WO2011152618A4 - 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소와 그의 정제방법 - Google Patents

국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소와 그의 정제방법 Download PDF

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    • G01N30/96—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation using ion-exchange

Definitions

  • the present invention relates to a method of purifying non-proliferative botulinum toxin and to a non-proliferative botulinum toxin having the effect of local paralysis obtained thereby.
  • Botox is widely used for treating cerebral palsy muscles as well as treating pain caused by rigid neck muscles, facial muscle stiffness, and vocal fold paralysis.
  • it is used for wrinkle removal and anti-aging treatment.
  • anti-aging medicine has become popular, and the use of botox is increasing every year.
  • Botox is injected into the muscles to paralyze the muscle nerves. This has resulted in the treatment of children with cerebral palsy, in which leg muscles are excessively rigid, injecting Botox to naturally gait.
  • the FDA has reported that Botox toxin is spreading to other parts of the body in addition to the legs, affecting respiratory muscle function and causing side effects [FDA NEWS RELEASE FOR IMMEDIATE RELEASE April 30, 2009, FDA Patient Safety News: Show # 74, April 2008].
  • FDA-approved Patient Labeling 7/31/09 APPENDIX 1 MEDICATION GUIDE BOTOX, FDA-approved Patient Labeling," said FDA.
  • Patients and doctors need to be careful about breathing slowness or difficulty swallowing after Botox, BOTOX Cosmetic (Boe-tox) (on a botulinum toxin A) for Injection)].
  • botulinum toxin purified by the above-mentioned method has a considerable amount of the toxin spread to other parts of the body, resulting in paralysis of peripheral organs or respiratory muscles, and serious side effects leading to death in severe cases.
  • the present invention has been proposed in order to solve the above problems.
  • An existing botulinum toxin type A preparation purified by chromatography after acid precipitation or acid precipitation is subjected to anion ion exchange resin chromatography using sodium chloride, And one of the subfractions was confirmed to have myofilmic activity, but not in the body.
  • the object of the present invention is to provide a non-proliferative botulinum toxin having a local non-proliferative but locally limited muscular activity and a method for separating the same.
  • the present invention provides a method of purifying a non-proliferating botulinum toxin, comprising the steps of adjusting the purified botulinum toxin type A preparation to a pH of 4.5 to 6.5 and a concentration of sodium chloride (NaCl) of 0.02 to 0.2 M Separating the sub-fractions by performing anion exchange resin chromatography added thereto; And obtaining a non-proliferative botulinum toxin fraction wherein the value of A260 / A280 in the sub-fraction is maintained at a level of 0.4 to 0.6.
  • the non-proliferative botulinum toxin of the present invention is isolated and purified by the above-mentioned method, wherein at least 150 ppb of Zn ion, at least 80 ppb of Fe ion, and at least 140 ppb of Mg ion per 100 U / As shown in FIG.
  • the present invention provides a method for distinguishing a non-proliferative botulinum toxin from a non-proliferative botulinum toxin in an amount of 1.5 to 3 times its half-life lethal dose, And judging whether the respiratory muscle is paralyzed or not.
  • a non-proliferative botulinum toxin having high toxin-to-protein titer for each production batch can be obtained.
  • a large amount of non-multiplying botulinum toxin that does not mix with diffusible toxins can be obtained by controlling anion chromatography conditions.
  • Fig. 1 is a result of ionic resin chromatography showing the result of separating sub-fractions according to Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the change in sub-peak% by the pH change of the buffer.
  • FIG. 3 is a graph showing changes in% peak fraction of each subunit according to the sample sample.
  • FIG. 5 is a photograph showing the in vivo diffusibility of the undifferentiated active fraction (pII) in the sub-fraction isolated according to Example 1 and the existing commercially available product in the right lower limb after administration for 12 hours.
  • FIG. 6 shows the survival rates according to the dose (A) and the post-administration time (B) after administration of the undifferentiated active fraction (pII) in the sub-fraction isolated according to Example 1 and the existing commercial product to the right lower limb of the mouse Graph.
  • FIG. 7 is a graph comparing the onset time of the muscle paralysis effect in the right lower limb of the non-spontaneous active fraction (pII) in the sub-fraction isolated by Example 1 and 1 U of the conventional commercial product.
  • FIG. 8 is a graph comparing the duration of muscle paralytic effect after administration to the right lower limb of the non-spontaneously active fractions (pII) of the sub-fractions separated by Example 1 and 0.5 U of the conventional commercial product.
  • NaCl sodium chloride
  • the method for purifying the non-proliferative botulinum toxin of the present invention is a method of purifying the botulinum toxin obtained by using the existing acid precipitation method or acid precipitation after ion precipitation by using the new anion ion exchange resin chromatography method proposed by the inventors of the present invention To obtain a fraction of the non-proliferating botulinum toxin.
  • the method for purifying the non-spreading botulinum toxin of the present invention comprises the steps of acid precipitation of the botulinum toxin type A formulation from Clostridium botulinum type A culture broth, or separation and purification of the botulinum toxin type A by chromatography after acid precipitation, Use a toxin type A formulation.
  • the buffer used to carry out the anion ion exchange resin chromatography is sodium acetate buffer, and each fraction which is separated by sequentially increasing the sodium chloride concentration added to obtain the sub-fraction is taken.
  • the sodium chloride was not used (concentration 0 M NaCl)
  • the fraction isolated was a diffusible active fraction (peak I, pI) in the body.
  • the concentration of sodium chloride used to obtain the pII is in the range of 0.02 to 0.2 M, and when no sodium chloride is used, or when the concentration of sodium chloride is higher or lower than the above range, pI or pIII fraction It is difficult to obtain a non-proliferative active fraction having a local muscle palsy effect, which is the object of the present invention.
