KR100699756B1 - 보툴리누스 독소의 안정한 액상 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 1 년 내지 2 년 이상 동안 표준 냉장실 온도에서 액상으로 저장하기에 안정하고, 6 개월 이상 더 고온에서 저장하기에 안정한 보툴리누스 독소의 액상 제제를 포함한다. 또한, 본 발명은 이러한 제제를 사용하여 치료하는 방법 및 여러 가지 치료학적 치료 및 미용학적 치료를 위한 의약품의 제조에 있어서의 이러한 제제의 용도를 포함한다.

Description

보툴리누스 독소의 안정한 액상 제제{STABLE LIQUID FORMULATIONS OF BOTULINUM TOXIN}
본 발명은 적어도 1 년 내지 2 년 동안 0 내지 10℃에서 액상으로 저장하기에 안정한 보툴리누스 독소의 치료 제제에 관한 것이다.
참고 문헌
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보툴리누스 독소는 혐기성 박테리아 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum)의 폴리펩티드 생성물이다. 이 독소는 신경근 접합부에서 신경 전달 물질 아세틸콜린의 시냅스전(前) 방출을 차단함으로써 포유류에게서 근육 마비를 야기시킨다. 이 독소는 치명적인 보툴리누스 중독과 연관된 지는 오래지만, 최근에 병소 이긴장증(예를 들면, 사시, 특발성 안검경련 및 반측안면 경련), 뿐만 아니라 분절성 이긴장증[예를 들면, 사경(斜頸), 구하악골 근긴장 이상 및 경련성 발성 장애] 및 근긴장을 포함하는 어떤 불수의근 운동 장애를 치료하는 데 있어서 치료학적으로 사용되고 있다. 또한, 이 독소는 안면 상의 주름살을 비외과적으로 감소시키는 것과 같은 다양한 미용학적 분야와, 다한증(과다 발한)을 치료하는 데 있어 이용되고 있다.
현재, 사람에 대한 치료학적 사용이 승인된 두 가지 보툴리누스 독소(A 형) 제제가 있는데, 이 둘은 "보톡스[BOTOX(등록 상표)]" {오큘리눔[Oculinum(등록 상표)]; 미국 캘리포니아주 어빈에 소재하는 알러간사(Allergan Inc.) 제품}와 "디스포트[DYSPORT(등록 상표)]"[영국에 소재하는 스펙스우드 파마수티컬스(Spexwood Pharmaceuticals, Ltd.) 제품]이다. 이들 제제는 사용 직전에 재구성되는 동결 건조 형태로 임상의에게 제공된다.
환자에 따라 투약 조건이 다르기 때문에, 개개의 환자들에게 요구되는 투여량은 상당히 다를 수도 있다. 더욱이, 어떤 분야에 대해서는, 임상의는 수 시간일 수도 있는 연장된 기간에 걸쳐서 조제 바이알의 함유물 중 단지 소량만을 투여해야 한다. 발행된 한 연구 서적에서 액상 보툴리누스 독소 제제를 실질적으로 활성을 유지하면서 재냉동하고 해동할 수 있다고 지적하였지만[샨츠(Schantz) 및 카우터(Kautter), 1978], 재구성된 독소의 활성을 평가하는 보다 최근의 연구에 따르면, "보톡스(등록 상표)"를 재구성하여 표준 냉장실(대략 4℃)에서 12 시간 동안 저장하였을 때, 그 효능의 44% 이상이 손실된다고 한다. 더욱이, 재구성된 제제를 영하 냉동실에 -70℃로 저장하였을 때, 2 주 후 그 효능의 약 70%가 손실된다[가틀란(Gartlan) 및 호프만(Hoffman), 1993]. 이러한 이유로, 그와 같은 조성물을 재구성한 후 4 시간이 지나면 사용하지 말 것이 권장된다. 이러한 점은 약제의 심각한 폐기와 환자에게 비용을 부담하게 되는 결과를 가져올 수 있다.
그러므로, 임상의에게 필요한 바와 같이, 용이하게 이송하고, 저장하여 사용할 수 있는 보툴리누스 독소의 즉석 액상 제제가 필요하다. 본 발명은 그러한 제제를 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 약학적 제제로 사용하기 위한 보툴리누스 독소의 안정한 액상 제제에 관한 것이다. 현재 입수 가능한 제제와는 달리, 본 발명의 제제는 표준 냉장실 온도(대략 4 ±2℃, 또는 약 2 내지 8℃, 또는 보다 일반적으로 약 0 내지 10℃ 범위)에서 장기간(1 년 이상) 저장 중에 액상으로 안정하다는 이점을 가진다. 관련 양태에서, 본 발명의 제제는 6 개월 이상 동안 "실온"(약 25℃, 또는 보다 일반적으로 10 내지 30℃ 범위) 저장 동안 액상으로 안정하다. 이러한 제제는 한 부위, 특히 근육 또는 근육군, 선(腺) 또는 기관의 콜린 작용성 신경 입력의 감소 또는 저해가 개선되는 상태에서 특히 유용하다. 이러한 상태의 예를 본 명세서에 기술한다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 단리된 보툴리누스 독소와, 약 pH 5 내지 약 pH 6의 완충 pH 범위를 제공할 수 있는 완충제를 포함하는 안정한 액상 약학적 제제를 포함한다. 이 일반 구체예에 따르면, 독소는 완충액 내에서 혼합되어 5 내지 6의 pH, 특히 pH 5.4 내지 pH 5.8, 바람직하게는 pH 5.5 내지 pH 5.6 범위인 액상 제제를 형성한다. 생성된 제제는 전술한 바와 같이, 1 년 이상, 또는 약 0 내지 10℃ 범위의 온도에서 2 년 이상, 또는 더 고온에서 6 개월 이상 안정하다. 대체로, 본 발명에 따르면, 공지된 보툴리누스 독소 혈청형(예를 들면, 혈청형 A, B, C1, C2, D, E, F 또는 G) 또는 등가의 생물학적 활성을 가진 다른 혈청형 중 어떠한 것도 본 발명의 제제에 포함될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제제에 사용되는 보툴리누스 독소는 클로스트리듐 보툴리눔으로부터 단리된 보툴리누스 독소 혈청형 A 또는 B이다.
바람직한 구체예에서, 보툴리누스 독소 B 형은 약 100 내지 20,000 U/㎖, 특히 약 1000 내지 5000 U/㎖의 농도로 제제 내 700 킬로달톤 분자량 복합체로서 존재한다. A 형을 사용할 경우, 보통 약 20 내지 2,000 U/㎖, 특히 약 100 내지 1,000 U/㎖의 농도로 존재한다. 상이한 혈청형을 배합하여 제제에 사용하는 경우, 그 유용한 투여량 또는 농도 범위는 그 각각의 생물학적 활성에 따라서 본 명세서에 예시된 투여량과 농도에 비례하여 결정할 수 있다.
제제에 사용될 수 있는 완충제는 포유류 조직, 특히 사람에게 주사하기에 안전한 것으로 간주되는 생리 완충제이다. 대표적인 완충제로는 인산, 인산-시트르산, 숙신산, 아세트산, 시트르산, 아코니트산, 말산 및 탄산계 완충 시스템이 있으며, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 제제는 사람 혈청 알부민 또는 젤라틴과 같은 부형 단백질을 포함하는 것이 바람직하다. 이 분야의 통상의 지식을 가진 자라면, 전술한 예시적인 완충제와 부형 단백질의 등가물도 인정하여 이용할 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 독소 제제는 그 효능을 유지하는 한, 이 분야에 공지된 다양한 용기 또는 바이알 중 어느 것에 패키지할 수 있다.
관련 양태에서, 본 발명은 선택된 근육 또는 근육군 또는 한선과 같은 특정한 선 부위, 또는 콜린 작용성 신경 분포를 가진 특정 기관으로의 콜린 작용성 전달과 같은 콜린 작용성 전달의 저해가 요구되는 환자를 치료하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 그러한 징후를 치료하기 위한 의약품을 제조함에 있어서, 본 발명의 제제의 용도를 포함한다.
보툴리누스 독소 제제를 사용하여 치료할 수 있는 치료학적 징후 및 미용학적 징후의 예로는 안검경련, 사시, 반측안면 경련, 중이염, 강직성 대장염, 아니스무스(anismus), 배뇨근 괄약근 근실조, 악관절 클렌칭, 척추 만곡, 근긴장, 예컨대 졸증, 척수 상해, 폐쇄성 두부 외상, 뇌성 마비, 다발성 경화증 및 파킨슨 병으로 구성된 군 중 하나 이상에 기인하는 근긴장, 및 이긴장증[예를 들면, 경련성 사경(경부 이긴장증), 경련성 발성 장애, 사지 이긴장증, 후두 이긴장증, 구하악골(메이지) 이긴장증]이 있으며, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 제제는 출산 중에 있는 환자의 회음부(회음부 근육)에 투여하여 그 근육을 이완시킬 수 있다. 본 발명의 제제의 예시적인 미용학적 용도로는 주름살 또는 주름진 이마를 야기시키는 근육에 투여하는 것이 있다. 본 발명의 제제의 다른 용도로는 근막 통증, 편두통과 관련된 두통, 혈관 장애, 신경통, 신경병증, 관절염 통증, 배부 통증, 다한증, 비루, 천식, 타액 과다 분비 및 위산 과다 분비가 있다.
본 발명의 제제의 특정한 투여 경로로는 근육내, 피하 또는 이온 삼투 요법 투여가 있다. 예를 들면, 본 발명에 의해 실행한 연구에 따르면, 보툴리누스 독소 B 형은 5000 내지 10000 유니트의 분할 일일 투여량 또는 단일 일일 투여량으로 근육내 투여할 경우 사경 이긴장증을 조절하는 데 효과적인 것으로 나타났다.
다른 관련 양태에 따르면, 본 발명은 다른 혈청형을 포함하는 안정한 액상 제제로 특정 보툴리누스 혈청형에 대해 면역 또는 불응성(refractory)이 생긴 환자를 치료하는 방법을 포함한다. 예를 들면, 보툴리누스 독소 혈청형 A에 불응성이 있는 환자는 보툴리누스 혈청형 B, C1, C2, D, E, F 또는 G 중 어느 것을 함유하는 안정한 액상 제제로 치료할 수 있으며, 보툴리누스 독소 혈청형 B에 불응성이 있는 환자는 보툴리누스 혈청형 A, C1, C2, D, E, F 또는 G 중 어느 것을 함유하는 안정한 액상 제제로 치료할 수 있다.
