率を容易に算出する方法を提供するものである。したがって、従来の方法のように標識、bisilfite処理、プライマーの設計ならびにハイブリダイゼーションの工程を一切必要としないため、極めて簡便、迅速な手法であり、装置化に適しているとともに、極めて高感度な測定結果が得られる。遺伝子DNAのメチル化は、細胞の分化やがん化の機構における遺伝子発現の制御に関わる重要な役割を果たしていることが知られている。したがって、本発明は、DNAメチル化異常によるがんなどの簡便な診断に威力を発揮すると考えられる。
１ 測定装置
２ 反応室
３ 作用電極
４ 対極
５ 参照電極
６ ポテンシオスタット
７ コンピュータ
８ 絶縁テープ
２ 反応室
３ 作用電極
４ 対極
５ 参照電極
６ ポテンシオスタット
７ コンピュータ
８ 絶縁テープ
Claims (4)
- ＤＮＡを含有する電解質溶液の試料中に、シトシン（C）とメチルシトシン（mC）に基づく酸化電流を検出可能な電位窓を酸化側に有する作用電極、対極及び参照電極を挿入し、作用電極に電位を掃引して試料中のシトシン（C）とメチルシトシン（mC）両核酸塩基の電解酸化電流を測定することを特徴とするＤＮＡ中のシトシンとメチルシトシン両核酸塩基の電気化学的検出方法。
- 試料中の各核酸塩基の電解酸化電流のうち、シトシン（C）とメチルシトシン（mC）の電解酸化電流を対比して、試料中のシトシンのメチル化率を非標識に定量することを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
- 試料中のシトシンとメチルシトシンの両核酸塩基の電解酸化電流と標準試料中のシトシン（C）とメチルシトシン（mC）の両核酸塩基の電解酸化電流を対比して、試料中のメチルシトシンを非標識に検出することを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
- ＤＮＡを含有する試料中のシトシンのメチル化率を非標識に定量することを特徴とする請求項３に記載の検出方法。
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| CN107356642A (zh) * | 2017-07-27 | 2017-11-17 | 西安交通大学 | 一种基于双标记扩增的血浆循环甲基化dna电化学检测方法及试剂盒 |
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|---|---|---|---|---|
| JP2001510895A (ja) * | 1997-07-18 | 2001-08-07 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 正弦曲線電圧電流法によるプリンおよびピリミジン塩基並びに非誘導体型核酸の検出 |
| JP2006090875A (ja) * | 2004-09-24 | 2006-04-06 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 電気化学測定用炭素電極及びその製造方法 |
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- 2007-09-13 JP JP2007238216A patent/JP4817331B2/ja active Active
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