SI20566A - Stabilne tekoče oblike botulinusovega toksina - Google Patents

Abstract

Izum se nanaša na tekoče oblike botulinusovega toksina, ki so stabilne pri shranjevanju v tekoči obliki pri standardni temperaturi hladilnika za najmanj 1-2 leti in pri shranjevanju pri višjih temperaturah za najmanj 6 mesecev. Izum se prav tako nanaša na metode zdravljenja z uporabo teh oblik in na uporabo teh oblik pri izdelavi zdravil za različne terapevtske in kozmetične postopke.ŕ

Description

STABILNE TEKOČE OBLIKE BOTULINUSOVEGA TOKSINA

Področje izuma

Izum se nanaša na terapevtske oblike botulinusovega toksina, ki so stabilne pri shranjevanju v tekoči obliki pri 0-10°C v obdobju najmanj enega do dveh let.

Reference

Consky, E.S., Lang, A.E. (1994) V: Therapy with Botulinum Toxin. Jankovič, J. in Hallet M., izdaja Marcel Dekker, Inc., New York.

Frankel, A.S., in Kamer, F. M. (1998) Chemical brovvlift. Arch. Otolaryngol. Surg. 124(3): 321-323.

Gartlan, M.G., in Hoffman, H.T. (1992) Crystalline preparation of botulinum toxin type A (Botox); Degradation in potency with storage. Otolaryngology - Head and Neck Surgery 102(2): 135-140.

Hambleton, P., Capel, B., Bailey, N., Heron, N.I., Crooks, A., Melling, J. (1981) Production, purification and toxoiing of Clostridium bolulinum type A toxin. Biomedical Aspects of Botulism, Academic Press, NY.

Hardman, J.G. in Limbird, L.E., Eks. izdaja (1996) Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics, 9. izdaja McGraw-Hill, New York.

Hoffman, H.T., in Gartlan, M.G. (1993) Stability of botulinum toxin in clinical use. Botulinum and Tetanus Neurotoxins (B.R. DasGupta, urednik), Plenum Press, NY.

Johnson, E.A., Goodnough, M.C., Borodic, G.E., (1997) U.S. Patent 5,696,077.

Lachman, L., Lieberman, H.A., Kanig, J.L. (1986) The Theory and Practice of Industrial Pharmacy (3. izdaja), Lea & Febiger, Philadelphia

Melling, J., Hambleton, P., in Shone, C.C. (1988) Clostridium botulinum toxins: nature and preparation for clinical use. Eye 2: 16-23

Physician’s Desk Reference, 51. izdaja, 1997. (“PDR”) Medical Economics Company, Inc., Montvale, NJ.

Schantz., D.J. in Kautter, D.A. (1978) Standardized assay for clostridium botulinum toxins, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 61:1.

Simpson, L.L. (1993) The actions of clostridial toxins on storage and release of neurotransmitters. Natural and Synthetic Neurotoxins, A.L. Harvey, urednik, Academic Press Ltd., San Diego, stran 277-317

Tsui, J.K.C. (1986), Lancet 2: 245-247

Osnova izuma

Botulinusov toksin je polipeptidni produkt anaerobne bakterije Closlridium botulinum. Toksin povzroča paralizo mišičevja pri sesalcih z blokiranjem presinaptičnega sproščanja nevrotransmiterja acetilholina na nevromuskularnem stičišču. Medtem ko je bil toksin dolgo povezovan z usodnim botulizmom, je bil v zadnjih letih uporabljan v terapevtske namene za zdravljenje določenih nekontroliranih motenj v gibanju mišičevja, vključno s fokalnimi distonijami (kot je strabizem, osnovni blefarospazem in hemifacialni spazem), kot tudi segmentalnimi distonijami (kot je tortikolis, oromandibularna distonija in spastična disfonija) in spastičnostjo. Toksin se je prav tako izkazal kot koristen pri številnih kozmetičnih indikacijah, kot je nekirurška redukcija gub na obrazu kot tudi pri zdravljenju hiperhidroze (prekomerne perspiracije).

Danes sta v namene zdravljenja ljudi registrirana dva preparata na osnovi botulinusovega toksina (tip A) - “ΒΟΤΟΧ®” (Oculinum®; Allergan Inc., Irvine, CA) in “DYSPORT®” (Spexwood Pharmaceuticals, Ltd.; U.K.). Obe obliki sta kliničnim zdravnikom dosegljivi v liofilizirani (zamrznjeni - posušeni) obliki primerni za raztapljanje tik pred uporabo.

Zaradi razlik med pacienti glede na potrebe po odmerku, se lahko odmerek, ki je potreben za vsakega posameznega pacienta pomembno razlikuje. Nadalje, pri določenih indikacijah sme klinični zdravnik uporabiti samo majhen delež vsebnosti pripravljene ampule v daljšem časovnem obdobju, ki je lahko nekaj ur. Čeprav je ena objavljena publikacija navajala, da so lahko tekoče oblike botulinusovega toksina ponovno zamrznjene in odtajane z v bistvu ohranjeno aktivnostjo (Schantz in Kautter, 1978), je več zadnjih študij, ki ocenjujejo aktivnost raztopljenega oz. preoblikovanega toksina dokazalo, da raztopljen in za 12 ur v hladilnik (približno 4°C) shranjen “ΒΟΤΟΧ®” izgubi najmanj 44% aktivnosti. Nadalje, po raztapljanju in shranjevanju v zmrzovalnik pri -70°C, seje po dveh tednih njegova učinkovitost zmanjšala za 70% (Gartlan in Hoffman, 1993). Zaradi teh razlogov je priporočeno, da se takšne sestavine ne uporabijo več kot 4 ure po raztapljanju. To lahko vodi v slabo izkoriščanje zdravila in stroške za pacienta.

Potemtakem je očitna potreba po “ready-to-use” tekoči obliki botulinusovega toksina, ki je primerna za takojšnjo in neposredno rabo in, ki bi jo bilo mogoče ustrezno transportirati, shranjevati in uporabljati v takšni obliki kot jo potrebuje klinični zdravnik. Pričujoč izum se nanaša na takšno obliko.

Povzetek izuma

Pričujoč izum je usmerjen na stabilne tekoče oblike botulinusovega toksina namenjenega za uporabo v farmacevtskih preparatih. Oblike, ki so predmet pričujočega izuma, imajo to prednost, da so v nasprotju s trenutno razpoložljivimi oblikami stabilne v tekoči obliki med shranjevanjem v daljših časovnih obdobjih (eno leto ali dlje) pri standardnih temperaturah hladilnika (približno 4±2°C ali približno 2-8°C ali bolj splošno, v območju od 0 do 10°C). Podobno so oblike stabilne v tekočem stanju najmanj šest mesecev pri shranjevanju na “sobni temperaturi” (približno 25° ali bolj splošno v območju od 10-30°C). Takšne oblike so še posebej učinkovite pri stanjih, ko nastopi redukcija ali inhibicija holinergičnega živca, še posebej mišice ali mišične skupine, žleze ali ko je organ ameliorativen. Primeri takšnih pogojev so opisani v tem kontekstu.

Izum se najprej nanaša na stabilno tekočo farmacevtsko obliko, ki vsebuje izoliran botulinusov toksin in pufer, ki je sposoben vzdrževati pufrano pH območje med približno pH5 in pH6. V skladu s tem splošno oblikovanim stališčem, je toksin pomešan v pufrano tekočino in tako oblikuje tekočo obliko, ki ima pH med 5 in 6, oz. zlasti med pH 5.4 in pH 5.8 in preferenčno približno 5.5-5.6. Nastala oblika je stabilna najmanj eno leto in tudi do najmanj dveh let v primeru, ko je temperatura v območju od približno 0-10°C ali najmanj 6 mesecev pri prej navedenih višjih temperaturah. V splošnem lahko glede na pričujoč izum oblike, ki so predmet izuma, vsebujejo katerikoli izmed znanih serotipov botulinusovega toksina (npr. serotipe A, B, C), C₂, D, E, F ali G) ali druge serotipe z ekvivalentno biološko aktivnostjo. Preferenčno je botulinusov toksin uporabljen v obliki serotipov botulinusovega toksina A ali B, ki sta izolirana iz Clostridium botulinum.

Preferenčno je botulinusov toksin tipa B v obliki oz. učinkovini prisoten kot kompleks z molekulsko maso 700 kilodaltonov v koncentraciji približno 100-20000 U/ml in še zlasti v območju koncentracij med približno 1000-5000 U/ml. Ko je v obliki oz. učinkovini uporabljen tip A, je le ta prisoten v koncentraciji približno 20-2000 U/ml, in zlasti med približno 100-1000 U/ml. Če je v obliki oz. učinkovini uporabljena kombinacija različnih serotipov, je lahko območje odmerkov ali koncentracij, pri katerih so učinkoviti, določeno v sorazmerju z odmerki in koncentracijami navedenimi v tem opisu, glede na njihovo posamezno biološko aktivnost.

Pufri, ki so lahko uporabljeni v obliki oz. učinkovini so fiziološki pufri, ki veljajo kot varni za injiciranje v tkivo sesalca, še posebej v človeka. Značilni pufri vsebujejo predvsem pufrne sisteme s fosfatno, fosfat-citratno, sukcinatno, acetatno, citratno, akonitatno, malatno in karbonatno osnovo. Učinkovina bo preferenčno vsebovala tudi ekscipientni protein, kot je človeški serumski albumin ali želatina. Razumljivo je, da bodo ekvivalente prej omenjenih vzorčnih pufrov in ekscipientnih proteinov identificirali in koristno uporabljali ljudje z ustreznimi izkušnjami na področju. Oblika s toksinom, ki je predmet pričujočega izuma, je lahko embalirana v kakršenkoli izmed številnih zabojev ali ampul, ki so znane na področju, dokler v takšni embalaži ohranja svojo aktivnost.

V zvezi s tem je predmet izuma tudi metoda zdravljenja pacienta v primeru, ko je potrebna inhibicija holinergičnega prenosa, kot je holinergični prenos do izbrane mišice ali mišične skupine ali do določenega predela žleze, kot so žleze lojnice, ali do določenega organa s holinergično inervacijo. Izum se prav tako nanaša na uporabo učinkovin, ki so predmet izuma, v pripravkih zdravil za zdravljenje takšnih indikacij.

Primeri terapevtskih in kozmetičnih indikacij, ki so lahko zdravljene z uporabo učinkovine botulinusovega toksina, so predvsem blefarospazem, strabizem, hemifacialni spazem, otitis media, spastični kolitis, anizmus, sečna destruzor-sfinkter dissinergija, stiskanje čeljusti, ukrivljenost hrbtenice, spastičnost, kot je spastičnost zaradi ene ali več skupin, ki sestojijo iz udarca, poškodbe hrbtenjače, zaprte poškodbe glave, cerebralne paralize, multiple skleroze in Parkinsonove bolezni in distonije, (npr. spastični tortikolis) (cervikalna distonija), spastična disfonija, distonija uda, laringealna distonija, oromandibulama (Meige) distonija). Učinkovina je lahko uporabljena na perineumu (perinealnih mišicah) porodnice, ki rojeva, za relaksacijo teh mišic. Primeri kozmetičnih indikacij se nanašajo na delovanje učinkovine na mišice, ki povzročajo nastanek gub in zgrbančenega obraza. Druge indikacije za učinkovino so miofascialna bolečina, glavobol povezan z migreno, vaskulame motnje, nevralgija, nevropatija, artritisna bolečina, bolečina hrbta, hiperhidroza, rinoreja, astma, prekomerno slinjenje in prekomerno izločanje želodčne kisline.