본 발명의 이들 및 다른 목적과 양태는 다음 발명의 상세한 설명을 첨부 도면과 함께 읽음으로써 완전히 명백해질 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 안정한 액상 약학적 보툴리누스 독소 제제와 그 사용 방법에 관한 것이다. 현재, 보툴리누스 독소 제제가 여러 가지 치료학적 용도와 미용학적 용도를 위해 시판되고 있지만, 용액 내 활성 독소 성분의 불안정성으로 인하여, 그 제제들은 염격한 저장 조건을 갖는 동결 건조 성분으로부터 재구성해야 한다. 예를 들면, "보톡스(등록 상표)"는 동결 건조 분말로서 제공되며, -5℃ 이하의 냉장실에서 운송되고 저장되어야 하며, 사용 직전에 계량된 양의 염수 용액을 첨가하여 재구성해야 한다. 재구성 후, 그 제제는 4 시간 이내에 환자에게 투여하고, 어떠한 재구성된 생성물은 이 기간 동안 냉동할 것이 권장되며(PDR, 1997), 재구성된 생성물의 냉동과 해동은 권장되지 않는다(호프만, 1993).
본 발명은 보툴리누스 독소를 함유하며, 표준 냉장실 온도에서 1 년 이상, 그리고 실온에서 6 개월 이상 액체로서 안정한 액상 제제를 제공한다. 이 제제는 특별한 저장 조건이나 운송 조건이 필요하지 않으며, 과잉 투여가 될 수 있는 독소의 희석시 오차 가능성을 줄이는 점에서 유리하다.
I. 정의
본 명세서에서 사용하는 용어 "안정한"은 정해진 기간 또는 무한정의 기간에 걸쳐서 생물학적 활성 물질, 특히 보툴리누스 독소에 의한 생물학적 활성 또는 효 능을 유지하는 것을 말한다.
용어 "보툴리누스 독소"란, 일반적으로 박테리아 클로스트리듐 보툴리눔으로부터 유도되는 생물학적 활성 단백질 또는 단백질 복합체를 말한다. 이 용어는 8 가지의 공지된 혈청학적으로 구별되는 독소(A, B, C1, C2, D, E, F 및 G) 중 어느 것을 말할 뿐만 아니라, 활성 분자를 형성하며, 콜린 작동성 신경 전달을 저해할 수 있는 동일한 일반 능력을 가진 어떤 추가적인 보툴리누스 독소를 말한다. 임의로, 이 용어는 또한 클로스트리듐 보툴리눔으로부터 유도되며, 본 명세서의 섹션 IIA에 기재된 바와 같이, 활성 분자와 복합체화되는 담체 단백질도 포함한다. 보툴리누스 독소 혈청형은 후술되는 바와 같이 약리학적으로 관련있지만, 면역학적으로 구별 가능하다. 대체로, 활성 독소 분자는 분자 크기가 약 145 내지 170 킬로달톤(kD)이다. 본 발명과 관련하여, 독소 단백질은 천연원으루부터 단리된 독소 및 담체 단백질 뿐만 아니라, 이 분야에 공지된 방법에 따라서 재조합적으로 생성되는 해당 독소와 담체 단백질도 포함한다는 것은 물론이다. 더욱이, 용어 "보툴리누스 독소"는 후술되는 바와 같이, 공지된 보툴리누스 독소 서열에 대해서 결실을 비롯하여 보존성 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가진 단백질을 포함한다.
보툴리누스 독소의 "생물학적 활성"은 신경 말단부로부터 아세틸콜린 방출을 차단함으로써 아세틸콜린 리셉터를 가진 시냅스에서 신경 전달을 차단할 수 있는 능력을 말한다. 이 용어는 본 명세서에서 "콜린 작동성 전달의 저해", "콜린 작동성 입력의 저해", "콜린 작동성 입력의 감소" 및 이들의 어형 변화형과 상호 교환 적으로 사용된다. 독소의 생물학적 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 마우스 LD50 분석을 포함한다. 이 분석에서 활성의 "유니트"는 한 투여량에서 테스트된 마우스의 50%를 사망시키는 데 요구되는 독소 단백질의 양으로 정의한다. 이 용어의 기능적 정의는 실시예 2에서 제공한다.
통상의 아미노산은 1 문자 약자 또는 3 문자 약자로 언급한다: 알라닌(A, Ala), 시스테인(C, Cys), 아스파르트산(D, Asp), 글루탐산(E, Glu), 페닐알라닌(F, Phe), 글리신(G, Gly), 히스티딘(H, His), 이소루신(I, Ile), 리신(K, Lys), 루신(L, Leu), 메티오닌(M, Met), 아스파르긴(N, Asn), 프롤린(P, Pro), 글루타민(Q, Gln), 아르기닌(R, Arg), 세린(S, Ser), 트레오닌(T, Thr), 발린(V, Val), 트립토판(W, Trp), 티로신(Y, Tyr).
용어 "액상 약학적 제제"란, 장기간 동안 완충 염수 또는 생리 완충액과 같은 액상 약학적 부형제에 저장될 수 있는 약제 또는 생물학적 제제의 약학적 활성 조제물을 말한다. 이 제제는 사용 전에 유사하거나 상이한 액체 내에 희석시키는 농축 제제일 수 있다.
용어 "완충제"란, 수성 매질 내에 용해된 경우, 수소 이온이 용액에 첨가되거나 제거될 때, 일정한 pH 범위 내에서 용액의 유리 수소 이온 농도를 유지시키는 역할을 하는 화합물, 대개는 염을 말한다. 이 기능을 제공할 경우, 염 또는 용액은 완충 능력을 갖는다고 하거나, 그러한 범위에 걸쳐서 용액을 완충시킨다고 한다. 일반적으로, 완충제는 그 pK의 ±1 pH 유니트 내의 범위에 걸쳐서 적당한 완충 능력을 갖는다. "생리 완충제"는 약학적 제조 방법의 한 부분으로서 투여되는 경우, 포유류, 특히 사람에게 비독성인 완충제이다. 본 발명에 관하여 적절한 생리 완충제의 예가 본 명세서에서 제공된다.
"약학적으로 허용 가능한 액체"는 포유류, 특히 사람에 의한 소비 또는 주사에 대하여 안전한 것으로 간주되는 액체이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "부형 단백질"은 약학적 활성 제제에 첨가되지만, 제제에 추가의 유의적인 생물학적 활성은 제공하지 않는 단백질을 말한다. 부형 단백질의 예로는 혈청 알부민, 특히 사람 혈청 알부민 및 젤라틴이 있으며, 이들로 한정되는 것은 아니다. 그러한 단백질은 약학적 제제를 투여하고자 하는 포유류에 비교적 비면역원성인 것이 바람직하다.
본 발명과 관련하여, 특히 청구 범위와 관련하여 사용되는 용어 "포함하는"은 "함유하는" 또는 "특징으로 하는"의 의미를 갖는 것으로 사용된다. 요소 A, B 및 C를 "포함하는" 조성물 또는 방법은 A, B 및 C 이외에도 X 또는 Y와 같은 다른 열거되지 않은 다른 요소도 포함할 수 있다.
본 발명에 관련하여, 특히 청구 범위와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 "대략" 또는 "거의"를 의미한다. 엄격한 수치 한정을 가하려는 것은 아니지만, 수치와 관련하여 이 용어는 열거된 값 또는 범위의 ±10%인 값을 의미하는 것으로 해석할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 다른 모든 용어들은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되거나 표준 의학 사전 또는 표준 과학 사전에 열거된 통상의 정의를 취하여 해석해야 한다.
II. 보툴리누스 독소
전술한 바와 같이, 보툴리누스 독소는 클로스트리듐 보툴리눔의 다양한 균주에 의해 생성된 폴리펩티드 생성물이다. 이들 균주는 8 가지 이상의 공지된, 혈청학적으로 구별되는 독소(A, B, C1, C2, D, E, F 및 G)를 생성한다. 클로스트리듐 바라티(Clostridium barati)와 클로스트리듐 부티리쿰(Clostridium butyricum)은 각각 혈청형 E 및 F와 유사한 단일 혈청형을 생성한다[심프슨(Simpson), 1993]. 보통, 독소 분자는 분자 크기가 약 145 내지 170 킬로달톤(kD)이다. 어떤 경우에서, 활성 독소 분자는 원종 폴리펩티드로부터 형성된 두 개의 이황화물 연결 사슬로 구성된다. 예를 들면, 보툴리누스 B 형은 150 kD의 단일 전구체 폴리펩티드로부터 생성되며, 닉(nick)을 내어 최대 활성에 대해 두 개의 황화물 연결 분획, 즉 100 kD의 중량 사슬(H 사슬)과 50 kD의 경량 사슬(L 사슬)을 발생한다. 천연 독소는, 또한 클로스트리듐 보툴리눔에 의해 생성된 비독성 담체 단백질에 비공유 결합된다. 이들 담체 단백질은 독소 사슬에 결합되어 900 kD(A 형), 바람직하게는 B 형에 대해 약 700 kD를 가진 복합체를 형성한다. 담체 단백질은 독소와 함께 공정제하여 전술한 제제의 부분을 최적 형성한다.
다양한 보툴리누스 독소 혈청형은 세포 내에서 상이한 결합 특이성을 나타낸다. 예를 들면, A 형 독소와 E 형 독소는 동일한 시냅토솜 결합 부위에 결합하는 것을 보이는 한편, B 형 독소는 상이한 부위에 결합하며, A/E 형 결합 부위에서 결합에 대해 경쟁하지 않는다[멜링(Melling), 1988]. 작용의 특별한 이론이나 메카니즘으로 얽매이고 싶지는 않지만, 독소의 H 사슬이 뉴런 세포 결합과 세포 관통 활 성을 제공하는 반면에, L 사슬은 시냅스에서 아세틸콜린 방출을 저해하는 역할을 한다고 믿어진다. 더욱이, 보툴리누스 독소 A 형과 B 형은 아세틸콜린 방출의 저해를 실행하는 데 있어서, 약간 상이한 메카니즘을 사용한다. 즉, A 형은 시냅스 관련 단백질-25(SNAP-25)를 분열시키는데, B 형은 소포 관련 멤브레인 단백질(VAMP 또는 시냅토브레빈)을 분열시키며, 이 두 단백질은 시냅스로부터의 시냅스 소포 방출 성분이다.