  • the purified botulinum toxin type A preparation reagent is performed in the range of 1/5 to 1 times the volume of the anion ion exchange resin chromatography column used, . That is, when the volume of the column is 1 ml and the amount of the purified botulinum toxin type A pharmaceutical preparation is 0.2 to 1 ml, the fraction of pII obtained is in the range of 20% to 50%.
  • the pII fraction obtained by the method of purifying the non-multiplying botulinum toxin of the present invention was found to be stable such that the half-life lethal dose (total LD50) confirmed by using a mouse was 1 ⁇ 10 5 to 5 ⁇ 10 5 U / ml .
  • the half-life lethal dose (total LD50) confirmed by using a mouse was 1 ⁇ 10 5 to 5 ⁇ 10 5 U / ml .
  • the onset of muscle paralysis was significantly faster and the duration of muscle paralysis was longer than that of the commercial product.
  • the non-proliferating botulinum toxin (pII fraction) obtained by the method of purifying the non-proliferating botulinum toxin of the present invention contains at least 150 ppb Zn ions, at least 80 ppb Fe ions and at least 140 ppb Mg ions per 100 U / ml of toxin do.
  • the method for purifying the non-proliferative botulinum toxin of the present invention is characterized in that the content of Mg, Fe and Zn is significantly higher than that of the botulinum toxin type A purified by the conventional method.
  • the non-proliferative botulinum toxin obtained by the present purification method of the present invention is 1.5 to 3 times the lethal dose of the non-proliferative botulinum toxin obtained by the present invention, and when injected into the right lower limb of the mouse, the right lower limb muscle paralyzes, but does not have paralysis or lethal activity of the respiratory muscle , Thereby determining whether or not the non-spreading botulinum toxin of the present invention is diffused.
  • a commercially available product used in Examples of the present invention is Botox preparation (Lot #: Allergan, Inc.) manufactured by the method disclosed in USP 7,354,740 (Animal product free system and process for purifying botulinum toxin) C2066 C2, C2481 C2) or the botulinum toxin type A preparation purified by a commercially available product or method described in the present invention, but it is not sufficient if it can be used as a purified botulinum toxin type A preparation by other acid precipitation or the like .
  • Fig. 1 [pI, Peak I Fraction); pII, Peak II (in vivo non-active active fraction); pIII, PeakIII (inactive fraction)].
  • the used column is Hitrap DEAE FF 1 ml (GE healthcare, Cat # 17-5055-01), and the buffer used is running buffer (running buffer) running buffer, sodium acetate buffer (pH 5.5), and elution buffer.
  • the peak% of the sub-fraction according to the change in the pH of the buffer used in the anion ion exchange chromatography is shown in FIG. As shown in FIG. 2, when the pH of the buffer is in the range of 4.5 to 5.5, the peak% of pII is increased.
  • the A260 / A280 of the sub-fraction according to the pH of the buffer is shown in the following Table 1, and the half-life lethal dose (Total LD50 (Unit)) is shown in Table 2 below.
  • pH of the buffer may be adjusted to 4.5 to 5.5 in order to obtain a purified, in-vivo unspent active fraction (pII).
  • the half-life lethal dose is 0.8 ⁇ 10 5 to 3.5 ⁇ 10 5 U / ml, which means that the recovery rate of pII is high.
  • the sub-fractions were obtained in the same manner as in Example 1, and the change in the peak characteristics of the sub-fractions (pI, pII and pIII) due to the change in the amount of the sample for this purpose is shown in Fig. 3.
  • the change in A260 / A280 (Total LD50 (Unit)) is shown in Table 4 below.
  • A260 / A280 appears to be 0.4 to 0.6 when the range of the therapeutic agent is in the range of 0.25 to 2 ml, and thus it can be judged to be suitable as the administration sample.
  • the range of the treatment volume is 1/5 to 2 times the column volume.
  • the half-life lethal dose is 0.8 ⁇ 10 5 to 3.5 ⁇ 10 5 U / ml, which indicates that the recovery rate of pII is high.
  • mice used (ICR mouse, female, 4week, 18 ⁇ 22g) were 10 mice per experimental group, and the mouse weights were accurately measured and recorded.
  • the 50 ⁇ l Hamilton syringe was filled with the sub-fraction at a concentration of 1 U / 20 ⁇ l without air to fit the unit, and the needle was injected into the muscle 3 cm from the ankle of the right hind leg of the ICR mouse.
  • the paralysis index and the degree of death were observed according to the paralysis index and the measurement standard shown in the following Table 5, and the results are shown in FIG.
  • Table 5 Score Dimensions 0 The appearance of the foot of a normal rat and gait One The toes are not gathered, but they turn off their legs when they walk. 2 The toes are gathered together with the criteria of 1. 3 The foot node bends inward with the criteria of 2. 4 With the criteria of 3, the foot is fully attached to the leg muscles and the leg is not worn.
  • the non-spontaneous active fractions (pII) of the sub-fractions isolated in Example 1 showed a significant increase in survival rate compared to the dose-dependent active fractions (pI) (A)
  • the survival rate over time at 2U of dose showed an extreme difference of pI 0% versus pII 100% (B).
  • mice used were 10 mice per experimental group, and the mouse weights were accurately measured and recorded.
  • a 50 ⁇ l Hamilton syringe was filled with the pre-purification sample and sub-fraction pII at a concentration of 1 U / 20 ⁇ l, without air to the unit, and injected into the muscle 3 cm from the ankle of the right hind leg of the ICR mouse.
