CN101329257B - 硝酸测定试剂盒及硝酸浓度测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用酶比色法技术的硝酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定硝酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、硝酸还原酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出硝酸的浓度大小。

Description

硝酸测定试剂盒及硝酸浓度测定方法

技术领域

本发明涉及一种硝酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定硝酸浓度的方法，属于食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

亚硝酸盐主要指亚硝酸钠，亚硝酸钠为白色至淡黄色粉末或颗粒状，味微咸，易溶于水。外观及滋味都与食盐相似，并在工业、农业、食品、建筑业中广为使用，由亚硝酸盐引起食物中毒的机率较高。1995年版中华人民共和国药典对蒸馏水检测增加了硝酸盐与亚硝酸盐检查。亚硝酸盐可被氧化变为硝酸盐，硝酸盐在无氧环境中受微生物的作用还原为亚硝酸盐，是致癌物质。

目前有按照国标GB/T5009.33做成的试剂盒，与标准色卡来比较进行定量，然而按照国标方法检测亚硝酸盐指标，步骤繁琐，而且有些试剂必需现配现用，费时又费力。它的检测原理：在酸性溶液中亚硝酸盐与对氨基苯磺酸作用生成重氮化合物，再与α-萘胺起偶合反应，生成紫红色偶氮染料，显色深浅与亚硝酸盐含量成正比。加入锌粉的目的是将硝酸盐还原成亚硝酸盐。

紫外分光光度法的原理：硝酸根离子在紫外区有强烈的吸收，利用它在220nm波长处的吸光度可定量测定硝酸盐。氯化物在此波长不干扰测定，溶解的有机物在220nm处也会有吸收，而硝酸根离子在275nm处没有吸收。因此，在275nm处作另一次测量，以校正硝酸盐值。紫外分光光度法操作过程简单。

还有利用离子色谱法紫外测定海水中亚硝酸盐、硝酸盐，这是利用离子色谱法结合紫外检测的方法。其他还有主要对肉制品、乳制品和蔬菜中亚硝酸盐检测的光度法(格里斯试剂比色法、催化(褪色)光度法、流动注射-分光光度法、顺序注射-分光光度法、导数光度法)、示波极谱法、荧光法等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定硝酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的硝酸测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行硝酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明硝酸浓度测定方法原理如下：

硝酸+还原型辅酶 硝酸还原酶 亚硝酸+水+辅酶

这种方法应用硝酸还原酶(Nitrate reductase；EC1.7.1.1；EC1.7.1.2；EC1.7.99.4)酶促反应连续监测法/终点比色法。硝酸还原酶酶解硝酸反应，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算硝酸的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂，如下成分关系的本发明硝酸测定试剂盒较为理想：

缓冲液                     100mmol/L

稳定剂                     500mmol/L

还原型辅酶                 0.25mmol/L

硝酸还原酶                 10000U/L

本发明的硝酸测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、硝酸还原酶。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。

试剂2

缓冲液、稳定剂、硝酸还原酶。

还原型辅酶、硝酸还原酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂、双剂，本发明测定硝酸浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。实施例一

本实施例的硝酸测定试剂为单试剂，包括：

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液     100mmol/L

稳定剂                             500mmol/L

还原型辅酶                         0.25mmol/L

硝酸还原酶                         10000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测硝酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出硝酸的浓度大小。实施例二

本实施例的硝酸测定试剂为双试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液   100mmol/L

稳定剂                           50mmol/L

还原型辅酶                       0.25mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液   100mmol/L

稳定剂                           500mmol/L

硝酸还原酶                       10000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测硝酸样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出硝酸的浓度大小。

申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。

总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、使于推广应用。

Claims (5)

1.一种利用酶比色法技术的硝酸浓度测定方法，其方法原理如下： 

将最终反应物置于紫外或者可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，测算出硝酸的浓度大小测定结果。 

2.一种硝酸测定试剂盒，主要成分包括： 

其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 

3.根据权利要求2所述硝酸测定试剂盒，其特征在于： 

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、硝酸还原酶组成单剂试剂。 

4.根据权利要求2所述硝酸测定试剂盒，其特征在于： 

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、硝酸还原酶组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、硝酸还原酶组成；还原型辅酶、硝酸还原酶在试剂1或试剂2中的位置不限，还原型辅酶、硝酸还原酶在试剂中的位置可以互换 。

5.根据权利要求2所述硝酸测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定 剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比；所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。