Natančno določeni načini uporabe učinkovin, ki so predmet izuma, so intramuskulama uporaba, subkutana uporaba ali iontoforezna uporaba. V raziskavah, ki so bile izvedene v podporo pričujočemu izumu, je bilo na primer ugotovljeno, daje botulinusov toksin tipa B učinkovit pri obvladovanju cervikalne distonije pri intramuskulami uporabi v deljenih ali posameznih dnevnih odmerkih med 5000-1000 enotami U.

Naslednji vidik izuma se nanaša na metode zdravljenja pacientov, ki so razvili imunost ali odpornost na določen serotip botulina, s stabilno tekočo obliko, ki vsebuje drugi serotip. Pacient, ki je odporen na botulinusov toksin serotipa A, je na primer lahko zdravljen s stabilno tekočo obliko, ki vsebuje katerikoli serotip botulina B, C_b C₂, D, E, F ali G ali pacient, kije odporen na botulinusov toksin serotipa B, je lahko zdravljen s stabilno tekočo obliko, ki vsebuje katerikoli serotip botulina A, C_b C₂, D, E, F in G. Na ta način se ponovno pridobi učinkovitost za določen serotip.

Ti in drugi predmeti ter lastnosti glede na izum bodo postali bolj razumljivi po prebiranju podrobnega opisa, ki sledi, v povezavi s spremljajočimi slikami.

Podroben opis izunta

Pričujoč izum se ukvarja s stabilnimi tekočimi farmacevtskimi oblikami botulinusovega toksina in njihovo uporabo. Preparati botulinusovega toksina, ki so komercialno dosegljivi v različne terapevtske in kozmetične namene, morajo biti zaradi nestabilnosti aktivnih toksinskih sestavin v raztopini, ponovno raztopljeni iz liofiliziranih sestavin za katere veljajo stroge zahteve glede shranjevanja. Na primer, “ΒΟΤΟΧ®” je mogoče dobiti v obliki liofiliziranega prahu, ki mora biti poslan in shranjen v hladilniku pri ali pod -5°C in ponovno raztopljen z dodatkom določene množine solne raztopine tik pred uporabo. Po raztapljanju je priporočljivo, da je oblika uporabljena na pacientu v 4 urah in da je vsak produkt v tem času hlajen (PDR, 1997); zamrzovanje in odtajanje že ponovno raztopljenega produkta ni priporočljivo (Hoffman, 1993).

Pričujoč izum se nanaša na stabilno tekočo obliko, ki vsebuje botulinusov toksin in ki je stabilna kot tekočina najmanj eno leto pri standardnih temperaturah hladilnika in najmanj šest mesecev pri sobni temperaturi. Prednost te oblike je v tem, da ne zahteva posebnih pogojev shranjevanja ali transportiranja in da je zmanjšana možnost napak pri redčenju toksina, ki bi lahko vodile do predoziranja.

I. Definicije

Kot je uporabljen v kontekstu, se termin “stabilen” (angl. stable) nanaša na zadrževanje biološke aktivnosti ali učinkovitosti biološko aktivne snovi, natančneje botulinusovega toksina, v določenem ali nedoločenem časovnem obdobju.

Termin “botulinusov toksin” (angl. botulinum toxin) se nanaša na biološko aktiven protein ali proteinski kompleks, ki ga proizvaja bakterija Clostridium botulinum. Termin se nanaša na katerekoli izmed najmanj osmih znanih serološko različnih toksinov (A, B, C), C₂, D, E, F in G) kot tudi na druge botulinusove toksine, ki imajo enako splošno sposobnost inhibiranja holinergične nevrotransmisije, ki tvori aktivno molekulo. Termin se prav tako lahko nanaša na nosilni protein, ki prav tako nastaja iz C. botulinum in ki tvori kompleks z aktivno molekulo, kot je opisano v delu IIA. Serotipi botulinusovega toksina so si v skladu z opisom spodaj farmakološko podobni, razlikujejo pa se imunološko. Na splošno ima aktivna toksinska molekula molekularno velikost med približno 145 in 170 kilodaltoni (kD). V kontekstu pričujočega izuma je mogoče razumeti, da toksinski protein vključuje toksine in nosilne proteine, ki so izolirani iz naravnega vira, kot tudi ustrezne toksine in nosilne proteine, ki rekombinantno nastanejo po metodah, ki so znane na področju tehnike. Še več, termin “botulinusov toksin” se nanaša na proteine z amino kislinskimi sekvencami, ki vključujejo ohranljive amino kislinske substitucije, vključno z izbrisom, glede na znane sekvence botulinusovega toksina, kot je opisano spodaj.

“Biološka aktivnost” botulinusovega toksina se nanaša na njegovo sposobnost blokiranja nevrotransmisije v sinapsah z acetilholinskimi receptorji z blokiranjem sproščanja acetilholina iz živčnih končičev. Termin se v kontekstu uporablja izmenoma s termini “inhibiranje holinergične transmisije”, “inhibiranje holinergičnega sprožanja”, “redukcija holinergičnega sprožanja” in ustreznimi odstopanji. Med metodami za določanje biološke aktivnosti toksina in vitro je v kontekstu opisana metoda določanja LD₅₀ na miših. “Enota” aktivnosti pri pogojih tega testa je definirana kot količina toksinskega proteina, ki je potreben za pomor 50% testiranih miši pri danem odmerku. Funkcionalna definicija tega termina je razvidna iz primera 2.

Eno ali tričrkovne okrajšave v kontekstu pogosto uporabljanih amino kislin se nanašajo na: alanin (A, Ala), cistein (C, Cys), asparaginsko kislino (D, Asp), glutaminsko kislino (E, Glu), fenilalanin (F, Phe), glicin (G, Gly), histidin (H, His), izolevcin (I, Ile), lizin (K, Lys), levcin (L, Leu), metionin (M, Met), asparagin (N, Asn), prolin (P, Pro), glutamin (Q, Gin), arginin (R, Arg), serin (S, Ser), treonin (T, Thr), valin (V, Val), triptofan (W, Trp), tirozin (Y,Tyr).

Termin “tekoča farmacevtska oblika” se nanaša na farmacevtsko aktivne preparacije zdravil ali bioloških učinkovin, ki so lahko za daljše časovno obdobje shranjene v tekočem farmacevtskem ekscipientu, kot je pufrana solna raztopina ali fiziološki pufer. Oblika je lahko koncentrirana oblika, ki je pred uporabo razredčena v podobni ali drugačni raztopini.

Termin “pufer” se nanaša na spojino, ponavadi sol, ki raztopljena v vodnem mediju služi za vzdrževanje koncentracije prostega vodikovega iona v raztopini znotraj določenega pH območja tudi po tem, ko so vodikovi ioni dodani ali odstranjeni iz raztopine. Govorimo o tem, da ima sol ali raztopina “pufrno kapaciteto” ali da takšna sol ali raztopina v takšnem območju raztopino pufra. Na splošno velja, da bo imel pufer zadostno pufrno kapaciteto v območju, kije znotraj ±1 pH enote njegove pK vrednosti. “Fiziološki pufer” je pufer, ki je uporabljen kot del farmacevtskega preparata netoksičen za sesalce, posebno človeka. V opisu so podani primeri relevantnih fizioloških pufrov glede na kontekst pričujočega izuma.

“Farmacevtsko sprejemljiva tekočina” je tekočina za katero velja, da je varna za uživanje ali vbrizgavanje v sesalce, posebej ljudi.

Termin “ekscipientni protein”, kot je uporabljen v kontekstu, se nanaša na protein, ki je dodan k farmacevtsko aktivnemu preparatu pri čemer pa ne vpliva na preparat z dodatno znatno biološko aktivnostjo. Primeri ekscipientnih proteinov so predvsem serumski albumini, posebno človeški serumski albumin in želatina. Takšni proteini bodo po možnosti relativno ne - imunogeni za sesalce na katerih bo farmacevtska oblika uporabljena.

Termin “vsebovati”, kot je uporabljen v kontekstu pričujočega izuma in še posebej v kontekstu patentnih zahtevkov, ima pomen termina “vključevati”, “obsegati” ali “označiti z”. Sestavina ali metoda, ki vsebuje elemente A, B in C lahko vključuje poleg A, B in C tudi druge nenavajane elemente, kot sta X ali Y.

Termin “okoli”, kot je uporabljen v kontekstu pričujočega izuma in še posebej v kontekstu patentnih zahtevkov, pomeni “približno” ali “blizu”. V kontekstu številčnih vrednosti, ne da bi bili zavezani točni številčni opredelitvi, je lahko termin razumljen kot da določa vrednosti, ki so ±10% vrednosti ali navajanega območja.

Vsi drugi termini, ki so uporabljeni v kontekstu, morajo biti razumljeni kot običajne definicije oz. označbe znane strokovnjakom s področja, ali kot definicije, ki so navedene v standardnem medicinskem ali znanstvenem slovarju.

II. Botulinusov toksin

Kot je bilo omenjeno zgoraj, je botulinusov toksin polipeptidni produkt, ki ga proizvajajo različne spore Clostridium botulinum. Te spore proizvajajo najmanj osem znanih serološko različnih toksinov (A, B, C_b C₂, D, E, F in G). C. barati in C. butyricum proizvajata po en serotip, ki je podoben serotipoma E oz, F (Simpson, 1993). Na splošno imajo toksinske molekule molekularno velikost med približno 145 in 170 kilodaltonov (kD). V nekaterih primerih se aktivne toksinske molekule sestoje iz dveh disulfidno povezanih verig oblikovanih iz polipeptida. Na primer, botulinusov toksin tipa B nastane iz enega prekurzorskega polipeptida velikosti 150 kD. Maksimalna aktivnost je dosežena, ko iz njega nastaneta dva fragmenta, in sicer ti. težka veriga (H-veriga), 100 kD, in lahka veriga (L-veriga), 50 kD, ki sta medseboj povezani preko disulfidne vezi. Naravna oblika toksina se nekovalentno veže na netoksične carrierje oz. nosilne proteine, ki jih prav tako proizvaja C. botulinum. Ti nosilni proteini se vežejo na toksinske verige in tako tvorijo komplekse velikosti 900 kD (tip A) in preferenčno približno 700 kD za tip B. Nosilni proteini so čiščeni skupaj s toksini in optimalno sooblikujejo del oblik, ki so opisane v kontekstu.

