KR102366786B1 - 바실러스 시아멘시스 jc-18 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물 - Google Patents

바실러스 시아멘시스 jc-18 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) JC-18 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물에 관한 것으로서, 토양으로부터 분리한 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주 또는 이의 배양액이 식물병 방제에 효과를 나타내므로, 이를 효과적으로 식물병 방제에 이용할 수 있다.

Description

바실러스 시아멘시스 JC-18 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물{Composition for controlling plant disease comprising Bacillus siamensis JC-18 or culture medium thereof}
본 발명은 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) JC-18 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 수탁번호 KCTC14159BP로 기탁된 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) JC-18 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물의 식물병 방제 효과에 관한 것이다.
일반적으로 농업에서 생산량을 높이고자 식물에서 유발되는 식물병을 방제하기 위해 지금까지 유기 화합물을 기초로 한 방제용 조성물을 제조하여 사용하여 왔다. 상기 농약으로는 유기질 또는 화학 방제용 조성물이 있는데, 최근에는 환경 오염 문제 및 농작물 오염 문제가 심각하게 대두되면서 화학 방제용 조성물의 사용 보다는 양질의 유기질 방제용 조성물을 사용하는 농법 개발이 확산되어 많은 유기질 방제용 조성물을 개발하여 사용하고 있으나, 화학 방제용 조성물의 대안으로서 과량 사용되는 유기질 방제용 조성물은 재료학적으로만 차이가 있을 뿐 토양의 오염, 연작 장해, 토양양분의 불균형, 병해충 발생 등 화학제와 비슷한 또 다른 문제점을 갖고 있다.
이러한 문제점을 해소하기 위해 화학 방제용 조성물을 대체할 수 있는 수단으로서, 농업 환경 및 생태계 부담을 최소화하면서 안전한 먹거리를 해결하는 생물학적 방법이 활발히 연구되고 있으며, 그 대체 방안으로 유용한 미생물을 이용하는 병해 방제 연구가 꾸준하게 이루어 지고 있다. 생물학적 방제용 조성물로 사용되는 주요 미생물로는 바실러스 속 (Bacillus sp.), 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.)등의 세균과 암펠로마이세스 속(Ampelomyces sp.), 트라이코더마 속(Trichoderma sp.) 등의 진균이 알려져 있다.
이러한 연구에 사용되는 미생물은 환경 및 인체에 무해한 미생물로서, 상기 미생물을 이용한 생물학적 방제용 조성물은 염류 집적 등 토양 오염의 환경 문제를 일으키지 않는다는 장점이 있으며, 생태계 안정성 유지에 탁월하며 작물 생산성을 지속적으로 향상시키는 이점이 있다.
그러나, 현재 국내에서도 미생물 제제의 개발 기술이 많이 향상되고 있음에도 불구하고, 아직까지 개발 수준이 상당히 미미한 실정이며, 국내에서 소비되는 미생물 방제 조성물은 주로 외국에서 수입하여 사용하는 경향이 높다.
이에 본 발명자들은 종래의 유기질 또는 화학 방제용 조성물의 문제를 해결할 수 있는 친환경 식물병 방제용 조성물을 개발하고자 노력한 결과, 본 발명의 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) JC-18 균주가 식물병 방제에 효과를 가지는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 식물병 방제 활성을 가지는 수탁번호 KCTC14159BP로 기탁된 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주를 제공하는 것이다.
이에, 본 발명의 다른 목적은 식물병 방제 활성을 가지는 수탁번호 KCTC14159BP로 기탁된 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주의 배양액을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수탁번호 KCTC14159BP로 기탁된 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수탁번호 KCTC14159BP로 기탁된 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주의 배양액 제조 단계; 및 상기 배양액으로부터 배양 상등액을 수득하는 상등액 수득 단계를 포함하는 식물병 방제용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수탁번호 KCTC14159BP로 기탁된 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주의 식물 방제 용도에 관한 것이다.
