CN1946431A - 用于肉毒毒素的局部施用和透皮递送的组合物和方法 - Google Patents

用于肉毒毒素的局部施用和透皮递送的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

用于肉毒毒素(包括肉毒毒素的衍生物)的局部递送的组合物，其包含肉毒毒素和载体，所述载体包含聚合物主链，所述主链包含具有附着的带正电荷的分枝或“效能”基团的长链多肽或非肽基聚合物。本发明也涉及这样的方法，该方法通过将有效量的肉毒毒素和载体一起给受试者的皮肤或上皮局部施用，减少肌肉麻痹和可用肉毒毒素治疗的病症，特别是皮下肌肉的麻痹，和最特别地是脸部肌肉的麻痹。也描述了用于施用的试剂盒。

Description

用于肉毒毒素的局部施用和透皮递送的组合物和方法
本申请要求2004年3月3日提交的美国临时专利申请号60/550,015的优先权。以美国临时专利申请号60/550,015的全文在此引用作为参考。
                     发明背景
皮肤保护身体的器官免受外界环境的威胁并充当恒温器以维持身体的温度。其由几个不同的层构成，各层具有特化的功能。主要的层包括表皮、真皮和皮下组织。表皮是覆在真皮上面的上皮细胞的层化层，真皮由结缔组织构成。表皮和真皮都进一步由皮下组织(内层脂肪组织)支持。
表皮，皮肤的最上层，只有0.1至1.5毫米厚(Inlander，Skin，New York，NY：People′s Medical Society，1-7(1998))。其由角质形成细胞构成并且基于其分化的状态分为几层。表皮可进一步分为角质层和由粒状melphigian以及基底细胞组成的活表皮层。角质层是吸湿的并且按重量计算需要至少10％的水分以维持其弹性和柔软性。吸湿性部分归因于角蛋白的保持水分的能力。角质层失去其柔软性和弹性时，其变得粗糙易碎，导致干性肤质。
正好位于表皮下面的真皮为1.5至4毫米厚。其是皮肤的三层中最厚的一层。此外，真皮也包含大多数皮肤的结构，包括汗腺和脂腺(其通过在皮肤中称为毛孔或粉刺的开口分泌物质)、毛囊、神经末梢和血管及淋巴管(Inlander，Skin，New York，NY：People′sMedical Society，1-7(1998))。然而，真皮的主要成分是胶原和弹性蛋白。
皮下组织是皮肤的最深层。其充当保持体温的绝热器和保护器官的减震器(Inlander，Skin，New York，NY：People′s Medical Society，1-7(1998))。另外，皮下组织也贮存作为能源蕴藏的脂肪。皮肤的pH一般在5和6之间。该酸性是由于存在来自皮脂腺分泌物的两性氨基酸、乳酸和脂肪酸造成的。术语“酸性保护膜”是指皮肤的大多数区域上存在可溶于水的物质。皮肤的缓冲能力部分归因于贮藏在皮肤角质层中的这些分泌物。
皱纹，老化体征中的一个体征，可以是由生物化学、组织学和生理学变化造成的，所述变化是由环境破坏积累的(Benedetto，International Journal of Dermatology，38：641-655(1999))。此外，存在可导致面部皱纹的特征性折痕、折皱和摺痕的其他次要因素(Stegman等人，The Skin of the Aging Face CosmeticDermatologcal Surgery，第2版，St.Louis，MO：Mosby Year Book：5-15(1990))。这些次要因素包括重力的恒定拉力、对皮肤的经常性和恒定性定位压力(即，在睡眠期间)，和由面部肌肉的收缩产生的反复的面部活动(Stegman等人，The Skin of the Aging FaceCosmetic Dermatological Surgery，第2版，St.Louis，MO：MosbyYear Book：5-15(1990))。为了潜在地减缓一些老化的体征，使用了不同的技术。这些技术从含有α羟酸和维生素A的面部保湿液到手术方法和神经毒素的注射。
皮肤的一个基本功能是为潜在地对正常内稳态有害的水分和物质的运输提供屏障。没有坚韧的、半透性的皮肤，身体将很快脱水。皮肤帮助防止有害物质进入身体。尽管大多数物质不能渗透过屏障，但已发展了许多策略来选择性地增加皮肤的透性并获得不同程度的成功。
肉毒毒素(Botulinum toxin)(也称作肉毒杆菌毒素或肉毒神经毒素)是由革兰氏阳性细菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生的神经毒素。其通过阻止突触传递或乙酰胆碱通过神经肌肉接头的释放来使肌肉产生麻痹，其也被认为以其他的方式发挥作用。其作用基本上阻断了通常导致肌肉痉挛或收缩的信号，从而产生麻痹。
肉毒毒素被分为八种血清学上相关但不同的神经毒素。其中，七种可导致麻痹，即A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒神经毒素。通过和类型特异性抗体的中和作用来区分这些亚型中的每一亚型。然而，对于所有这七种活性肉毒毒素，肉毒毒素蛋白分子的分子量大约为150kD。因为通过细菌释放，所以肉毒毒素是包含和非毒素蛋白结合在一起的150kD肉毒毒素蛋白分子的复合物。梭菌可产生900kD、500kD和300kD形式的A型肉毒毒素复合物。B型和C型肉毒毒素只有700kD或500kD表观的复合物产生。D型肉毒毒素可以300kD和500kD的复合物形式产生。E型和F型肉毒毒素只以大约300kD复合物的形式产生。据认为复合物(即，分子量大于大约150kD)含有非毒素血凝素蛋白以及非毒素和非毒性非血凝素蛋白。这两种非毒素蛋白(其和肉毒毒素分子一起包含相关的神经毒素复合物)可用于为肉毒毒素分子提供抗变性的稳定性，以及当毒素被摄入时提供抗消化酸的保护作用。此外，更大的(大于大约150kD分子量)的肉毒毒素复合物可能导致肉毒毒素从肉毒毒素复合物的肌内注射位点扩散的速度变慢。
肉毒毒素的不同血清型在其作用的动物种类和在其引起的麻痹严重度和持续时间上是不同的。例如，如以在大鼠中产生的麻痹率估量，已确定A型肉毒毒素比B型肉毒毒素强500倍。此外，已确定B型肉毒毒素在480u/kg的剂量(大约是灵长类动物对于A型的LD50的12倍)下在灵长类动物中是无毒的。由于肉毒毒素的分子大小和分子结构的原因，其不能穿过角质层和多层底层皮肤结构。
肉毒中毒，由于系统性肉毒毒素暴露而产生的特征综合症状，自古以来就在欧洲存在。在1895年，Emile P.van Ermengem第一次从腌生猪肉中分离出厌氧性产孢子杆菌，该腌生猪肉获自在比利时死于肉毒中毒的死猪的死后的组织。Van Ermengem发现所述疾病是由他称为肉毒芽孢杆菌(Bacillus botulinus)产生的细胞外毒素引起的(Van Ermengem，Z Hyyg Infektionskr，26：1-56；Rev Infect(1897))。1922年该名称改为肉毒梭菌。名称梭菌用于反映该微生物的无氧特性，也反映其形态学特征(Carruthers和Carruthers，CanJ Ophthalmol，31：389-400(1996))。在1920年代，在其他食物中毒暴发后分离了A型肉毒杆菌毒素的粗提物形式。University ofCalifornia，San Francisco的Dr.Herman Sommer进行了第一次纯化神经毒素的尝试(Borodic等，Ophthalmic Plast Recostr Surg，7：54-60(1991))。1946年，Dr.Edward J.Schantz和其同事分离了以晶体形式存在的神经毒素(Schantz等人，In：Jankovi J，HalletM(Eds)Therapy with Botulinum Toxin，New York，NY：MarcelDekker，41-49(1994))。到了1949年，Burgen和其同事能够证明肉毒毒素阻断通过神经肌肉接点的冲动(Burgen等人，J Physiol，109：10-24(1949))。Allan B.Scott在1973第一次在猴子中使用肉毒毒素A(BTX-A)。Scott证实持续3个月的可逆的眼肌麻痹(Lamanna，Science，130：763-772(1959))。此后很快地，报导了BTX-A成功地在人中治疗了斜视、眼睑痉挛、和痉挛性斜颈(Baron等人，In：Baron EJ，Peterson LR，Finegold SM(Eds)，Bailey & ScottsDiagnostic Microbiology，St.Louis，MO：Mosby Year Book，504-523(1994)；Carruthers和Carruthers，Adv Dermatol，12：325-348(1997)；Markowitz，In：Strickland GT(Eds)HuntersTropical Medicine，第7版，Philadelphia：W.B.Saunders，441-444(1991))。在1986年，Jean和Alastair Carruthers，由眼外科医生和皮肤科医生组成的夫妻团队，开始发展肉毒毒素-A(BTX-A)的化妆品用途，用于眉间区域中和运动相关的皱纹的治疗(Schantz和Scott，In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum，NewYork：Academic Press，143-150(1981))。Carruthers使用BTX-A治疗皱纹在1992年导致其的关于该方法的开创性出版物问世(Schantz和Scott，In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects ofBotulinum，New York：Academic Press，143-150(1981))。到了1994年，相同的组报导了关于治疗脸上的其他运动相关的皱纹的经验(Scott，Ophthalmol，87：1044-1049(1980))。这反过来导致化妆用的BTX-A治疗法的问世。
A型肉毒毒素据认为是人们已知的致死性最强的天然的生物学试剂。在土壤中可发现肉毒梭菌的孢子，其可在未恰当灭菌的和封闭的食物容器中生长。细菌的摄入可导致肉毒中毒，其可以是致命的。但同时，肉毒毒素的肌肉麻痹性作用已被用于治疗作用。肉毒毒素的受控施用已用于提供肌肉麻痹来治疗病症，例如，特征在于过度兴奋的骨骼肌的神经肌肉病症。已用肉毒毒素治疗的病症包括偏侧面肌痉挛、成人发生的痉挛性斜颈(adult onset spasmodic torticollis)、肛裂、眼睑痉挛、大脑性瘫痪、cervical dystonia、偏头痛、斜视、temperomandibular joint disorder和各种类型的肌肉痉挛和抽搐。最近以来，肉毒毒素的肌肉麻痹性作用已被用于治疗性应用和化妆品面部应用，例如皱纹、眉间纹(frown lines)和面部肌肉痉挛或抽搐造成的其他结果的治疗。
因为施用的无痛性质、更大的可覆盖的治疗表面积、配制具有更高比活性的纯毒素的能力、减少的对应用肉毒毒素治疗剂的培训、更少的产生想要的效应所必需的剂量和不需要大量的毒素来达到治疗性临床结果的原因，肉毒毒素的局部递送提供了更安全和更想要的可选择的治疗法。因此，不需要注射并用于肉毒毒素的透皮递送的有效方法以及用于施用肉毒毒素以治疗或预防许多病症的有效方法是非常想要的。
                     发明概述