모든 클로스트리듐 보툴리눔 독소 혈청형은 포유류에게서 통상의 생리학적 결과를 생성한다. 이들 모두는 투여 부위에 따라서 부분 또는 전체 근육 마비, 또는 기관이나 선 기능의 차단 또는 저해를 야기시킨다. 따라서, 본 발명의 제제는 전술한 생물학적 활성을 특징으로 하는 클로스트리듐 보툴리눔으로부터 유도되는 보툴리눔 독소 혈청형 중 어느 것으로도 사용할 수 있다. 대부분의 현재 공지된 혈청형의 아미노산 서열 또한 공지되어 있거나, 이 분야에 공지된 방법에 의해 결정할 수 있다. 본 발명과 관련하여, 보툴리누스 독소 제제는 그러한 공지된 서열에 대한 보존성 아미노산 치환을 가진 재조합적으로 가공된 보툴리누스 독소를 포함하는 것으로 더 해석해야 함은 물론이다. 일반적으로, 이러한 치환은 천연 아미노산의 표준 치환 부류로부터 이루어진다. 예를 들면, 표준 치환 부류는 통상의 측쇄 성질과, 예를 들면 데이호프(Dayhoff) 주파수 교환 매트릭스와 같은 이 분야에 공지된 표준 주파수 교환 매트릭스에 의해 측정되는 바와 같이, 사실상 상동 단백질 내 치환의 최고 주파수에 따라서 여섯 가지 부류가 될 수 있다. 예를 들어 데이호프 매트릭스 하에서, 그 부류들은 클라스 I: Cys; 작은 지방족 측쇄와 OH 기 측쇄 를 나타내는 클라스 II: Ser, Thr, Pro, Hyp, Ala 및 Gly; 수소 결합을 형성할 수 있는 중성 및 음전하를 띠는 측쇄를 나타내는 클라스 III: Asn, Asp, Glu 및 Gln; 염기성 극성 측쇄를 나타내는 클라스 IV: His, Arg 및 Lys; 분지쇄 지방족 측쇄를 나타내는 클라스 V: Ile, Val 및 Leu; 및 방향족 측쇄를 나타내는 클라스 VI: Phe, Tyr 및 Trp이다. 또한, 각각의 그룹은 아미노산 유사체, 예를 들면, 클라스 IV 내에 오르니틴, 호모아르기닌, N-메틸 리신, 디메틸 리신 또는 트리메틸 리신을 포함할 수 있고, 그룹 VI 내에 할로겐화 티로신을 포함할 수 있다. 더욱이, 이들 부류들은 L 및 D 입체 이성질체를 모두 포함할 수 있지만, L-아미노산이 치환에 있어서 바람직하다. 예를 들면, Asn, Gln 또는 Glu와 같은 다른 클라스 III 잔류물에 대한 Asp의 치환체는 보존성 치환체이다.
보툴리누스 독소 활성은 이 분야에 공지된 것과 같은 전기 영동 분석을 사용하여 측정할 수 있지만, 활성은 독소를 마우스와 같은 작은 동물에 주사하여 테스트된 동물의 평균 50%를 사망시키는 데 요구되는 독소의 투여량을 결정함으로써 측정하는 것이 통상적이다. 이 투여량을 "치사량-50' 또는 LD50이라고 하며, 생물학적 활성 유니트로 정의한다. 치료학적 용도를 위한 투여량은 협약에 의해, 그러한 유니트로 표준화된다. 하기 섹션 IIIB에서 더 상세하게 논의되겠지만, 다양한 혈청형은 LD50 유니트에 의해 측정되는 바와 같이, 상이한 사람 치료 효능을 가질 수도 있다. 치료학적 투여량은 이 분야에 공지된 방법에 따라서 이 정보로부터 적정할 수 있다.
III. 보툴리누스 독소의 제조
이 섹션에서는 본 발명에 따른 제제에 사용하고자 하는 보툴리누스 독소를 제조하는 방법이 기술된다.
A. 클로스트리듐 보툴리눔으로부터 보툴리누스 독소의 정제
이 섹션은 보툴리누스 독소 B 형을 예로 들어 배양된 클로스트리듐 보툴리눔으로부터 정제된 보툴리누스 독소를 제조하는 일반 방법을 제공한다. 본 명세서에 구체적으로 열거한 방법들 이외에도, 보툴리누스 독소 A 형 및 B 형 뿐만 아니라, 다른 공지된 혈청형을 제조하기 위한 다른 방법들도 이 분야에 공지되어 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 제제 내 활성 성분은 보툴리누스 독소로 알려진 클로스트리듐 보툴리눔 추출물의 단백질 성분이며, 그 활성 성분의 분자량은 약 145 내지 170 kD이고, 보다 큰 분자량을 가진 천연 단백질 복합체 내에 존재하는 것이 일반적이다. 이 섹션은 보툴리누스 독소 혈청형 A 및 B를 위주로 여러 가지 보툴리누스 독소의 예시적인 정제 방법을 제공한다. 일반 과학 문헌에는 이 독소의 다른 정제 방법을 위한 지침이 제공되며, 이 분야의 통상의 지식을 가진 자라면, 그러한 방법을 확인하여 본 발명에 따라서 제조된 제제에 사용하고자 하는 특정 독소에 그 방법을 적용할 수 있을 것이다.
통상, 보툴리누스 독소 B 형은 이 분야에 널리 공지된 방법에 따라서, 클로스트리듐 보툴리눔의 고 역가 발효물로부터 복합체로서 단리한다. 스톡 배양물은 유기물의 분배에 관한 국가 조례에 따라서, 질병 관리국(Center for Disease Control; CDC) 등에서 라이센스를 획득한 연구 기관에 의해 미국 내에서 입수할 수 있다. 보툴리누스 독소 B 형의 정제에 대해서는 클로스트리듐 보툴리눔 오크라(Okra) 또는 빈(Bean) B가 적당한 출발 물질이다. 냉동된 스톡 배양물을 티오글리콜레이트 배지 또는 트립티카제 펩톤 배지와 같은 배양 배지를 함유하는 시험관에 접종한 후, 배양물을 성장시키고, 본 명세서에서 후술되며, 미국 특허 제5,696,077호에 상세하게 기재되어 있는 방법에 따라 처리한다. 상기 특허는 본 명세서에서 참고로 인용한다.
간단히 설명하면, 배양물을 이 분야에 공지된 방법에 따라서 팽창시킴으로써 박테리아 출발 물질의 충분량을 생성하여 소정 수율의 독소를 얻는다. 대체로, 약 20 리터의 박테리아 배양물이 0.5 그램의 독소를 생성하는 데 필요하다. 배양물을 실온으로 조절하고, 배양물의 pH를 황산 또는 다른 적당한 산으로 pH 3.5로 조절한다. 생성된 침전물을 고정시키고, 맑아진 상청액을 경사 분리한다. 그 다음, 염화칼슘을 교반하면서 침전물에 첨가하고, 부피를 탈이온수로 증가시켜 CaCl2의 최종 농도가 약 150 mM이 되게 한다. pH를 거의 중성(pH 6.5)으로 올리고, 독소 용액을 원심 분리에 의해 정화한다. pH를 3.7로 조정하여 독소를 재침전시킨다. 생성된 침전물을 고정시키고, 독소 침전물을 원심 분리에 의해 수집한 다음, 완충액(pH 5.5)에 재용해시켜서 동일한 완충액으로 밤새도록 완전히 투석한다. 투석된 독소를 원심 분리하여 생성된 상청액을 음이온 교환 컬럼(DEAE)에 통과시켜 크로마토그래피를 행한다. 비결합된 분획을 수집하여 단백질 성분에 대해 테스트한다. 황산암모늄을 약 60% 포화도로 첨가하여 독소 복합체를 이 분획으로부터 침전시킨다. 펠릿을 인산염 완충액에 용해시키고, 동일한 완충액(pH 7.9)으로 투석한다. 이 정제된 독소 제조물은 본 발명의 제제를 제조하는 데 사용할 수 있다.
보툴리누스 독소 A 형의 제조 방법도 이 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 함블톤(Hambleton) 등(1981) 및 멜링(Melling) 등(1981)의 문헌에는 클로스트리듐 보툴리눔 A 형 NCTC 2916으로부터 보툴리누스 독소 A 형을 생성하고 정제하는 방법이 기재되어 있는데, 상기 두 문헌은 본 명세서에서 참고로 인용한다. 박테리아의 배양물을 검증된 종자 스톡으로부터 성장시키고, 이 분야에 널리 공지된 조건에 따라서, 혐기성 조건 하에 작동하는 30 리터 발효기에 접종한다. 독소 수율은 계속해서 모니터하며(예를 들면, LD50 측정에 의해서), 최대 수율에 도달하면(대략 2 x 106 마우스 LD50/㎖), 배양물을 pH 3.5로 산성화하고(3 N H2SO4로 조절), 독소를 원심 분리에 의해 수거한다. 이 침전된 미정제 독소를 재용해시켜서 0.2 M 인산염 완충액(pH 6.0)으로 추출한 후, 리보뉴클레아제 처리(34℃에서 100 ㎍/㎖)하고, NH4SO4(25℃에서 60% 포화)를 사용하여 침전시킨다. 그 다음, 침전물을 재현탁시키고, pH 5.5에서 DEAE-세파셀(Sephacel) 이온 교환 크로마토그래피를 행한다(배치식 예비 흡착 후). 분획을 활성에 대해 모니터하고, NH4SO4(25℃에서 60% 포화)를 사용하여 활성 분획을 다시 침전시킨다. 후술되는 바와 같이, 이 침전물은 저장하고, 재용해시켜서 본 발명의 제제를 만들 수 있다.
본 발명의 제제는 보툴리누스 독소 A 형 및 B 형에 대해 기술한 방법에 따라서 제조된 것과 같은 독소 결합 복합체를 포함하거나, 이 분야에 공지된 방법에 따 라서, 보툴리누스 독소 C1, C2, D, E, F 또는 G의 동등한 형태를 이용하는 것이 바람직하다. 독소의 역가는 와륜 혼합과 같은 기포와 격렬한 진탕을 피하면서, 재구성된 독소 결합 복합체를 사람 혈청 알부민과 같은 부형 단백질에 연속 희석시킴으로써 결정된다. 통상의 방법에 따르면, 역가는 실시예 2에 기재된 마우스 LD50 분석과 같은 마우스 치사량 분석에서 결정된다. 작업 스톡을 희석하고, 분액하여 저장을 위해 동결 건조한다. 이 스톡 용액을 분석 테스트하여 이 분야에 널리 공지된 방법과 하기 실시예 2에 예시된 방법에 따라서 단백질 농도, LD50, 순도 및 약학적 타당성을 결정한다.
IV. 안정한 보툴리누스 독소 제제
본 발명은 보툴리누스 독소를 제조하여 장기간 동안, 예를 들면 "냉장실" 온도(즉, 약 5 ±3℃, 보다 바람직하게는 4 ±2℃, 보다 일반적으로는 0 내지 10℃)에서 1 년 내지 2 년 이상, 또는 "실온"(즉, 약 25℃, 보다 일반적으로는 10 내지 30℃)에서 약 6 개월 이상 그 효능을 유지하는 안정한 액상 제제 내에 저장할 수 있다는 발견에 기초한다. 이러한 제제는 외과의가 더 재구성할 필요없이 사람 또는 다른 포유류 종에게 용이하게 분배할 수 있다. 본 발명의 제제는 적당한 완충 조건에 의해 유지시켰을 때, pH 5 내지 6, 바람직하게는 5.5 내지 5.6의 pH를 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 제제는 하나 이상의 보툴리누스 단백질을 포함할 수도 있다.