본 발명은 기탁된 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) JC-18 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 배양액은 식물병 방제 효과를 나타낸다.
본 발명자들은 토양에서 분리된 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주 또는 그의 배양액이 식물병 방제에 효과가 있음을 확인하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 식물병 방제 활성을 가지는 수탁번호 KCTC14159BP로 기탁된 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주이다. 상기 균주는 토양으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 식물병 방제 활성을 가지는 수탁번호 KCTC14159BP로 기탁된 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주의 배양액이다.
본 발명의 또 다른 양태는 수탁번호 KCTC14159BP로 기탁된 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주 또는 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물이다.
상기 식물병은 식물병원에 의하여 유발된다. 식물병원은 생물성, 비생물성 및 바이러스로 구별할 수 있다. 생물성 원인으로 곤충, 선충, 응애, 원생동물, 달팽이, 쥐나 새와 같은 야생 동물, 조류, 기생성 종자 식물 등이 있으나, 식물에 가장 큰 피해를 초래하는 생물성 원인은 진균, 세균, 끈적균 및 파이토플라스마와 같은 미생물이다. 반면, 비생물성 원인으로는 토양 조건, 광선의 과다 또는 부족, 고온 또는 저온, 건조 또는 과습, 강풍, 폭우, 폭설, 우박, 서리, 벼락, 공해물질, 비료 농약에 의한 약해 등이 있다.
본 발명의 식물병은 진균으로부터 유래된 것일 수 있고, 상기 진균은 풋마름병원균(Ralstonia solanacearum), 잿빛곰팡이병원균(Botrytis cinerea), 흰가루 병원균(Sphaerotheca fuliginea, Leveillula taurica), 탄저병원균(Colletotrichum acutatum), 도열병원균(Pyricularia grisea), 시들음병원균(Fusarium sp.), 줄기마름병원균(Corynespora cassiicola)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예를 들어 풋마름 병원균 및 잿빛곰팡이병원균 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양액은 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주를 배양하고, 균주를 제거한 후 수득된 배양 상등액, 이의 분획물, 이의 농축물 또는 이의 동결건조물인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주의 배양 상등액에 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid, TFA)를 처리한 후 침전물을 분리함으로써, 상기 배양 상등액의 분획물을 얻었다.
상기 배양액은 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주를 16시간 내지 40시간, 16시간 내지 36시간, 24시간 내지 40시간, 24시간 내지 36시간, 30시간 내지 40시간, 30시간 내지 36시간 배양하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 34시간 내지 38시간 배양하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주의 배양을 위해서는 TSA(Tryptic Soy Agar)배지를 이용할 수 있다. 구체적으로, TSA(Tryptic Soy Agar)배지는 트립톤, 소이빈 및 아가를 포함하는 배지를 의미할 수 있다.
상기 식물병 방제는 식물병원 생육의 저하를 통해 달성되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 유효성분들의 제형 그대로 제조되거나, 농약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합되어 유제, 용액제, 현탁제, 수화제, 유동제, 분제, 과립제, 분산제 등으로 제형화 될 수 있다.
상기 농약학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 방제용 조성물의 유효 성분과 배합되어 그 유효 성분의 활성을 저해하지 않으면서 그 유효 성분의 살포, 저장 및/또는 운반을 촉진시키고 식물에 허용 가능한 이상의 독성을 나타내지 않는 임의의 물질을 말한다.