本发明涉及包含肉毒毒素的新组合物，更确切地是这样的组合物，该组合物能够将肉毒毒素运输或递送通过皮肤或上皮(也称作“透皮递送”)，从而可用作局部施用以给受试者提供肉毒毒素以达到此处描述的各种治疗、美学和/或美容目的。
本发明的一个方面是提供包含肉毒毒素和载体的组合物。所述载体具有聚合物主链，所述主链具有附着的带正电荷的分支基团。所述载体和所述肉毒毒素之间的结合是非共价结合。
本发明的另一方面提供了用于给受试者施用肉毒毒素的试剂盒。所述试剂盒包含了以对其透皮递送有效的量存在的肉毒毒素和载体，所述载体具有聚合物主链，该主链具有附着的带正电荷的分支基团。所述载体和肉毒毒素之间的结合是非共价结合。
本发明的另一方面提供用于给受试者施用肉毒毒素的试剂盒。该试剂盒包含用于将肉毒毒素递送给皮肤的装置和组合物，所述组合物包含具有聚合物主链的载体，所述主链具有附着的选自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及触角足PTD的带正电荷的分支基团，其中下标n1是从0至大约20的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25的奇整数。
本发明提供了给受试者施用肉毒毒素的方法，该方法包括将肉毒毒素和有效量的载体一起给受试者的皮肤或上皮局部施用。所述载体具有聚合物主链，所述主链具有附着的带正电荷的分支基团，并和所述肉毒毒素非共价地结合。
在一个方面，本发明涉及这样的组合物，该组合物包含肉毒毒素(如此所定义的)和这样的载体，所述载体包含带正电荷的“主链”，所述主链具有此处描述的带正电荷的分枝或“效能”基团。最优选地所述带正电荷的载体是长链带正电荷的多肽或带正电荷的非肽基聚合物，例如聚烯化亚胺。本发明还涉及用于产生生物学效应的方法，例如肌肉麻痹、减少分泌过多或出汗、治疗神经疼痛或偏头痛、减少肌肉痉挛、预防或减少痤疮、或减少或增强免疫应答，通过局部使用(优选地对需要该治疗的受试者或患者的皮肤使用)有效量的此类组合物来进行所述方法。本发明也涉及用于产生美学和/或美容效果的方法，例如通过给脸部局部使用肉毒毒素而不是通过注射入脸部肌肉产生所述效果。
本发明也提供了用于制备或配制包含载体和肉毒毒素的组合物以及其它额外的产品或预混剂的试剂盒，所述产品是生产可用的制剂所需的产品，所述预混剂可用于生产这样的制剂。可选择地所述试剂盒包含用于分开地但将肉毒毒素和载体给受试者组合施用的手段。
                    附图概述
图1显示这样的实验的结果，该实验显示了使用本发明的包含肽主链的组合物进行的肉毒毒素的透皮递送的效率。
图2是描述小鼠的后肢的状态的照片，在所述小鼠中，用本发明的组合物处理一只肢体的区域，用另一种含有肉毒毒素但不包含本发明的载体的组合物处理另一只肢体的区域。
图3是描述在用“Essentia Botox洗剂”进行局部处理前和处理后的受试者的前额上的绉纹的照片。
图4显示在(A)用“Essentia Botox洗剂”局部处理皱纹后，和(B)处理前的前额的Mikrosil铸型(Mikrosil cast)。这些Mikrosil铸型清楚地显示未经处理的一侧具有更深的皱纹，所述Mikrosil铸型，因为其可最大限度地使由于拍摄实际的受试者而导致的假象降到最小，从而非常有用。
图5显示描述在受试者的前额上进行的Minor’s淀粉/碘检测的照片，所述检测在施用“Essentia Botox洗剂”(A)和对照(B)后5天进行。对照洗剂包含了具有大约21,000的分子量的和具有TAT分支基团的带正电荷的多聚赖氨酸主链。在施用后2分钟拍摄这些照片。
图6和图5相同，除了其是在4分钟后拍摄的外。
图7显示用于腋下多汗症(axillary hyperhidrosis)研究的给药区域。注意，给药区域超出由腋毛覆盖的区域1厘米。
图8a表示这样的实验的结果，所述实验显示了通过对人受试者使用短肽基载体，将肉毒毒素作为局部试剂治疗性地递送通过完整皮肤的效率，用于治疗腋下多汗症。照片显示，在用Botox和短肽基载体一起或单独的载体处理后4周，按重量测量，出汗量(每5分钟的mg数)显著降低。结果是作为和相同组的基线值的比的4周的值，通过Wilcoxon分析确定显著性，p＜0.05。N＝10个患者。图8b表示这样的实验的结果，该实验显示了通过对人受试者使用短肽基载体，将肉毒毒素作为局部试剂治疗性的递送通过完整的皮肤的效率，用于治疗腋下多汗症。照片显示，在用Botox和短肽基载体一起或单独的载体处理后4周，按重量测量，出汗量(每5分钟的mg数)显著降低。结果是两个时间点上的作为和对照值的比的处理值，通过Wilcoxon分析确定显著性，p＜0.05。N＝10个患者。
图9显示描述在用用于腋下多汗症治疗的“Essentia Botox洗剂”治疗前和治疗后的Minor’s淀粉/碘检测的照片。显示了基线和2周的淀粉/碘检测值，其中对于受试者#12，用“Essentia Botox洗剂”(a和c)处理右腋，和给左腋施用对照(b和d)。这些照片说明在用淀粉碘中的载体+botxo处理后观察到的一般益处。尽管在对照侧观察到一些交叉(和按重量计算的数据25％的减少一致)，但使用处理物提供了显著的减少(和在接受处理的侧按重量计算的数据65％的减少一致)。
                      发明详述
本发明提供了通过局部施用合适的制剂进行的肉毒毒素的递送，特别是透皮递送的组合物和方法。
根据本发明，已发现此处所描述的具有效能基团的带正电荷的载体分子适合作为肉毒毒素的运输系统，其使该毒素能够被透皮施用至肌肉和/或其他和皮肤相关的结构。所述转运可在无需肉毒毒素的共价修饰的情况下发生。
“带正电荷的”是指载体在至少一些溶液相条件下，更优选地在至少一些生理相容的条件下具有正电荷。更确切地，此处所用的“带正电荷的”是指所述基团含有在所有pH条件都带电荷的官能团，例如季胺，或含有可在某些溶液相条件下例如pH发生变化的条件下获得正电荷的官能团，在该情况下是伯胺。更优选地，此处所用的“带正电荷的”是指具有在生理相容条件下和阴离子结合的形为的基团。对于本领域技术人员而言很明显的是，具有多个带正电荷的部分的聚合物不必是同聚物。带正电荷的部分的其他示例在现有技术中是熟知的并且可容易地使用，这对本领域技术人员而言也是很显然的。
一般地，所述带正电荷的载体(也称作“带正电荷的主链”)一般是线性的原子链，其在链上具有在生理pH下携带正电荷的基团，或具有附着至从主链延伸出来的侧链的携带正电荷的基团。优选地，带正电荷的主链自身不具有明确的酶促或生物学活性。线性主链是碳氢主链，在一些实施方案中，其被选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子间插。大部分主链原子通常是碳。此外，所述主链通常是重复单位(例如，氨基酸、聚(氧乙烯)、聚(丙烯亚胺)、聚烯化亚胺等)的聚合物，但可以是异聚合物。在一组实施方案中，带正电荷的主链是聚丙烯亚胺，其中许多胺的氮原子以携带正电荷的铵基(四取代的)形式存在。在另一个实施方案中，带正电荷的主链是非肽基聚合物，其可以是异聚合物或同聚合物，例如聚烯化亚胺，例如聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺，具有从大约10,000至大约2,500,000、优选地从大约100,000至大约1,800,000，和最优选地从大约500,000至大约1,400,000的分子量。在另一组实施方案中，所述主链已附着多个含有带正电荷基团(例如，铵基、吡啶基、基、锍基、胍基或amidinium基)的侧链部分。该组实施方案中的侧链部分可以以一致的或可变的间距沿主链放置。此外，侧链的长度可以相似或不同。例如，在一组实施方案中，侧链可以是具有从1至20个碳原子并在远端(远离主链)以上面提到的带正电荷的基团中的一个结束的线性的或分枝的烃链。在本发明的所有方面，载体和具有生物学活性的试剂之间的结合是通过非共价相互作用结合的，所述相互作用的非限定性例子包括，例如，离子相互作用、氢键、范德瓦尔斯力或其组合。
在一组实施方案中，带正电荷的主链是具有多个带正电荷的侧链基团(例如，赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、高精氨酸等)的多肽。优选地，所述多肽具有从大约10,000至大约1,500,000，更优选地从大约25,000至大约1,200,000，最优选地从大约100,000至大约1,000,000的分子量。本领域技术人员认识到，当氨基酸用于本发明的该部分时，所述侧链在附着的中心可具有D型或L型(R或S构型)。可选择地，所述主链可以是多肽的类似物，例如类肽(peptoid)。参见，例如，Kessler，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32：543(1993)；Zuckermann等人Chemtracts-Macromol.Chem.4：80(1992)；和Simon等人Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 89：9367(1992))。简而言之，类肽是多聚甘氨酸，其中侧链附着至主链的氮原子而不是附着至α碳原子。如上所述，侧链的一部分通常以带正电荷的基团结尾以提供带正电荷的主链组分。在例如美国专利号5,877,278中描述了类肽的合成，其以其全文在此引用作为参考。当所述术语在此使用时，具有类肽主链结构的带正电荷的主链被认为是“非肽”，因为其不是由在α碳原子位置上具有天然发生的侧链的氨基酸构成的。
可应用例如多肽的空间或电子模拟物来使用多种其他主链，其中肽的酰胺键由取代物替代，所述取代物是例如酯键、硫代酰胺键(-CSNH-)、反向硫代酰胺键(-NHCS-)、氨基亚甲基键(-NHCH2-)或反向亚甲基氨基键(-CH2NH-)、酮亚甲基键(-COCH2-)、次膦酸基(-PO2RCH2-)、磷酸酰胺和磷酸酰胺酯键(-PO2RNH-)、反向肽键(-NHCO-)、反式烯烃键(-CR＝CH-)、氟代烯烃键(-CF＝CH-)、二亚甲基键(-CH2CH2-)、硫醚键(-CH2S-)、羟亚乙基键(-CH(OH)CH2-)、亚甲氧基键(-CH2O-)、四唑(CN4)、亚磺酰胺基(-SO2NH-)、亚甲亚磺酰胺基(-CHRSO2NH-)、反向亚磺酰胺基(-NHSO2-)，以及具有丙二酸和/或gem-二氨基-烷基亚基的主链，例如，由Fletcher等人((1998)Chem.Rev.98：763)综述的，和由其中引用的参考资料所详细描述的。许多前述的取代物产生近似的(和由α氨基酸形成的主链相比)电子等排聚合物主链。
在上面提供的各主链中，可附着携带正电荷的基团的侧链基团。例如，亚磺酰胺连接的主链(-SO2NH-和-NHSO2-)可具有附着至氮原子上的侧链基团。类似地，羟乙烯基(-CH(OH)CH2-)连接链可携带附着至羟基取代基的侧链基团。通过使用标准的合成方法，本领域技术人员可容易地改造其他键合化学物质以使其提供带正电荷的侧链基团。