실시예 1은 농도가 5000 U/㎖인 보툴리누스 독소(B 형) 제제의 제조 방법에 대한 상세한 설명을 제공한다. 이러한 제제 조건은 용이한 투약 패키지에서 안정한 제제를 제공하기 위하여, 혈청형에 따라 요구되는 농도로 보툴리누스 독소 A 형과 같은 보툴리누스 독소의 다른 혈청형에 적용할 수 있음은 물론이다.
간단히 말해서, A 형 및 B 형에 관하여 전술한 정제된 독소 제제와 같은 보툴리누스 독소의 농축 제제를 pH 5 내지 pH 6, 바람직하게는 약 pH 5.6인 숙신산염 완충제와 같은 희석제와 혼합한다. 보툴리누스 독소 B 형의 경우, 마우스 LD50 분석으로 평가하였을 때, 약 5000 U/㎖ 농도가 바람직하지만, 전달하고자 하는 투여량에 따라서, 100 내지 20,000 U/㎖ 범위, 또는 심지어 그 이상의 농도가 필요하거나 바람직할 수도 있다. 보툴리누스 독소 A 형의 경우, 20 내지 2,000 U/㎖, 바람직하게는 약 100 내지 1,000 U/㎖ 범위의 농도가 간편할 수 있다. 약학적 제조를 위하여, 제제를 샘플링하고, 가능한 미생물 오염물의 존재 여부에 대해 테스트하여(생적재), 환자에게 분배하기 위한 유리 또는 폴리프로필렌 바이알로 멸균 여과한다. 최종 생성물은 1 년 이상 액상으로 저장할 수 있으며, 바람직하게는, 마우스 LD50 테스트(실시예 2)에서 효능이 20% 이하로 손실된 것으로 입증된 바와 같이, 생물학적 효능의 유의적인 손실없이 0 내지 10℃에서 2 년 이상 저장할 수 있다.
위에서 언급한 희석제는 복합체의 안정성에 악영향을 주지 않고, 약 pH 5 내지 pH 6의 안정한 pH 범위를 지지한다면, 어떠한 약학적으로 허용 가능한 액체일 수 있다. 특히 적당한 완충제의 예로는 숙신산염 완충제와 인산염 완충제가 있지만, 이 분야의 전문가라면, 그 완충제가 허용 가능한 pH 안정도, 또는 정해진 범위 내에서 "완충 능력"을 제공하는 한, 본 발명의 제제가 특정한 완충제로 한정되지 않음을 이해할 것이다. 대체로, 완충제는 그 pK의 약 1 pH 유니트 내에서 적당한 완충 능력을 갖는다[라크만(Lachman) 등, 1986]. 본 발명에 관련하여, 완충제로는 pK가 약 4.5 내지 6.5 범위인 완충제가 있다. 완충제의 타당성은 출간된 pK 표에 기초하여 평가하거나 이 분야에 널리 공지된 방법에 의해 실험적으로 결정할 수 있다. 전술한 숙신산염 완충제 및 인산염 완충제 외에, 다른 약학적으로 유용한 완충제로는 아세트산염, 시트르산염, 아코니트산염, 말산염 및 탄산염 완충제가 있다(라크만). 용액의 pH는 어떤 약학적으로 허용 가능한 산, 예를 들면 염산 또는 황산, 또는 염기, 예를 들면 수산화나트륨을 사용하여 그 범위 내에서 소정의 종점을 조정할 수 있다.
제제에 첨가되는 부형 단백질은 다수의 약학적으로 허용 가능한 단백질 또는 펩티드 중 어느 것일 수 있다. 부형 단백질은 면역 반응을 일으키지 않으면서 포유류 대상에 대한 그 투여 능력에 따라 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 사람 혈청 알부민은 사람에게 투여되는 약학적 제제에 사용하기에 매우 적당하며, 이에 비해, 소 혈청 알부민은 소에게 사용하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들면, 젤라틴과 같은 다른 공지의 약학적 단백질 부형제도 이 목적을 위해 사용할 수 있다. 부형제는 보유 용기 또는 바이알에 독소 단백질 착체가 흡착되는 것을 방지하기에 충분한 농도로 제제 내에 포함된다. 부형제의 농도는 부형제의 성질과 제제 내 독소 복합체의 농도에 따라서 변한다. 예를 들어 본 발명에 따라서 실행된 연구에서, 0.5 mg/mL 사람 혈청 알부민의 농도가 5000 U/mL 보툴리누스 독소 B 형을 함유하는 제제의 목적에 충분한 한편, 대부분의 사람에게서 유의적인 면역 반응 또는 알레르기 반응을 일으키지 않으며, 대체로 1000 U 보툴리누스 B 형 당 약 0.05 mg 내지 1 mg의 농도로 충분한 보호를 제공해야 하는 것으로 나타났다.
보툴리누스 독소 A 형을 안정화하기에 적당한 부형제 농도도 기술하였다. 예를 들면, "보톡스(등록 상표)"는 독소 활성의 100 유니트 당 0.5 mg 알부민을 첨가함으로써 안정화된다(PDR).
V. 용도
A. 보툴리누스 독소 제제의 치료학적 용도 및 미용학적 용도
본 발명의 약학적 조성물은 콜린 작용성 신경 전달, 특히, 한정하는 것은 아니지만 평활근 또는 골격근의 조절과 관련된 콜린 작용성 신경 전달의 저해 또는 차단이 요구되는 다수의 징후에 사용할 수 있다. 이 섹션은 본 발명의 제제를 치료학적으로 사용할 수 있는 장애의 예를 제공하지만, 본 명세서에 제공되는 예로 본 발명을 한정하는 것으로 해석해서는 안된다. 이들 징후의 일부에 대한 투여량과 투여 경로는 하기 B에 기재되어 있다.
보툴리누스 독소, 특히 보툴리누스 A 형은 강직성 근육 장애의 치료에 효과적인 것으로 나타났다. 단일 치료 섭생(다중 근육내 주사를 포함할 수도 있음)은 수 개월 동안 조절 불가능한 근육 강직성으로부터의 고통을 덜어준다. 예를 들면, "보톡스(등록 상표)"(보툴리누스 독소 A 형)은 안검경련의 치료를 위한 안구 안와 국소 주사에 대해서 미국 식품 의약품국에 의해 승인을 받았다. 다른 징후로는 다른 병소 이긴장증, 예를 들면 후두 이긴장증, 메이지 증후군(구하악골 이긴장증; 구안 운동 이상), 경련성 사경[하드맨(Hardman) 등, 1996], 사지 이긴장증, 아니스무스, 및 배뇨근 괄약근 근실조, 안검경련, 사시, 반측안면 경련 뿐만 아니라 비루, 중이염, 타액 분비 과다, 천식, 강직성 대장염, 위산 분비 과다(예를 들면, 미국 특허 제5,766,005호 참조), 편두통 관련 두통, 혈관 장애, 신경통 또는 신경병증(미국 특허 제5,714,468호; WO 953041호), 관절염 통증(WO 9517904호), 횡문근 또는 평활근 관련 위장관 장애(미국 특허 제5,674,205호), 출산 중 회음부 이완(미국 특허 제5,562,899호), 또는 악관절 클렌칭의 경감(미국 특허 제5,298,019호)이 있다. 또한, 보툴리누스 독소 A 형은 안면 상의 "주름선"을 유발하는 근육 긴장의 미용학적 경감을 달성하고, "이마 융기(blowlift)"를 달성하기 위하여 국소 투여하고 있으며[프란켈(Frankel), 1998], 병소 다한증 치료(심한 발한; WO 9528171호; 미국 특허 제5,766,605호) 뿐만 아니라 척추의 소아성 만곡의 치료(미국 특허 제5,053,005호), 성인 및 소아 뇌성 마비(미국 특허 제5,298,019호; WO 9305800호), 및 뇌성 마비에 의해 유발되는 경련 및 불수의근 수축, 다발성 경화증 또는 파킨슨 병(미국 특허 제5,183,462호) 치료를 위해 피부내 주사할 경우 유용한 것으로 밝혀졌다. 상기 인용된 모든 참고 문헌들은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명에 따라서 실행된 실험에서, 보툴리누스 독소 B 형을 함유하는 안정한 액상 제제를 테스트하여 사경이라고도 알려진 경부 이긴장증, 개체가 머리, 목 및 척추에서 불수의근 경련과 근육 수축을 경험하여 머리가 돌아가거나 기울어지게 되는 상태에 효과적인 것으로 나타났다. 또한, 이 상태는 빈번하게 진전(震顫)과 골격근 통증을 수반한다. 일반적으로, 이 장애의 병인은 알려지지 않았지만, 관련된 근육 조직의 과민성을 유발하는 중추 신경계 기능 장애의 결과인 것으로 생각된다. 항콜린 작용제, 도파민 작용제, 근육 이완제, 진경제 및 항경련제를 비롯한 현재의 치료 섭생은 지속적인 경감을 제공하지 않는다. 보툴리누스 독소 B 형은 국소 마비 또는 부전 마비를 야기시킴으로써 이 상태를 치료하는 데 효과적이며, 주사 후 약 1 주의 통상의 개시 시간과 약 1 내지 4 개월 지속되는 반응 기간을 가진다.
다른 보툴리누스 독소 혈청형의 제제도 A 형에 관하여 전술한 상태 중 어느 것의 기초 치료에 유용하다. 또한, 전술한 바와 같이, 보툴리누스 독소 B 형 내지 G 형도 독소에 대한 면역 반응의 존재로 인하여 보툴리누스 독소 A 형에 의한 치료에 불응성을 갖게 되는 환자의 치료에 유용하다. 이와는 반대로, 혈청형 A도 혈청형 B 또는 다른 독소 혈청형의 어느 것에 불응성을 갖게 되는 환자에게 유용할 수 있다. 하나 이상의 보툴리누스 독소 혈청형의 제제도 본 발명에 따라서 제조하여 사용할 수 있다.
대체로, 이들의 유사한 생물학적 효과의 관점에서, 다양한 보툴리누스 독소 유형을 다양한 장애, 특히 근육 이긴장증과 관련된 장애의 치료에 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, A 형 및 B 형에 관하여 전술한 바와 같이, 유효 투여량(LD50 또는 생물학적 유니트로 표기함)은 여러 가지 혈청형간에 유의적으로 변할 수 있다. 등가 투여량의 산정은 테스트된 독소 중 어느 것에 대해 기재된 공지의 투여량을 기준으로 이루어질 수 있다.