상기 담체는 토양 천연 광물(예를 들면 카올린, 점토, 활석, 초크), 토양 합성 광물(예를 들면 고분산 실리카, 실리케이트), 탄소 기재 물질(목탄, 역청 등), 황, 천연 또는 합성 수지, 비료, 셀룰로스 기재 물질(톱밥 및 옥수수 속대), 물, 방향족 용매(예: 솔베소 프로덕츠, 자일렌), 파라핀(예를 들면 광유 분획), 알코올
(예를 들면 메탄올, 부탄올, 펜탄올, 벤질 알코올), 케톤(예를 들면 시클로헥사논, 메틸 히드록시부틸 케톤, 디아세톤 알코올, 메시틸 옥사이드, 이소포론), 락톤(예를 들면 감마-부티로락톤), 피롤리돈(피롤리돈, N-메틸피롤리돈, N-에틸피롤리돈, n-옥틸피롤리돈), 아세테이트(글리콜 디아세테이트), 글리콜, 디메틸 지방산 아미드, 지방산, 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방제용 조성물은 또한 습윤제, 분산제, 부동제, 증점제, 보존제, 전착제 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는 다음 단계를 포함하는 식물병 방제용 조성물의 제조방법이다:
바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) JC-18 균주 유래 배양액을 제조하는 배양액 제조 단계; 및
상기 배양액으로부터 배양 상등액을 수득하는 상등액 수득 단계.
상기 배양액 제조 단계는 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주를 16시간 내지 40시간, 16시간 내지 36시간, 24시간 내지 40시간, 24시간 내지 36시간, 30시간 내지 40시간, 30시간 내지 36시간 배양하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 34시간 내지 38시간 배양하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양액 제조 단계는 25 내지 40 ℃, 25 내지 35 ℃, 25 내지 30 ℃, 30 내지 40 ℃에서 배양하는 것일 수 있으며, 예를 들어 30 내지 35 ℃에서 배양하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 상등액 수득 단계는 배양액을 3500 내지 4500 rpm, 3700 내지 4500 rpm, 4000 내지 4500 rpm에서 원심 분리하여 상등액을 수득하는 것일 수 있으며, 예를 들어 4000rpm에서 원심 분리하여 상등액을 수득하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 상등액 수득 단계는 배양액을 25분 내지 35분, 30 내지 35분간 원심 분리하여 상등액을 수득하는 것일 수 있으며, 예를 들어 30분간 원심 분리하여 상등액을 수득하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물병 방제용 조성물의 제조방법은 다음 단계를 더 포함하는 것일 수 있다:
상기 상등액에 트리플루오로아세트산, 염산(HCl), 아세트산 (CH3COOH)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 상등액을 산성화시킬 수 있는 시약을 처리하여 교반액을 제조하는 교반 단계; 및
상기 교반액을 원심 분리하여 침전물을 분리하는 침전물 수득 단계.
상기 트리플루오로아세트산은 상등액 대비 0.5 내지 1.5 부피%(v/v), 0.7 내지 1.5 부피%(v/v), 0.9 내지 1.5 부피%(v/v), 0.5 내지 1.3 부피%(v/v), 0.7 내지 1.3 부피%(v/v), 0.9 내지 1.3 부피%(v/v), 0.5 내지 1.1 부피%(v/v), 0.7 내지 1.1 부피%(v/v), 0.9 내지 1.1 부피%(v/v) 첨가할 수 있으며, 예를 들어 1 부피%(v/v)첨가할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 침전물 수득 단계는 교반액을 3500 내지 4500 rpm, 3700 내지 4500 rpm, 4000 내지 4500 rpm에서 원심 분리하여 침전물을 수득할 수 있는 것이며, 예를 들어 4000rpm에서 교반액을 원심 분리하여 침전물을 수득할 수 있는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 침전물 수득 단계는 교반액을 3 내지 6분, 또는 4 내지 6분간 원심 분리하여 침전물을 수득할 수 있는 것이며, 예를 들어 5분간 교반액을 원심 분리하여 침전물을 수득할 수 있는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물병 방제용 조성물의 제조방법은 액체크로마토그래피를 이용하여 침전물에서 활성 대사 산물을 분획하는 분획물 제조단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 분획물 제조단계는 액체크로마토그래피의 고정상 칼럼으로 썬파이어 C18을 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 분획물 제조단계는 액체크로마토그래피의 이동상 용매로 트리플루오르 아세트산, 물, 아세토니트릴, 메탄올, n-프로판올, 아세톤, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 니트로메탄, n-헵탄, 사이클로헥산, 카본 테트라클로라이드, 클로로포름, 벤젠, 톨루엔, 메틸렌 클로라이드, 테트라클로로에틸렌, 1,2-디클로레탄 등으로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 혼합되어 이루어진 것을 용매로 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 트리플루오르 아세트산은 물에 0.01 내지 0.1 부피%(v/v), 0.03 내지 0.1 부피%(v/v), 0.05 내지 0.1 부피%(v/v), 0.01 내지 0.07 부피%(v/v), 0.01 내지 0.05 부피%(v/v) 포함되어 사용될 수 있으며, 예를 들어 0.05 부피%(v/v) 포함되어 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 아세토니트릴은 40 부피%(v/v)에서 60 부피%(v/v)의 농도 구배로 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) JC-18 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물에 관한 것으로서, 토양으로부터 분리한 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주와 그의 배양액이 식물병 방제에 효과를 나타내므로, 이를 효과적으로 식물병 방제에 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) JC-18 균주의 계통수 분석 결과를 나타낸 계열도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주 배양 상등액의 풋마름병 최저 저해농도를 나타낸 사진이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주의 배양액의 잿빛 곰팡이병 활성을 나타낸 사진이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주의 이차 대사산물의 잿빛 곰팡이병 활성을 나타낸 사진이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주의 이차 대사산물의 질량분석 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주의 이차 대사산물의 질량분석 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주의 이차 대사산물의 질량분석 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1. 식물병 방제 활성 균주의 분리
