CN105486853A - 一种α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒，属于临床体外检测试剂技术领域。本发明试剂盒包括试剂R和校准品。通过在试剂R中以醋酸钠为缓冲体系和加入一定量的氯化钠，有效的提高了试剂盒的稳定性和分析灵敏度，其线性范围也较好，试剂的准确度高，有利于在市场中进一步的推广使用。

Description

一种α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒
技术领域
本发明涉及临床体外检测试剂技术领域, 特别涉及一种α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒。
背景技术
α-L-岩藻糖苷酶 (Alpha-L-Fucosidase, AFU) 广泛分布于人体内的各种组织、细胞及体液中，在肝、肺、脑、肾、胰、胎盘组织、细胞培养液中的成纤维细胞、白细胞以及血清、尿液、唾液、泪液和垂体液中均含此酶；该酶基本功能是催化含岩藻糖基的低聚糖、糖蛋白及糖苷的水解代谢，其本质是一种糖蛋白，在包括免疫反应、信号转导等多种方面发挥重要作用。α-L-岩藻糖苷酶最初应用于岩藻糖苷贮积病的诊断，之后研究者陆续发现α-L-岩藻糖苷酶对多种疾病的发生及发展均有重要的意义。Deugnier等于1980年首先发现原发性肝癌患者血清α-L-岩藻糖苷酶升高，具有较高的特异性和灵敏性，多项研究证实α-L-岩藻糖苷酶可作为原发性肝癌的肿瘤标志物。
化学显示法不能完全解决溶血和血清黄疸等对测定结果的影响并且该方法过程比较繁琐，尤其在肝脏疾病诊断中最为突出。该试剂盒采用的是动力学连续检测法，以醋酸盐为缓冲液，并在试剂中增添了120 mmol/L氯化钠，使该试剂盒具有准确度好，稳定性强，灵敏度高的特点。
发明内容
针对于现有技术存在的问题, 本发明提供了一种α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒, 该试剂盒与常规的试剂盒相比, 稳定性和线性范围比常规的检测试剂盒要好, 分析灵敏度高, 有利于试剂在临床上的推广应用。
本发明是通过以下措施实现的：
一种α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒, 其特征在于, 它包含试剂R和校准品, 其中试剂R组成为：100 mmol/L醋酸钠、100 mmol/L 2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷（CNPF）、120mmol/L 氯化钠、7.7 mmol/L叠氮钠。所述试剂R在使用时和血清的比例250：25。
本发明所使用的校准品为北京九强生物技术有限公司生产的AFU校准品。
本发明的试剂盒在自动生化分析仪日立7180上进行, 其具体使用方法如下：
R：试剂 U：样品
生理盐水、U或 记录吸光度A1 记录吸光度A2
S:25 μl; R:250 μl 计算∆A/min
加入生理盐水、样本或校准品25 μl, 之后再加入R试剂250 μl延迟3 min后, 记录吸光度A1, 反应2 min后记录吸光度值A2, 计算∆A/min。
本发明的有益效果：
本发明提供的α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒, 以醋酸钠为缓冲体系，增强了试剂的稳定性；通过添加120 mmol/L氯化钠, 降低了血清黄疸和溶血对试剂准确度的影响，提高了试剂灵敏度。
附图说明
图1 实施例2准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；
图2 实施例3准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；
图3 实施例4准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性。
具体实施方式
为了更好的理解本发明, 下面结合具体实施例来进一步详细说明。
实施例1
一种α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒, 它包括试剂R和校准品。
其中试剂R组成为：
二硫苏糖醇缓冲液 100 mmol/L
2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷（CNPF） 100 mmol/L
叠氮钠 7.7 mmol/L
本实施例描述的试剂盒, 在使用时, 其测定方法是采用日立7180自动分析仪, 操作如下：
加入生理盐水、样本或校准品25 μl, 之后再加入R试剂250 μl延迟3min后, 记录吸光度值A1, 反应2 min后记录吸光度值A2，计算∆A/min。
本实施例所使用的校准品为北京九强生物技术有限公司生产的AFU校准品。
实施例2
一种α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒, 它包括试剂R和校准品。
其中试剂R组成为：
醋酸钠缓冲液 100 mmol/L
2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷（CNPF） 100 mmol/L
氯化钠 50 mmol/L
叠氮钠 7.7 mmol/L
本实施例描述的试剂盒, 在使用时, 其测定方法是采用日立7180自动分析仪, 操作如下：
加入生理盐水、样本或校准品25μl, 之后再加入R试剂250μl延迟3min后, 记录吸光度值A1, 反应2min后记录吸光度值A2，计算∆A/min。
本实施例所使用的校准品为北京九强生物技术有限公司生产的AFU校准品。
具体测定方法同实施例1。
实施例3
一种α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒, 它包括试剂R和校准品。
其中试剂R组成为：
醋酸钠缓冲液 100 mmol/L
2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷（CNPF） 100 mmol/L
氯化钠 100 mmol/L
叠氮钠 7.7 mmol/L
本实施例描述的试剂盒, 在使用时, 其测定方法是采用日立7180自动分析仪, 操作如下：
加入生理盐水、样本或校准品25μl, 之后再加入R试剂250μl延迟3min后, 记录吸光度值A1, 反应2min后记录吸光度值A2，计算∆A/min。
本实施例所使用的校准品为北京九强生物技术有限公司生产的AFU校准品。
具体测定方法同实施例1。
实施例4
一种α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒, 它包括试剂R和校准品。
其中试剂R组成为：
醋酸钠缓冲液 100 mmol/L
2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷（CNPF） 100 mmol/L
氯化钠 120 mmol/L
叠氮钠 7.7 mmol/L