Različni serotipi botulinusovega toksina kažejo različne posebnosti pri vezanju v celicah. Zdi se na primer, da se toksina tipa A in E vežeta na isto sinaptosomalno vezivno mesto, medtem ko se toksin tipa B veže na drugo mesto in ne “tekmuje” za vezanje na vezivno mesto tipa A/E (Melling, 1988). Medtem ko ni željeno da bi šlo za vezanje po določeni teoriji ali mehanizmu, je verjeti, da H-veriga toksina skrbi za nevronalno celično vezanje in celično penetracijske aktivnosti, medtem ko L-veriga deluje tako, da inhibira acetilholinsko sproščanje v sinapsi. Nadalje, verjeti je, da tipa A in B botulinusovega toksina uporabljata nekoliko drugačne mehanizme za učinkovito inhibicijo acetilholinskega sproščanja: tip A cepi Synapse Associated Protein - 25 (SNAP-25) in tip B cepi Vesicle-Associated Membrane Protein (VAMP, ali sinaptobrevin); oba omenjena proteina pa sta komponenti, ki se sproščata iz sinapse.

Vsi toksinski serotipi C. botulinum-a vodijo do skupnega fiziološkega rezultata pri sesalcih. Vsi namreč inhibirajo ah blokirajo holinergično sinapsično aktivnost, ki vodi do delne ah popolne paralize mišičevja ah blokade ah inhibicije organa ah žlezne funkcije, odvisno od mesta uporabe. Glede na to je lahko oblika, ki je predmet pričujočega izuma, uporabljena s katerimkoli serotipom botulinusovega toksina, ki nastane iz C. botulinum, za katerega so značilne zgoraj opisane biološke aktivnosti. Amino kislinske sekvence večine trenutno znanih serotipov so prav tako poznane ah pa so lahko določene z na področju znanimi metodami. Razumljivo je, da mora biti v kontekstu pričujočega izuma, oblika botulinusovega toksina nadalje razložena z vključitvijo rekombinantno grajenega botulinusovega toksina, ki ima ohranljive amino kislinske substitucije glede na takšne znane sekvence. Na splošno bodo takšne substitucije opravljene iz standardnih substitucijskih razredov naravnih amino kislin. Na primer, standardni substitucijski razredi so lahko šest razredov, ki temeljijo na skupnih lastnostih stranskih verig in najvišji pogostosti substitucije v homolognih proteinih v naravi, kot je na primer določeno z na področju poznano standardno pogostostjo izmenjave matriksa, kot je Dayhoffova pogostost izmenjave matriksa. Na primer pri Dayhoffovem matriksu razredi: razred I: Cys; razred II: Ser, Thr, Pro, Hyp, Ala in Gly, ki predstavljajo kratke alifatske stranske verige in stranske verige z OH skupinami; razred III: Asn, Asp, Glu in Gin, ki predstavljajo nevtralne in negativno nabite stranske verige, ki so sposobne tvoriti vodikove vezi; razred IV: His, Arg in Lys, ki predstavljajo bazične polarne stranske verige; razred V: Ile, Val, in Leu, ki predstavljajo razvejane alifatske stranske verige, in Met; in razred VI: Phe, Tyr in Trp, ki predstavljajo aromatske stranske verige. Nadalje, vsaka skupina lahko vključuje sorodne amino kislinske analoge, kot je ornitin, homoarginin, N-metil lizin, dimetil lizin ah trimetil-lizin v razredu IV in halogeniran tirozin v skupini VI. Nadalje, razredi lahko vključujejo obojne, L in D stereoizomere, čeprav so L-aminokisline za substitucijo preferirane. Za primer, substitucija Asp z drugim preostankom razreda III, kot je Asn, Gin ali Glu, je ohranljiva substitucija.

Medtem ko je lahko aktivnost botulinusovega toksina izmerjena z uporabo na področju poznanih elektrofizioloških testov, se aktivnost na splošno meri z vbrizgom toksina v majhne živali, kot je miš, in določanjem odmerka toksina, ki je potreben za smrtnost v povprečju 50% testiranih živali. Govorimo o “smrtni dozi - 50” ali LD₅₀, ki je definirana kot enota biološke aktivnosti. Po konvenciji so odmeiki /a h-iiipevlsko standardizirani glede na te enote. Kot je detaljno diskutirano v poglavju HIB spodaj, lahko imajo različni serotipi različno terapevtsko učinkovitost za človeka izmerjeno v enotah LD₅₀. Terapevtski odmerki so lahko določeni na osnovi teh informacij z metodami, ki so znane na področju.

III. Priprava botulinusovega toksina

To poglavje opisuje metode za pripravo botulinusovega toksina uporabljenega v oblikah glede na pričujoč izum.

A. Čiščenje botulinusovega toksina iz C. botulinum

To poglavje govori o splošnih metodah za pripravo očiščenega botulinusovega toksina iz kultiviranega C. botulinum na primeru botulinusovega toksina tipa B. Poleg metod, ki so navedene, so na področju poznane tudi alternativne metode za pripravo botulinusovega toksina tipa A in B, kot tudi drugih znanih serotipov.

Kot je bilo omenjeno zgoraj je aktivna sestavina v oblikah pričujočega izuma proteinska komponenta ekstraktov C. botulinum znana kot botulinusov toksin. Gre za aktivno komponento molekulske teže med približno 145-170 kD, ki je ponavadi prisotna v naravnem proteinskem kompleksu z veliko višjo molekulsko težo. V tem poglavju so navedeni primeri metod za čiščenje različnih botulinusovih toksinov, s povdarkom na botulinusovem toksinu serotipov A in B. Razumeti je, da splošna znanstvena literatura predpisuje ravnanje z alternativnimi metodami čiščenja toksinov. Osebe z izkušnjami na strokovnem področju bodo sposobne identificirati oz. izbrati takšne metode in jih uporabiti v primeru določenega toksina, ki ga želimo uporabiti v oblikah pripravljenih glede na pričujoč izum.

Običajno je botulinusov toksin tipa B izoliran po na področju znanih metodah kot kompleks iz visoko titernih fermentacij kultur C. botulinum. Matične kulture je mogoče dobiti v Združenih državah pri institucijah z licenco ustreznega centra (“Center for Disease Control (CDC)”) ali drugje, seveda v skladu z nacionalno zakonodajo glede distribucije organizmov. Za čiščenje botulinusovega toksina tipa B sta primerna izhodna materiala C. botulinum Okra ali Bean B. Z zamrznjenimi matičnimi kulturami cepimo medij, kot je tioglikolatni medij ali triptozni peptonski medij ter že odrasle kulture. Sledi postopek v skladu s spodaj opisanimi metodami, ki so podrobno obravnavane v ameriškem patentu U.S. Patent 5,696,077. Le ta je v nadaljevanju bodisi opisan ali pa naveden kot referenca.

Na kratko, kulture so razmnožene po na področju znanih metodah, da bi tako proizvedle zadostno količino začetnega bakterijskega materiala, ki proizvaja željen delež toksina. Na splošno velja, daje za nastanek 0.5 gramov teksina potrebnih 20 litrov bakterijskih kultur. Kulture so nato izpostavljene sobni temperaturi, pH pa je naravnan na vrednost pH 3.5 z žveplovo ali drugo primerno kislino. Sledi usedanje precipitata in dekantiranje prozornega supernatanta oz. preostanka nad usedlino. K precipitatu je nato ob mešanju dodan kalcijev klorid, volumen pa je povečan z deionizirano vodo, tako daje končna koncentracija CaCl₂ približno 150 mM. PH je povišan na približno nevtralno vrednost (pH 6.5), raztopina toksina pa je razbistrena s centrifugiranjem. Z nastavitvijo pH vrednosti na pH do 3.7 se toksin nato ponovno izloči v obliki oborine oz. precipitata. Sledi usedanje nastalega precipitata, zbiranje toksičnega precipitata s centrifugiranjem, nato pa ponovno raztapljanje v pufru (pH 5.5) in temeljito dializiranje čez noč ob uporabi istega pufra. Dializiran toksin je nato centrifugiran, nastal supernatant pa kromatografiran skozi anionsko izmenjalno kolono (DEAE). Nevezani deli so zbrani in testirani na vsebnost proteina. Sledi usedanje toksinskih kompleksov iz te frakcije ob dodatku amonijevega sulfata do približno 60% nasičenja. Nastali delci so nato raztopljeni v fosfatnem pufru in dializirani ob uporabi istega pufra (pH 7.9). Tako očiščena toksinska preparacija se lahko uporablja za pripravo oblik.

Metode za pripravo botulinusovega toksina tipa A so prav tako poznane na strokovnem področju. Na primer, Hambleton s sodelavci (1981) in Melling s sodelavci (1988), ki so v kontekst izuma vključeni z navedbo reference, opisujejo proizvodnjo in čiščenje botulinusovega toksina tipa A iz Clostridium botulinum tipa A NCTC 2916. Kulture bakterij porastejo na ustreznem medij. 30 litrski fermentor je nato cepljen z omenjenimi bakterijami pod anaerobnimi pogoji glede na standardne pogoje, ki so znani na področju tehnike. Delež toksina je kontinuirano spremljan (na primer z določitvijo LD₅₀). Ko je dosežen maksimalni delež (približno 2 x 10⁶ LD₅₀/ml v primeru mišjih testnih osebkov), je kultura acidificirana (pH naravnan z 3N II₂SO₄ na pH 3.5), toksin pa je izločen s centrifugiranjem. Ta oborjen čisti toksin je nato ponovno raztopljen in ekstrahiran z 0.2 M fosfatnim pufrom (pH 6.0), sledi ribonukleazna obdelava (100pg/ml pri 34°) in usedanje z uporabo NH₄SO₄ (60% nasičenje pri 25°). Oborina je nato ponovno suspendirana in vodena na DEAD-Sephacel ionsko izmenjalno kromatografijo pri pH 5.5 (sledi šaržna predadsorpcija). Sproti je spremljana aktivnost frakcij, po uporabi NH₄SO₄ pa se aktivne frakcije ponovno usedajo (60% nasičenje pri 25°). S shranjevanjem in ponovnim raztapljanjem usedline nastane oblika, kije predmet tega izuma.

Oblike, ki so predmet pričujočega izuma, preferenčno vključujejo toksin vezan v kompleks pripravljen po zgoraj opisanih metodah za botulinusov toksin tipov A in B, ali pa se uporabljajo ekvivalentne oblike botulinusovega toksina tipov C|, C₂, D, E, F ali G, pripravljene po metodah, ki so znane na področju tehnike. Titer toksina je določen z večkratnimi razredčenji ponovno raztopljenega toksina vezanega v kompleks z ekscipientnim proteinom, kot je človeški serumski albumin. Pri tem je preprečeno nastajanje mehurčkov in silovito mešanje, kot je vorteks mešanje. Glede na konvencijo se titer določa z določanjem smrtnosti miši, kot je test LD₅₀ za mišji osebek opisan v primeru

2. Delovna matična raztopina je razredčena, razdeljena in liofilizirana za shranjevanje. Takšna matična raztopina je nato testirana z namenom določitve proteinske koncentracije, LD₅₀, čiščenja in farmacevtske stabilnosti po dobro znanih metodah, kot je predstavljeno v primeru 2.