식물병 방제 활성이 있는 균주는 전남 곡성군 입면 생물 방제 연구 센터에 존재하는 잡초 근권(생장하는 뿌리가 물질을 섭취하고 저장함으로써, 결과적으로 구성 생물의 비율이 달라지는 등 다양한 변화를 일으키는 토양 환경)토양에서 분리하였다. 구체적으로, 잡초 근권 토양 1g을 채취하여 인산 완충 생리식염수(Phosphate buffered saline, pH 7.0)에 희석한 후, TSA(Tryptic Soy Agar)플레이트에 도말하여, 30 ℃에서 3일 이상 배양하였다. 300점 이상의 잡초 근권 토양에 존재하는 균주를 분리하였으며, 분리한 균주의 식물병 방제활성을 조사하였다.
실시예 2. 식물병 방제 활성이 있는 선별 균주의 동정
최종 선별된 균주 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) JC-18는 16S rRNA 염기서열 분석을 통하여 동정을 수행하였다. 분리 균주는 순수분리한 후 TS 플레이트(Plate)상태로 냉장 택배를 이용하여 마크로젠(서울)에 의뢰하였고, 27F 및 1492R의 유니버설 프라이머 세트(universal primer set)를 사용하여 16S rRNA 염기서열 분석을 수행하였다.
상기 분리 균주 바실러스 시아멘시스 JC-18의 16S rRNA 코딩 염기서열로 총 1,503bp의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
서열번호 명칭 서열 (5'---> 3') bp
1 Bacillus siamensis JC-18 16S rRNA
TTTTTTATTTTTCTTTTCCTCAGACGACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATG
CAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGG
GTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAA
CCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAG
GTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGG
TGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGA
TCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG
TAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG
TGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGC
CGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTA
ACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAA
TTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGC
CCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGA
AGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAG
GAACACCCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAG
CGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTA
AACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTA
ACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAA
GGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAG
CAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGAT
AGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAG
CTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGAT
CTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAA
CCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGG
CTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTT
AAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGA
CTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAA
TACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAA
CACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGA
CAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAA		 1,503
2 Bacillus siamensis JC-18 16S rRNA 27F forward primer AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 20
3 Bacillus siamensis JC-18 16S rRNA 27F reverse primer TACGGYTACCTTGTTACGACTT 22
상기 수행한 염기서열을 기초로 염기서열의 상동성 검사는 등록된 정보(GeneBank database)를 대상으로 블라스트 프로그램(Blast program, http://www.ncbi.nlm.nhi.gov)에 의해 실행하였다. 그 결과 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) 종과 99%의 상동성을 나타내었으며, 분자계통학적 위치를 나타내는 계통 발생적 분지도(phylogenetic tree)를 도 1에 나타내었다.