在一个实施方案中，带正电荷的主链是具有分支基团(也称作效能基团)的多肽。如此处所用的，效能基团或分支基团是具有促进带正电荷的主链转运通过组织或细胞膜的作用的任何试剂。分支基团或效能基团的非限定性示例包括-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT或其片段、或触角足(Antennapedia)的蛋白转导域、或其片段，其中下标n1是从0至20的整数，更优选地是0至8的整数，更优选地是2至5的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25、更优选地大约7至大约17、最优选地大约7至大约13的奇整数。其他优选的实施方案是这样的实施方案，在所述实施方案中，HIV-TAT片段具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q，其中下标p和q各独立地是从0至20的整数，所述片段通过该片段的C端或N端附着至主链。优选的HIV-TAT片段是其中下标p和q各自独立地是0至8、更优选地2至5的整数的片段。在另一个优选的实施方案中，带正电荷的侧链或分支基团是触角足(Antp)的蛋白转导域(PTD)、或保持活性的其片段。优选地带正电荷的载体以至少大约0.05％(载体总重量的百分比)、优选地从大约0.05至大约45％的重量，最优选地从大约0.1至大约30％的重量的量包含带正电荷的侧链分支基团。对于具有式-(gly)n1-(arg)n2的带正电荷的分支基团，最优选的量是从大约0.1至大约25％。
在另一个实施方案中，所述主链部分是多聚赖氨酸，带正电荷的分支基团附着至所述赖氨酸侧链氨基。所述多聚赖氨酸具有从大约10,000至大约1,500,000、优选地从大约25,000至大约1,200,000，和最优选的大约100,000至大约1,000,000的分子量。其可以是可商购获得(Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri，USA)的多聚赖氨酸中的任一种，例如，具有MW＞70,000的多聚赖氨酸、具有70,000至150,000的MW的多聚赖氨酸、具有MW 150,000至300,000的多聚赖氨酸和具有MW＞300,000的多聚赖氨酸。多聚赖氨酸的恰当选择依赖于组合物的其余组分，要足以为组合物提供总的净正电荷和提供这样的长度，该长度优选地是带负电荷的组分的组合长度的1至4倍。优选的带正电荷的分支基团或效能基团包括，例如，-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly3Arg7)或HIV-TAT。在另一个优选的实施方案中，带正电荷的主链是长链聚烯化亚胺例如聚乙烯亚胺，例如，分子量为大约1,000,000的聚乙烯亚胺。
带正电荷的主链或载体分子是新的化合物并形成本发明的方面，所述主链或载体包含具有上述分支基团的多肽或聚烯化亚胺。
在本发明的另一个实施方案中，只有具有带正电荷的分支基团的带正电荷的载体是肉毒毒素的透皮递送所必需的。在某些实施方案中，所述带正电荷的载体是具有多个上述的带正电荷的侧链基团的多肽(例如，赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、高精氨酸等)。优选地，所述多肽具有至少大约10,000的分子量。在另一个实施方案中，带正电荷的载体是非肽基聚合物例如具有至少大约100,000分子量的具有多个带正电荷的侧链基团的聚烯化亚胺。这些聚烯化亚胺包括聚乙烯亚胺和聚丙烯亚胺。在任一示例中，为了用作透皮递送所唯一必需的试剂，所述带正电荷的载体分子包含带正电荷的分枝或效能基团，包括-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT或其片段、触角足PTD或其片段，其中下标n1是从0至20，更优选地从0至8，更优选地2至5的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25，更优选地从大约7至大约17和最优选地从大约7至大约13的奇整数。优选地所述侧链或分支基团具有上述通式-(gly)n1-(arg)n2。其他优选的实施方案是这样的方案，在所述方案中，分支基团或效能基团是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下标p和q各自独立地是从0至20的整数，所述片段通过该片段的C端或N端附着至载体分子。所述侧链分支基团可在附着的中心具有D型或L型(R或S构型)。优选的HIV-TAT片段是这样的片段，在所述片段中，下标p和q各自独立地是从0至8、优选地2至5的整数。其他优选的实施方案是这样的实施方案，在所述实施方案中，分支基团是触角足PTD基团或其保持基团活性的片段。这些在本领域中是已知的，例如根据Console等人，J.Biol.Chem.278：35109(2003)。优选地带正电荷的载体以至少大约0.05％(作为载体总重量的百分比)、优选地从大约0.05至大约45％的重量，和最优选地从大约0.1至大约30％的重量的量包含侧链带正电荷的分支基团。对于具有式-(gly)n1-(arg)n2的带正电荷的分支基团，最优选的量是从大约0.1至大约25％。
在另一个实施方案中，所述载体是具有附着至赖氨酸侧链氨基的带正电荷的分支基团的多聚赖氨酸。用于该特定实施方案的多聚赖氨酸可以是可商购获得(例如，Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri，USA)的多聚赖氨酸中的任一种，例如，具有MW＞70,000的多聚赖氨酸、具有70,000至150,000的MW的多聚赖氨酸、具有MW150,000至300,000的多聚赖氨酸和具有MW＞300,000的多聚赖氨酸。然而，优选的多聚赖氨酸具有至少大约10,000的MW。优选的带正电荷的分支基团或效能基团包括，例如，-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly3Arg7)、HIV-TAT或其片段、和触角足PTD或其片段。
在本发明的另一个实施方案中，所述载体是相对较短的多聚赖氨酸或聚乙烯亚胺(PEI)主链(其可以是线性或分枝的)，并且其具有带正电荷的分支基团。这些载体在使组合物中的主链和肉毒毒素的不受控制的凝聚减少至最低上非常有用，所述凝聚使运输效率急剧降低。当所述载体是相对短的线性多聚赖氨酸或PEI主链时，所述主链具有低于75,000，更优选地低于30,000，和最优选地低于25,000的分子量。然而，当载体是相对短的分枝多聚赖氨酸或PEI主链时，主链将具有低于60,000，更优选地低于55,000和最优选地低于50,000的分子量。然而，如果组合物包含此处描述的隔离试剂(partitioningagents)，那么分枝的多聚赖氨酸和PEI主链的分子量可高达75,000，而线性多聚赖氨酸和PEI主链的分子量可高达150,000。
此处所用的术语“肉毒毒素”是指无论是通过细菌产生的还是通过重组技术产生的任何已知类型的肉毒毒素，以及以后可被发现的任何这样的类型，包括通过基因工程产生的变体或融合蛋白。如上面所提到的，目前，已表征了七种免疫学上不同的肉毒神经毒素，即A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒神经毒素，其各自通过用类型特异性抗体进行中和来区别。肉毒毒素血清型可从Sigma-Aldrich和从Metabiologics，Inc.(Madison，Wisconsin)以及从其他来源商购获得。肉毒毒素的不同血清型在其作用的动物种类和在其引起的麻痹的严重度和持续时间上是不同的。至少两种类型的肉毒毒素，A型和B型，可以以制剂形式商购获得用于治疗某些病症。例如，在商标为BOTOXO的Allergan的制剂中和商标为DYSPORT的Ipsen的制剂中含有A型，而在商标为MYOBLOC的Elan的制剂中含有B型。
用于本发明组合物的肉毒毒素可选择地可以是肉毒毒素的衍生物，即其是这样的化合物，所述化合物具有肉毒毒素活性，但相对于天然发生的或重组的天然的肉毒毒素，在其任何部分或任何链上包含一种或多种化学或功能性改变。例如，肉毒毒素可以是经修饰的神经毒素(例如，这样的神经毒素，当和天然地或重组地产生的神经毒素或其衍生物或其片段相比，其氨基酸的至少一个被删除、被修饰或被替代)。例如，所述肉毒毒素可以是以这样的方式修饰的肉毒毒素，所述方式是例如增强其特性或减少不想要的副作用，但仍保持想要的肉毒毒素活性的方式。如上所述，肉毒毒素可以是由细菌产生的肉毒毒素复合物中的任一种。可选择地，肉毒毒素可以是使用重组或化学合成技术制备的毒素(例如，重组肽、融合蛋白或杂合的神经毒素，如从不同的肉毒毒素的亚基或结构域制备而来的(参见美国专利6,444,209))。肉毒毒素也可以是完整的分子的部分，该部分经显示具有必需的肉毒毒素活性，在该情况下其自身可被使用或用作组合分子或缀合分子例如融合蛋白的部分。此外，肉毒毒素可以肉毒毒素前体(该前体自身可以是无毒的)的形式存在，例如，在蛋白水解断裂后变得有毒的无毒性锌蛋白酶。
本发明也涉及肉毒毒素的组合物和混合物的一般用途，不过由于其不同的性质和特性，目前在卫生保健或美容业中一般不施用肉毒毒素血清型的混合物。
本发明的组合物优选地以这样的产品形式存在，即该产品被用于受试者或患者即需要特定治疗的人或其他哺乳动物的皮肤或上皮。术语“需要”是指包括药物和保健相关(例如治疗涉及不想要的面部肌肉痉挛的症状)的需要，以及美容和主观(例如改变或改善面部组织的外观)上的需要。一般地，通过将肉毒毒素和载体以及通常地一种或多种额外的药物可接受的载体或赋形剂混合来制备组合物。在其最简单的形式中，其可包含简单的水性药物可接受的载体或稀释剂，例如缓冲盐水。然而，组合物可包含一般存在于局部药物组合物或药妆(cosmeceutical)组合物中的其他成分，包括皮肤或药物可接受的载体、赋形剂或介质(即和其施用的组织相容的载体、赋形剂或介质)。此处使用的术语“皮肤或药物可接受的”是指此处描述的组合物或其组分适合用于和这些组织接触，或适用于患者而通常无过度的毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等。适当地，本发明的组合物可包含常规地用于所述领域特别是药妆和皮肤学领域中的任何组分。所述组合物也可包含一些小阴离子，优选地多价阴离子，例如，磷酸盐、天冬氨酸盐或柠檬酸盐。
根据其形式，本发明的组合物可包括溶液、乳液(包括微乳液)、悬浮液、乳膏剂、洗剂、凝胶、粉剂或其他类型的固体或液体组合物，所述其他类型的组合物用于可使用所述组合物的皮肤或其他组织。除了肉毒毒素和载体分子外，这些组合物可包含一般用于该产品的其他成分，例如抗微生物剂、增湿剂和水合剂、渗透剂、防腐剂、乳化剂、天然的或合成的油、溶剂、表面活性剂、去垢剂、润滑药剂、抗氧化剂、芳香剂、充填剂、增稠剂、石蜡、气味吸收剂(odor absorbers)、染料、着色剂、粉剂，和任选地包含麻醉剂、止痒添加剂、植物萃取物、调节剂、暗化剂(darkening agent)或亮化剂(lightening agent)、吉洛特、湿润剂、云母、矿物质、多酚、硅氧烷或其衍生物、防晒剂(sunblocks)、维生素和植物药(phytomedicinals)。
在特别优选的实施方案中，所述组合物包含胶凝剂和/或粘性调节剂。一般加入这些试剂以增加组合物的粘度，从而使组合物的施用更容易和更精确。此外，这些试剂帮助防止水性肉毒毒素/载体溶液变干，变干将导致肉毒毒素的活性降低。特别优选的试剂是不带电荷和不干扰肉毒毒素活性或不干扰毒素-载体复合物通过皮肤的效率的试剂。所述胶凝剂可以是某些基于纤维素的胶凝剂，例如羟丙基纤维素(HPC)。在一些实施方案中，将肉毒毒素/载体复合物配制在具有2-4％的HPC的组合物中。可选择地，可通过加入聚乙二醇(PEG)改变含有肉毒毒素/载体复合物的溶液的粘度。在其他实施方案中，将肉毒毒素/载体溶液和预先混合的粘性试剂例如Cetaphil增湿剂混合。