IV. Stabilne oblike botulinusovega toksina

Odkritje pričujočega izuma je, da je lahko botulinusov toksin pripravljen in shranjen v stabilni tekoči obliki, ki ohrani svojo učinkovitost v daljšem časovnem obdobju, npr. najmanj 1-2 leti pri temperaturah, ki so značilne za hladilnik (tj. okoli 5±3°C, ali bolj določeno, približno 4±2°C, ali bolj splošno, 0-10°C) ali najmanj približno 6 mesecev pri “sobni temperaturi” (tj. okoli 25°C ali bolj splošno 10-30°C). Takšna oblika je lahko primerno posredovana ljudem ali drugim sesalcem v obliki zdravila ne da bi bilo potrebno nadaljnje raztapljanje, ki bi ga moral opraviti zdravnik. Za obliko je značilen pH, ki je med približno pH 5 in 6, preferenčno približno pH 5.5 - 5.6, in ki je vzdrževan v ustreznih pufranih pogojih. Oblika lahko vsebuje tudi eden ali več ekscipientnih proteinov.

Primer 1 podaja natančna navodila za pripravo oblike botulinusovega toksina (tip B) v koncentraciji 5000 U/ml. Razumeti je, da so lahko takšni pogoji oblikovanja uporabni tudi na drugih serotipih botulinusovega toksina, kot je botulinusov toksin tipa A, v koncentracijah zahtevanih za takšne serotipe, z namenom, da bi nastale stabilne oblike v primernih dozirnih embalažah.

Na kratko, koncentriran preparat botulinusovega toksina, kot so zgoraj opisane prečiščene toksinske preparacije, ki se nanašajo na tipa A in B, je pomešan s tekočino za razredčenje, kot je sukcinatni pufer, ki ima pH med pil 5 in pH 6, preferenčno približno pH 5.6. V primeru botulinusovega toksina tipa B, je bila na osnovi testa strupenosti na miši LD₅₍₎ določena željena koncentracija, ki je približno 5000 U/ml. Kakorkoli, potrebna ali željena koncentracija je pravzaprav katerakoli v območju od 100-20000 U/ml ali celo višje, odvisno od odmerka namenjenega za razpečevanje. V primeru botulinusovega toksina tipa A, so primerne koncentracije v območju od 20-2000 in preferenčno okoli 100-1000 U/ml. V farmacevtske proizvodne namene je oblika vzorčena in testirana na prisotnost možnih mikrobioloških kontaminantov (bioobremenitev) in je sterilna filtrirana v steklene ali polipropilenske ampule namenjene za uporabo na pacientih. Končni produkt je lahko shranjen v tekoči obliki najmanj eno leto in preferenčno več kot dve leti pri 0-10°C, ne da bi pri tem pomembno izgubil na biološki aktivnosti, kot je to razvidno iz manj kot 20% izgube aktivnosti v primeru strupenostnega testa na miših LD₅₀ (primer 2).

Zgoraj omenjena tekočina za razredčenje je lahko katerakoli farmacevtsko sprejemljiva tekočina, ki ne bo negativno vplivala na stabilnost kompleksa in ki bo omogočala vzdrževanje stabilnega pH območja med približno pH 5 in pH 6. Primeri posebno primernih pufrov so sukcinatni in fosfatni pufri; kakorkoli, ljudje, ki se ukvarjajo s tem področjem, bodo ugotovili, da oblike, ki so predmet pričujočega izuma, niso omejene na posamezen pufer dokler pufer omogoča zadovoljivo stopnjo stabilnosti pH ali zadostno “pufrno kapaciteto” v navedenem območju. Na splošno velja, da ima pufer zadostno pufrno kapaciteto znotraj približno 1 pH enote njegove pK vrednosti. (Lachman s sodelavci, 1986). V kontekstu pričujočega izuma gre za pufre, ki imajo pK vrednosti v območju približno 4.5-6.5. Primernost pufra je lahko določena na osnovi objavljenih pK tabel ali pa je lahko določena empirično z metodami, ki so na področju dobro poznane. Poleg zgoraj omenjenih sukcinatnih in fosfatnih pufrov so drugi farmacevtsko uporabni pufri acetatni, citratni, akonitatni, malatni in karbonatni (Lachman). PH raztopine je lahko uravnana na željeno končno vrednost znotraj območja z uporabo katerekoli farmacevtsko sprejemljive kisline, na primer klorovodikove kisline ali žveplove kisline, ali baze, na primer natrijevega hidroksida.

Ekscipientni protein, ki je dodan k obliki, je lahko katerikoli izmed številnih farmacevtsko sprejemljivih proteinov ali peptidov. Preferenčno je ekscipientni protein izbran glede na njegovo sposobnost, da pri uporabi na osebkih sesalcev ne izzove imunskega odziva. Na primer, človeški serumski albumin je zelo primeren za uporabo v farmacevtskih oblikah, ki se uporabljajo za ljudi; nasprotno pa je lahko goveji serumski albumin izbran za uporabo pri govedu. V ta namen so lahko uporabljeni tudi drugi znani farmacevtski proteinski ekscipienti, kot je na primer želatina. Ekscipient je vključen v obliko v zadostni koncentraciji, da prepreči adsorpcijo toksinskega proteinskega kompleksa na steno posode ali ampule. Koncentracija ekscipienta se bo spreminjala glede na naravo ekscipienta in koncentracijo toksinskega kompleksa v obliki. Tako je bilo v primeru študij, ki so bile izvedene v podporo pričujočemu izuma določeno, da je koncentracija 0.5 mg/ml človeškega serumskega albumina zadostna za oblike, ki vsebujejo 5000 U/ml botulinusovega toksina tipa B, dokler le ta ne vzbudi signifikantne imunološke ali alergijske reakcije v večini človeških osebkov; na splošno bi naj koncentracije med približno 0.05 mg in 1 mg na 1000 U botulinusovega toksina B nudile zadostno zaščito.

Prav tako so bile opisane primerne ekscipientne koncentracije za stabiliziranje botulinusovega toksina tipa A. Na primer “ΒΟΤΟΧ®” je stabiliziran z dodatkom 0.5 mg albumina na 100 enot toksinske aktivnosti (PDR).

V. Uporabnost

A. Uporaba botulinusovih toksinskih oblik v terapevtske in kozmetične namene Farmacevtske učinkovine, ki so predmet pričujočega izuma, so lahko uporabljene v primeru številnih indikacij v katerih je željena inhibicija ali blokada holinergične nevrotransmisije, oz. predvsem ko je holinergična transmisija povezana s kontrolo gladkih ali skeletnih mišic, To poglavje navaja primere motenj, v primeru katerih so lahko terapevtsko uporabljene oblike oz. učinkovine, ki so predmet tega izuma. Navedenih primerov ne smemo razumeti na način, ki bi kakorkoli omejeval vsebino izuma. Značilni odmerki in načini uporabe za nekatere od teh indikacij so opisani v poglavju B spodaj.

Butulinusov toksin, še posebej botulinusov toksin tipa A, se je izkazal kot zelo učinkovit pri zdravljenju spastičnih mišičnih motenj. Posamezen način zdravljenja (ki lahko vključuje večkratno intramuskularno vbrizgavanje) lahko povzroči oblažitev nekontroliranega mišičnega spazma celo za nekaj mesecev. Na primer, “ΒΟΤΟΧ®” (botulinusov toksin tipa A) je registriran pri ameriški “Food and Drug Administration” za lokalizirano vbrizganje v očesno votlino za zdravljenje blefarospazma. Med relevantnimi indikacijami so še druge fokalne distonije, kot je laringealna distonija, Meige-ev sindrom (oromandibularna distonija: orofacialna diskinezija), spastični tortikolis (Hardman s sodelavci, 1996), distonija uda, animus in sečna detruzor-sfinkter dissinergija, blefarospazem, strabizem, hemifacialni spazem kot tudi rinoreja, otitis media, prekomerno slinjenje, astma, spastični kolitis, prekomerno izločanje želodčne kisline (glej npr. patent U.S. Patent 5,766,005), glavobol povezan z migreno, vaskularne motnje, nevralgija ali nevropatija (patenta U.S. Patent 5,714,468; WO 953041), bolečine pri artritisu (patent WO 9517904), motnje v delovanju gastrointestinalnega trakta, ki se nanašajo na striatno ali gladko mišico (patent U.S. Patent 5,674,205), relaksacija perineuma med rojevanjem (patent U.S. Patent 5,562,899) ali olajšanje oz. sproščanje pri stiskanju čeljusti (patent U.S.

Patent 5,298,019). Botulinusov toksin tipa A je bil prav tako lokalno vbrizgan z namenom sproščanja mišične napetosti, ki povzroča gube na obrazu (angl. “frown lines”) in da bi tako bilo doseženo glajenje (angl. “browlift”) (Frankel, 1998). Ugotovljeno je bilo tudi, da je botulinusov toksin tipa A po tem ko je vbrizgan v kožo, učinkovit za zdravljenje fokalne hiperhidroze, (prekomerno znojenje; patent WO 9528171, patent U.S. Patent 5,766,605) kot tudi za zdravljenje juvenilne ukrivljenosti hrbtenice (patent U.S. Patent 5,053,005) pri odraslih in juvenilne cerebralne paralize (patent U.S. Patent 5,298,019, patent WO 9305800) in spazmov in neželjenjih kontrakcij, ki jih povzroča cerebralna paraliza, multipla skleroza ali Parkinsonova bolezen (patent U.S. Patent 5,183,462). Vse reference, ki so bile navedene v zgornjem tekstu, je mogoče kot reference upoštevati v celoti.

V eksperimentih, ki so bili izvedeni v podporo pričujočemu izumu, so bile stabilne tekoče oblike, ki vsebujejo botulinusov toksin tipa B, testirane in ocenjene kot učinkovite pri cervikalni distoniji, znani tudi kot tortikolis, bolezenskih stanjih, ki so posledica neželjenih spazmov in mišičnih kontrakcij v glavi, vratu in hrbtenici, ki vodijo do spremembe smeri ali nagnjenosti gibanja glave. Te težave so pogosto povezane tudi tresenjem in mišičnoskeletnimi bolečinami. Na splošno je etiologija teh motenj neznana; kakorkoli, smatra se, da je posledica disfunkcije centralnega živčnega sistema, ki vodi do hiperaktivnosti vpletene muskulature. Trenutni načini zdravljenja, vključno z antiholinergičnimi, dopaminergičnimi, sredstvi za relaksacijo mišic, antispazemskimi in antikonvulzijskimi zdravili ne vodijo do trajnega olajšanja. Botulinusov toksin tipa B je tako učinkovit pri zdravljenju takšnih primerov s povzročitvijo lokalne paralize ali pareze, ki praviloma nastopi približno 1 teden po vbrizgu in traja od približno 1 do 4 mesece.

Oblike drugih serotipov botulinusovega toksina so učinkovite v primarnem zdravljenju prej opisanih bolezenskih stanj, ki so se nanašali na uporabo tipa A. Nadalje, kot je bilo omenjeno zgoraj, je botulinusov toksin tipov B-G prav tako učinkovit pri zdravljenju pacientov, ki so postali odporni na zdravljenje z botulinusovim toksinom tipa A zaradi imunskega odziva na toksin. Nasprotno pa je lahko serotip A uporabljen na pacientih, ki so postali odporni na serotip B ali katerikoli drugi serotip toksina. Oblike enega ali večih serotipov botulinusovega toksina so lahko napravljene in uporabljene v skladu s pričujočim izumom.