本实施例描述的试剂盒, 在使用时, 其测定方法是采用日立7180自动分析仪, 操作如下：
加入生理盐水、样本或校准品25 μl, 之后再加入R试剂250 μl延迟3 min后, 记录吸光度值A1, 反应2 min后记录吸光度值A2，计算∆A/min。
本实施例所使用的校准品为北京九强生物技术有限公司生产的AFU校准品。
具体测定方法同实施例1。
对上述实施例1-4中制得的试剂盒分析性能进行实验验证。
准确度验证实验：
将实施例2、3、4的试剂盒作为实验组, 市场上获得认可的一种准确度优异的α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒 (北京某公司生产) 作为对照组进行对比实验, 对40个样本进行检测, 检测的结果如图1-图3。
通过图1-图3的检测数据可知, 实施例2、3、4检测试剂盒与对照检测试剂盒的检测结果相关性分别为0.9972、0.9988、0.9997, 相关性比较好, 表明本发明的试剂盒与市场上获得认可的具有优异准确度的α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒有高度一致性, 证明本发明试剂盒添加的其他各种成分对其准确性不会造成影响, 试剂盒依然保持较好的准确度。
线性相关性验证实验：
找到α-L-岩藻糖苷酶高值样本为120.0 U/L, 用生理盐水进行系列稀释, 配制6个不同浓度的样本, 依次为120.0 U/L、 96.0 U/L 、72.0 U/L、48.0 U/L、24.0 U/L、0 U/L浓度的样本, 每个浓度水平各样本分别测定三次, 分别取其平均值。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如表1所示。
表1 实施例1-4线性相关验证实验检测结果
理论浓度 (U/L) 实施例1检测结果 (U/L) 实施例2检测结果 (U/L) 实施例3检测结果 (U/L) 实施例4检测结果 (U/L)
0 0.3 0.4 0.6 0
24 23.4 24 24 23.1
48 47.2 48.3 47.9 45.9
72 71.2 72 72.9 72.3
96 96 93.6 96.3 96.6
120 112.5 123.9 116.4 117.9
相关系数 r 0.9972 0.9981 0.9989 0.9993
上述检测结果显示, 实施例1-4检测结果相关性均大于0.990, 但实施例2、3、4的检测结果大于0.998, 与实施例1相比具有更好的线性相关性, 这说明本发明试剂具有更好的线性相关性。
稳定性验证实验：
在2℃-8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存试剂, 检测四种实施例试剂的稳定性。四种试剂每月选取同一样本测定其吸光度三次, 取平均值, 与新鲜的实施例1试剂检测结果进行对比, 从而确定试剂的稳定时间。检测数据如表2。
表2 稳定性验证实验检测结果
时间 实施例1试剂检测结果 实施例2试剂检测结果 实施例3试剂检测结果 实施例4试剂检测结果 新鲜的实施例1试剂检测结果
12个月 7.1739 7.0362 7.2549 7.2846 7.2333
13个月 32.112 32.283 32.814 32.688 33.138
14个月 40.22784 40.33152 40.21056 40.38336 40.29696
15个月 32.9274 33.6501 33.5313 33.2145 33.7194
16个月 30.2175 45.3798 45.3951 46.0224 45.7011
17个月 4.91832 37.49328 37.11312 37.15272 37.45368
18个月 0.36288 27.79776 27.40032 27.71136 27.89568
19个月 0.0126 21.7539 21.6216 21.8169 21.7791
20个月 0.00432 20.2392 19.85472 19.97136 20.0232
21个月 0 15.183 15.3945 15.3765 15.5745
22个月 0 11.8224 11.9304 11.9556 12.0888
23个月 0 8.8101 8.6346 8.5509 8.8155
24个月 0 3.9204 3.9834 3.8178 4.023
25个月 0 3.0213 3.0987 3.15 3.8088
26个月 0 5.8968 8.34624 10.35504 23.01696
实验结果显示, 实施例1试剂在2℃-8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月稳定, 而实施例2、3、4试剂在2℃-8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存24个月稳定, 说明在试剂中醋酸钠缓冲体系和氯化钠二者共同作用有效的提高了α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒的稳定性。
分析灵敏度验证实验：
用本发明AFU比色法检测试剂盒测试已知浓度在36.3 U/mL的样本, 记录吸光度差值。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如表3所示。
表3 分析灵敏度实验结果
理论浓度 (U/mL) 实施例1检测结果ΔA 实施例2检测结果ΔA 实施例3检测结果ΔA 实施例4检测结果ΔA
36.3 0.0652 0.0836 0.0952 0.0973
通过检测数据可知, 实施例2、3、4检测试剂盒的吸光度差值均比实施例1的高, 说明在试剂中醋酸钠缓冲体系和氯化钠二者共同作用有效的提高了α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒的分析灵敏度
综合以上分析, 本发明提供的α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒, 在试剂R中醋酸钠缓冲体系和氯化钠能够有效的提高试剂盒的稳定性和分析灵敏度, 线性范围较好, 试剂的准确度也较好。因此, 本发明提供的α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒有利于在市场中进一步的推广使用。

Claims (3)

1.一种α-L-岩藻糖苷酶比色法检测试剂盒, 其特征在于, 它包含试剂R和校准品, 其中试剂R组成为：100 mmol/L醋酸钠、100 mmol/L 2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷（CNPF）、120 mmol/L 氯化钠、7.7 mmol/L叠氮钠。
2.根据权利要求1所述的试剂盒, 其特征在于, 醋酸钠缓冲液和氯化钠使试剂盒具有准确度好，稳定性强，灵敏性高的特点。
3.根据权利要求1所述的试剂盒, 其特征在于, 所述试剂R在使用时和血清的比例250：25。
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