CN101691601A - 一种通过酶法测定二氧化碳浓度来确定草酸浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通过酶法测定二氧化碳浓度来确定草酸浓度的方法，包括：(1)草酸+草酸脱羧酶+醋酸缓冲溶液，20～37℃，反应30～60min；(2)配制pH7.3～8.5的含磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、NADH、苹果酸脱氢酶的Tris-HCl缓冲液，37℃温育，380nm处测A1；(3)在步骤2中添加步骤1反应液，37℃反应5min，380nm处测A₂及A₃；(4)根据ΔA_380nm＝ΔA_待测－ΔA_空白计算NADH减少量，再根据反应原理计算生成二氧化碳的浓度，从而计算草酸脱羧酶的浓度。该方法操作简便，所用的酶试剂较便宜，成本低，灵敏度高，与其它市售的测定草酸的试剂盒相比精确度相近，有很好的实用性。

Description

一种通过酶法测定二氧化碳浓度来确定草酸浓度的方法

技术领域

本发明属草酸浓度的酶分析领域，特别是涉及一种通过酶法测定二氧化碳浓度来确定草酸浓度的方法。

背景技术

目前草酸含量的测定方法主要有滴定法、原子吸收法、比色法、酶法和高压液相色谱法(HPLC)，另外还有离子色谱法、毛细管电泳法(CE)等。

滴定法建立最早，作为一种经典方法至今仍在食品分析中广泛应用，但发展不大，其灵敏度低，操作较繁琐、耗时的缺陷没有改善。比色法廉价、灵敏度高，但预沉淀操作难于完全将草酸提取出来，操作繁琐且重复性较差；毛细管电泳灵敏度高，操作也较简便，但该仪器尚未普及。高压液相色谱法灵敏度高，重复性好，操作简便，快捷，但分离过程中无机酸的干扰较严重，且仪器昂贵，对操作人员的要求较高，普及困难，较适于在专业部门使用。酶法及酶-电极法检测草酸简便快速，灵敏度高，选择性好，回收率高，将酶法的放大作用、良好选择性与电极法的快速简便有机的结合了起来，是一种很有前途的检测方法。

现在研究报道较多的利用酶测定草酸的方法，是利用草酸氧化酶催化草酸与氧气生成二氧化碳和过氧化氢的特性，再通过检测氧气的消耗量、二氧化碳或过氧化氢的生成量来定量草酸。这种方法简便、精确度高，是目前测定草酸的经典方法。但是由于草酸氧化酶造价较高，该法的大范围推广应用受到了很大的限制。因此大家都在寻找一种可替代该经典方法，且耗时短、价格较便宜、精确度与该方法相近的测定草酸的分析方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种通过酶法测定二氧化碳浓度来确定草酸浓度的方法，该方法操作简便，所用的酶试剂较便宜，成本低，灵敏度高，与其它市售的测定草酸的试剂盒相比精确度相近，有很好的实用性。

本发明的一种通过酶法测定二氧化碳浓度来确定草酸浓度的方法，包括：

(1)第一步反应酶催化反应体系的构建

空白样品的准备：量取0.3mL200mmol/L醋酸缓冲液，0.1mL草酸及0.1mL失活的草酸脱羧酶，混合备用；

待测样品的准备：量取0.3mL 200mmol/L醋酸缓冲液，0.1mL草酸及0.1mL酶活＞0.8U/mL的草酸脱羧酶，混合备用；

第一步反应酶催化反应体系总体积V₂为0.5mL，反应pH为3.0-5.5，反应温度为20-37℃，反应时间为30-60min；

(2)第二反应体系

分别准备2管各1mL的CO₂测定试剂样品，于37℃温育5min，pH 7.3～8.5，380nm条件下测得A₁；

其中CO₂测定试剂的组成：8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mM NADH、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和大于200-300U/L的苹果酸脱氢酶，66-100mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.3～8.5；