Na splošno je potrebno upoštevati, da je mogoče glede na podobne biološke učinke različne tipe botulinusovega toksina izmenoma uporabljati za zdravljenje različnih motenj, še posebno tistih, ki so povezane z mišično spastičnostjo. Pri tem je potrebno upoštevati, da se lahko, kot je opisano v nadaljevanju glede na tipa A in B, učinkoviti odmerki (izraženi s termini LD₅₀ ali biološkimi enotami) pomembno razlikujejo za različne serotipe.

Ocena ekvivalentnih odmerkov je lahko opravljena na osnovi znanih odmerkov, ki so že publicirani za testirane toksine.

B. Odmerki in način uporabe

Botulinusov toksin je znan kot močan in včasih usoden toksin za živali. Vendar je lahko njegova uporaba na ljudeh povsem varna, kot je opisano spodaj, ko je dovolj pozorno določen način uporabe in njegov odmerek.

Odmerki za različne oblike botulinusovega toksina se spreminjajo glede na serolip uporabljenega toksina. Na primer, pri eksperimentih, ki so bili opravljeni z namenom podprtja pričujočega izuma, je bilo ugotovljeno, daje, če primerjamo enote LD₅₀ na miših, botulinusov toksin tipa A (“ΒΟΤΟΧ®”) 4-6 krat bolj učinkovit kot botulinusov toksin tipa B, ko gre za sprožanje paralize na opicah, kot je bilo določeno z elektrofiziološkimi meritvami izbranih skeletnih mišic. To opazovanje je v skladu z eksperimentalnimi rezultati pri podganah, ki so pokazali velika odstopanja v količini dveh toksinov, ki povzročijo paralizo podganjih udov (Sellin; Jackson). Na osnovi teh opazovanj je tako mogoče določiti primerne ekvivalentne odmerke, lahko pa jih empirično določi izkušen zdravnik.

Odstopanja glede na priporočene odmerke se lahko prav tako spreminjajo glede na zgodovino pacienta. Za paciente, ki so na primer že večkrat prejeli odmerke botulinusovega toksina tipa A velja, da postanejo odporni na nadaljnje zdravljenje in da so potrebni večji odmerki, da bi bil dosežen po času ekvivalenten učinek. Ne da bi posebej verjeli v katerikoli že določen mehanizem delovanja je verjeti, da se ta fenomen nanaša na razvoj serotipno specifičnega imunskega odziva pacienta. Pojav protiteles pri pacientih, ki so izpostavljeni ponavljajoči se terapiji z botulinusovim toksinom tipa A, je evidentiran v območju približno 3 do 57%. Glede na to je priporočljivo, da je v primeru, ko se klinični zdravnik odloči za zamenjavo serotipa med potekom zdravljenja, začetni odmerek novega serotipa izračunan na osnovi pacienta in ne na osnovi prej uporabljenih odmerkov na pacientu.

Primerne metode za uporabo so katerekoli, ki omogočajo prenos aktivne toksinske sestavine v določeno tkivo, ne da bi pri tem povzročale' nevarne stranske učinke na pacientu. Te metode so lahko predvsem intramuskularno (i.m.) vbrizgavanje, lokalno doziranje, subdermalna, perinevralna uporaba, iontoforezna tokovna uporaba in podobne. Na področju so poznani tudi posebni postopki apliciranja oz. dovajanja botulinusovih toksinov za katere je značilna omejena sistemska porazdelitev aktivnih komponent. Elektromiografija je lahko uporabljena za identifikacijo ali bolj natančno lociranje specifične mišične skupine, posebej za zdravljenje mišic, ki jih je težko identificirati, kot so mišice v očesni votlini, v področju larinksa in pterigoidnega področja, kot tudi pri zelo debelih osebah.

Zdravljenje distonij je običajno zaključeno z uvajanjem toksina v bližino področij inervacije prizadete mišice, ponavadi z intramuskularnim vbrizgom z uporabo hipodermične igle. Ponavadi posledična lokalizirana paraliza privede do ublažitve za 3 do 4 mesece. Pacient je lahko testiran tudi pri nižjih odmerkih, ki se individualno povečujejo do optimalnega odmerka, da bi tako dosegli zadostno nevromuskularno blokado, ki bi ublažila oz. nevtralizirala vsako disfunkcijo, ne da bi pri tem prišlo do direktne paralize. Spremembe odmerka se lahko izkažejo kot potrebne, če postane pacient odporen na toksin. Prednost pričujočega izuma je, da le ta dejansko presega pogost problem povezan z odmerkom, ki je posledica nestabilnosti toksinskega materiala v raztopini in ki vodi do nadaljnjih negotovosti glede primernega odmerka.

Priporočeni odmerki botulinusovega toksina tipa A so bili določeni za številne indikacije in so na področju poznani. Na primer, za zdravljenje strabizma, je za uporabo na vertikalnih mišicah in za horizontalni strabizem manjši kot 20 dioprij (angl. “diopters”), priporočen odmerek 1.25-2.5 U botulinusovega toksina tipa A; odmerek 2.5-5 U je priporočen za horizontalni strabizem, ki je večji kot 20 prizemskih dioprij (angl. “prism diopters”) (Physician’s Desk Reference, 51^sl Edition).

Botulinusov toksin tipa A je prav tako uporaben za zdravljenje blefarospazma pri čemer je odmerek 1.25-2.5 U vbrizgan z merilno iglo (27-30) v medialni ali lateralni predtarzalni očesni orbikularis zgornje veke in v medialni ali lateralni predtarzalni očesni orbikularis spodnje veke. Učinki zdravljenja trajajo približno 3 mesece; pri ponovnem zdravljenju je lahko odmerek povišan dvakrat, odvisno od odziva pacienta. Priporočeno je, da kumulativni odmerek v 30 dnevnem časovnem obdobju ne presega 200 U botulinusovega toksina tipa A (Physician ’s Desk Reference, 51^st Edition).

Primer 3 se nanaša na primere študij uporabe različnih odmerkov botulinusovega toksina tipa B za zdravljenje cervikalne distonij e (tortikolis) z uporabo učinkovine glede na pričujoč izum. V teh študijah, kot je prav tako poudarjeno spodaj, je bil botulinusov toksin tipa B v tekoči obliki v skladu s pričujočim izumom, namenjen za uporabo kliničnim zdravnikom, seveda skupaj z navodili za shranjevanje oblike v kliničnem hladilniku s kontrolo temperatur med 2-8°C. V splošnem je bila oblika razdeljena iz večje količine, ki je bila pripravljena in shranjena pri priporočeni temperaturi 6-12 mesecev. Klinični zdravniki so prejeli obliko, ki je bila shranjena približno 6 mesecev.

Na kratko, pacienti so prejeli različne odmerke toksina z intramuskularnim (i.m.) vbrizgavanjem v 2-4 površinske vratne in/ali ramenske mišične skupine, ki so jih določili klinični zdravniki na osnovi mišične okvare. V okviru ene študije so bili uporabljeni individualno razdeljeni odmerki v območju od 100-1200 U, pri čemer je kumulativni odmerek znašal med 270-2280 U v časovnem intervalu do 398 dni. Na vseh pacientih je bilo med potekom študije ugotovljeno izboljšano stanje, zmanjšana aktivnost oblike pa med potekom študije ni bila zaznana.

Nadaljnje študije izvedene v podporo pričujočemu izumu so pokazale, da so lahko pacienti, ki so postali odporni na botulinusov toksin tipa A, zdravljeni z botulinusovim toksinom tipa B. Pacienti, ki so sodelovali pri tej študiji, so pokazali zmanjšano odzivnost na botulinusov toksin tipa A. Kot uspešno zdravljeni so bili obravnavani, če je bilo v njihovem primeru zaznati najmanj 25% odklon na celotni skali (odklon = izboljšanje) Toronto Western Spasmodic Torticollis Rating Scale (TWSTRS; Consky, 1994) v primerjavi z bazno linijo. Uporabljene so bili oblike z individualnimi odmerki botulinusovega toksina tipa B in sicer med 150-1430 U. Kumulativen odmerek je znašal od 300-12000 enot v 117 dneh, kot je podrobno opisano v primeru 3.

Na splošno se je stanje pacientov med študijo izboljšalo, še posebej pri višjih odmerkih. Med študijo niso bili ugotovljeni dokazi niti, da bi šlo za razvoj blokirajočih protiteles na botulinusov tip B, niti da bi šlo za zmanjšano aktivnost oblike. V nadaljnji študiji so bili periodično v časovnem obdobju 203 dni aplicirani posamezni odmerki 0, 400, 1200 in 2400 U botulinusovega toksina tipa B. Ugotovljeno je bilo uspešno zdravljenje tortikolisa, kot je opisano zgoraj.

Primeri v nadaljevanju ponazarjajo pričujoč izum vendar ga pri tem v nobenem primeru ne omejujejo.

Primeri

Materiali

Razen v primeru, ko je drugače navedeno, je mogoče vse v kontekstu opisane reagente dobiti pri kateremkoli znanem trgovcu, ki prodaja reagente za uporabo v kemijskih, biokemijskih, biotehnoloških ali farmacevtskih industrijah.

Primer 1: Priprava stabilne oblike botulinusovega toksina

A. Priprava sukcinatnega pufra

Sukcinatni pufer je bil pripravljen v 3 litrskih volumnih z 2.7 mg/ml dinatrijevega sukcinata in 5.8 mg/ml natrijevega klorida ob dodatku 0.5 mg/ml človeškega serumskega albumina (Michigan Biological Products Institute). Koncentrirana klorovodikova kislina je bila uporabljena za uravnavanje pH vrednosti pufra na pH 5.6. Pufer je bil nato filtriran skozi 0.2pm filter v hermetično zaprto posodo. Pred uporabo je bil vzorec odvzetega pufra testiran na pH, bakterijski endotoksin in bioprimesi.

B. Priprava oblike oz. učinkovine botulinusovega toksina

Del koncentriranega botulinusovega toksina tipa B je bil razredčen približno 1000 krat s sukcinatnim pufrom (pH 5.6). Tako je bila dosežena aktivnost 5000±l 000 U/ml. Razredčen toksin je bil nato shranjen v 2 litrske zaprte steklene posodice in je tako predstavljal “matično raztopino”. Nato je bil shranjen pri 5±3°C dokler ni bil material poslan za polnjenje.

Pred polnjenjem je bil vzorec matične raztopine testiran na prisotnost mikrobioloških kontaminantov (bioprimesi) v skladu z na področju znanimi standardiziranimi metodami. Matična raztopina je bila vodena s peristaltično črpalko preko za medicinsko uporabo namenjenega cevnega sistema in sterilno filtrirana (0.2μηι) v sterilno prostornino znotraj polnilnega prostora. Nastala sterilna filtrirana matična raztopina je bila nato napolnjena v 3.5 ml steklene ampule in sicer v deležih 0.5 ml (2500 U), 1 ml (5000 U) ali 2 ml (10000 U).