  • the degree of paralysis of the mouse was visually confirmed, and the state of the mouse after 12 hours from the injection was shown in FIG. 5, The results are shown in Fig.
  • the onset time of the muscle paralysis effect is shown in FIG. 7, and the duration of the muscle paralysis effect is shown in FIG.
  • pII is injected intramuscularly but paralyzed, but conventional commercial products have been shown to have spread to the waist and opposite legs and paralyzed.
  • pII showed a significant increase in survival rate as compared with the commercial product (A), and the survival rate over time at a dose of 2 U was significantly higher than the pII of 100% (B).
  • the duration of the muscle palsy effect was longer than that of the commercially available product at a dose of 0.5 U, which was longer than 80 days.
  • the pII fraction was diluted, and the same amount of botulinum toxin (100 U) and ancillary additives were injected and lyophilized, and the activity between commercial product and pII lyophilisate was identical And then analyzed for ion content.
  • the two freeze-dried products were dissolved in distilled water (10 ml), and the ion content was measured using an inductively coupled plasma mass spectrometer. The results are shown in Table 7 below.

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Abstract

본 발명은 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법과 이에 의하여 정제된 비확산형 보툴리눔 독소에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제를 염화나트륨(NaCl)의 농도를 조절하여 첨가한 음이온 크로마토그래피를 수행하여 아분획을 분리하는 단계와 상기 아분획 중 A260/A280의 값이 일정범위인 분획을 수득하는 단계를 포함하여 이루어지는 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법과, 이에 의하여 정제된 것으로 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소에 관한 것이다.

Description

국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소와 그의 정제방법
본 발명은 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법과 그에 의하여 얻어진 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소에 관한 것이다.
미국 식품의약품안전청(FDA)은 주름제거 등 미용치료에 쓰이는 '보톡스'(Botox)가 심한 경우 사망 등 심각한 부작용을 일으킬 수 있다고 경고했다.
"보톡스를 주사한 부위가 아닌 다른 부위에 근육마비 반응이 일어나는 부작용이 보고됐다"며 "보톡스 주사를 맞고 병원에 입원하거나 사망하기도 했다"고 말했다. 심각한 보톡스 부작용이 발생한 환자 대부분은 뇌성마비로 인한 근육경직을 치료하기 위해 다리 근육에 보톡스 주사를 맞은 어린이 환자들이라고 FDA는 밝혔다.
국내에서도 보톡스는 뇌성마비 환자 근육 치료는 물론 경직된 목 근육 치료나 안면 근육 경직으로 인한 통증 치료 및 성대 마비 치료 등에 광범위하게 쓰이고 있다. 미용 치료 분야에서는 주름살 제거·피부 노화 방지 치료 등에 쓰이고 있으며, 최근 노화 방지 의료가 유행을 이루면서 보톡스 사용량은 매년 증가하고 있다.
보톡스를 근육에 주사하면 근육 신경이 마비되는 효과가 있다. 이로 인해 다리 근육이 과도하게 경직된 뇌성마비 어린이에게 보톡스를 주사해 걸음걸이를 자연스럽게 하는 치료가 시행돼 왔다. FDA는 보톡스 독소가 다리 외에 체내의 다른 부위로 퍼져나가면서 호흡 근육기능에 영향을 미쳐 부작용이 발생한 것으로 보고 있다[FDA NEWS RELEASE FOR IMMEDIATE RELEASE April 30, 2009, FDA Patient Safety News: Show #74, April 2008]. FDA는 이와 관련, "보톡스를 맞고 나서 호흡이 느려지거나 삼키기 힘들어지는 증세가 생기는지 환자와 의사들은 주의할 필요가 있다"고 말했다[FDA-approved Patient Labeling 7/31/09 APPENDIX 1: MEDICATION GUIDE BOTOX, BOTOX Cosmetic(Boe-tox)(on a botulinum toxin A) for Injection)].
그러나 FDA는 "주름살 제거 등 미용 목적으로 쓰인 보톡스 주사에서는 아직까지 심각한 부작용 사례가 보고된 바 없다"고 말했다. FDA는 이와 관련해 의사들에게 보톡스 처방을 중단하라는 조치를 취하지는 않았다.
미국의 소비자 단체들은 최근 "1997년부터 2006년까지 FDA에 보고된 보톡스 관련 부작용 사례가 180건이고 그 중 16건의 사망 사례도 있다"며 보톡스 사용시 이상 반응이 생길 수 있다는 경고를 강화하라는 청원을 FDA에 냈었다.
종래의 발명에서는 산침전(USP 7,354,740. Animal product free system and process for purifying a botulinum toxin, Allergan, Inc.), 또는 산침전 후 크로마토그래피를 추가적으로 시행(USP 7,452,697. Chromatographic method and system for purifying a botulinum toxin, Allergan, Inc. 한국특허출원제10-2008-0016800호 클로스트리디움 보툴리눔으로부터 보툴리눔 독소를 정제하는 방법, 메덱스젠; 한국특허출원 제10-2002-0000685호 클로스트리디움 보툴리눔 Ａ형 독소를 정제하는 방법, 메디톡스)하여 보툴리눔 독소를 정제하여 왔다.
그러나, 상기한 방법으로 정제된 보툴리눔 독소는 상당량이 치료부위 이외의 체내로 퍼져 주변 장기나 호흡 근육이 마비되는 증상이 나타나고 있으며, 심각한 경우에는 사망에 이르는 심각한 부작용을 갖는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 제안되는 것으로, 산침전 또는 산침전 후 크로마토크래피에 의하여 정제된 기존의 보툴리눔 독소 A형 제제를 염화나트륨을 사용하여 음이온 이온교환수지 크로마토그래피하여 3개의 이질적인 아분획이 존재함을 확인하고, 그 중 하나의 아분획이 근마비 활성을 가지면서도 체내 비확산형임을 확인하였다.