本发明的组合物任选地可包含隔离试剂。如此处所用的，“隔离试剂”是这样的任何物质或添加剂，即其具有防止或最小化本发明的肉毒毒素和载体的不想要的或不受控制的凝聚的性质。隔离试剂可在例如当由于体积的限制必须使用浓缩的肉毒毒素溶液的时候使用。在这些情况下，所述隔离试剂使肉毒毒素保持分散状态，从而防止在没有隔离试剂时会发生的毒素凝聚。一般地，隔离试剂是(1)无刺激性的，(2)不破坏肉毒毒素，(3)不增加任何渗透性，(4)提供可靠的和稳定的颗粒大小，(5)不带电荷，和(6)不干扰毒素和透皮载体的复合。合适的隔离试剂的例子是EtOH(EtOH)。在优选的实施方案中，EtOH少于组合物的20％，和最优选地少于组合物的5％。
例如，如果体积限制要求在0.5ml溶液中，而不是2.5ml溶液中重构100U的肉毒毒素，那么人们一般观察到肉毒毒素将表现不想要的凝聚，从而降低了活性。然而，通过加入1％的EtOH作为分散试剂，在该浓度下，在24小时后仍然保持完全的活性。例如在另一个示例中，在1.0ml 0.9％的NaCl重构溶液中的Botox具有完全的活性，而在0.5ml 1％和5％EtOH+0.9％NaCl中的重构产生具有完全活性的溶液。
在本发明的某些实施方案中，向肉毒毒素组合物中加入寡聚或多聚阴离子桥以提高毒素与带正电荷的主链载体的复合作用。如在本领域中所熟知的，肉毒毒素实际上是不同蛋白的复合物，其中一些是带正电荷的，其中一些是带负电荷的。因为毒素的组分的确切分布视毒素的来源变化而变化，来自某些来源的肉毒毒素可以具有更低的和此处描述的带正电荷的主链形成复合物的趋势。然而，本发明的一个方面是发现：通过向这些肉毒毒素加入寡聚或多聚阴离子桥，可非常显著地增加局部给药的效率和功效。这些寡聚/多聚阴离子桥的合适的示例包括磷酸钠(5％)、PBS或5％的多聚L-天冬氨酸(例如，具有3000的分子量)。
本发明的组合物可以控释组合物或缓释组合物的形式存在，其中将要递送的肉毒毒素和载体包囊化或装入材料中，以使其在一段时间内以受控的方式释放至皮肤上。可将肉毒毒素和载体装入基质、脂质体、囊泡、微囊、微球体等，或装入固体颗粒材料，所有这些材料都是被选择和/或构建来在一段时间内释放肉毒毒素的。可将肉毒毒素和载体一起包囊化(例如，在相同的胶囊中)或分开包囊化(在分开的胶囊中)。
通过使用此处的描述的组合物，可将肉毒素以这样的有效量递送至皮肤下面的肌肉中，或递送至皮肤内的腺体结构中，所述有效量可产生麻痹、产生松弛、减缓抽搐、预防或减轻痉挛、减少腺体分泌或提供其他想要的效果。和可注射的或可移植的材料相比，以这种方式局部递送肉毒毒素可减少剂量、降低毒性和使得可为想要的效果提供更精确的剂量最优化。
施用本发明的组合物，以使得能够施用有效量的肉毒毒素。此处所用的术语“有效量”是指如上面定义的这样的量的肉毒毒素，该量的肉毒毒素足以产生想要的肌肉麻痹或其他生物学或美学效应，但该量绝对是安全的量，即低至足以避免严重的副作用的量。想要的效果包括使某些肌肉松弛，其目的在于例如减少细纹和/或皱纹(特别是在脸部的)的出现、或以其他方式例如加宽眼睛、抬高嘴角、或使从上唇散开的细纹平滑来调整面貌，或总体缓解肌肉紧张。最后提到的效果，即肌肉紧张的总体缓解，可在脸部或其他部位实现。本发明的组合物可包含用作单剂治疗的合适的有效量的肉毒毒素，或可以是更浓缩的，以在施用的部位进行稀释或以多次施用的方式进行使用。通过使用本发明的带正电荷的载体，可将肉毒毒素给受试者透皮施用以治疗病症，所述病症是例如不想要的面部肌肉或其他肌肉痉挛、多汗症、痤疮或身体中其他部位的想要减轻肌肉疼痛或痉挛的病症。局部施用肉毒毒素以透皮递送至肌肉或与皮肤相关的其他结构。可给例如腿、肩、背(包括下背部(lower back))、腋窝、手掌、足、颈、腹股沟、手或足的背部、肘、上臂、膝盖、大腿、臀部、躯干、骨盆或想要施用肉毒毒素的身体的任何其他部分。
也可施用肉毒毒素以治疗其他病症，包括治疗神经痛、预防或减轻偏头痛或其他头痛、预防或减轻痤疮、预防或减轻肌张力障碍(dystonia)或张力障碍收缩(dystonic contractions)(无论是主观性的还是临床性的)、预防或减轻和主观的或临床的多汗症相关的症状、减少分泌过多或出汗、降低或加强免疫应答、或治疗其他疾病，所述其他疾病是被建议通过注射施用肉毒毒素或已经进行注射施用肉毒毒素来治疗的病症)。
为了免疫相关的目的，也可施用此处描述的肉毒毒素或其他治疗性蛋白。令人惊奇的是，也可施用此处描述的肉毒毒素以降低免疫应答。更确切地，本发明允许通过其它的施药途径递送肉毒毒素，从而改变所述试剂的复合抗原呈递。通过该方式，本发明可用于减少对针对肉毒毒素的抗原的免疫应答，和用于帮助反复施用而没有和免疫相关的活性降低。可选择地，可制备和局部施用所述复合物以增强免疫应答，例如提供有关各种蛋白的免疫例如儿童免疫而无需注射。对于和免疫相关的活性的用途，“有效量”是指这样的量的肉毒毒素，即该量足以使受试者在施用或系列施用肉毒毒素后产生对其的免疫应答。
最优选地，在医生的指导下或在其他专业护理人员的指导下施用所述组合物，或由他们来施用所述组合物。可以单剂治疗的方式或以一段时间内系列周期性治疗的方式施用其。对于为了上述目的的肉毒毒素的透皮递送，给想要得到效果的部位上的皮肤局部施用上述组合物。在将水性肉毒毒素/载体溶液直接给皮肤施用的实施方案中，为了防止溶液变干(其可导致毒素活性的降低)，优选地覆盖经处理的区域(例如，用Cetaphil增湿剂)或用屏障(例如，Telfa)封闭经处理的区域。因为其性质，最优选地，应当非常小心地，以可产生想要的结果但不产生任何不利的或不想要的结果的施用比率和施用频率施用所用的肉毒毒素的量。因此，例如，应当以每cm2的皮肤面积从大约1U至大约20,000U、优选地大约1U至大约10,000U的肉毒毒素的比率施用本发明的局部组合物。例如，优选地可将这些范围内的较高剂量和例如控释材料一起使用，或使得能够在除去之前在皮肤上停留更短的时间。
为了保持溶液的功效，在施用肉毒毒素/载体组合物之前皮肤表面的恰当处理是非常重要的。例如，为了在施用之前清洁皮肤上的表面油脂而在皮肤的表面引入表面活性剂令人吃惊地会起反作用，因为表面活性剂似乎破坏了肉毒毒素的活性。即使随后在施用肉毒毒素/载体溶液之前用水洗涤数次，该现象仍会发生。甚至极温和的表面活性剂，例如婴儿抹擦的表面活性剂，似乎都会导致该现象。因此，在优选的施用本发明的组合物的方法中，单独地用水预先清洁皮肤。只用水清洗也似乎适度地提高了肉毒毒素的透皮运输。
此外，在施用肉毒毒素/载体复合物之前，可剥离皮肤以减少角质层。原则上，剥离皮肤的方法应当导致增强的肉毒毒素的透皮运输效率。然而，用于剥离皮肤的方法是重要的。例如，丙酮介导的人或动物中的角质层的减少似乎减少了随后施用的肉毒毒素的活性。相反地，胶带剥离(即，用胶带贴在皮肤的表面上，然后取下胶带)似乎在小鼠模型和人中使得肉毒毒素渗透得更深并且减少了剂量。据推测，皮肤表面的磨损(例如，通过使用抛光垫(abrasive pad))可产生和胶带剥离相似的效果。
本发明也包括用于进行包含肉毒毒素和载体的组合物的透皮递送的装置，所述载体具有带正电荷的主链，所述主链具有附着的此处定义的分支基团。这些装置在结构上可以如皮肤贴剂一样简单，或可以是更复杂的装置，包括用于分配和监控组合物的分配的工具和任选地用于监控受试者的状况(例如监控受试者和正被分配的物质的反应)的工具。
应当指出，用于建造装置的材料的选择是非常重要的。用于建造递送装置的优选的材料是不会导致肉毒毒素/载体溶液的活性丧失(通过肉毒毒素的降解或在装置表面上的不想要的吸附导致的活性丧失)的材料。已观察到该不想要的形为，例如当水溶液中的肉毒毒素/载体接触聚丙烯表面时观察到该行为，但当肉毒毒素/载体溶液接触聚氯乙烯(PVC)表面时则没有观察到该行为。
一般地，可在装置中预先配制和/或预先安装组合物或随后制备组合物，例如通过使用这样的试剂盒随后制备组合物，所述试剂盒分开地包含两种组分(肉毒毒素和载体)，但提供了用于在施用时或施用之前将其混合的工具。载体分子的量或其对肉毒毒素的比例依赖于所述组合物中选择使用的载体。可容易地确定，例如通过进行一个或多个实验(例如下面描述的实验)确定在给定的情况下的载体分子的合适的量或比例。
一般地，本发明也包括将肉毒毒素施用给需要其的受试者或患者的方法。所述方法包括，将有效量的肉毒毒素和具有带正电荷的主链的载体一起施用，所述主链具有附着的此处描述的带正电荷的分支基团。“和......一起”是指以组合的方法将两种组分(肉毒毒素和载体)一起施用，该方法可包括将其组合在组合物中，然后再将组合物给受试者施用，或将其分开施用，但以这样的方式分开施用其，所述方式可使其一起作用，从而提供有效量的治疗性蛋白的必需递送。例如，可首先将含有载体的组合物用于受试者的皮肤，然后使用含有肉毒毒素的皮肤贴剂或其他装置。可将肉毒毒素以无水的形式整合入皮肤贴剂或其他分配装置中，可在使用皮肤贴剂之前给皮肤的表面施用带正电荷的载体，这样可使所述两类物质共同作用，产生想要的透皮递送。因此，所述两种物质(载体和肉毒毒素)，以组合的方式起作用，或可能相互作用以在原位形成组合物或组合。因此，本发明也包含这样的试剂盒，所述试剂盒包含通过皮肤分配肉毒毒素的装置和含有载体或主链并且适合于给受试者的皮肤或上皮施用的液体、凝胶、乳膏剂等。用于在专业护理人员指导下施用或由患者或受试者施用本发明的组合物的试剂盒也可包含适合于该目的的定制的施药器(customapplicator)。
本发明的组合物、试剂盒和方法使得可以递送更纯的具有更高比活性、潜在地提高的药物动力学的肉毒毒素。此外，所述载体可充当稳定剂，减少对外源辅助蛋白(例如，在400-600mg范围内的人血清白蛋白或在250-500mg范围内的重组血清白蛋白)和/或多糖稳定剂的需要并且可有益地降低对肉毒毒素的免疫应答。此外，所述组合物适合用于pH在4.5至6.3范围内变化的生理环境，因此其可具有这样的pH。本发明的组合物可在室温下或在冷冻的条件下贮存。
下面是本发明的代表性实施例。其展示了功能性肉毒神经毒素复合物通过皮肤的递送而无需共价修饰要递送的神经毒素。
                       实施例
                       实施例1
      通过使用肽基载体在体内进行的肉毒毒素的转运
本实验显示在一次施用后，和对照相比，肽基载体将含有完整的标记蛋白肉毒毒素的大复合物运输通过完整皮肤的用途。
主链的选择：
通过将-Gly3Arg7共价地附着至多聚赖氨酸(MW 112,000)来装配带正电荷的主链，通过以18％的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有18个赖氨酸残基共价地缀合至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连接至赖氨酸侧链的游离胺基来进行该附着。所述经修饰的主链被命名为“KNR”。对照聚阳离子是相同大小的和来自相同批次的未经修饰的多聚赖氨酸(称为“K”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。
治疗剂：
选择Boxtox商标的肉毒毒素A(Allergan)进行本实验。其具有大约150,000的分子量。
样品的制备：
根据厂商说明书对肉毒毒素进行重构。用经计算超过12倍摩尔量的硫代NHS-LC生物素(Pierce Chemical)对蛋白的等分进行生物素化。被标记的产物称作“Btox-b”。