그 결과 분리 균주를 바실러스 시아멘시스 JC-18로 명명하였고, 대한민국 한국생명공학연구원에 기탁하였다.
실시예 3. 식물병 방제 활성이 있는 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주의 항균 및 항진균 활성 시험
분리 선별한 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) JC-18 균주의 풋마름병 및 잿빛곰팡이병에 미치는 활성을 조사하기 위해 -80℃로 보관된 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주를 TS(tryptic soy)고체 배지에 도말 접종(streaking)하여 30℃에서 18시간 동안 배양하고, 배양 후 생성된 단일 콜로니(colony)를 멸균된 TS 액체배지 10mL에 접종한 후, 18시간동안 배양하여 균주 배양액을 제조하였다.
3-1. 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주 배양액이 풋마름병에 미치는 효과
바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) JC-18 균주 배양액을 TS 액체 배지 1 L에 1 부피%(v/v) 접종하여 계대배양(subculture)하였고, 4000rpm에서 30분간 원심 분리하여 균체를 제거하고 배양 상등액만을 얻어내어 시험에 사용하였다.
풋마름병원균(Ralstonia solanacearum)은 TS 고체배지에 도말 접종(Streaking)하여 30℃에서 2일간 배양하고, 생성된 단일 콜로니를 멸균된 TS 액체배지에서 3일간 배양하였다. 배양 후, 풋마름병원균의 생균수를 106 CFU/mL로 희석한 후, 100 ul/ml, 50 ul/ml, 25 ul/ml 및 12 ul/ml의 농도별로 바실러스 시아멘시스 JC-18 배양 상등액을 처리하여 최저 저해 농도(Minimum inhibitory concentration)를 측정하였고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
실험 결과, 100 ul/ml 바실러스 시아멘시스 JC-18 배양 상등액에서 풋마름병원균이 저해되는 것을 확인하였다.
3-2. 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주 배양액이 잿빛곰팡이병에 미치는 효과
바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) JC-18 균주의 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea) 활성은 잿빛곰팡이가 접종된 PDA 배지(Potato Dextrose Agar)에 바실러스 시아멘시스 균주 배양액을 대치 배양하여 수행하였다. 25℃에서 6일간 배양한 후 방제 효과를 측정하였고 그 결과를 도 3a에 나타내었다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주는 잿빛곰팡이의 생육을 저해시키는 저해대를 형성하였으며, 방제 효과 또한 우수함을 확인하였다.
바실러스 시아멘시스 JC-18 균주의 항진균성 대사산물의 정제를 위해 -80℃로 보관된 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주를 TS 고체 배지에 도말 접종하여 30℃에서 18시간 동안 배양하고, 배양 후 생성된 단일 콜로니를 멸균된 TS 액체 배지 10 mL에 접종하였다. 18시간 동안 배양 후 TS 액체 배지 1 L에 1 부피%(v/v) 접종하여 계대배양(subculture)하였고, 4000rpm에서 30분간 원심 분리하여 배양 상등액을 얻었다.
배양 상등액에 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid, TFA)을 1 부피%(v/v) 처리하여 교반시키고, 이를 4000rpm에서 5분간 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 얻어진 침전물을 100 부피%(v/v) 메탄올(methanol, MeOH)에 용해시켜 8 mm의 페이퍼 디스크(paper disc)에 적하하고 완전히 건조 후 잿빛곰팡이가 접종된 PDA 배지에 대치 배양하여 활성을 확인하였다. 25℃의 온도에서 10일간 배양한 후, 방제 효과를 측정하였다.