즉, 본 발명은 체내 비확산형이면서 국소제한적으로 근마비 활성을 가지는 비확산형 보툴리눔 독소와 이를 분리하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법은, 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제를 pH는 4.5 내지 6.5 범위, 염화나트륨(NaCl)의 농도를 0.02 내지 0.2M로 조절하여 첨가한 음이온 이온교환수지 크로마토그래피를 수행하여 아분획을 분리하는 단계; 및 상기 아분획 중 A260/A280의 값이 0.4 내지 0.6 수준을 유지하는 비확산성 보툴리눔 독소 분획을 수득하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소는, 상기한 방법에 의하여 분리 정제된 것으로, 독소 100U/ml당 Zn 이온이 적어도 150ppb, Fe 이온이 적어도 80ppb, Mg 이온이 적어도 140ppb로 포함되는 것을 특징으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소를 판별하는 방법은, 상기 비확산형 보툴리눔 독소를 그의 반수치사량의 1.5 내지 3배의 양으로 마우스 우하지에 주사하고, 우하지 근육과 호흡근의 마비 여부와 치사여부를 판단하는 것을 특징으로 한다.
상기한 본 발명에 의하면, 목적하는 부분에 근마비효과가 발생되고 그 외의 부분에는 독소가 확산되지 않으면서, 근마비 효과가 빠르고 지속적으로 발생하는 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소를 얻을 수 있다.
또한 본 발명에 의하면, 기존과 달리 각 생산 배치별 단백질 대비 독소 역가가 높은 비확산형 보툴리눔 독소를 얻을 수 있다.
또한 본 발명에 의하면, 음이온 크로마토그래피 조건을 조절하여 확산성 독소와 혼합되지 않는 비확산형 보툴리눔 독소를 다량으로 얻을 수 있다.
도 1은 실시예 1에 의하여 아분획을 분리한 결과를 나타낸 이온수지 크로마토그래피 결과이다.
도 2는 버퍼의 pH 변화에 의한 아분획 피크%의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 시료 시료양에 따른 각 아분획 피크%의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 1에 의하여 분리된 아분획 중 활성분획(pI 및 pII)의 투여량(A) 및 투여 후 시간 변화(B)에 따른 생존율을 나타낸 것이다[Mouse: ICR, female, 4week, 18~22g n=10, IM injection into right hind leg].
도 5는 실시예 1에 의하여 분리된 아분획 중 체내 비확산형 활성분획(pII)과 기존 시판제품을 마우스의 우하지에 투여 후 12 시간의 체내 확산성을 비교한 사진이다.
도 6은 실시예 1에 의하여 분리된 아분획 중 체내 비확산형 활성분획(pII)과 기존 시판제품을 마우스의 우하지에 투여 후 투여량(A) 및 투여 후 시간(B)에 따른 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 1에 의하여 분리된 아분획 중 체내 비확산형 활성분획(pII)과 기존 시판제품 1U씩 마우스의 우하지에 투여 후 근마비 효과 개시 시간을 비교한 그래프이다.
도 8은 실시예 1에 의하여 분리된 아분획 중 체내 비확산형 활성분획(pII)과 기존 시판제품 0.5U씩 마우스의 우하지에 투여 후 근마비효과 지속시간을 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법을 단계별로 구체적으로 설명한다.
본 발명은, 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제를 염화나트륨(NaCl)의 농도를 조절하여 첨가한 음이온 크로마토그래피를 수행하여 아분획을 분리하는 단계와 상기 아분획 중 A260/A280의 값이 0.4 내지 0.6 수준을 유지하는 비확산성 보툴리눔 독소 분획을 수득하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법은 기존의 산침전법이나 산침전 후 이온수지 크로마토그래피를 이용하여 얻어진 보툴리눔 독소를 다시 본 발명의 발명자에 의하여 제안된 새로운 음이온 이온교환수지 크로마토그래피법을 적용하여 비확산형 보툴리눔 독소의 분획을 획득하는 방법이다.
따라서, 본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법에는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) A 형 균주 배양액으로부터 보툴리눔 독소 A 형 제제를 산침전시키거나, 산침전 후 크로마토그래피에 의하여 분리하고 정제하여 얻어진 보툴리눔 독소 A 형 제제를 사용한다.
상기한 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제를 염화나트륨을 사용하여 음이온 이온교환수지 크로마토그래피를 수행할 경우, 이온교환 수지로부터 3개의 아분획을 얻을 수 있다. 상기 음이온 이온교환수지 크로마토그래피를 수행하기 위하여 사용되는 완충액은 아세트산나트륨(sodium acetate) 완충액이며, 여기에 아분획을 얻기 위해 첨가되는 염화나트륨 농도를 순차적으로 높여 분리되는 각 분획을 취한다. 염화나트륨을 사용하지 않을 경우(농도 0M NaCl)에 분리되는 분획은 체내 확산형 활성분획(peak I, pI)임이 확인되었고, 염화나트륨의 농도를 0.02 내지 0.2 M로 한 경우에 분리되는 분획은 체내 비확산형 활성분획(peak II, PII) 임이 확인되었으며, 염화나트륨의 농도를 1 M으로 한 경우에 분리되는 분획은 체내 확산형 비활성분획(peak III, pIII)임이 확인되었다.