在各情况下，如同递送高度负电的大核苷酸复合物一样，使用过量的聚阳离子装配具有过量正电荷的终复合物。净中性或净正电荷防止了来自高度负电的细胞表面蛋白聚糖和细胞外基质对蛋白复合物的排斥。对所有组的Btox-b剂量进行标准化，也对要局部施用的组合物的总体积和终pH进行标准化。如下制备样品：
标记为“JMW-7”的组：将每等分(即总共20U)2.0U的Btox-b和肽基载体KNR以经计算为4∶1的MW比率混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至200微升。将所得的组合物用1.8ml Cetaphil洗剂混合均匀并以200微升进行等分。
标记为“JMW-8”的组：将每等分(即总共20U)2.0U的Btox-b和K以4∶1的MW比混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至200微升。将所得的组合物和1.8ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
在用肽基载体和经标记的Btox进行一次处理后确定透皮递送效率的动物实验
在处理期间通过吸入异氟烷麻痹动物。在被麻痹后，C57 black 6小鼠(每组n＝4)接受局部敷药，将200微升剂量的适当处理物施用于背部皮肤的颅部分(之所以选择该部分是因为小鼠不能用嘴或四肢达到该区域)。动物不进行脱毛。在最初的处理之后30分钟，通过吸入CO2对小鼠实行安乐死，由盲测者(blinded observer)收获完整厚度的经处理的皮肤部分。将经处理的部分分成三等分，在10％的中性缓冲的福尔马林中固定颅部分12-16小时，然后贮存在70％的EtOH中直至石蜡包埋。如下面所概述的，由盲测者将中心部分进行快速冷冻并将其直接用于生物素显示。为进行溶解研究，快速冷冻经处理的尾部节段。
如下进行生物素显示。简而言之，将各切片浸没在NeutrAvidin缓冲液中1小时。为观察碱性磷酸酶的活性，在盐水中洗涤横切面4次，然后浸没在NBT/BCIP(Pierce Scientific)中1小时。然后在盐水中漂洗切片，在具有平场复消色差透镜的Nikon E600显微镜上对整个切片照相。
数据处理和统计分析：
由盲测者使用Image Pro Plus软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)通过分批图象分析确定总的阳性染色，并将其标准化为总的横切面面积以确定各组的阳性染色百分比。然后，在单向ANOVA重复测量中使用Statview软件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下进行显著性分析来确定各组的平均值和标准差。
结果：
在将Btox-b与KNR(“EB-Btox”)或K(“n1”)一起进行一次局部施用后，用总面积的百分比来表示对于生物素化的肉毒毒素呈阳性的平均横切面面积。将所述结果列于下列的表1中并在图1中进行说明。在图1中，在用“EB-Btox”和对照“n1”进行每天一次的处理三天后，将对于标记是阳性的面积测定为总面积的百分比，其中“EB-Btox”包含Btox-b和肽基载体KNR，“n1”包含Btoxb和聚阳离子K。描述各组的平均值和标准差。
表4.在将Btox-b与KNR(JMW-7)或K(JMW-8)一起进行一次局部施用30分钟后，以总的横切面的百分比表示的被标记的肉毒毒素区域的平均值和标准差。
  组   平均值   标准差
  JMW-7   33   5.333334
  JMW-8   8.666667   0.333334
P＝0.0001(在置信度99％下是显著的)
                      实施例2
       具有肽基载体的局部肉毒毒素制剂的治疗效果
实施例1表明在鼠类模型的完整皮肤中局部施用后，肽基透皮载体可使肉毒毒素有效地转运。然而，该实验没有表明复合蛋白肉毒毒素在转运穿过皮肤后是否以功能性形式释放。因此建立下列的实验来估计：使用该肽基载体(同样，无蛋白的共价修饰)是否可将肉毒毒素作为局部试剂递送穿过完整的皮肤仍具治疗效果。
通过将-Gly3Arg7共价地附着至多聚赖氨酸MW 112,000来装配带正电荷的主链，以18％的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有18个赖氨酸残基共价附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连接至赖氨酸侧链的游离胺基来进行该附着。所述经修饰的主链被命名为“KNR”。对照聚阳离子是相同大小的和来自相同批次的未经修饰的多聚赖氨酸(称为“K”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。和在实施例1中一样使用相同的肉毒毒素治疗剂，和以相同的方式制备其。如下制备样品：
标记为“JMW-9”的组：将每等分(即总共60U)2.0单位的肉毒毒素和肽基载体KNR以经计算为4∶1的MW比率混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至600微升。将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
标记为“JMW-10”的组：将每等分(即总共60U)2.0单位的肉毒毒素和K以4∶1的MW比混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至600微升。将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
标记为“JMW-11”的组：用磷酸缓冲盐溶液将每等分(即总共60U)2.0单位的无聚阳离子的肉毒毒素稀释至600微升。将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
在用肽基载体和肉毒毒素进行一次处理后确定治疗效率的动物实验
在处理期间通过吸入异氟烷麻痹动物。在被麻痹后，C57 black 6小鼠(每组n＝4)接受局部敷药，将400微升剂量的适当处理物均一地施用于脚趾至大腿中部(mid-thigh)。两只腿都进行处理，对于任一侧，处理都是随机的。动物不进行脱毛。在最初的处理之后30分钟，根据公开的足趾外展(digital abduction)分值(用于评价足的灵活性)(Aoki，KR.A comparison of the safety margins of botulinumneurotoxin serotypes A，B，and F in mice.Toxicon.2001Dec；39(12)：1815-20)在施用肉毒毒素后就足趾外展的能力对小鼠进行估计。小鼠的灵活性也通过主观估计。
数据处理和统计分析：
由两个盲测者独立地将足趾外展分值列表。然后，在单向ANOVA重复测量中使用Statview软件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下进行显著性分析来确定各组的平均值和标准误。
结果：
将平均足趾外展分值(在肉毒毒素与KNR(“JMW-9”)、K(“JMW-10”)或无聚阳离子的稀释剂一起进行一次局部施用后获得的)示于下面表2并在图2的代表性显微照片中进行说明。和两个对照(其相互之间是相当的)相比，肽基载体KNR提供了统计学上显著的肉毒毒素通过皮肤的功能性递送。本发明的另外的独立重复实验(总共三个独立的实验，所有实验具有相同的结论：具有KNR而非对照的局部肉毒毒素具有统计学上显著的麻痹作用)进一步确认了本发现和揭示了在具有K或不具有K的局部肉毒毒素(即两个对照)之间没有显著的不同。有趣的是，小鼠始终朝向被麻痹的肢体方向走动(在100％的接受处理的动物中发生该现象，在来自任一对照组的对照中发生率为0％)。如图2所示，用肉毒毒素和对照聚阳离子多聚赖氨酸或用肉毒毒素而无聚阳离子(“单独的Botox”)处理的肢体可活动足趾(当被提起时，作为防御机制)，但用肉毒毒素和肽基载体KNR(“Essentia Botox洗剂”)处理的肢体则不能活动。
表2在一次局部施用肉毒毒素和肽基载体KNR(“JMW-9”)、肉毒毒素和对照聚阳离子K(“JMW-10”)、和单独的肉毒毒素(“JMW-11”)后30分钟，足趾外展分值。
  组   平均值   标准差
  JMW-9   3.333   0.333
  JMW-10   0.333   0.333
  JMW-11   0.793   0.300
P＝0.0351(在置信度95％下是显著的)
结论：
本实验表明肽基透皮载体可将治疗有效量的肉毒毒素治疗剂转运穿过皮肤而无需治疗剂的共价修饰。本实验也进一步确认当在对照中局部施用时，肉毒毒素不起作用。
                          实施例3
       具有非肽基载体的局部肉毒毒素制剂的治疗效率
本实证显示非肽基载体在本发明中的性能。
方法：
主链的选择：
通过将-Gly3Arg7共价地附着至聚乙烯亚胺(PEI)MW 1,000,000来装配带正电荷的主链，通过以30％的饱和度(即，每100个赖氨酸残基中有30个赖氨酸残基共价附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连接至PEI侧链的游离胺基来进行该附着。经修饰的主链被命名为“PEIR”以表示大的非肽基载体。对照聚阳离子是相同大小的和来自相同批次的未经修饰的PEI(称为“PEI”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。如实施例1中那样，使用相同的肉毒毒素治疗剂。
根据厂商说明书从Botox产品对肉毒毒素进行重构。在各情况下，同递送高度负电的大核苷酸复合物一样，用过量的聚阳离子装配具有过量正电荷的终复合物。净中性或净正电荷防止了来自高度负电的细胞表面蛋白聚糖和细胞外基质对蛋白复合物的排斥。对所有组的肉毒毒素剂量进行标准化，也对要局部施用的组合物的总体积和终pH进行标准化。如下制备样品：
标记为“AZ”的组：将每等分(即总共60U)2.0单位的肉毒毒素和超纯形式的非肽基载体PEIR以经计算为5∶1的MW比混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至600微升。将所得的组合物和5.4mlCetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
标记为“BA”的组：将每等分(即总共60U)2.0单位的肉毒毒素和PEI以5∶1的比混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至600微升。将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
在一次处理后确定治疗效率的动物实验
在处理期间通过吸入异氟烷麻痹动物。在被麻痹后，C57 black 6小鼠(每组n＝3)接受局部敷药，将400微升剂量的适当处理物均一地施用于脚趾至大腿中部。对两只腿都进行处理，对两侧中的任一侧来说，处理都是随机的。动物不进行脱毛处理。在最初的处理之后30分钟，根据公开的足趾外展分值(用于评价足的灵活性)(Aoki，KR.Acomparison of the safety margins of botulinum neurotoxinserotypes A，B，and F in mice.Toxicon.2001 Dec；39(12)：1815-20)在施用肉毒毒素后就足趾外展的能力对小鼠进行估计。小鼠的灵活性也通过主观估计。