B. 투여량 및 투여 방식
보툴리누스 독소는 동물에게 효능있고, 때로는 치명적인 독소로서 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, 전술한 바와 같이, 투여 방식과 투여량을 조절하여 충분한 치료가 행해진다면, 이 약제는 사람에게 안전하게 사용될 수 있다.
여러 가지 형태의 보툴리누스 독소의 투여량은 사용된 독소의 혈청형에 따라서 변한다. 예를 들면, 본 발명에 의해 실행된 실험에서, 마우스 LD50을 비교하였을 때, 보툴리누스 독소 A 형["보톡스(등록 상표)"]은 원숭이에게 마비를 유발함에 있어서 선택된 골격근의 전기 생리학적 측정으로 평가하였을 때, 보툴리누스 독소 B 형보다 약 4 내지 6 배 더 강력한 것으로 나타났다. 이 관찰은 래트 사지의 마비를 유발시키는 데 요구되는 두 가지 독소의 양이 큰 차이를 보인다는 래트 실험 결과[셀린(Sellin); 잭슨(Jackson)]와 일치한다. 이들 관찰의 관점에서, 적당한 등가 투여량은 전문적인 지식을 가진 자가 실험적으로 산정하거나 결정할 수 있다.
권장 투여량의 변동은 환자 병력에 따라서 달라질 수 있다. 예를 들면, 보툴리누스 독소 A 형이 반복적으로 투여된 환자는 더 이상의 치료에 대해 "불응성"을 갖게 되어 동등한 시간 대비 효과를 산출하기 위하여 더 많은 투여량이 필요한 것으로 보고되었다. 어떤 특정한 작용 메카니즘을 언급하지 않더라도, 이 현상은 혈청형 특이적인 면역 반응이 환자에게 전개되는 것과 관련있다고 믿어진다. 반복된 보툴리누스 독소 A 형 치료를 받는 환자의 항체 발생률에 대한 보고는 약 3% 내지 57% 범위이다. 따라서, 임상의가 치료 섭생 중에 혈청형을 바꿀 것을 선택하는 경우에서, 새로운 혈청형의 초기 투여량은 환자의 투약력을 기준으로 하기보다는 환자 자체를 기준으로 하여 산출해야 한다.
적당한 투여 방법은 환자에게 심각한 부작용을 유발하지 않으면서, 활성 독소 성분을 대상 조직에 전달할 수 있는 어떠한 것일 수도 있다. 그러한 방법으로는 근육내 주사, 국소 투여, 피하, 신경초 적용, 이온 삼투 요법 투여 등이 있으며, 이들로 한정되는 것은 아니다. 활성 성분의 전신 분배를 제한하기 위한 수단을 비롯하여, 보툴리누스 독소의 특정한 투여 과정은 이 분야에 널리 알려져 있다. 근전계를 사용하여, 특히 안구의 안와, 후두 및 익상 부위의 근육, 뿐만 아니라 비만증 환자의 근육과 같이 확인하기 어려운 근육과 관련된 치료에 대해 특정 근육군을 확인하고, 더 정확하게 위치를 알아내는 데 사용할 수 있다.
이긴장증의 치료는 통상적으로 피하 바늘을 사용하여 근육내 주사에 의해 환부 근육의 신경 분포 부위의 인접부로 독소를 투여함으로써 실행하는 것이 통상적이다. 전형적으로, 생성된 국소 마비는 3 개월 또는 4 개월까지 환자에게 경감을 제공한다. 명백한 마비를 유발하지 않으면서 어떤 기능 장애를 보정하는 데 충분한 신경 근육 차단을 달성하기 위하여, 환자를 보다 적은 투여량으로 테스트하여 최적 투여량으로까지 개별적으로 적정할 수 있다. 환자가 독성에 대한 불응성을 갖게 된다면, 투여량 변화가 나타날 수도 있다. 본 발명의 이점은 적당한 투여량과 관련된 더 이상의 모호성을 초래할 수 있는, 용액 내 독소 물질의 불안정성과 연관된 통상의 투여량 문제점을 극복한다는 것이다.
보툴리누스 독소 A 형의 권장 투여량은 다수의 징후에 대해 결정되었으며, 이 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 사시 치료의 경우, 1.25 내지 2.5 U 보툴리누스 독소 A 형의 투여량이 수직근 투여 및 20 디옵터 미만의 수평 사시에 대해 권장 되며, 20 프리즘 디옵터 이상의 수평 사시에 대해서는 2.5 내지 5 U가 권장된다(Physician's Desk Reference, 51 판).
또한, 보툴리누스 독소 A 형은 27 내지 30 게이지 바늘을 사용하여 1.25 내지 2.5 U의 투여량을 상안검의 내측 및 외측 전방 검판 안윤상골과 하안검의 외측 전방 검판 안윤상골로 주사하여 안검경련을 치료하는 데 사용할 수 있다. 치료는 약 3 개월 동안 지속되는 것으로 예상되며, 반복 치료시, 환자의 반응에 따라서 투여량이 2 배까지 증가할 수도 있다. 200 U 이하의 보툴리누스 독소 A 형의 누적 투여량을 30 일 기간에 걸쳐서 제공할 것이 권장된다(Physician's Desk Reference, 51 판).
실시예 3은 본 발명에 따른 제제를 사용하는 경부 이긴장증(사경)의 치료에서 보툴리누스 독소 B 형의 사용에 대한 투여량 범위 연구의 예를 제공한다. 하기 약술한 이들 연구에서, 본 발명에 따른 보툴리누스 독소 B 형 액상 제제가 2 내지 8℃ 범위의 온도 조절기를 갖춘 임상용 냉장실 내에 제제를 저장하는 설명서와 함께 투여 임상의에게 제공되었다. 보통, 제제는 제조 로트로부터 공급되고, 6 내지 12 개월 동안 권장 온도에서 저장하였다. 임상의는 제제의 대략 6 개월 공급분을 수령하였다.
간단히 말해서, 환자는 2 내지 4 피부 부위의 목 및/또는 어깨 근육군에 근육내 주사에 의하여 독소의 가변적인 투여량을 수용하였으며, 그 장애의 근육 관련성에 대한 임상의 평가에 따라서 결정하였다. 한 연구에서, 100 내지 1200 U 범위의 개별 분할 투여량을 수용하였으며, 누적 투여량은 398 일까지의 범위에 걸쳐서 270 내지 2280 U 범위였다. 모든 환자는 이 연구 중에 개선되었으며, 제제 효능의 축소는 연구 과정 중에 관찰되지 않았다.
본 발명에 따라서 실행된 또 다른 연구는 보툴리누스 독소 A 형에 대해 불응성을 갖게 된 환자를 보툴리누스 독소 B 형으로 치료할 수 있다는 것을 밝혔다. 여기서, 연구에 참여한 환자는 보툴리누스 독소 A 형에 대한 반응성이 감소한 것으로 나타났으며, 치료 후, 이들이 토론토 서부 경련성 사경 등급 스케일[Toronto Western Spasmodic Torticollis Rating Scale(TWSTRS); 콘스키(Consky), 1994]에 의해 평가하였을 때, 기준선 스코어와 비교하여 총 스코어가 25% 이상 감소한 것으로 나타났다면(감소 = 개선), 성공적으로 치료된 것으로 간주하였다. 실시예 3에 상세하게 기재한 바와 같이, 150 내지 1430 U의 보툴리누스 독소 B 형 제제의 개별 투여량을 투여하였으며, 누적 투여량은 117 일까지에 걸쳐서 300 내지 12000 유니트의 범위였다. 전반적으로, 환자는 이 연구에서, 특히 고 투여량에서 개선되었으며, 보툴리누스 B 형에 대한 항체의 차단이 전개되지 않았고, 제제 효능의 감소도 나타나지 않았다. 또 다른 연구에서, 전술한 바와 같이, 0, 400, 1200 및 2400 U 보툴리누스 독소 B 형 제제의 개별 투여량을 203일의 기간 동안 주기적으로 투여하여 사경 치료에 성공하였다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며, 본 발명을 한정하는 것은 결코 아니다.
재료
달리 지적하지 않는 한, 본 명세서에 기재된 모든 시약은, 필요에 따라서 화학 공업용, 생화학 공업용, 생명 공학 산업용, 약학 산업용 시약을 판매하는 평판있는 시중 판매업체로부터 구할 수 있다.
실시예 1: 안정한 보툴리누스 독소 제제의 제조
A. 숙신산염 완충제의 제조
숙신산염 완충제를 2.7 mg/mL 숙신산이나트륨과 5.8 mg/mL 염화나트륨으로 3 L 로트에서 제조하고, 0.5 mg/mL 사람 혈청 알부민[미시건 바이올로지컬 프로덕츠 인스티튜트(Michigan Biological Products Institute)]으로 보충하였다. 진한 염산을 사용하여 완충제의 pH를 pH 5.6으로 조절하였다. 완충제를 0.2 ㎛ 필터에 통과시켜 가압 밀봉 용기로 여과하였다. 사용 전에, 완충제를 샘플링하여 pH, 박테리아 내독소 및 생적재에 대하여 테스트하였다.
B. 보툴리누스 독소 제제의 제조
숙신산염 완충제(pH 5.6)를 사용하여 농축 보툴리누스 독소 B 형의 분액을 대략 1000 배 희석하여 5000 ±1000 U/㎖의 효능을 얻었다. 희석된 독소를 2 L 밀봉 유리 용기에 저장하였으며, "벌크 용액"으로 언급한다. 그 다음, 이 재료를 충전을 위해 적재할 때까지 5 ±3℃에서 저장하였다.
충전 전에, 벌크 용액을 샘플링하여 이 분야에 공지된 표준 방법에 따라서 미생물 오염의 존재(생적재)에 대해 테스트하였다. 그 다음, 의약 등급의 튜브를 경유하여 연동 펌프에 의해 이송하고, 충전실 내부에 위치한 멸균 벌크 수용기로 멸균 여과(0.2 ㎛)하였다. 생성된 멸균 여과된 벌크 용액을 3.5 cc 유리 바이알에 0.5 mL(2500 U), 1 mL(5000 U) 또는 2 mL(10000 U)의 분액으로 충전하였다.
최종 용기 생성물의 조성은 표 1에 나타낸다.