즉, 상기한 pII를 얻기 위하여 사용되는 염화나트륨의 농도는 0.02 내지 0.2M 범위이며, 염화나트륨을 사용하지 않거나, 염화나트륨의 농도가 상기 범위보다 높거나 낮을 경우에는 수득되는 아분획에 pI 또는 pIII 분획이 혼합될 수 있으므로 본 발명에서 목적하는 국소적 근마비 효과를 가지는 비확산형 활성분획을 얻기 곤란하다.
한편, 상기와 같이 염화나트륨을 사용한 음이온 이온교환수지 크로마토그래피의 경우 완충액의 pH가 4.5 내지 5.5 범위에서 수행될 경우, 분리되는 아분획 중 pI 또는 pIII 분획의 혼합 정도가 적어지고 pII 분획의 순도가 높아진다. 이는 A260/A280을 비교하거나 마우스 우하지근육주사시 마비부위 정도로 확인할 수 있다.
또한, 상기와 같이 염화나트륨을 사용한 음이온 이온교환수지 크로마토그래피의 경우 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제 시료양이 사용되는 음이온 이온교환수지 크로마토그래피 칼럼 부피 대비 1/5 내지 1배 범위에서 수행될 경우 pII의 분획량이 커진다. 즉, 칼럼의 부피가 1ml이고 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제 시료양이 0.2 내지 1 ml일 경우 얻어지는 pII의 분획량은 20% 내지 50% 범위로 나타낸다.
한편, 상기한 본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법에 의하여 얻어진 pII 분획은 마우스를 사용하여 확인한 반수치사량(total LD50)이 1 X 105 내지 5 X 105 U/ml로 나타나는 등 안정한 것으로 확인되었다. 또한, 처치 대상에 투여시 목적 부위 외로 확산되는 현상이 없고, 시판제품과 비교할 경우 근마비 효과 개시가 유의적으로 빠르며, 근마비 지속시간이 길다는 것을 확인할 수 있다.
또한, 상기한 본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법에 의하여 얻어진 비확산형 보툴리눔 독소(pII 분획)는 독소 100U/ml당 Zn 이온이 적어도 150ppb, Fe 이온이 적어도 80ppb, Mg 이온이 적어도 140ppb로 포함된다. 본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법은 기존 방법에 의하여 정제된 보툴리눔 독소 A 형보다 Mg, Fe 및 Zn의 함량이 유의적으로 높게 나타나는 특징이 있음을 확인하었다.
이러한 본 발명의 정제방법에 의하여 얻어진 비확산형 보툴리눔 독소는 그의 반수치사량의 1.5 내지 3 배의 양으로 마우스의 우하지에 주사 시 우하지 근육은 마비되는 반면, 호흡근의 마비나 치사활성을 없는 것으로 확인되었고, 이로써 본 발명의 비확산형 보툴리눔 독소의 확산 여부를 판별할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예 및 도면 등에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예 및 도면 등에 의하여 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 실시예 등에서 사용된 시판제품은 USP 7,354,740[Animal product free system and process for purifying a botulinum toxin]에 개시된 방법에 의하여 제조된 알러간 사(Allergan, Inc)의 보톡스 제제(Lot#: C2066 C2, C2481 C2)이나, 본 발명이 이에 제시된 시판제품이나 방법에 의하여 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제에만 적용되는 것은 아니며, 그 외 산침전 등에 의하여 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제로서 사용 가능한 것이면 충분히 적용될 수 있을 것이다.
실시예 1. 음이온 이온수지 크로마토그래피 분리 분획
보툴리눔 독소 배양액을 기존의 산침전법으로 정제한 정제물을 시료로 하여 음이온 크로마토그래피를 실시하여 3개의 아분획을 분리하였으며, 분리 결과는 도 1 에 나타내었다[pI, Peak I(체내 확산형 활성분획); pII, Peak II(체내 비확산형 활성분획); pIII, PeakIII(비활성 분획)].
음이온 이온교환 크로마토그래피 시 사용기기는 AKTA FPLC(GE Healthcare)이고, 사용 칼럼(column)은 Hitrap DEAE FF 1ml(GE healthcare, Cat# 17-5055-01)이며, 사용 완충액(buffer)는 러닝 완충액(running buffer)로서 아세트산나트륨 완충액(Sodium Acetate buffer)(pH 5.5), 일루션 완충액(elution buffer)이었다.
아세트산나트륨에 1M 염화나트륨(pH 5.5), 일루션(Elution) 조건 0M NaCl로 unbound wash(pI, 체내 확산형 활성분획)한 후, 0.05M NaCl(pII, 체내 비확산형 활성분획)을 이용하여 피크(peak)를 분리하고, 1M NaCl로 일루션(elution)(pIII, 비활성 분획), 유속(Flow rate) 1 ml/min, 시료 전처리로서 산침전 후 탈염(desalting)하여 사용하였다.
실시예 2. 버퍼(Buffer) pH 변화에 의한 피크(Peak) 변화 및 특성
상기 음이온 이온교환 크로마토그래피 시 사용한 버퍼의 pH의 변화에 따른 아분획의 피크 %는 도 2 에 나타내었다. 도 2 에 도시한 바와 같이, 버퍼의 pH가 4.5 내지 5.5 범위인 경우 pII의 피크%가 커짐을 확인할 수 있다. 버퍼의 pH에 따른 아분획의 A260/A280 는 다음 표 1에 나타내었으며, 반수치사량(Total LD50(Unit))을 다음 표 2 에 나타내었다.
표 1
A260/A280
pH 4.5 pH 5.0 pH 5.5 pH 6.0
pI 0.76± 0.15 0.69± 0.09 0.67± 0.05 0.63± 0.08
pII 0.50± 0.05 0.55± 0.04 0.55± 0.03 0.81± 0.19
pIII 0.76± 0.10 0.82± 0.13 0.84± 0.12 0.79± 0.09
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 버퍼의 pH가 4.5 내지 5.5 범위인 경우 A260/A280가 0.45 내지 0.6으로 나타나서 투여 시료로 적합한 것으로 판단할 수 있다.