数据处理和统计分析：
由两个盲测者独立地将足趾外展分值列表。然后，在单向ANOVA重复测量中使用Statview软件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下进行显著性分析来确定各组的平均值和标准差。
结果：
将在一次局部施用肉毒毒素和PEIR(“AZ”)、或肉毒毒素和对照聚阳离子PEI(“BA”)后获得的平均足趾外展分值示于下列的表3中。将重复实验(对本实验进行单次独立重复实验)的结果列于表4。和对照相比，非肽基载体PEIR提供了统计学上显著的肉毒毒素通过皮肤的功能性递送。和前面一样，观察到动物朝向被麻痹的肢体作圆周走动。
表3：在一次局部施用Botox和超纯PEIR(“AZ”)、或Botox和对照聚阳离子PEI(“BA”)后30分钟的足趾外展分值。显示平均值和标准差。
  组   平均值   标准差
  BA   0.833   0.307
  AZ   3.917   0.083
P＝0.0002(在置信度99％下是显著的)
表4：在一次局部施用Botox和超纯PEIR(“AZ1”)、或Botox和对照聚阳离子PEI(“BA1”)后30分钟的足趾外展分值。显示平均值和标准差。
  组   平均值   标准差
  BA1   0.333   0.211
  AZ1   3.833   0.167
P＝0.0001(在置信度99％下是显著的)
结论：
本实验表明非肽基透皮载体可将治疗剂量的肉毒毒素转运穿过皮肤而无需在之前共价修饰肉毒毒素。这些发现补充了用具有肽基转移试剂进行的实验。使用非肽基或肽基载体获得治疗效果的选择可使施用适合特定的情况、环境和施用方法，加宽了本发明的透皮递送平台的范围。
                       实施例4
具有肽基载体的局部肉毒毒素制剂对前额多汗症和皱纹的治疗
                        功效
本实验表明，通过使用该肽基载体，可将肉毒毒素作为局部试剂治疗性地递送通过完整的皮肤以治疗人受试者上的前额多汗症和皱纹。
用于前额多汗症和皱纹研究的实验方法：
使用具有Nikon TTL Macro-speedlight SB29s闪光灯的NikonD70照相机(Nikon，Inc.USA)在蓝色背景下拍摄受试者的前额的基线和处理后的照片。
使用Sony Digital Handycam摄象机在蓝色背景下拍摄受试者的前额的基线和处理后的录相。
使用10％的局部聚维酮碘溶液(Walgreen Co.，Deerfield，Illinois)和Kingsford′s 100％的玉米淀粉(ACH Food Companies，Inc.，Memphis，Tennessee)进行Minor′s淀粉/碘检测以显示汗的产生。使用无菌棉球(Johnson & Johnson Consumer ProductCompany，Skillman，New Jersey)用碘溶液涂抹受试者的前额，然后让其完全干燥。使用无菌棉球用淀粉轻轻地涂在该区域。在环境室温下通过体育运动引发出汗。当汗溶解碘并和淀粉粉末反应时就出现深蓝色的小点。使用具有Nikon TTL Macro-speedlight SB29s闪光灯的Nikon D70照相机在蓝色背景下拍摄碘-淀粉检测法的基线和处理后的照片。用70％EtOH清洗受试者的前额，然后用去离子水清洗。
在处理实施前，通过用于角质层的非侵入性胶带粘贴方法(non-invasive tape stripping method)预处理受试者的前额上的预先确定的处理区域。将预先剪好的胶带用于处理区域，用力压牢数秒。通过从胶带的一角拉起快速地取下胶带。在取下第一胶带后立即向相同的区域小心地施用第二胶带。重复进行胶带粘贴3至5次。
处理物的配制：
配制无菌的0.9％的氯化钠(Abbott Laboratories，NorthChicago，Illinois)+5％EtOH+5％的标记有A-3C(Donlar BioPolymer，Inc.Bedford Park，Illinois)的短链多聚天冬氨酸溶液的Botox重构溶液(即，每1.0毫升溶液，900微升无菌的0.9％的氯化钠和50微升的100％EtOH和50微升的短链多聚天冬氨酸溶液)。以1毫克/毫升的浓度配制具有0.9％的氯化钠和5％的EtOH的Kn21T(即，以500微升Kn21T为等分，其中加入了25微升100％的EtOH)。如此处所用的，Kn21T是指具有21,000的分子量和TAT分支基团的带正电荷的多聚赖氨酸主链。使用具有18G11/2的不含乳胶成份的注射器(BectonDickinson & Co.，Franklin Lakes，New Jersey)，用1.0毫升重构溶液对100个单位的Botox(Allergan，Irvine，CA)进行重构。通过8次倒转小心地混合重构的Botox。每个受试者使用200单位的Botox。制备“Essentia Botox溶液”，其具有200个单位的Botox和Kn21T+5％EtOH(即，向500微升的Kn21T和25微升100％的EtOH中加入2.0毫升Botox)并室温下放置5分钟以形成复合物。
用重构溶液和Kn21T+5％EtOH制备对照溶液(即向500微升的Kn21T和25微升100％的EtOH中加入2.0毫升重构溶液)并保持在室温。
处理物应用：
受试者靠在桌子上，用防护罩围住眼睛、脸和上半身。使用移液器对受试者的前额均匀地施用处理物，并用戴有无粉剂的腈手套的手指作环形运动将其按摩入皮肤。用薄层Cetaphil润肤霜(moisturizing cream)(Galderma，Fort Worth，TX)覆盖处理区域并温育60分钟。在60分钟温育后，用无菌纱布片除去处理物。将沙布片和手套扔入收集生物危害物的袋中。
结果：
图3描述了在用肽基载体和肉毒毒素组合局部处理后，皱纹长度、深度和宽度显著减少。本实验进一步确认，当和透皮载体组合时，局部施用的肉毒毒素可提供显著的肌肉麻痹以提供美容效果。图4是经处理的皮肤(A)和未处理的皮肤(B)的Mikrosll铸型。在未处理的皮肤的铸型上可见皱纹。
图5和6显示Minor′s淀粉/碘检测法的结果。图5显示施用后2分钟拍摄的照片，图框(A)对应于用Essentia Botox洗剂处理的一侧，图框(B)对应于用只含有Kn21T载体的对照洗剂处理的侧面。图6和图5相同，除了其摄自施用后4分钟之外。注意，在对照洗剂侧的染色更明显，表明在该侧的皮肤分泌的汗更多。也要注意，在未处理侧更早地开始出汗。
结论：
本实施例表明，局部施用的肉毒毒素复合物可在减少细纹和粗皱纹上提供显著的美容益处。该透皮作用进一步确定可用合适的载体实现局部施用肉毒毒素复合物例如此处描述的复合物后的肌肉麻痹。因此本实施例表明肉毒毒素的局部施用可导致肌肉痉挛例如眼睑痉挛(blepharospasm)或斜颈的缓解以及与肌肉痉挛相关的疼痛例如下背疼痛的缓解。
                        实施例5
  具有肽基载体的局部肉毒毒素制剂对腋下多汗症的治疗功效
本实验证明，通过使用该肽基载体是否可将肉毒毒素作为局部试剂治疗性地递送通过完整的皮肤以治疗人受试者的腋下多汗症(每组10个腋窝，在随机双盲模式中对每位患者一个腋窝进行处理，另一个腋窝用作对照)。
腋下多汗症研究的纳入标准(inclusion criteria)：
·年龄：18岁或更大
·健康志愿者
·提供知情同意书并由志愿者签名
·愿意遵从指导和返回以进行继续观察
·具有预先存在的、主观性的多汗症
·受试者未怀孕或未计划在以后3个月内怀孕
·受试者居住在和/或工作在San Francisco或离研究区域较近
·受试者在过去6个月内从未接受腋下出汗症的治疗
·受试者不打算在以后3个月内进行腋下出汗症的治疗
重量测量法：
作为重量测量法的部分，首先使受试者适应进行检测的区域的新环境。确切地，受试者以放松的姿势在室温72-77下坐15分钟。
腋窝准备：(戴上无粉剂的腈手套以进行下列方法。)受试者换上一次性披肩和乳罩(如果是女性)或脱下上身衣服(如果是男性)以完全暴露两个腋窝。预先确定的给药区域为腋窝上长毛的皮肤包括的区域再加上扩展超出长毛皮肤1cm的区域。用取自50ml锥形管中的预湿的无菌沙布片清洗给药区域，使用沙布的一面以相同的方向从上至下进行5次长抚摩擦拭来进行清洗。每次用干净的预湿的沙布片再重复该步骤3次，同时当心不要刺激或摩擦皮肤。将沙布片扔入垃圾。对另一个腋窝重复相同的洗涤方法。通过从腋窝的上部至底部的用力压垫运动用干燥无菌的沙布来干燥腋窝，同时小心不要刺激或摩擦皮肤。然后，在进行重量估计方法后，通过将滤纸置于腋皱下进一步干燥腋窝并使所述滤纸在测试部位驻留5分钟。患者坐起，以放松的位置将其胳膊靠在其身上。将滤纸扔入垃圾。在第一次重量估计前，让受试者休息1分钟而不进行腋下处理。
汗的产量测量(重量估计)：(在这些测量之前戴上一双新的无粉剂的腈手套)。受试者将其手一起举到头的后面以完全暴露腋窝，同时部分倾斜(大约45度)。从锥形贮藏管中取出预先称过重的滤纸并将其放在受试者的腋窝下，将滤纸的顶部沿腋皱线的中心排成列。用手指将滤纸保持原位，同时受试者松弛放下手臂至身体的侧面。受试者坐起，用两只胳膊紧紧地靠着其躯干进行5分钟。当滤纸被牢固地置于两个腋窝下面时开始计时。同时测量两个腋窝。5分钟后，从腋窝取出滤纸并将其放回相同的各锥形管中。先放置的滤纸先取出。拧紧锥形管的盖子以防止汗从管中蒸发。以一分钟间隔再重复两次汗的产生。
Minor′s淀粉/碘检测：
受试者将其手一起举至头的后面以完全暴露腋窝。如前所述用无菌沙布片将碘溶液涂抹在预先确定的腋下区域并让其晾干。当碘已完全干时，用棉球将薄层淀粉涂在由碘覆盖的区域上。在施用淀粉前先让碘晾干以减少假阳性和背景。然后受试者坐起，用双臂紧紧地夹住其躯干。5分钟后，受试者举起其手臂并将手一起置于脑后以完全暴露腋窝。拍摄各腋窝的照片，清楚地标明左腋窝和右腋窝及日期。用70％的EtOH清洗腋窝，然后用无菌去离子水清洗。
处理物制备：
用盐和5％的EtOH以1mg/ml的浓度制备Kn21pr(即，以500微升Kn21pr为等分，向其中加入25微升100％的EtOH)。如此处所用的，Kn21pr是指带正电荷的多聚赖氨酸主链，该主链具有21,000的分子量和包含被保护的寡聚精氨酸的分支基团。使用具有18G11/2的不含乳胶成份的无菌3ml注射器(Becton Dickinson & Co.，FranklinLakes，New Jersey)，用0.75毫升0.9％的氯化钠(AbbottLaboratories，North Chicago，Illinois)对100个单位的Botox(Allergan，Irvine，CA)进行重构。通过倒转8次小心地混合重构的Botox。对每一受试者使用200单位的Botox。用200单位的Botox和5％的EtOH和Kn21pr制备处理溶液(即，向500微升的Kn21pr+25微升100％的EtOH中加入1.5毫升Botox)并在室温下保持5分钟以使之形成复合物。在5分钟的温育期后，加入大约1.0毫升4％的HPC(羟丙基纤维素)(具有1％的EtOH)并使用小的金属调药刀(spatula)轻轻地混合彻底。将均质的处理溶液转移至3ml注射器中和注射器尖盖(syring tip cap)中。(Becton Dickinson and Company，Franklin Lakes，New Jersey)。