Sestava končnega že embaliranega produkta je prikazana v tabeli 1.

Tabela 1

Sestava oblike oz. učinkovine botulina B

Aktivna sestavina	Neaktivne sestavine	Koncentracija
Botulinusov toksin tipa B	-	5000±1000 LD50 U/ml
-	Sukcinat, USP	10 mM
-	Natrijev klorid, USP	100 mM
-	Človeški albumin, FDA sproščen	0.5 mg/ml
-	Klorovodikova kislina, NF	za uravnavanje pH

Primer 2: Testiranje stabilnosti oblike botulinusovega toksina A. Stabilnostni rezultati

Botulinusov toksin tipa B je bil izdelan, razredčen, kot je opisano zgoraj, na koncentracijo 2500 enot U/ml. 1 ml tako pripravljene oblike je bil shranjen v 5 ml steklene ampule pri 5° C za do in vključno 30 mesecev. Pri 0, 1,3, 6, 9, 12, 18, 24 in 30 mesecih po pričetku shranjevanja, so bili posamezni slučajno odmerjeni vzorci testirani na aktivnost s strupenostnin testom LD₅₀ z mišmi kot testnimi osebki. Raztopinam je bil prav tako določen videz, izmerjen pa je bil tudi pH po standardnih metodah.

Tabela 2 kaže rezultate za testirane vzorce, ki so bili odvzeti pri različnih časih. Ti rezultati kažejo, da so oblike pripravljene v skladu s pričujočim izumom stabilne, kot je to razvidno iz aktivnosti po najmanj 30 mesečnem shranjevanju pri 5°C, ki je znotraj območja aktivnosti objavljenih za čas 0.

Tabela 2

Stabilnost oblike pri 5°C

v Cas shranjevanja (meseci)	Aktivnost (povprečna; U/ml)	pH	Videz
0	1750-3250	5.5	Prehoden
1	1941	NDb	ND
3	2541	5.6	ND
6	2020	5.6	Prehoden
9	2357	5.6	Prehoden
12	2064	5.6	Prehoden
18	2318	5.4	Prehoden
24	1799	5.6	Prehoden
30	2101	5.6	Prehoden

^a prehoden = čist, prosojen, brezbarvna do svetlo rumeno obarvana raztopina, v bistvu brez vidnih prostih delcev ^b test ni bil opravljen

Tabela 3 prikazuje rezultate testiranja odmerjenega volumna oblike botulinusovega toksina tipa B, kije bil pripravljen in odmerjen kot je opisano zgoraj, pri čemer pa je bil shranjen pri 25°C. Ti rezultati kažejo, daje oblika stabilna najmanj 6 mesecev pri 25°C, kot je to razvidno iz povprečne aktivnosti, ki ostaja najmanj okoli 90% in preferenčno najmanj 95% po 6 mesecih shranjevanja in najmanj 75% glede na začetno aktivnost po 9 mesečnem shranjevanju pri 25°C.

Tabela 3

Stabilnost oblike pri 25°C

Čas shranjevanja (meseci)	Aktivnost (povprečna; U/ml)	PH	Videz*
0	1941	5.5	Prehoden
1	2297	5.6	NDb
2	1935	5.6	ND
3	2017	5.6	ND
6	1909	ND	Prehoden
9	1579	5.6	Prehoden

^a prehoden = čist, sprosojen, brezbarvna do svetlo rumeno obarvana raztopina, v bistvu brez vidnih prostih delcev ^b test ni bil opravljen

B. Testi stabilnosti

1. Določanje pH vrednosti oblike botulinusovega toksina

PH oblike botulinusovega toksina tipa B je bil merjen z uporabo Fisherjevega Scientific Accumet pH metra, Model 50, z avtomatsko temperaturno kompenzacijo vzorca. Elektroda je bila Orionova Ross Combination Electrode s KCL referenčno elektrodo. PH določitev je potekala v skladu s standardizirano dvo-točkovno kalibracijo (pH 4.0, pH 7.0) po navodilih proizvajalca. Za vsak vzorec so bile opravljene tri meritve. PH vrednost je bila registrirana za 2 signifikantni vrednosti na osnovi katerih je bilo določeno povprečje.

2. Test aktivnosti LD₅₍₎ na miših

Za določitev LD₅₀ so bile uporabljene zdrave, neuporabljene CFW ali CD-I miši obeh spolov teže 18 do 22 g. Miši so bile testirane pri 5 odmerkih oblike botulinusovega toksina tipa B v primeru vsakega polnjenega produkta. Test je bil ponovljen petkrat.

Iz testnega vzorca sta bili pripravljeni dve matični raztopini. Matična raztopina A je bila dobljena z redčenjem testnega vzorca do določene aktivnosti 750 U/ml z želatinastim fosfatnim pufrom pH 6.2. Matična raztopina B je bila dobljena z 10 kratnim redčenjem raztopine A na 75 U/ml. Nadaljnje razredčitve so bile pripravljene iz matične raztopine B in sicer 1:7.5,1:10,1:13.5,1:18 in 1:24.3.

Mišim je bilo intraperitonealno vbrizgano 0.2 ml ustrezno razredčene spojine. Miši so bile zadržane še 4 dni po vbrizgu, pri čemer so bile dnevno opazovane. Zabeleženi so bili vsi smrtni primeri. Opazovanja so bila končana po štirih dneh.

Število skupnih smrtnih primerkov (angl. “Cumulative Deaths”) (CD) pri različnih stopnjah razredčitve, je bilo izračunano s prištevanjem števila smrtnih primerkov od maksimalnega razredčenja navzgor. Število skupnih preživelih primerkov (angl. “Cumulative Survivors”) (CS) je bilo izračunano s prištevanjem števila preživelih primerkov od minimalnega razredčenja navzdol. %CD je bil izračunan kot CD/(CD+CS)xl00% za vsako razredčenje. Razredčenje, ki predstavlja LD₅₀, je bilo določeno s proporcionalno distančno oz. intervalno metodo (angl. “Proportional Distance”) (PD) Reed-a in Muench-a z uporabo redčenj, pri katerih %CD ustreza 50% skupnega števila smrtnih primerkov.

Proporcionalni interval (angl. “The propotional distance”) (PD) = (%CD> 50%)-50% (%CD > 50%) - (%CD < 50%)

Dobljena PD vrednost je bila pomnožena z logaritmom razlike med vrednostmi stopenj redčenja, ki je ustrezajo 50% CD. Ta vrednost je bila dodana k logaritmu redčenja, ki ustreza smrtnosti (CD) višji kot 50. Tako je bilo dobljeno redčenje, ki predstavlja LD₅₀.

Na osnovi antilogaritma tega redčenja je bilo dobljeno število LD₅₀ enot toksina na injiciran volumen (0.2 ml). To število je bilo nato pomnoženo s 5 da bi tako dobili LD₅₀ enote na ml toksina matične raztopine B.

LD₅₀ enote na ml matične raztopine B so bile pomnožene s faktorjem redčenja (tj. redčenje, ki je potrebno za določeno aktivnost 75 U/ml) da bi tako dobili aktivnost vzorca. Aritmetična sredina in standardna deviacija LD₅₀ enot na ml so bile izračunane za 5 veljavnih testov.

3. Videz oblike

Videz je bil določen z vizualnim primerjanjem glede na črno in belo podlago na svetlem, sledilo pa je nežno mešanje. Tako so bile ocenjene barva, prozornost in prisotnost vidnih delcev.

Primer 3: Zdravljenje cervikalne distonije (CD)

A. Redčenje zdravila, preračun, uporaba in režim doziranja

1. Rokovanje z zdravilom

Ampule za zdravila so bile napolnjene z 2.0 ml (10000 U), 1.0 ml (5000 U) ali 0.5 ml (2500 U) nerazredčenim proučevanim zdravilom. Pri rokovanju je bilo preprečeno močno mešanje in penjenje, ker se lahko tako botulinusov toksin v enem ali drugem primeru denaturira. Oblika je bila odstranjena iz ampule z uporabo 1 ml tuberkulinske igle, ki zagotavlja odmerjanje natančnega volumna.

2. Preračun zdravila

Botulinusov toksin tipa B je bil uporabljen na pacientih s cervikalno distonijo (CD). Šlo je za uporabljanje vsebine primerne ampule (ampul), da bi tako odmerili odmerek naveden v spodnji tabeli. Enote v skladu s povečanjem odmerka (U) na miših so bile preračunane kot sledi v nadaljevanju, pri čemer pomeni 1U količino toksina prisotnega v odmerku, ki predstavlja LD₅₀ in je določen v primeru uporabljenih miši kot testnih osebkov kot je opisano v primeru 2.

Pri vsakem doziranju je bil botulinusov toksin tipa B uporabljen v skladu s standardnimi postopki, kot so opisani spodaj. Vbrizganja snovi so izvedli nevrologi, ki so bili predhodno izobraževani na področju terapevstke uporabe botulinusovega toksina na pacientih s CD. Od pacientov je bilo zahtevano, da se sprostijo kolikor je to pač mogoče, da bi tako olajšali opazovanje glave in vratu v položaju mirovanja. Opravljeno in s palpacijo potrjeno je bilo določanje vratnih mišic, ki so vključene v nastajanje CD. Po preudarku preiskovalca, je bila izvedena EMG evaluacija za nadaljno lociranje najprej prizadetih mišic. Mišice, primerne za zdravljenje po tem postopku so mišica dvigalka skapule, srednja in prednja mišica na vratu, semispinalni kapitizem (angl. “semispinalis capitism”), splenius kapitus (angl. “splenius capitus”), sternokleidomastoid in trapezius. Vbrizgavanja so bila opravljena na vseh teh mišicah in sicer na 1 do 5 mestih. Celotni vbrizgan volumen na določenem mestu je bil manjši ali enak 1.0 ml, da bi se tako izognili lokalnim tkivnim deformacijam, pa vendar najmanj 0.1 ml, da bi tako olajšali določanje točnega volumna s standardno 1.0 ml iglo. V začetku so pacienti dobili celotni odmerek 5000 U, sledilo pa je še kasnejše doziranje do približno 15000 enot, ki je potekalo pri naknadnih obiskih pacientov.

B. Klinične študije cervikalne distonije (CD)

Študija 1

Študija v kateri je bila učinkovina botulinusovega toksina tipa B vbrizgana v 2-4 površinske vratne in/ali ramenske mišične skupine, je bila izvedena na osmih pacientih (3 moških, 5 ženskah) s povprečno starostjo 43.9 let in individualnimi kliničnimi diagnozami idiopatske CD. Pacientom je bilo dovoljeno, da so podvrženi zdravljenju vsake štiri tedne, da tako ne bi prišlo do resnih negativnih učinkov ali nenehnega kliničnega izboljšanja pri demonstraciji. Pacienti so sodelovali pri 1-5 doziranjih. Individualno doziranje se je gibalo od 100 U do 1200 U pri čemer so znašali celotni kumulativni odmerki od 270 U do 2280 U botulinusovega toksina tipa B, kot je opisano v kontekstu. Učinkovitost je bila določena z uporabo skale Tsui Torticollis Skale (Tsui, J.K.C. (1986), Lancet 2: 245-247). Pacienti so pri študiji sodelovali 127 do 398 dni, pri čemer je bil povprečen čas študije 244.8 dni. Vrednosti za tortikolis so bile v osnovi podobne bazni liniji in pri vseh pacientih je šlo za majhen odmik v vrednosti (odmik = izboljšanje), ki nakazuje trend pogojen z odmerkom v primerjavi s celotnimi odmerki. Na splošno lahko rečemo, da se na pacientih kaže izboljšano stanje glede tortikolisa. Razvoja blokirajočih protiteles v tej študiji ni zaznati.