따라서, 정제된 체내 비확산형 활성분획(pII)을 얻기 위해서는 버퍼의 pH를 4.5 내지 5.5 로 조절하는 것이 바람직할 것이다.
표 2
Total LD50(Unit)
pH 4.5 pH 5.0 pH 5.5 pH 6.0
기존 산침전법 정제물(전시료) 5± 0.8 5± 1 5± 0.8 5± 1.2
pI 1.5± 0.4 3± 0.5 2± 0.4 2± 0.8
pII 0.2± 0.2 1± 0.2 3± 0.4 0.4± 0.2
pIII - 0.2± 0.1 0.2± 0.1 2± 1
(단위: 105 U)
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 버퍼의 pH가 5.0 내지 5.5 범위인 경우 반수치사량이 0.8 X 105 내지 3.5 X 105 U/ml으로 나타나서 pII의 회수율이 높은 것으로 판단할 수 있다.
따라서, 안정한 체내 비확산형 활성분획(pII)을 얻기 위해서는 버퍼의 pH를 5.0 내지 5.5 로 조절하는 것이 바람직할 것이다.
실시예 3. 시료양(sample loading) 변화에 의한 피크 변화 및 특성
실시예 1과 동일한 방법으로 아분획을 얻되, 이를 위한 시료의 양 변화에 의한 각 아분획(pI, pII 및 pIII)의 피크 특성 변화를 도 3 에 나타내었고, 각 아분획별 A260/A280의 변화를 다음 표 3에 나타내었으며, 반수치사량(Total LD50 (Unit))을 다음 표 4 에 나타내었다.
표 3
A260/A280
0.25 ml 0.5ml 1ml 2ml
pI 0.67± 0.08 0.64± 0.07 0.68± 0.09 0.67± 0.13
pII 0.55± 0.02 0.56± 0.01 0.55± 0.04 0.55± 0.03
pIII 0.85± 0.14 0.84± 0.09 0.82± 0.18 0.84± 0.24
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 시료양이 0.25 내지 2ml 범위인 경우 A260/A280가 0.4 내지 0.6으로 나타나서 투여 시료로 적합한 것으로 판단할 수 있다.
따라서, 체내 비확산형 활성분획(pII)을 다량으로 얻기 위해서는 시료양을 컬럼 부피 대비 1/5 내지 2배 범위로 조절하는 것이 바람직할 것이다.
표 4
Total LD50(Unit)
0.25 ml 0.5 ml 1 ml 2 ml
기존 산침전법 정제물(전시료) 2.5± 0.5 5± 1 10± 4 20± 5
pI 0.8± 0.2 1.6± 0.4 5± 2 15± 4.8
pII 1.6± 0.2 4± 0.6 4± 0.9 4± 1.5
pIII 0.2± 0.1 0.4± 0.1 0.8± 0.2 0.6± 0.3
(단위: 105 U)
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 시료양이 0.25 내지 1 ml 범위인 경우 반수치사량이 0.8 X 105 내지 3.5 X 105 U/ml 으로 나타나서 pII의 회수율이 높은 것으로 판단할 수 있다.
따라서, 안정한 체내 비확산형 활성분획(pII)을 얻기 위해서는 시료양을 컬럼 부피 대비 1/5 내지 1배 범위로 조절하는 것이 바람직할 것이다.
실험예 1. 근마비 효과 비교 시험 방법
1) 우하지근육주사 방법
상기 실시예 1에 의하여 분리된 아분획의 근마비 효과를 확인하기 위하여 마우스를 사용하여 우하지근육 주사법을 수행하였다.
사용한 마우스(ICR mouse, female, 4week, 18~22g)는 실험군당 10 마리이며, 마우스의 무게를 정확히 측정하고 기록하였다. 50 ㎕ 해밀턴 주사기에 상기 아분획을 1U/20 ㎕ 농도로 단위에 맞게 공기 없이 채운 다음 ICR 마우스의 오른쪽 뒷다리 발목부위에서 바늘을 3cm가량 집어넣어 근육내에 주사하였다. 근육내 주사 후 시간대별로 다음 표 5에 제시된 마비지수 및 측정기준에 준하여 마비지수 및 사망유무를 관찰하여 그 결과를 도 4 에 나타내었다.
표 5
Score 측정 기준
0 정상 쥐의 발 모양새와 걸음걸이
1 발가락은 모아지지 않았으나 걸을 때 다리를 끈다.
2 1의 기준과 함께 발가락이 모아져 있다.
3 2의 기준과 함께 발마디가 안쪽으로 굽어있다.
4 3의 기준과 함께 발이 다리근육쪽으로 완전히 붙어있으며 다리를 못 쓴다.
표 6
분획 마우스 우하지주사시 마비부위
체내 확산형 활성 분획 우하지, 횡경막, 좌하지 등 체내 여러 부위
체내 비확산형 활성 분획 우하지
체내 확산형 비활성 분획 -
도 4 에 도시된 바와 같이, 상기 실시예 1에서 분리된 아분획 중 체내 비확산형 활성분획(pII)은 확산형 활성분획(pI)에 비하여 투여용량 대비 유의한 생존률 증가를 보였고(A), 투여용량 2U에서 시간 경과에 따른 생존율은 pII 100% 대비 pI 0%의 극단적인 차이를 나타냄(B)을 확인할 수 있다.