用0.9％的氯化钠+5％EtOH和Kn21pr制备对照溶液(即，向500微升Kn21pr和25微升100％的EtOH中加入1.5毫升0.9％氯化钠)并在室温下放置5分钟。在温育后，加入大约1.0毫升4％的HPC(含有1％EtOH)并用小的金属调药刀轻轻地混合彻底。将均质的对照液转移至3ml注射器和注射器尖盖中。
物理物的施用(带上无粉剂的腈手套)：
受试者将其手指交叉扣在一起并将手置于头的背面以完全暴露受试者的腋窝。然后，受试者靠在椅子上呈大约45度的角度。如图7中所示，可视地绘出用于施用的给药区域(即，超出长毛的皮肤1cm的区域)。检查皮肤是否干燥。将标记有表示左边的“L”的经标记的注射器和标记有表示右边的“R”的注射器的注射器尖盖取走，并准备对受试者的腋窝施用。用注射器围绕给药区域均匀地涂上处理溶液并用手指按摩1分钟使之进入皮肤。然后受试者放下其手臂贴在身体侧边并温育60分钟。在60分钟温育后，用无菌沙布片清洁处理物。将沙布片和手套扔入装生物危害物的袋中。允许受试者离开。
结果：
Essentia局部BT减少出汗65％，在图8a中对其进行说明。在用单独的Kn21pr主链(对照)或Kn21pr主链+200U Botox(对基线的比例)治疗(对两侧随机进行)4周后的出汗量。使用NPSS，以p为显著性，在p＜0.05下，通过魏克森讯号等级检定(Wilcoxon signed rank)进行统计分析。[n＝10个受试者]。
第二次比较：基线对4周(参见图8b)。在用单独的kn21pr主链(对照)或kn21pr主链+200U Botox(处理与对照的比例)治疗(两侧随机进行)腋窝4周后的出汗量(每5分钟的mg数)示于图6。使用NPSS，以p为显著性，在p＜0.05下，通过魏克森讯号等级检定进行统计分析。[n＝10]。
图9显示这样的照片，该照片描述了在用用于腋下多汗症的治疗的“Essentia Botox洗剂”进行局部治疗之前和之后的Minor’s淀粉/碘检测。显示对于受试者#12的基线上的淀粉/碘检测对2周后的检测，其中用“Essentia Botox洗剂”(a和c)处理右腋窝，用对照(b和d)给左腋窝施用。这些照片说明在用淀粉碘中的载体+botox治疗后观察到的一般益处。尽管在对照侧观察到一些交叉(和在重量数据上25％的减少一致)，但处理物提供了显著的减少(和在处理侧在重量数据上65％的减少一致)。
结论：
本实施例进一步确定，肉毒毒素复合物的局部施用容易地在患有多汗症(主观地或通过测量判断的)的患者群中在减少出汗上提供了治疗上的益处，所述肉毒毒素是此处公开的根据本发明形成的复合物。在上面所示的前额的情况下和在手掌/足底(此时结合使用手套以在驻留期间限制制剂的扩散)的情况下已提供了该减少出汗的功效。用于提供治疗上的益处的肉毒毒素的该透皮递送进一步确定了所述方法可扩展用于其他情况(其中SNAP功能或乙酰胆碱信号是至关重要的)，例如膀胱功能障碍或痉挛、胃肠施用或皮脂腺分泌以减少臭味或预防/治疗痤疮。

Claims (150)

1.包含肉毒毒素和载体的组合物，所述载体包含聚合物主链，所述聚合物主链具有附着的带正电荷的分支基团，其中所述载体和所述肉毒毒素之间的结合是非共价结合。
2.权利要求1的组合物，其中所述肉毒毒素是肉毒毒素衍生物。
3.权利要求1的组合物，其中所述肉毒毒素包含重组肉毒毒素。
4.权利要求1的组合物，其中所述肉毒毒素包含经修饰的肉毒毒素。
5.权利要求1的组合物，其中所述肉毒毒素选自A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒毒素。
6.权利要求5的组合物，其中所述肉毒毒素是A型肉毒毒素。
7.权利要求5的组合物，其中所述肉毒毒素是B型肉毒毒素。
8.权利要求5的组合物，其中所述肉毒毒素是C1型肉毒毒素。
9.权利要求5的组合物，其中所述肉毒毒素是D型肉毒毒素。
10.权利要求5的组合物，其中所述肉毒毒素是E型肉毒毒素。
11.权利要求1的组合物，其中所述载体包含多肽，所述多肽具有附着的选自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT、触角足PTD、和HIV-TAT的片段或触角足PTD的片段的带正电荷的分支基团，其中下标n1是从0至大约20的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25的奇整数。
12.权利要求11的组合物，其中所述载体包含多肽，所述多肽具有带正电荷的选自-(gly)n1-(arg)n2的分支基团，其中下标n1是从约0至大约20的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25的奇整数。
13.权利要求12的组合物，其中下标n1是从0至大约8的整数。
14.权利要求12的组合物，其中下标n1是从大约2至大约5的整数。
15.权利要求12的组合物，其中下标n2是从大约7至大约17的奇整数。
16.权利要求12的组合物，其中下标n2是从大约7至大约13的奇整数。
17.权利要求11的组合物，其中所述载体包含多肽，所述多肽具有附着的选自HIV-TAT和其片段的带正电荷的分支基团。
18.权利要求17的组合物，其中所述分支基团是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的带正电荷的HIV-TAT片段，其中下标p和q各自独立地是从0至20的整数。
19.权利要求1的组合物，其中所述带正电荷的分支基团按重量计算占至少大约0.05％的载体总重量。
20.权利要求1的组合物，其中所述带正电荷的分支基团按重量计算占大约0.5％至大约45％的载体总重量。
21.权利要求1的组合物，其中所述带正电荷的分支基团按重量计算占大约0.1％至大约30％的载体总重量。
22.权利要求1的组合物，其中所述主链包含带正电荷的多肽。
23.权利要求22的组合物，其中所述主链包含带正电荷的多聚赖氨酸。
24.权利要求23的组合物，其中所述多聚赖氨酸具有从大约10,000至大约1,500,000的分子量。
25.权利要求23的组合物，其中所述多聚赖氨酸具有从大约25,000至大约1,200,000的分子量。
26.权利要求23的组合物，其中所述多聚赖氨酸具有从大约100,000至大约1,000,000的分子量。
27.权利要求1的组合物，其中所述主链包含带正电荷的非肽基载体。
28.权利要求27的组合物，其中所述主链包含带正电荷的聚烯化亚胺。
29.权利要求28的组合物，其中所述聚烯化亚胺是聚乙烯亚胺。
30.权利要求29的组合物，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约10,000至大约2,500,000的分子量。
31.权利要求29的组合物，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约100,000至大约1,800,000的分子量。
32.权利要求29的组合物，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约500,000至大约1,400,000的分子量。
33.权利要求1的组合物，其具有从大约4.5至大约6.3的pH。
34.权利要求1的组合物，当在室温下或在冷冻条件下贮存时其是稳定的。
35.权利要求1的控释组合物。
36.权利要求1的液体组合物。
37.权利要求1的凝胶组合物。
38.权利要求1的组合物，其是乳膏剂、洗剂或软膏剂。
39.权利要求1的组合物，其还包含盐水。
40.权利要求1的组合物，其还包含盐水和pH缓冲系统。
41.用于给受试者施用肉毒毒素的试剂盒，其包含肉毒毒素和对其透皮递送有效的量的载体，所述载体包含聚合物主链，所述主链具有附着的带正电荷的分支基团，其中所述载体和所述肉毒毒素之间的结合是非共价结合。
42.权利要求41的试剂盒，其还包含定制的施药器。
43.权利要求42的试剂盒，其中所述定制的施药器经设计供专业护理人员使用。
44.权利要求42的试剂盒，其中所述定制的施药器经设计供受试者自己使用。
45.权利要求41的试剂盒，其包含预先配制的包含所述肉毒毒素和所述载体的组合物。
46.权利要求41的试剂盒，其中分开地配制所述肉毒毒素和所述载体以在施用之前进行组合。
47.权利要求41的试剂盒，其中在用于通过皮肤给受试者施用所述肉毒毒素的装置中含有所述肉毒毒素。
48.权利要求47的试剂盒，其中所述装置是皮肤贴剂。
49.用于给受试者施用肉毒毒素的试剂盒，其包含用于将肉毒毒素递送给皮肤的装置和组合物，所述组合物包含含有聚合物主链的载体，所述主链具有附着的选自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及触角足PTD的带正电荷的分支基团，其中下标n1是从0至大约20的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25的奇整数。
50.权利要求49的试剂盒，其中所述装置是皮肤贴剂。
51.给受试者施用肉毒毒素的方法，该方法包括将所述肉毒毒素和有效量的载体一起给受试者的皮肤或上皮局部施用，所述载体包含具有附着的带正电荷的分支基团的聚合物主链，其中所述载体和所述肉毒毒素之间的结合是非共价结合。
52.权利要求51的方法，其包括给受试者的皮肤或上皮局部施用有效量的权利要求1的组合物。
53.权利要求51的方法，其包括给受试者的皮肤或上皮分开地施用所述肉毒毒素和所述载体。
54.权利要求51的方法，其中施用所述肉毒毒素以获得想要的生物学效果。
55.权利要求54的方法，其中施用所述肉毒毒素以获得美学或美容上的益处。
56.权利要求54的方法，其中施用所述肉毒毒素以减少或预防免疫应答。
57.权利要求56的方法，其中减少或预防的免疫应答改善了之后所述组合物再施用时的治疗反应。
58.权利要求54的方法，其中施用所述肉毒毒素以预防或减轻和主观或临床多汗症相关的症状。
59.权利要求54的方法，其中局部施用所述肉毒毒素以预防或减轻主观或临床上的张力障碍收缩或肌张力障碍。
60.权利要求54的方法，其中局部施用所述肉毒毒素以预防或减轻和肌肉痉挛相关的症状。
61.权利要求60的方法，其中给受试者的下背部局部施用所述肉毒毒素。
62.权利要求60的方法，其中给受试者的颈部局部施用所述肉毒毒素。
63.权利要求60的方法，其中给受试者的至少一条腿局部施用所述肉毒毒素。
64.权利要求51的方法，其中给受试者的脸部或其一部分局部施用所述肉毒毒素。
65.权利要求51的方法，其中给受试者的腋窝或其部分局部施用所述肉毒毒素。
66.权利要求51的方法，其中给受试者的手掌或足或其部分局部施用所述肉毒毒素。
67.权利要求51的方法，其中给受试者的背部或颈部或其部分局部施用所述肉毒毒素。
68.权利要求51的方法，其中给受试者的腹股沟或其部分局部施用所述肉毒毒素。
69.权利要求51的方法，其中给受试者的手或足或其部分局部施用所述组合物。
70.权利要求51的方法，其中给受试者的肘、上臂、膝盖或大腿，或其部分局部施用所述肉毒毒素。
71.权利要求51的方法，其中给受试者的臀部或其部分局部施用所述肉毒毒素。
72.权利要求51的方法，其中给受试者的躯干或其部分局部施用所述肉毒毒素。
73.权利要求51的方法，其中给受试者的骨盆或其部分局部施用所述肉毒毒素。
74.权利要求51的方法，其中施用所述肉毒毒素以产生或增强免疫应答。
75.权利要求51的方法，其中局部施用所述肉毒毒素以预防或减轻和偏头痛相关的症状。
76.权利要求51的方法，其中局部施用所述肉毒毒素以预防或减轻痤疮。