2. Študija 2

Pacienti, ki so bili vključeni v to študijo, so imeli klinično diagnozo idiopatska CD (tortikolis) in so razvili odpornost na botulinusov toksin tipa A. Pacienti so prejeli intramuskularne injekcije učinkovine oz. oblike botulinusovega toksina tipa B glede na pričujoč izum v 2-4 površinske vratne in ramenske mišice.

Dvanajst pacientov (povprečna starost 52.3 let) je bilo vključenih in tretiranih v študiji. Pacienti so sodelovali v študiji od 37 do 127 dni s povprečnim časom 65 dni. Pacienti so bili zdravljeni z 1 do 3 odmerki študiranega zdravila. Kumulativni odmerki so znašali od 940-2100 U, posamezni odmerki pa od 150-1430 U botulinusovega toksina tipa B. Povprečen čas med doziranji je bil 22.3 dni za paciente, ki so prejemali nižje odmerke (skupno 100-899 U) in 48.4 dni za tiste, ki so prejemali večje odmerke (900-1500 U).

Klinični rezultat je bil definiran kot najmanj 25% odmik v vrednosti na skali Toronto Western Spasmodic Torticollis Rating Scale (TWSTRS) - eksaktna skala (Consky, E.S., Lang, A.E. (1994) v: Therapy with Botulinum Toxin. Jankovič, J in Hallet M, izd. Marcel Dekker, Inc. New York) glede na bazno linijo (odmik = izboljšanje). Srednja vrednost bazne linije je bila podobna za vse paciente. V 56% pacientov v skupini višjih odmerkov je bilo zaznati odmik v TWSTRS-eksaktni vrednosti v primerjavi z 7% pacientov v skupini nižjih odmerkov. Majhno izboljšanje TWSTRS- bolečinskih vrednosti je bilo prav tako zaznano v primeru obeh skupin, še posebej v začetnih fazah študije. Pri teh pacientih ni bilo nobenih dokazov o razvoju blokirajočih protiteles botulinusovemu toksinu B.

3. Študija 3

Osemindvajset pacientov (povprečna starost 50.9 let) s potrjeno diagnozo cervikalne distonije je dobilo injekcije oblike botulinusovega toksina tipa B v 2-4 površinske vratne in ramenske mišice. Odmerki so se s časom povečevali (do 1.5 krat pri naslednjem vbrizgu). Klinični rezultat je bil določen z uporabo TWSTRS-eksaktnega testa, kot je opisano zgoraj, pri čemer so bile 25% nižje vrednosti upoštevane kot izboljšanje.

Pacienti so v študiji sodelovali od 28-117 dni oziroma povprečno 71.9 dni. Pacienti so bili zdravljeni z 1 do 3 odmerki učinkovine. Kumulativni odmerki so znašali od 1430U do 12000U, pri čemer so bili posamezni odmerki v območju od 300U do 12000U. V namene kliničnega ocenjevanja so bile definirane 4 skupine: 100-800 U (skupina A), 900-2399 U (skupina B), 2400-5999 U (skupina C) in 6000-12000 U (skupina D). Časovni intervali med doziranjem odmerkov so bili kot sledi: skupina A, 13-101 dni, povprečno 35.7 dni; skupina B, 14-113 dni, povprečno 48.8 dni; skupina C, 29-177 dni, povprečno 62.2 dni; skupina D, 28-177 dni, povprečno 55.1 dni.

Srednje vrednosti bazne linije so bile podobne za vse paciente v vseh obravnavanih skupinah, in vse 4 skupine so pokazale srednje znižanje vrednosti (izboljšanje) med potekom študije. Na splošno je bil povprečni procent izboljšanja glede na bazno linijo in povprečna stopnja odziva za eksaktno vrednost med to študijo najvišja pri skupinah C in D. Vrednosti povprečnega maksimalnega izboljšanja, povprečnega maksimalnega procenta izboljšanja in povprečne maksimalne stopnje odziva so bile višje za dve skupini z višjimi odmerki kot za dve skupini z nižjimi odmerki (8.1 in 6.8 vs. 2,1 in 3.6 za maksimalno izboljšanje; 43.9% in 35.5% vs. 10% in 16.1% za povprečno maksimalno izboljšanje; 0.32 in 0.23 vs. 0.05 in 0.09 za povprečno maksimalno stopnjo odziva). Procent pacientov, ki so se odzivali na zdravljenje je bilo višje za dve skupini z višjimi odmerki (C, 80% in D, 78%) kot za dve skupini z nižjimi odmerki (A, 0% in B, 27%). Povprečno trajanje odziva je bilo daljše pri dveh skupinah z višjimi odmerki (C, 47.6 dni; D, 38.1 dni) kot za dve skupini z nižjimi odmerki (A, 0 dni; B, 31 dni). Ti podatki za pričujoč izuma kažejo, daje odziv na oblike botulinusovega b toksina odvisen od odmerka.

4. Študija 4

Trije odmerki oblike botulinusovega toksina tipa B so bili testirani v primerjavi z zdravljenjem s placebo v okviru študije, ki je vključevala 85 CD pacientov. Vključitev pacientov v študijo je bila naključna, v paru na slepo (angl. “double-blind”), z enojnim odmerkom (angl. “single-dose”), 4-ročna (angl. “4-arm”), v paralelni skupini (angl. “parallel-group”) in z vključenimi večimi centri (angl. “multi-center”). Pacienti so bili stari od 18 do 80 let. Odmerki po 400, 1200 ali 2400 U botulinusovega toksina tipa B so bili vbrizgani v 2-4 površinske vratne in/ali ramenske mišične skupine. Pacienti so bili ocenjevani z uporabo TWSTRS skale pri bazni liniji in 2 ter 4 tedne po zdravljenju. Pacienti, ki niso kazali 3 ali več točk izboljšanja (>20%) v TWSTRS eksaktni vrednosti po 4 tednih, so bili izločeni iz študije kot neodzivni. Odzivni pa so se vračali na testiranje vsake 4 tedne, dokler stopnja njihovega odziva ni padla za več kot 50 %.

Vse TWSTRS vrednosti so kazale izboljšanje z naraščajočim odmerkom oblike botulinusovega toksina tipa B. Po 4 tednih, je bilo zaznati statistično pomembno izboljšanje pri pacientih, ki sodijo v skupino z odmerkom 2400 U, v primerjavi s pacienti, ki so bili zdravljeni s placebo, v primeru obeh TWSTRS-bolečinskega in TWSTRScelotnega ocenjevanja. Procent pacientov, ki je kazal izboljšanje, je bil večji v skupini 2400 U. Povprečne globalne ocene za paciente so bile pomembno višje v skupini 2400 U po 2, 4 in 8 tednih v primerjavi s katerokoli drugo zdravljeno oz. obravnavano skupino; glede na analize variance podatkov po 4 tednih so bile ugotovljene pomembne razlike (p=0.0286) med oz. obravnavanimi skupinami. Prav tako je bila pomembna razlika med placebo in skupino odmerka 2400 U (p=0.0050) in v primeru analize odziva na odmerek (p=0.0028). V analizah variance podatkov po 4 tednih je bila statistično pomembna razlika (p=0.0073) med zdravljenimi skupinami, prav tako pa je bila očitna pomembna razlika med placebo in skupino z odmerkom 2400 U (p=0.0015) in v primeru analize odziva na odmerek (p=0.0008).

Pacienti so bili v to študijo vključeni 25 do 203 dni, z višjim povprečjem števila dni za skupino z odmerkom 2400 U (61 dni).

5. Študija 5

Ta študija je bila prav tako naključna, v parih na slepo (angl. “double-blind”), placebo kontrolirana, z enojnim odmerkom (angl. “single dose”), 4-ročna (angl. “4-arm”), v paralelnih skupinah in z ambulantnimi bolniki večih centrov (angl. “multi-center outpatient”) in je bila namenjena proučevanju učinkov enojnega zdravljenja s placebo (skupina A) ali zdravljenja z enim do tremi odmerki (2500 U, skupina B; 5000 U, skupina C; 10000 U, skupina D) oblike botulinusovega toksina tipa B vbrizganimi v 2 do 4 površinske vratne in/ali ramenske mišične skupine pacientov s potrjeno diagnozo CD. Pacienti so bili testirani ob obiskih 2 in 4 tedne po zdravljenju. Tisti z več kot 20% izboljšanjem po 4 tednih v primerjavi z bazno linijo (TWSTRS-skupna vrednost) so bili smatrani kot odzivni in so bili povabljeni na ponovno ocenitev po 4 tedenskih intervalih v obdobju maksimalno 4 mesecev, ali dokler vrednost njihovega odziva ni padla za več kot 50 %.

Stodvaindvajset pacientov starih od 19-81 let je bilo vključenih v študijo. Čas ko so bili pacienti nadalje vključeni v študijo je v bistvu pomenil čas, ko so se le ti odzvali na zdravilo med študijo. Zdravljene skupine so bile podobne tako za minimalno kot za maksimalno število dni, ko so pacienti sodelovali v študiji. Povprečni čas študije je naraščal z naraščajočim odmerkom, od 45 dni za placebo skupina A, na 61 dni (B), 67 dni (C) in 75 dni (D).

Za vse TWSTRS vrednosti so vse obravnavane skupine kazale izboljšanje glede na bazno linijo po 4 tednih. Vse TWSTRS vrednosti so težile izboljšanju z naraščajočim odmerkom. Po analizi kovariance 4 tedenskih TWSTRS-skupnih vrednosti, je bila celotna razlika med zdravljenimi skupinami statistično pomembna (p=0.0001). Nadalje je bila pomembna analiza odziva glede na odmerek (p=0.0001) in pomembne so bile tudi vse tri primerjave placeba z aktivnimi skupinami (p=0.0016 za placebo vs 2500 U; p=0.0005 za placebo vs 5000U; p=0.0001 za placebo vs 10000U). Procent pacientov, ki so se odzvali na zdravljenje po 4 tednih, je bil večji v skupini D (10000U) kot v katerikoli drugi skupini za TWSTRS-skupni, nezmožnost in bolečino. Opazen je pomemben odziv na odmerek za vsako izmed štirih TWSTRS vrednosti (skupno, p<0.001; eksaktno, p=0.035; nezmožnost, p=0.002; bolečina, p=0.001). Stanje glede bolečine seje po štirih tednih izboljšalo za vse zdravljene skupine na 67.5, 70.2 in 75.1 v skupinah B, C oz. D. Na splošno so bile razlike med zdravljenimi skupinami statistično pomembne (p=0.0049), analiza odziva na odmerek je bila statistično pomembna (p=0.0017) in primerjave placeba z vsemi tremi aktivnimi zdravljenimi skupinami so bile pomembne (p=0.0149, 0.0084 in 0.0007 za skupine B, C oz. D v primerjavi s placebo).