실험예 2. 시판제품과 체내 비확산형 활성분획(pII)간의 체내 확산성 비교
시판제품(알러간사 보톡스(Lot#: C2066 C2, C2481 C2))과 상기 실시예 1에 의하여 분리된 아분획 pII의 근마비 효과를 확인하기 위하여 마우스를 사용하여 우하지근육 주사법을 수행하였다.
사용한 마우스(ICR mouse, female, 4week, 18~22g)는 실험군당 10 마리이며, 마우스의 무게를 정확히 측정하고 기록하였다. 50 ㎕ 해밀턴 주사기에 정제 전 시료와 아분획 pII 을 1U/20 ㎕ 농도로 단위에 맞게 공기 없이 채운 다음 ICR 마우스의 오른쪽 뒷다리 발목부위에서 바늘을 3cm가량 집어넣어 근육내에 주사하였다. 근육내 주사 후 체내 확산성을 관찰하기 위하여, 마우스의 마비정도를 육안으로 확인하고, 주사 후 12 시간이 경과된 마우스의 상태를 사진을 도 5에 나타내었으며, 투여시간 및 투여량에 따른 사망 유무를 관찰한 결과를 도 6에 나타내었다. 또한, 근마비 효과 개시 시간은 도 7에 나타내었고, 근마비 효과 지속시간을 도 8에 나타내었다.
도 5에 도시된 바와 같이, pII는 근육내 주사한 우하지만 마비되나, 기존 시판제품은 허리 및 반대쪽 다리까지 확산되어서 마비되었음을 보여준다.
도 6에 도시된 바와 같이, pII는 시판제품에 비하여 투여용량 대비 유의한 생존률 증가를 보였고(A), 투여용량 2U에서 시간 경과에 따른 생존율은 pII 100% 대비 기존 기술제조품 0%의 극단적인 차이를 나타냄을 확인할 수 있다(B).
도 7에 도시된 바와 같이, pII는 시판제품에 비하여 투여용량 1U에서 근마비효과 개시가 유의적으로 빠르게 나타남을 확인할 수 있다.
도 8에 도시된 바와 같이, pII는 시판제품에 비하여 투여용량 0.5U에서 근마비효과가 지속기간이 80일 이상 길었다.
실험예 3. 보툴리눔 독소 동결건조물의 이온함량 분석
시판제품(알러간사 보톡스(Lot#: C2066 C2, C2481 C2))과 상기 실시예 1 에 의하여 분리된 아분획 pII의 동결건조물간의 이온함량에 대한 분석을 수행하였다.
시판제품과 비교하기 위하여 pII 분획을 희석하여 같은 양의 보툴리눔 독소(100U)와 부수 첨가물을 병입하여 동결건조를 수행하였으며 마우스 반수치사 시험법을 이용하여 시판제품과 pII 동결건조물간의 활성이 동일함을 확인한 후 이온함량 분석을 진행하였다. 두 동결건조물을 증류수 10ml을 이용하여 녹인 후 유도결합 플라즈마 질량분석기를 이용하여 이온함량을 측정하였으며, 그 결과를 다음 표 7에 나타내었다.
표 7
Mg Fe Zn
pII 183.0 ± 19.3* 105.4 ± 22.1** 332.6 ± 140.8***
시판제품 78.1 ± 7.4* 39.6 ± 3.3 65.6 ± 25.9
* p<0.0015, ** p<0.011, ***p<0.045
상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 의하여 정제된 비확산형 보툴리눔 독소(pII분획)의 동결건조물이 시판제품에 비하여 Mg, Fe, Zn이온의 함량이 유의적으로 높음을 확인할 수 있었다.
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.
본 발명에 의하면, 목적하는 부분에 근마비 효과가 발생되고 그 외의 부분에는 독소가 확산되지 않으면서, 근마비 효과가 빠르고 지속적으로 발생하는 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소를 다량으로 얻을 수 있다.

Claims (3)

  1. 정제된 보툴리눔 독소 A 형 제제를 pH는 4.5 내지 6.5 범위, 염화나트륨(NaCl)의 농도를 0.02 내지 0.2M로 조절하여 첨가한 음이온 이온교환수지 크로마토그래피를 수행하여 아분획을 분리하는 단계; 및
    상기 아분획 중 A260/A280의 값이 0.4 내지 0.6 수준을 유지하는 비확산성 보툴리눔 독소 분획을 수득하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 비확산형 보툴리눔 독소의 정제방법.
  2. 청구항 1에 의하여 분리 정제된 것으로,
    독소 100U/ml당 Zn 이온이 적어도 150ppb, Fe 이온이 적어도 80ppb, Mg 이온이 적어도 140ppb로 포함되는 것을 특징으로 하는 비확산형 보툴리눔 독소.
  3. 청구항 2의 비확산형 보툴리눔 독소를 그의 반수치사량의 1.5 내지 3배의 양으로 마우스 우하지에 주사하고, 우하지 근육과 호흡근의 마비 여부와 치사여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 비확산형 보툴리눔 독소를 판별하는 방법.