보툴리누스 B 형 제제의 조성
활성 성분 비활성 성분 농도
보툴리누스 독소 B 형 -- 5000 ±1000 LD50 U/mL
-- 숙신산염, USP 10 mM
-- 염화나트륨, USP 100 mM
-- 사람 알부민, FDA 방출 0.5 mg/mL
-- 염산, NF pH 조절용

실시예 2: 보툴리누스 독소 제제의 안정성 테스트
A. 안정성 결과
보툴리누스 독소 B 형을 제조하고, 전술한 바와 같이 2500 유니트/㎖의 농도로 희석하였으며, 5℃에서 30 개월 동안 5 mL 유리 바이알에 1 mL 분액으로서 저장하였다. 초기 저장 후, 0, 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 및 30 개월째에 분액을 무작위로 선택하여 마우스 LD50 분석에서 효능에 대해 테스트하였다. 용액을 외관 관찰하였으며, 표준 방법에 따라서 pH에 대해 테스트하였다.
표 2는 여러 시간점에서 제거한 분액의 테스트 결과를 나타낸다. 이들 결과는 시간 0에서 보고된 효능의 범위 내에 있는 효능으로 입증되는 바와 같이, 본 발명에 따라서 제조된 제제가 5℃에서 저장했을 때 30 개월 이상 동안 안정하다는 것을 보여준다.
5℃에서 제제의 안정성
저장 기간 (개월) 효능 (평균; U/㎖) pH 외관a
0 1750-3250 5.5 합격
1 1941 NDb ND
3 2541 5.6 ND
6 2020 5.6 합격
9 2357 5.6 합격
12 2064 5.6 합격
18 2318 5.4 합격
24 1799 5.6 합격
30 2101 5.6 합격
a합격 = 맑은 무색 내지 밝은 황색 용액; 실질적으로 육안으로 보이는 입자 없음
b 테스트 실행 안됨
표 3은 전술한 바와 같이 제조하여 분액하였지만, 25℃에서 저장한 보툴리누스 B 형 독소의 분액에 대해 테스트한 결과이다. 이들 결과는 25℃에서 6 개월 저장 후 초기 효능의 약 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 그리고 9 개월 저장 후 초기 효능의 75% 이상을 보유하는 평균 효능으로 입증되는 바와 같이, 이 제제가 25℃에서 6 개월 이상 안정하다는 것을 보여준다.
25℃에서 제제의 안정성
저장 기간 (개월) 효능 (평균; U/㎖) pH 외관a
0 1941 5.5 통과
1 2297 5.6 NDb
2 1935 5.6 ND
3 2017 5.6 ND
6 1909 ND 통과
9 1579 5.6 통과
a합격 = 맑은 무색 내지 밝은 황색 용액; 실질적으로 육안으로 보이는 입자 없음
b 테스트 실행 안됨
B. 안정성 테스트
1. 보툴리누스 독소 제제의 pH 측정
온도 보정 프로브가 장착된 피셔 사이언티픽 어큐메트 pH 미터(Fisher Scientific Accumet pH Meter) 모델 50을 사용하여 보툴리누스 독소 B 형 제제의 pH를 측정하였다. 전극은 KCl 기준 전극이 장착된 오리온 로스 콤비네이션 일렉트로드(Orion Ross Combination Electrode)였다. pH 측정은 제조자의 지시서에 따라서 표준 2 점 표준화(pH 4.0, pH 7.0) 후에 행하였다. 각 샘플에 대하여 3 회 측정하였다. pH 값은 두 자리 유효 수자로 기록하여 평균값을 취하였다.
2. 마우스 LD 50 효능 테스트
체중이 18 내지 22 g인 건강하고, 사용한 적이 없는 암컷 또는 수컷 CFW 또는 CD-1 마우스를 사용하여 LD50을 측정하였다. 각각의 충전된 생성물에 대하여, 마우스를 5 회분 투여량의 보툴리누스 독소 B 형 제제로 테스트하였다.
두 개의 스톡 용액을 테스트 샘플로부터 제조하였다. 스톡 용액 A는 테스트 샘플을 pH 6.2의 젤라틴 인산염 완충제를 사용하여 750 U/mL의 평가 효능으로 희석하여 얻었다. 스톡 용액 B는 용액 A를 75 U/mL로 10 배 희석하여 얻었다. 다음 테스트 희석액을 스톡 용액 B로부터 제조하였다: 1:7.5, 1:10, 1:13.5, 1:18 및 1:24.3.
마우스에게 화합물의 적당한 희석액 0.2 mL를 복강내 주사하였다. 마우스를 주사 후 4 일 동안 방치하고, 매일 관찰하였다. 사망을 기록하였다. 4 일 후에 관찰을 종결하였다.
상이한 희석 레벨에서의 누적 사망자수(CD)는 최대 희석도에서부터 시작하여 사망자 수를 추가하여 계산하였다. 누적 생존자수(CS)는 최소 희석도에서부터 시작하여 생존자 수를 추가하여 계산하였다. CD(%)는 각각의 희석도에서 CD/(CD + CS) x 100%로 계산하였다. LD50을 나타내는 희석도는 50% 누적 사망률을 괄호로 묶은 CD(%) 값을 산출하는 희석도를 사용하여 리드(Reed) 및 뮌히(Muench)의 비례 거리(PD)법에 의해 결정하였다.
Figure 112001005157205-pct00001
얻어진 PD 값은 50% CD를 괄호로 묶은 희석 레벨 간의 로그차를 곱하였다. 이 값을 50보다 큰 폐사율(CD)과 함께 희석도의 로그값에 더하여 LD50을 나타내는 희석도를 구하였다. 이 희석도의 역로그를 계산하여 주사 부피(0.2 mL) 당 독소의 LD50 수치를 계산하였다. 그 다음, 이 수치에 5를 곱하여 독소 스톡 용액 B의 mL 당 LD50을 구하였다.
스톡 용액 B의 mL 당 LD50 유니트를 그 희석 인자(즉, 75 U/mL의 평가 효능을 생성하는 데 필요한 희석도)와 곱하여 샘플의 효능을 구하였다. mL 당 LD50 유니트의 수학적 평균과 표준 편차는 5 회 유효 테스트에 대하여 계산하였다.
3. 제제의 외관
외관은 완만한 교반 후에 밝은 광선 아래에서 흑색 및 백색 배경에 대해 육안 검사를 통하여 평가하였다. 색상, 선명도 및 가시적 입자의 존재를 모두 평가하였다.
실시예 3: 경부 이긴장증(CD)의 치료
A. 약제 희석, 계산, 투여 및 투여 섭생
1. 약제 처리
약제 바이알을 충전하여 희석하지 않은 연구 약제 2.0 mL(10000 U), 1.0 mL(5000 U) 또는 0.5 mL(2500 U)를 전달하였다. 보툴리누스 독소가 변성될 수 있기 때문에, 격렬한 진탕 또는 기포 발생은 모든 처리 단계에서 피하였다. 모든 부피를 제거하기 위하여 1 mL 투베르쿨린 주사기를 사용하여 제제를 바이알에서 제거하였다.
2. 약제 계산
적당한 바이알의 함량을 투여함으로써 보툴리누스 독소 B 형을 경부 이긴장증(CD) 환자에게 투여하여 하기 표에 나타낸 투여량을 제공하였다. 투여량 점증에 대한 마우스 유니트(U)를 다음과 같이 계산하였으며, 1 U는 실시예 2에 기재된 바와 같이 마우스에 대해 측정한 LD50을 나타내는 투여량에 존재하는 독소의 양이다.
각각의 투여 기간 동안, 보툴리누스 독소 B 형을 후술하는 바와 같은 표준 과정에 따라서 투여하였다. CD 환자에 대한 보툴리누스 독소의 치료학적 사용에 대해 미리 훈련받은 신경의에 의해 화합물을 주사하였다. 환자를 가능한한 많이 휴식시켜서 안정된 머리 및 목 자세의 관찰을 용이하게 하였다. CD를 유발하는 데 개입된 목 근육을 결정하고, 개입된 근육의 촉진(觸診)에 의해 확인하였다. 조사자의 재량으로, EMG 평가를 행하여 일차적으로 영향을 받는 근육의 위치를 더 추적하였다. 이 프로토콜의 치료에 대해 고려되는 근육은 견갑골 거근, 외측 사각근 및 내측 사각근, 척추 소두, 팽대 소두, 흉쇄 유양 돌기 및 능형골이다. 각각의 이들 근육의 1 내지 5 부위로 주사하였다. 부위 당 총 주사 부피는 국소 조직 염좌를 피하기 위하여 1.0 mL 이하, 0.1 mL 이상으로 하였으며, 표준 1.0 mL 주사기로 정확한 부피 측정을 하였다. 초기에, 환자에게 5000 U의 총 투여량이 투여되었으며, 환자가 임상 병원에 방문 할 때, 약 15000 유니트까지의 후속 투여량을 투여하였다.
B. 경부 이긴장증(CD)의 임상 연구
연구 1
평균 연령이 43.9 세이고, 특발성 CD의 개인 임상 진단을 받은 8 명의 환자(남성 3 명, 여성 5 명)가 연구에 참여하였으며, 보툴리누스 독소 B 형을 2 내지 4 군데 목 및/또는 어깨 근육군 표면에 주사하였다. 환자를 4 주 마다 자주 치료받게 하였지만, 발표 시에 심각한 역효과나 계속적인 개선은 나타나지 않았다. 환자들은 1 내지 5 회 투여 세션에 참여하였다. 개별 투여 세션은 100 U 내지 1200 U였으며, 총 누적 투여량은 전술한 바와 같은 보툴리누스 독소 B 형 제제의 270 U 내지 2280 U였다. 추이 사경 스케일[Tsui, J. K. C.(1986), Lancet 2: 245-247]을 사용하여 효능을 측정하였다. 환자들은 127 일 내지 398 일 동안 이 연구에 참여하였으며, 평균 연구 시간은 244.8 일이었다. 사경 스코어는 기준선에서 유사하였으며, 모든 환자들은 총 투여량을 비교하였을 때, 투여량 관련 동향의 약간의 징후와 함께 스코어 경사가 완만하였다(경사 = 개선). 전반적으로, 환자들은 사경 조건이 개선되었다. 이 연구에서 항체 차단이 진전되는 징후는 없었다.
2. 연구 2
이 연구에 참여한 환자들은 특발성 CD(사경)의 임상 진단을 받았으며, 보툴리누스 독소 A 형에 대한 불응성이 전개되고 있었다. 환자들에게 본 발명에 따른 보툴리누스 독소 B 형 제제를 목과 어깨 근육의 2 내지 4 피부 부위에 근육내 주사하였다.
20 명의 환자(중간 연령 52.3 세)가 참여하여 연구를 완성하였다. 환자들은 37 일 내지 127 일 동안 이 연구에 참여하였으며, 평균 기간은 65 일이었다. 환자들은 연구 약제의 1 내지 3 투여량으로 치료하였다. 누적 투여량은 940 내지 2100 U 범위였으며, 개별 투여량은 보툴리누스 독소 B 형 150 내지 1430 U 범위였다. 투여량 세션 간의 평균 시간 간격은 저 투여량(총 100 내지 899 U)이 투여된 환자에 대하여 22.3 일이었고, 고 투여량 범위(900 내지 1500 U)의 환자에 대하여 48.4 일이었다.
