CN101173895A - 二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒及二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度测定方法 - Google Patents
二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒及二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、辅酶、芳基二烷磷酸、芳基醇脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活性浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
Description
技术领域
本发明涉及一种二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术
血清中的二乙基对硝基苯磷酸酯酶，主要在肝脏表达，其作用是水解组织中磷酸酯。血清中的二乙基对硝基苯磷酸酯酶与人体中的高、低密度脂蛋白代谢有关。二乙基对硝基苯磷酸酯酶可以保护低密度脂蛋白，避免氧化修饰，所以，可以认为，二乙基对硝基苯磷酸酯酶是一种具有抗动脉粥样硬化以及抗炎作用的酶。血浆二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性的增加，使血浆中抗氧化修饰型低密度脂蛋白的自身抗体水平降低18.8％，而高密度脂蛋白上二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性的增加，使高密度脂蛋白水平升高9.1％。
吸烟者体内的二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活性浓度较之非吸烟者或戒烟者的活性浓度低，因而抗氧化作用也随之降低，导致血管中产生较多胆固醇沉积，而多余的胆固醇可以导致血管堵塞，最终导致心脏病或中风发生。除吸烟之外，糖尿病和衰老也与二乙基对硝基苯磷酸酯酶水平降低有关。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用、酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度测定方法原理如下：
芳基二烷磷酸+水 二乙基对硝基苯磷酸酯酶 二烷基磷酸+芳基醇
芳基醇+辅酶 芳基醇脱氢酶 芳基醛+还原型辅酶
这种方法应用二乙基对硝基苯磷酸酯酶(Paraoxonase；EC 3.1.1.2)酶(偶)联芳基醇脱氢酶(Arylalcohol dehydrogenase；EC 1.1.1.90；EC1.1.1.91)酶促反应连续监测法。二乙基对硝基苯磷酸酯酶酶解芳基二烷磷酸反应产生芳基醇，再通过(偶)联合芳基醇脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算二乙基对硝基苯磷酸酯酶酶的活性浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂较为理想：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
辅酶 3mmol/L
芳基醇脱氢酶 14000U/L
芳基二烷磷酸 14mmol/L
本发明的二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、辅酶、芳基二烷磷酸、芳基醇脱氢酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、芳基二烷磷酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、芳基醇脱氢酶。
辅酶、芳基二烷磷酸、芳基醇脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、芳基二烷磷酸。
试剂3
缓冲液、稳定剂、芳基醇脱氢酶。
辅酶、芳基二烷磷酸、芳基醇脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂或三剂，本发明测定二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
辅酶 3mmol/L
芳基醇脱氢酶 14000U/L
芳基二烷磷酸 14mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测二乙基对硝基苯磷酸酯酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值4180。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活性浓度大小。
实施例二
本实施例的二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
辅酶 3mmol/L
芳基二烷磷酸 10mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
芳基醇脱氢酶 16000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测二乙基对硝基苯磷酸酯酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活性浓度大小。
实施例三
本实施例的二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
辅酶 3mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
芳基二烷磷酸 18mmol/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
芳基醇脱氢酶 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测二乙基对硝基苯磷酸酯酶样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活性浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
Claims (6)
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度测定方法，其方法原理如下：
芳基二烷磷酸+水 二乙基对硝基苯磷酸酯酶 二烷基磷酸
+芳基醇
芳基醇+辅酶 芳基醇脱氢酶 芳基醛+还原型辅酶
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活性浓度大小测定结果。
2.一种二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，主要成分包括：
缓冲液 20-500mmol/L
稳定剂 1-50mmol/L
辅酶 1-6mmol/L
芳基醇脱氢酶 1000-80000U/L
芳基二烷磷酸 1-50mmol/L
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、芳基二烷磷酸、芳基醇脱氢酶组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、芳基二烷磷酸、芳基醇脱氢酶组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、芳基二烷磷酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、芳基醇脱氢酶组成。辅酶、芳基二烷磷酸、芳基醇脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、芳基二烷磷酸、芳基醇脱氢酶组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、芳基二烷磷酸组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、芳基醇脱氢酶组成。辅酶、芳基二烷磷酸、芳基醇脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
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