실험 결과, 도 3b와 같이 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주 유래 대사 산물이 잿빛 곰팡이의 생육을 저해시키는 저해대를 형성하였음을 확인하였다.
실시예 4. 식물병 방제 활성이 있는 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주 유래 항진균성 활성 대사 산물의 분석
바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) JC-18 균주 유래 항진균성 대사산물을 고성능 액체크로마토 그래피(Shimadzu HPLC, Japan)와 API2000 질량분석기(AB Sciex사)를 이용하여 분석하였다. 고정상 칼럼은 썬파이어 C18 (SunFire C18, Waters사, 100Å, 10 μm, 4.6 X 250 mm)을 이용하였으며, 이동상 용매는 0.05 부피%(v/v)의 트리플루오로 아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 사용하였다. 아세토니트릴 농도는 40 부피%(v/v)에서 60 부피%(v/v)를 1분당 1 mL씩 20분간 농도 구배를 주어 흘려주었으며, 파장은 230 nm의 조건에서 수행하였다.
실험 결과, 활성 대사산물 분획물에서 머무름 시간(retention time) 순으로 m/z 1043 내지 1085의 이투린계(iturin family), m/z 1436 내지 1521의 펜기신계(fengycin family), m/z 994 내지 1050의 서펙틴계(surfactin family) 분자량이 검출되었으며, 구체적으로 도 4a에 m/z 1043.6, 1057.6 (이투린으로 추정), 도 4b에 m/z 1464.5, 1479.3 및 1491.9 (펜기신으로 추정) 그리고 도 4c에 m/z 1009.0, 1023.1, 1037.3 및 1045.5 (서펙틴으로 추정)의 분자량을 나타내었다.
이들은 지방산 길이에 따라 14Da의 분자량 차이를 가지는 환형리포펩타이드(cyclic lipopeptide)계 항균 물질이며, 본 발명의 바실러스 시아멘시스 JC-18 균주, 균주의 배양 상등액, 상기 배양 상등액을 산성화시켜 분리한 침전물 및 활성 대사산물 분획물은 상기 환형리포펩타이드 계열을 포함하고 있어 다양한 식물 병원균에 대하여 저해능력을 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC14159BP 20200327
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Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 식물병 방제에 활성을 가지는 수탁번호 KCTC14159BP로 기탁된 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) JC-18 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 풋마름병원균(Ralstonia solanacearum) 또는 잿빛곰팡이병원균(Botrytis cinerea)으로부터 유래된 식물병 방제용 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제3항에 있어서, 상기 배양액은, 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) JC-18 균주를 배양하고, 균주를 제거한 후 수득된 배양 상등액, 이의 분획물, 이의 농축물, 또는 이의 동결건조물인 것인, 식물병 방제용 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 배양액은 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) JC-18 균주를 16시간 내지 40시간 동안 배양하여 수득한 것인, 식물병 방제용 조성물.
  8. 다음 단계를 포함하는 풋마름병원균(Ralstonia solanacearum) 또는 잿빛곰팡이병원균(Botrytis cinerea)으로부터 유래된 식물병 방제용 조성물의 제조방법:
    바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) JC-18 균주의 배양액을 제조하는 배양액 제조 단계; 및
    상기 배양액으로부터 배양 상등액을 수득하는 상등액 수득 단계.
  9. 제8항에 있어서, 다음 단계를 더 포함하는 것인, 식물병 방제용 조성물의 제조방법:
    상기 상등액에 트리플루오로아세트산, 염산(HCl), 아세트산 (CH3COOH)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 처리하여 교반액을 제조하는 교반 단계; 및
    상기 교반액을 원심 분리하여 침전물을 분리하는 침전물 수득 단계.
  10. 제9항에 있어서, 다음 단계를 더 포함하는 것인, 식물병 방제용 조성물의 제조방법:
    액체크로마토그래피를 이용하여 침전물에서 활성 대사 산물을 분획하는 분획물 제조단계.
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