임상 이점은 토론토 서부 경련성 사경 등급 스케일(TWSTRS) - 중증도[콘스키(Consky, E. S.), 랭(Lang, A. E.)(1994); Therapy with Botulinum Toxin. 잔코비치(Jankovic, J) 및 할렛(Hallet, M) 출판, 마렉 데커사(Marcel Dekker, Inc.), 뉴욕 소재]에서 기준선과 비교하였을 때, 25% 이상의 스코어 경사로 정의하였다(경사 = 개선). 평균 스코어는 기준선에서 모든 환자에게 유사하였다. 고 투여량군에서 환자의 56%는 TWSTRS - 중증도 스코어 경사를 보인 반면에, 저 투여량군에서는 환자의 7%가 스코어 경사를 나타내었다. TWSTRS - 통증 스코어의 완만한 개선도 양 군에서, 특히 연구의 초기 단계에서 관찰되었다. 이들 환자에게서 보툴리누스 독소 B 형에 대한 항체 차단의 전개는 나타나지 않았다.
3. 연구 3
경도 이긴장증 진단이 확인된 28 명의 환자(평균 연령 50.9 세)에게 시간 대비 점증 투여량(연속 세션 당 1.5 배까지)으로 보툴리누스 독소 B 형 제제를 목과 어깨 근육의 2 내지 4 피부 부위에 주사하였다. 전술한 바와 같이, 임상 이점은 TWSTRS - 중증도 테스트를 사용하여 평가하였으며, 25% 스코어 감소를 개선으로 간주하였다.
환자들은 28 일 내지 177 일 동안 연구에 참여하였으며, 평균 연구 시간은 71.9 일이었다. 환자들은 제제의 1 내지 3 회 투여량으로 치료하였다. 누적 투여량은 1430 U 내지 12000 U 범위였으며, 개별 투여량은 300 U 내지 12000 U였다. 임상 평가를 위하여, 4 투여량군을 정의하였다: 100 내지 800 U(A 군), 900 내지 2399 U(B 군), 2400 내지 5999 U(C 군) 및 6000 내지 12000 U(D 군). 투여 세션 간의 시간 간격 범위는 다음과 같다: A 군, 13 내지 101 일, 평균 35.7 일; B 군, 14 내지 113 일, 평균 48.8 일; C 군, 29 일 내지 177 일, 평균 62.2 일; D 군, 28 일 내지 177 일, 평균 55.1 일.
평균 기준선 스코어는 모든 치료군의 모든 환자에게서 유사하였으며, 모든 4 개의 군은 연구 중에 평균 스코어 감소(개선)를 나타내었다. 전반적으로, 기준선으로부터의 평균 개선률과 중증도 스코어에 대한 평균 반응비는 연구 중에 C 군과 D 군에게서 가장 높았다. 평균 최대 개선, 평균 최대 개선률 및 평균 최대 반응비의 측정치는 두 고투여량군이 두 저투여량군보다 더 높았다(최대 개선에 대하여 8.1 및 6.8 대 2.1 및 3.6; 평균 최대 개선률에 대하여 43.9% 및 35.5% 대 10% 및 16.1%; 평균 최대 반응비에 대하여 0.32 및 0.23 대 0.05 및 0.09). 치료에 반응하는 환자의 백분률은 두 고투여량군(C 군, 80% 및 D 군, 78%)이 두 저투여량군(A 군, 0% 및 B 군 27%)보다 높았다. 평균 반응 기간은 두 고투여량군(C 군, 47.6 일; D 군, 38.1 일)이 두 저투여량군(A 군, 0 일; B 군, 31 일)보다 높았다. 이들 데이터는 본 발명에 따른 보툴리누스 B 독소 제제에 대한 투여량 의존 반응을 보여준다.
4. 연구 4
보툴리누스 독소 B 형 제제의 세 가지 투여량을, 무작위, 이중 맹검, 단일 투여량, 사지, 평행군, 다중심 연구에 참여한 85 CD 환자를 포함하는 연구에서 위약 치료에 대하여 테스트하였다. 환자들은 18 세 내지 80 세 연령 범위였다. 투여량은 목 및/또는 어깨 근육군의 2 내지 4 피부 부위에 투여한 보툴리누스 독소 B 형 400, 1200 또는 2400 U였다. TWSTRS 스코어링 스케일을 사용하여 치료 후 2 주 및 4 주째에 환자를 평가하였다. 4 주째에 TWSTRS 중증도 스코어에서 3 점 이상의 개선(≥20%)이 나타나지 않은 환자를 비반응자로서 이 연구에서 제외하였다. 반응자들은 그들의 반응 레벨이 50% 이상 떨어질 때까지 4 주마다 평가하였다.
모든 TWSTRS 스코어는 보툴리누스 독소 B 형 제제의 투여량을 점증시킴에 따라서 개선을 나타내었다. 4 주째에, TWSTRS - 통증 및 TWSTRS - 총 평가에 의해서 위약 치료된 환자들과 비교하였을 때, 2400 U 투여량군의 환자에게서 통계학적으로 유의적인 개선이 있었으며, 개선이 나타난 환자의 백분률은 2400 U 군의 환자에게서 가장 높았다. 평균 환자 전반 평가는 다른 치료군의 어떠한 군과 비교해도 2 주, 4 주 및 8 주째에 2400 U 군의 환자에게서 상당히 더 높았으며, 4 주 데이터에 대한 분산 분석에서 치료군간에 통계학적으로 유의적인 차(p = 0.0286)가 있었다. 위약 투여량군과 2400 U 투여량군 간의 유의적인 차(p = 0.0050)는 없었으며, 투여량 반응 분석에서의 유의적인 차(p = 0.0028)도 없었다. 4 주 데이터 분산 분석에서, 치료군간에 통계학적으로 유의적인 차(p = 0.0073)는 없었으며, 위약 투여량군과 2400 U 투여량군 간의 유의적인 차(p = 0.0015) 또한 없었고, 투여량 반응 분석에서의 유의적인 차(p = 0.0008)도 없었다.
환자들은 25 일 내지 203 일 동안 이 연구에 참여하였으며, 2400 U 투여량군에 대한 평균 일수가 더 높았다(61 일).
5. 연구 5
이 연구도 무작위, 이중 맹검, 위약 조절, 단일 투여량, 사지, 평행군, 다중심 외래 환자 연구이며, CD 진단이 확인된 환자의 목 및/또는 어깨 근육군 2 내지 4 피부 부위에 주사한 위약(A 군)의 단일 치료 또는 보툴리누스 독소 B 형 제제의 세 가지 투여량(2500 U, B 군; 5000 U, C 군; 10000 U, D 군) 중 한 가지의 효과를 실험하였다. 환자들은 치료후 방문 2 주 및 4 주째에 평가하였다. 기준선(TWSTRS - 총 스코어)과 비교하여 4 주째에 20% 이상의 개선이 나타난 환자를 "반응자"로 간주하였으며, 최대 4 개월 동안 4 주 간격으로, 또는 이들의 반응 스코어 레벨이 50% 이상 떨어질 때까지 재평가받도록 하였다.
연령 범위가 19 세 내지 81 세인 122 명의 환자들이 이 연구에 참여하였다. 환자가 이 연구를 계속 참여한 시간을 이들이 연구 약제에 반응한 시간으로 반영하였다. 치료군은 환자들이 이 연구에 남아있던 최소 일수 및 최대 일수에 대해 유사하였다. 평균 연구 시간은 투여량이 증가함에 따라서, 즉 위약군 A에 대한 45 일로부터 61 일(B 군), 67 일(C 군) 및 75 일(D 군)로 증가하였다.
모든 TWSTRS 스코어에 대해서, 모든 치료군은 기준선으로부터 4 주째에 개선을 나타내었다. 모든 TWSTRS 스코어는 제제의 투여량이 증가함에 따라서 개선되는 경향을 보였다. 4 주 TWSTRS - 총 스코어에 대한 공분산 분석에서, 치료군 간의 전반적인 차가 통계학적으로 유의적이었다(p = 0.0001). 또한, 투여량 반응 분석은 유의적이었으며(p = 0.0001), 위약과 활성군의 모든 3 가지 비교는 유의적이었다(위약 대 2500 U에 대하여 p = 0.0016; 위약 대 5000 U에 대하여 p = 0.0005; 위약 대 10,000 U에 대하여 p = 0.0001). 4 주째에 치료에 반응한 환자의 백분률은 D 군(10000 U)이 다른 군들보다 TWSTRS - 총, 장애 및 통증 스코어에 대하여 더 높았다. 네 가지 TWSTRS 스코어(총, p < 0.001; 중증도, p = 0.035; 장애, p = 0.002; 통증, p = 0.001) 각각에 대하여 유의적인 투여량 반응이 있었다. 통증 평가는 4 주째 모든 치료군에 대하여 B 군, C 군 및 D 군에서 각각 67.5, 70.2 및 75.1로 개선되었다. 치료군간의 전반적인 차는 통계학적으로 유의적이었으며(p = 0.0049), 투여량 반응 분석도 통계학적으로 유의적이었고(p = 0.0017), 위약군과 세 가지 모든 활성 치료군의 비교도 유의적이었다(위약군과 비교하였을 때, B 군, C 군 및 D 군에 대하여 각각 p = 0.0149, 0.0084 및 0.0007).
실시예 4: 사람 피험자의 보툴리누스 독소 B 형 제제에 대한 생리학적 반응
이 분야에 공지된 표준 전기 생리학적 방법을 사용하여 신근 디기탈리스 브레비스(extensor digitalis brevis; EDB) M 파 진폭에 대하여 18 명의 건강한 피험자를 테스트하였다. 피험자들은 18 세 내지 22 세 범위였다. 전기 생리학적 연구는 보툴리누스 독소 B 형 제제 1.25 U 내지 480 U(근육내) 범위의 투여량을 주사한 후 2 일, 4 일, 6 일, 9 일, 11 일, 13 일 및 14 일째에 실행하였다. 데이터 분석의 결과는 투여량을 증가시킴에 따른 EDB M 파 진폭 및 면적의 투여량 의존적 감소로 나타났다. 480 U에서의 최대 효과는 기준선으로부터 M 파 진폭의 75% 감소를 유발하였다.