Primer 4: Fiziološki odziv na obliko botulinusovega toksina tipa B v človeških osebkih Osemnajst zdravih osebkov je bilo testiranih na ekstenzorski digitalis brevis (EDB) Mvalovni digitalni odziv na botulinusov toksin tipa B z uporabo standardnih elektrofizioloških metod, ki so znane na področju. Osebe so bile stare od 18 do 22 let. Elektrofiziološke študije so bile izvedene 2, 4, 6, 9, 11, 13 in 14 dni po intramuskularnem vbrizgu odmerkov od 1.25 U do 480 U oblike botulinusovega toksina tipa B. Rezultati analize podatkov so pokazali, da odvisnost od odmerka pada v EDB M-valovni amplitudi in področju z naraščajočim odmerkom. Maksimalni učinek je dosežen pri 480 U v primeru 75% redukcije M-valovne amplitude glede na bazno linijo.

V ločeni študiji je bilo naključno izbranih 10 osebkov, ki jim je bil vbrizgan odmerek oblike botulinusovega toksina tipa B “B” v enem EDB in odmerek “ΒΟΤΟΧ©” (botulinusov toksin tipa A “A”) v drugem EDB ob uporabi ene do petih različnih shem doziranja: 1.25 U A/ 20 U B; 2.5 U A/ 80 U B; 5 U A/160 U B; 7.5 U A/ 320 U B; 10 U A/

480 U B (2 osebi na eno shemo doziranja). Kontrolnemu osebku je bila injicirana solna raztopina v vsako EDB mišico. Hitrost padanja v M-valovni amplitudi in področju je bila podobna za obe mišici, z maksimalnim učinkom po približno 6 dneh po injiciranju. Oba serotipa sta pokazala od odmerka odvisno pojemanje M-valovni amplitudi. Učinek je bil za obe vrsti toksinov naj večji po 9 dneh.

Čeprav so bile v opis izuma vključene reference, ki zadevajo specifične metode in vsebine, bo upoštevano, da so možne različne modifikacije in spremembe ne da bi pri tem šlo za odstopanje od izuma.

Claims (39)

1. Patentni zahtevki

   1. Stabilna tekoča farmacevtska oblika botulinusovega toksina, ki vsebuje farmacevtsko sprejemljiv pufer, kije sposoben vzdrževati pufran pH v območju med približno pH 5 in pH 6, in izoliran botulinusov toksin;

   pri čemer je omenjena oblika stabilna kot tekočina za najmanj eno leto pri temperaturi med približno 0 in 10 stopinjami Celzija.
2. 2. Oblika po patentnem zahtevku 1, pri čemer je omenjena temperatura približno 5±3 stopinje Celzija.
3. 3. Oblika po patentnem zahtevku 1, pri čemer je omenjena temperatura približno 4±2 stopinji Celzija.
4. 4. Oblika po kateremkoli patentnem zahtevku od 1-3, pri čemer ima omenjen pufer pK vrednost v območju od pH 4.5-6.5.
5. 5. Oblika po kateremkoli patentnem zahtevku od 1-4, pri čemer je omenjena oblika toksina stabilna v tekoči obliki najmanj dve leti.
6. 6. Oblika po kateremkoli patentnem zahtevku od 1-5, pri čemer je omenjeno pufrano pil območje približno pH 5.6±0.2.
7. 7. Oblika po kateremkoli patentnem zahtevku od 1-6, pri čemer je omenjeni pufer izbran iz skupine, ki sestoji iz fosfatnega pufra, fosfat-citratnega pufra in sukcinatnega pufra.
8. 8. Oblika po kateremkoli patentnem zahtevku od 1-7, pri čemer je omenjen botulinusov toksin serotip botulinusovega toksina izbran iz skupine, ki sestoji iz serotipov A, B, C|, C₂, D, E, F in G.
9. 9. Oblika po patentnem zahtevku 8, pri čemer je omenjen botulinusov toksin botulinusov toksin tipa B prisoten v koncentraciji v območju približno 100-20000 U/ml.
10. 10. Oblika po patentnem zahtevku 9, pri čemer je omenjen botulinusov toksin tipa B prisoten v koncentraciji med približno 1000-5000 U/ml.
11. 11. Oblika po patentnem zahtevku 9 ali patentnem zahtevku 10, pri čemer je omenjen botulinusov toksin tipa B prisoten v kompleksu z visoko molekularno maso približno 700 kilodaltonov (kD).
12. 12. Oblika po patentnem zahtevku 8, pri čemer je omenjen botulinusov toksin botulinusov toksin tipa A prisoten v koncentraciji v območju približno 20-2000 U/ml.
13. 13. Oblika po patentnem zahtevku 12, pri čemer je omenjen botulinusov toksin tipa A prisoten v koncentraciji v območju približno 100-1000 U/ml.
14. 14. Oblika po kateremkoli patentnem zahtevku od 1-13, ki nadalje vključuje ekscipientni protein.
15. 15. Oblika po patentnem zahtevku 14, pri čemer je omenjen ekscipientni protein izbran iz skupine, ki sestoji iz serumskega albumina, rekombinantnega človeškega serumskega albumina in želatine.
16. 16. Stabilna tekoča farmacevtska oblika botulinusovega toksina, ki vsebuje farmacevtsko sprejemljiv tekoč pufer, ki je sposoben vzdrževati pufran pH v območju med približno pH 5 in pH 6 in izoliran botulinusov toksin;

    pri čemer je omenjena oblika toksina stabilna kot tekočina najmanj približno 6 mesecev pri temperaturi med približno 10 in 30 stopinjami Celzija.
17. 17. Oblika po patentnem zahtevku 16, pri čemer je omenjena temperatura približno 25°C.
18. 18. Oblika po kateremkoli patentnem zahtevku od 16-17, pri čemer ima omenjeni pufer pK vrednost v območju od pH 4.5-6.5.
19. 19. Oblika po kateremkoli patentnem zahtevku od 16-18, pri čemer je omenjen pufer izbran iz skupine, ki sestoji iz fosfatnega pufra, fosfat-citratnega pufra in sukcinatnega pufra.
20. 20. Oblika po kateremkoli patentnem zahtevku od 16-19, pri čemer je omenjeno pufrano pH območje približno pH 5.6±0.2.
21. 21. Oblika po kateremkoli patentnem zahtevku od 16-20, pri čemer je omenjen botulinusov toksin serotip botulinusovega toksina izbran iz skupine, ki sestoji iz serotipov A, B, C|, C₂, D, E, F in G.
22. 22. Oblika po patentnem zahtevku 21, pri čemer je omenjen botulinusov toksin botulinusov toksin tipa B prisoten v koncentraciji približno 100-20000 U/ml.
23. 23. Oblika po patentnem zahtevku 22, pri čemer je omenjen botulinusov toksin tipa B prisoten v koncentraciji v območju približno 1000-5000 U/ml.
24. 24. Oblika po patentnem zahtevku 22 ali patentnem zahtevku 23, pri čemer je omenjen botulinusov toksin tipa B prisoten v kompleksu z visoko molekularno maso približno 700 kD.
25. 25. Oblika po patentnem zahtevku 21, pri čemer je omenjen botulinusov toksin botulinusov toksin tipa A prisoten v koncentraciji v območju približno 20-2000 U/ml.
26. 26. Oblika po patentnem zahtevku 25, pri čemer je omenjen botulinusov toksin botulinusov toksin tipa A prisoten v koncentraciji v območju približno 100-1000 U/ml.
27. 27. Oblika po kateremkoli patentnem zahtevku od 16-26, ki nadalje vključuje ekscipientni protein.
28. 28. Oblika po patentnem zahtevku 27, pri čemer je omenjen ekscipientni protein izbran iz skupine, ki sestoji iz serumskega albumina, človeškega serumskega albumina in želatine.
29. 29. Uporaba stabilne tekoče oblike botulinusovega toksina glede na katerikoli patentni zahtevek 1-28 za proizvodnjo zdravil za uporabo pri zdravljenju pacientov, ko je potrebna inhibicija holinergičnega prenosa do izbrane mišice, mišične skupine, žleze ali organa.
30. 30. Uporaba glede na patentni zahtevek 29, pri čemer omenjen pacient trpi zaradi motnje izbrane iz skupine, ki sestoji iz spastičnosti, blefarospazma, strabizma, hemifacialnega spazma, distonije, otitis media-e, spastičnega kolitisa, anizmusa, sečne detruzor-sfinkter dissinergije, stiskanja Čeljusti in ukrivljenosti hrbtenice.
31. 31. Uporaba glede na patentni zahtevek 30, pri čemer omenjen pacient trpi zaradi spastičnosti zaradi ene ali več skupin, ki sestojijo iz udarca, poškodbe hrbtenjače, zaprte poškodbe glave, cerebralne paralize, multiple skleroze in Parkinsonove bolezni.
32. 32. Uporaba glede na patentni zahtevek 30, pri čemer omenjen pacient trpi zaradi distonije izbrane iz skupine, ki sestoji iz spazmodičnega tortikolisa (cervikalna distonija), spazmodične disfonije, distonije uda, laringealne distonije, in oromandibularne (Meige) distonije.
33. 33. Uporaba glede na patentni zahtevek 29, pri čemer omenjena izbrana mišica ali mišična skupina povzroča gubo ali zgrbančen obraz.
34. 34. Uporaba glede na patentni zahtevek 29, pri čemer je omenjena izbrana mišica perinealna mišica in pri čemer omenjen pacient rojeva.
35. 35. Uporaba glede na patentni zahtevek 29, pri čemer omenjen pacient trpi zaradi pogojev izbranih iz skupine, ki sestoji iz miofascialne bolečine, glavobola povezanega z migreno, vaskularnih motenj, nevralgije, nevropatije, artritisne bolečine, bolečine hrbta, hiperhidroze, rinoreje, astme, prekomernega slinjenja in prekomernega izločanja želodčne kisline.
36. 36. Uporaba glede na katerikoli patentni zahtevek od 29-35, pri čemer je omenjen pacient odporen na botulinusov toksin tipa A in ko je omenjen botulinusov toksin v omenjeni obliki izbran iz skupine, ki sestoji iz botulinusovega toksina serotipov B, C _b C₂, D, E, F in G.
37. 37. Uporaba glede na patentni zahtevek 36, pri čemer je omenjen botulinusov toksin v omenjeni obliki botulinusov toksin tipa B.
38. 38. Uporaba glede na katerikoli patentni zahtevek od 29-35, pri čemer je omenjen pacient odporen na botulinusov toksin tipa B in je omenjeni botulinusov toksin v omenjeni obliki izbran iz skupine, ki sestoji iz botulinusovega toksina serotipov A, C j, C₂, D, E, F in G.
39. 39. Uporaba po patentnem zahtevku 38, pri čemer je omenjen botulinusov toksin v omenjeni obliki botulinusov toksin tipa A.