PCT/KR2011/003547 2010-05-31 2011-05-13 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소와 그의 정제방법 WO2011152618A2 (ko)

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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101134146B1 (ko) 2010-05-31 2012-04-19 메덱스젠 주식회사 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소와 그의 정제방법
KR101775682B1 (ko) * 2015-11-30 2017-09-06 주식회사 대웅 보툴리눔 독소의 제조방법

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE303567B (ko) * 1959-02-17 1968-09-02 Behringwerke Ag
US3409605A (en) * 1965-06-15 1968-11-05 American Cyanamid Co Concentration and purification of growth factor-placental origin (human)
WO1996005222A1 (en) * 1994-08-08 1996-02-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Purification and pharmaceutical compositions containing type g botulinum neurotoxin
US5939070A (en) * 1996-10-28 1999-08-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Hybrid botulinal neurotoxins
AU2340299A (en) * 1998-01-26 1999-08-09 University Of Massachusetts Biologically active hemagglutinin from type a (clostridium botulinum) and methods of use
DE19925739A1 (de) * 1999-06-07 2000-12-21 Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh Therapeutikum mit einem Botulinum-Neurotoxin
GB9921592D0 (en) * 1999-09-13 1999-11-17 Microbiological Res Authority Preparation of highly pure toxin fragments
US20030118598A1 (en) 2000-02-08 2003-06-26 Allergan, Inc. Clostridial toxin pharmaceutical compositions
US6670322B2 (en) * 2000-06-01 2003-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of targeting pharmaceuticals to motor neurons
KR100455280B1 (ko) 2000-06-28 2004-11-08 삼성코닝 주식회사 인듐 틴 옥사이드(ｉｔｏ)의 제조방법
DE10035156A1 (de) * 2000-07-19 2002-02-07 Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh Proteinkomplex als Vehikel für oral verfügbare Protein-Arzneimittel
JP2003009897A (ja) * 2001-07-03 2003-01-14 Keiji Oguma ボツリヌス毒素の分離・精製法
KR20030060150A (ko) * 2002-01-07 2003-07-16 (주)메디톡스 클로스트리디움 보툴리눔 ａ형 독소를 정제하는 방법
AU2003221050A1 (en) * 2002-03-29 2003-10-13 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Remedy for hypermyotonia
US6673598B1 (en) * 2002-10-29 2004-01-06 Synthecon, Inc. Disposable culture bag
US7160699B2 (en) * 2003-09-25 2007-01-09 Allergan, Inc. Media for clostridium bacterium and processes for obtaining a clostridial toxin
US7452697B2 (en) * 2003-09-25 2008-11-18 Allergan, Inc. Chromatographic method and system for purifying a botulinum toxin
US7148041B2 (en) * 2003-09-25 2006-12-12 Allergan, Inc. Animal product free media and processes for obtaining a botulinum toxin
KR20050074806A (ko) * 2004-01-14 2005-07-19 팜텍(주) 결정형 보툴리늄 독소의 제조방법
US7514088B2 (en) * 2005-03-15 2009-04-07 Allergan, Inc. Multivalent Clostridial toxin derivatives and methods of their use
US7064639B2 (en) * 2004-07-30 2006-06-20 Delta Systems, Inc. Electromagnetic latching switch
BRPI0508374A (pt) 2005-03-03 2007-07-31 Allergan Inc meios para bactéria clostrìdio e processo para obtenção de uma toxina clostrìdica
US7465457B2 (en) * 2005-04-14 2008-12-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for preparing botulinum neurotoxin type A light chain
JP4920583B2 (ja) 2005-06-03 2012-04-18 ライオン株式会社 脂肪酸低級アルキルエステルおよび軽油代替燃料
JP4979690B2 (ja) * 2006-04-28 2012-07-18 一般財団法人化学及血清療法研究所 神経毒素の定量方法
AR061669A1 (es) * 2006-06-29 2008-09-10 Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa Aplicacion de alta frecuencia de terapia con toxina botulinica
PT2085093E (pt) * 2006-10-27 2015-06-26 Chemo Sero Therapeut Res Inst Preparação que contém uma toxina botulínica tipo a altamente purificada derivada de um agente patogénico do botulismo infantil
CN101204577A (zh) * 2006-12-21 2008-06-25 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种a型肉毒毒素结晶复合物的制备方法
KR101025617B1 (ko) 2008-02-25 2011-03-30 메덱스젠 주식회사 클로스트리디움 보툴리눔으로부터 보툴리눔 독소를정제하는 방법
KR20090120222A (ko) * 2008-05-19 2009-11-24 (주)메디톡스 식물 유래 성분 함유 배지 및 가요성 폐쇄 용기를 이용하여클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법
KR102005930B1 (ko) * 2008-12-31 2019-07-31 레반스 테라퓨틱스, 아이엔씨. 주사용 보툴리눔 독소 제제
US8440204B2 (en) * 2009-04-30 2013-05-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Subtype of Closteridium botulinum neurotoxin type A and uses thereof
US8129139B2 (en) * 2009-07-13 2012-03-06 Allergan, Inc. Process for obtaining botulinum neurotoxin
PT2490986T (pt) * 2009-10-21 2018-11-13 Revance Therapeutics Inc Métodos e sistemas para purificar neurotoxina botulínica não complexada
EP2512519A2 (en) * 2009-12-18 2012-10-24 Allergan, Inc. Clostridium botulinum carrier complex for the administration of therapeutic agents
US8546108B2 (en) * 2010-01-25 2013-10-01 Allergan, Inc. Methods of intracellular conversion of single-chain proteins into their di-chain form
KR101134146B1 (ko) 2010-05-31 2012-04-19 메덱스젠 주식회사 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소와 그의 정제방법
JP6061853B2 (ja) * 2010-07-30 2017-01-18 メディミューン，エルエルシー 活性ポリペプチドまたは免疫複合体の精製方法

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Guida et al. ORCID ID 0000-0003-1027-7049. Genetic Polymorphism in Porphyria: Resolution of A Case of Tetraplegia by Administration of Hemin During a Porphyric Crisis and Subsequent Therapeutic Procedure with the use of Givosiran
Batbayar et al. DETERMINATION OF SOME ORGANIC ACIDS IN “BARAGSHUN EN” PREPARATION

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