별도의 연구에서, 10 명의 환자를 무작위로 추출하여 한 EDB에서 보툴리누스 독소 B 형 "B" 제제로 주사하고, 다른 EDB에서 다섯 가지 상이한 투여 계획: 1.25 U A/20 U B; 2.5 U A/80 U B; 5 U A/160 U B; 7.5 U A/320 U B; 10 U A/480 U B(투여량 계획 당 2 명의 피험자) 중 한 가지를 사용하여 "보톡스(등록 상표)"(보툴리누스 독소 A형 "A")의 투여량으로 투여하였다. 한 명의 대조 피험자는 각각의 EDB 근육에 염수 주사하였다. M 파 진폭 및 면적의 강하율은 양 근육에서 유사하였으며, 최대 효과는 주사 후 대략 6 일째에 발생하였다. 두 혈청형은 M 파 진폭의 투여량 의존적 감소를 나타내었다. 운동 후 촉진은 두 유형의 독소에 대하여 9 일째에 가장 컸다.
본 발명을 특정한 방법과 구체예를 참고로 기술하였지만, 여러 가지 수정과 변형이 본 발명을 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.

Claims (50)

  1. 안정하고 즉시 사용가능한(ready-to-use) 액상 약학적 보툴리누스 독소 제제로서,
    약 pH 5 내지 pH 6의 완충 pH 범위를 제공하는 약학적으로 허용 가능한 완충 염수;
    치료적 농도의 정제된 보툴리누스 독소; 및
    혈청 알부민을 포함하는 부형 단백질을 포함하며,
    상기 제제는 약 0 내지 10℃의 온도에서 1 년 이상 또는 약 10 내지 30℃의 온도에서 약 6 개월 이상 액상으로서 안정한 것을 특징으로 하는 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 온도는 약 5 ±3℃인 것을 특징으로 하는 제제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 온도는 약 4 ±2℃인 것을 특징으로 하는 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충 염수는 pH 4.5 내지 6.5 범위의 pK를 갖는 것을 특징으로 하는 제제.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 독소 제제는 2 년 이상 동안 액상으로 안정한 것을 특징으로 하는 제제.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충 pH 범위는 약 pH 5.6 ±0.2인 것을 특징으로 하는 제제.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충 염수는 인산염 완충제, 인산염-시트르산염 완충제 및 숙신산염 완충제로 구성된 군 중에서 선택되는 완충 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보툴리누스 독소는 혈청형 A, B, C1, C2, D, E, F 및 G로 구성된 군 중에서 선택되는 보툴리누스 독소 혈청형인 것을 특징으로 하는 제제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 보툴리누스 독소는 약 100 내지 20,000 U/㎖ 범위의 치료적 농도로 존재하는 보툴리누스 독소 B 형인 것을 특징으로 하는 제제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 보툴리누스 독소 B 형은 약 1000 내지 5000 U/㎖의 치료적 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 제제.
  11. 제9항에 있어서, 상기 보툴리누스 독소 B 형은 약 700 킬로달톤(kD)의 고분자량 복합체로 존재하는 것을 특징으로 하는 제제.
  12. 제8항에 있어서, 상기 보툴리누스 독소는 보툴리누스 독소 A형이며, 안정하고 즉시 사용가능한 액상 약학적 제제 중에 약 20 내지 2000 U/㎖ 범위의 치료적 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 제제.
  13. 제12항에 있어서, 상기 보툴리누스 독소 A 형은 안정하고 즉시 사용가능한 액상 약학적 제제 중에 약 100 내지 1000 U/㎖ 범위의 치료적 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 제제.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정하고 즉시 사용가능한 액상 약학적 제제가 100 mM 염화나트륨; 완충 pH 5.6의 10 mM 숙신산염 완충제; 및 0.5 mg/㎖의 인간 혈청 알부민을 포함하며, 보툴리누스 독소가 5,000 ± 1,000 U/㎖ 농도로 존재하는 보툴리누스 독소 B형인 것을 특징으로 하는 제제.
  15. 삭제
  16. 혈청 알부민 보툴리누스 독소 제제를 포함하는 안정하고 즉시 사용가능한 액상 약학적 제제로서,
    pH 5.6의 완충 pH를 제공하는 약학적으로 허용 가능한 완충 염수 및
    제제 중에서 안정한 보툴리누스 독소를 포함하며,
    상기 독소 제제는 약 10 내지 30℃ ±10%의 온도에서 약 6 개월 이상 액상으로서 안정하며,
    100 mM 염화나트륨; 완충 pH 5.6의 10 mM 숙신산염 완충제; 및 0.5 mg/㎖ 인간 혈청 알부민을 추가로 포함하고,
    상기 보툴리누스 독소는 5,000 ± 1,000 U/㎖ 농도로 존재하는 보툴리누스 독소 B형인 것을 특징으로 하는 제제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 온도는 약 25℃인 것을 특징으로 하는 제제.
  18. 삭제
  19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 완충 염수는 인산염 완충제, 인산염-시트르산염 완충제 및 숙신산염 완충제로 구성된 군 중에서 선택되는 완충 성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 제제.
  20. 삭제
  21. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 보툴리누스 독소는 혈청형 A, B, C1, C2, D, E, F 및 G로 구성된 군 중에서 선택되는 보툴리누스 독소 혈청형인 것을 특징으로 하는 제제.
  22. 제21항에 있어서, 상기 보툴리누스 독소는 약 100 내지 20,000 U/㎖의 농도로 존재하는 보툴리누스 독소 B 형인 것을 특징으로 하는 제제.
  23. 제22항에 있어서, 상기 보툴리누스 독소 B 형은 약 1000 내지 5000 U/㎖ 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 제제.
  24. 제22항에 있어서, 상기 보툴리누스 독소 B 형은 약 700 kD의 고분자량 복합체로 존재하는 것을 특징으로 하는 제제.
  25. 제21항에 있어서, 상기 보툴리누스 독소는 약 20 내지 2000 U/㎖ 범위의 농도로 존재하는 보툴리누스 독소 A 형인 것을 특징으로 하는 제제.
  26. 제25항에 있어서, 상기 보툴리누스 독소는 약 100 내지 1000 U/㎖ 범위의 농도로 존재하는 보툴리누스 독소 A 형인 것을 특징으로 하는 제제.
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 인간을 제외한 환자의 선택된 근육, 근육군, 선(腺) 또는 기관에 제1항 내지 제3항, 제16항 또는 제17항 중 어느 한 항에 따른 액상 보툴리누스 독소 제제의 약학적으로 유효한 투여량을 투여하는 단계를 포함하는, 선택된 근육, 근육군, 선 또는 기관으로의 콜린 작용성 입력의 저해에 의해 장애를 치료하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 장애는 근긴장, 안검경련, 사시, 반측안면 경련, 이긴장증, 중이염, 강직성 대장염, 아니스무스(anismus), 배뇨근 괄약근 근실조, 악관절 클렌칭 및 척추 만곡으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 근긴장은 졸증, 척수 상해, 폐쇄성 두부 외상, 뇌성 마비, 다발성 경화증 및 파킨슨 병으로 구성된 군 중 하나 이상에 기인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 이긴장증은 경련성 사경(경부 이긴장증), 경련성 발성 장애, 사지 이긴장증, 후두 이긴장증 및 구하악골(메이지) 이긴장증으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제29항에 있어서, 상기 선택된 근육 또는 근육군은 주름살 또는 주름진 이마를 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제29항에 있어서, 상기 근육은 출산 중과 관련된 회음부 근육인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제29항에 있어서, 상기 장애는 근막 통증, 편두통과 관련된 두통, 혈관 장애, 신경통, 신경병증, 관절염 통증, 배부 통증, 다한증, 비루, 천식, 타액 과다 분비 및 위산 과다 분비로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제29항에 있어서, 상기 제제 내 상기 보툴리누스 독소는 보툴리누스 독소 혈청형 B, C1, C2, D, E, F 및 G로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 제제 내 상기 보툴리누스 독소는 보툴리누스 독소 B 형인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제29항에 있어서, 상기 제제 내 상기 보툴리누스 독소는 보툴리누스 독소 혈청형 A, C1, C2, D, E, F 및 G로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 제제 내 상기 보툴리누스 독소는 보툴리누스 독소 A 형인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 선택된 근육, 근육군, 선 또는 기관으로의 콜린 작용성 전달 저해가 필요한 환자를 치료하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제3항, 제16항 또는 제17항 중 어느 한 항에 따른 안정하고 즉시 사용가능한 액상 약학적 보툴리누스 독소 제제.
  41. 제40항에 있어서, 상기 환자는 근긴장, 안검경련, 사시, 반측안면 경련, 이긴장증, 중이염, 강직성 대장염, 아니스무스, 배뇨근 괄약근 근실조, 악관절 클렌칭 및 척추 만곡으로 구성된 군 중에서 선택되는 장애를 가진 것을 특징으로 하는 제제.
  42. 제41항에 있어서, 상기 환자는 졸증, 척수 상해, 폐쇄성 두부 외상, 뇌성 마비, 다발성 경화증 및 파킨슨 병으로 구성된 군 중의 하나 이상에서 기인하는 근긴장을 가진 것을 특징으로 하는 제제.
  43. 제41항에 있어서, 상기 환자는 경련성 사경(경부 이긴장증), 경련성 발성 장애, 사지 이긴장증, 후두 이긴장증 및 구하악골(메이지) 이긴장증으로 구성된 군 중에서 선택되는 이긴장증을 가진 것을 특징으로 하는 제제.
  44. 제40항에 있어서, 상기 선택된 근육 또는 근육군은 주름살 또는 주름진 이마를 유발하는 것을 특징으로 하는 제제.
  45. 제40항에 있어서, 상기 선택된 근육은 회음부 근육이고, 상기 환자는 출산 중인 것을 특징으로 하는 제제.
  46. 제40항에 있어서, 상기 환자는 근막 통증, 편두통과 관련된 두통, 혈관 장애, 신경통, 신경병증, 관절염 통증, 배부 통증, 다한증, 비루, 천식, 타액 과다 분비 및 위산 과다 분비로 구성된 군 중에서 선택되는 상태를 가진 것을 특징으로 하는 제제.
  47. 제40항에 있어서, 상기 환자는 보툴리누스 독소 A 형에 불응성이 있고, 상기 제제 내 상기 보툴리누스 독소는 보툴리누스 독소 혈청형 B, C1, C2, D, E, F 및 G로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제제.
  48. 제47항에 있어서, 상기 제제 내 상기 보툴리누스 독소는 보툴리누스 독소 B 형인 것을 특징으로 하는 제제.
  49. 제40항에 있어서, 상기 환자는 보툴리누스 독소 B 형에 불응성이 있고, 상기 제제 내 상기 보툴리누스 독소는 보툴리누스 독소 혈청형 A, C1, C2, D, E, F 및 G로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제제.
  50. 제49항에 있어서, 상기 제제 내 상기 보툴리누스 독소는 보툴리누스 독소 A 형인 것을 특징으로 하는 제제.
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