77.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素是肉毒毒素衍生物。
78.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含重组肉毒毒素。
79.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含经修饰的肉毒毒素。
80.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素选自A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒毒素。
81.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素是A型肉毒毒素。
82.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素是B型肉毒毒素。
83.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素是C型肉毒毒素。
84.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素是D型肉毒毒素。
85.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素是E型肉毒毒素。
86.权利要求51的方法，其中所述载体包含聚合物主链，所述主链具有附着的选自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT、触角足PTD、和HIV-TAT或触角足PTD的片段的带正电荷的分支基团，其中下标n1是从0至大约20的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25的奇整数。
87.权利要求86的方法，其中所述载体包含多肽，所述多肽具有附着的选自-(gly)n1-(arg)n2的带正电荷的分支基团，其中下标n1是从约0至大约20的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25的奇整数。
88.权利要求87的方法，其中下标n1是从0至大约8的整数。
89.权利要求87的方法，其中下标n1是从大约2至大约5的整数。
90.权利要求87的方法，其中下标n2是从大约7至大约17的奇整数。
91.权利要求87的方法，其中下标n2是从大约7至大约13的奇整数。
92.权利要求86的方法，其中所述载体包含多肽，所述多肽具有附着的选自HIV-TAT和其片段的带正电荷的分支基团。
93.权利要求92的方法，其中所述分支基团是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的带正电荷的HIV-TAT片段，其中下标p和q各自独立地是从0至20的整数。
94.权利要求51的方法，其中所述带正电荷的分支基团按重量计算占至少大约0.05％的载体总重量。
95.权利要求51的方法，其中所述带正电荷的分支基团按重量计算占大约0.5％至大约45％的载体总重量。
96.权利要求51的方法，其中所述带正电荷的分支基团按重量计算占大约0.1％至大约30％的载体总重量。
97.权利要求51的方法，其中所述主链包含带正电荷的多肽。
98.权利要求97的方法，其中所述主链包含带正电荷的多聚赖氨酸。
99.权利要求98的方法，其中所述多聚赖氨酸具有从大约10,000至大约1,500,000的分子量。
100.权利要求98的方法，其中所述多聚赖氨酸具有从大约25,000至大约1,200,000的分子量。
101.权利要求98的方法，其中所述多聚赖氨酸具有从大约100,000至大约1,000,000的分子量。
102.权利要求51的方法，其中所述主链包含带正电荷的非肽基载体。
103.权利要求102的方法，其中所述带正电荷的非肽基聚合物是聚烯化亚胺。
104.权利要求102的方法，其中所述聚烯化亚胺是聚乙烯亚胺。
105.权利要求104的方法，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约10,000至大约2,500,000的分子量。
106.权利要求104的方法，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约100,000至大约1,800,000的分子量。
107.权利要求104的方法，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约500,000至大约1,400,000的分子量。
108.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含重组肉毒毒素。
109.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素以具有从大约4.5至大约6.3的pH的组合物形式施用。
110.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素以控释组合物的形式施用。
111.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含在液体组合物中。
112.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含在凝胶组合物中。
113.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含在乳膏剂、洗剂或软膏剂形式的组合物中。
114.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含在还含有盐水的组合物中。
115.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含在还含有盐水和pH缓冲系统的组合物中。
116.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含在用于分配肉毒毒素的装置中，该装置局部地用于受试者的皮肤或上皮。
117.权利要求116的方法，其中所述装置是皮肤贴剂。
118.权利要求117的方法，其中所述装置是小室胶囊化(cell-encapsulating)装置。
119.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和粘膜分泌相关的症状。
120.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻肥胖或其症状。
121.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻炎症或其症状。
122.权利要求121的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和银屑病相关的症状。
123.权利要求122的方法，其中将所述组合物和其他治疗形式一起施用。
124.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻打鼾。
125.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和糖尿病相关的皮肤症状。
126.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以促进伤口愈合。
127.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和自主神经功能障碍有关的症状。
128.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和大脑性瘫痪相关的症状。
129.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和桥本甲状腺炎相关的症状。
130.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和乳腺疾病相关的症状。
131.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以改变毛发生长。
132.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和甲状旁腺疾病相关的症状。
133.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和运动障碍相关的症状。
134.权利要求133的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和帕金森氏疾病相关的症状。
135.权利要求133的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和震颤相关的症状。
136.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和癫痫相关的症状。
137.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和内耳疾病相关的症状。
138.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和泌尿疾病相关的症状。
139.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻其他胆碱能控制的分泌。
140.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和神经精神紊乱相关的症状。
141.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和受伤的肌肉相关的症状。
142.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和耳疾病相关的症状。
143.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和癌症相关的症状。
144.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和神经陷夹病症(nerve entrapment disorders)相关的症状。
145.权利要求54的方法，其中局部地施用所述肉毒毒素以预防或减轻和高钙血症相关的症状。
146.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素包含融合蛋白。
147.权利要求5的组合物，其中所述肉毒毒素是F型肉毒毒素。
148.权利要求5的组合物，其中所述肉毒毒素是G型肉毒毒素。
149.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素是F型肉毒毒素。
150.权利要求51的方法，其中所述肉毒毒素是G型肉毒毒素。
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