(3)第三反应体系

空白样品组：混合1mL CO₂测定试剂和0.01～0.05mL第一步反应酶催化反应空白样品液V₃；

待测样品组：混合1mL CO₂测定试剂和0.01～0.05mL第一步反应酶催化反应待测样品液V₃；

第三反应体系总体积V₁为1mL+V₃，37℃，5min，pH 7.3～8.5，380nm条件下测得空白组A₂及待测组A₃；

(4)计算草酸浓度mmol/L

公式(1)

其中，V₁——最后的反应液总体积(mL)

v——加入待测样草酸体积(mL)

V₂——第一步酶反应液总体积(mL)

V₃——第三步参加酶反应液的体积(mL)

d——比色皿光径(cm)

ε₁——NADH的吸收系数：1.33L·mmol^-1·cm^-1，在380nm处

ΔA_380nm＝ΔA_待测-ΔA_空白；ΔA_空白＝A₂-A₁，ΔA_待测＝A₃-A₁。

本发明通过酶法测定草酸含量的原理是利用草酸脱羧酶催化分解草酸生成甲酸和二氧化碳，再通过烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和苹果酸脱氢酶(MDH)体系，采用分光光度法在380nm波长下检测NADH浓度的变化计算二氧化碳的浓度，从而计算草酸浓度，具体流程如下所示：

有益效果

本发明的通过酶法测定二氧化碳浓度来确定草酸浓度的方法，操作简便，所用的酶试剂较便宜，成本低，灵敏度高，与其它市售的测定草酸的试剂盒相比精确度相近，有很好的实用性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

注：[1]CO₂测定试剂的组成：8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mMNADH、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和大于200-300U/L的苹果酸脱氢酶，66mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.0；[2]参见公式(1)。

计算：

实施例2

注：[1]CO₂测定试剂的组成：8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mM NADH、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和大于200-300U/L的苹果酸脱氢酶，66mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.0；[2]参见公式(1)。

计算：

实施例3

注：[1]CO₂测定试剂的组成：8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mMNADH、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和大于200-300U/L的苹果酸脱氢酶，66-100mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.0；[2]参见公式(1)。

计算：

Claims (1)

1.一种通过酶法测定二氧化碳浓度来确定草酸浓度的方法，包括：

(1)第一步反应酶催化反应体系的构建

空白样品的准备：量取0.3mL 200mmol/L醋酸缓冲液，0.1mL草酸及0.1mL失活的草酸脱羧酶，混合备用；

待测样品的准备：量取0.3mL 200mmol/L醋酸缓冲液，0.1mL草酸及0.1mL酶活＞0.8U/mL的草酸脱羧酶，混合备用；

第一步反应酶催化反应体系总体积V₂为0.5mL，反应pH为3.0-5.5，反应温度为20-37℃，反应时间为30-60min；

(2)第二反应体系

分别准备2管各1mL的CO₂测定试剂，于37℃温育5min，pH 7.3～8.5，380nm条件下测得A₁；

其中CO₂测定试剂的组成：8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mM NADH、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和大于200-300U/L的苹果酸脱氢酶，66-100mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.3～8.5；

(3)第三反应体系

空白样品组：混合1mL CO₂测定试剂和0.01～0.05ml第一步反应酶催化反应空白样品液V₃；

待测样品组：混合1mL CO₂测定试剂和0.01～0.05ml第一步反应酶催化反应待测样品液V₃；

第三反应体系总体积V₁为1mL+V₃，37℃，5min，pH 7.3～8.5，380nm条件下测得空白组A₂及待测组A₃；

(4)计算草酸浓度mmol/L

公式(1)

其中，V₁——最后的反应液总体积(mL)

v——加入待测样草酸体积(mL)

V₂——第一步酶反应液总体积(mL)

V₃——第三步参加酶反应液的体积(mL)

d——比色皿光径(cm)

ε₁——NADH的吸收系数：1.33L·mmol^-1·cm^-1，在380nm处

ΔA_380nm＝ΔA_待测-ΔA_空白；ΔA_空白＝A₂-A₁，ΔA_待测＝A₃-A₁。